CN110108830A - 一种同时对蓝靛果中9种花青素进行定性和定量检测的方法 - Google Patents

一种同时对蓝靛果中9种花青素进行定性和定量检测的方法 Download PDF

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Abstract

一种同时对蓝靛果中9种花青素进行定性和定量检测的方法，本发明涉及蓝靛果中花青素的检测方法。本发明是要解决现有的蓝靛果花青素检测方法难于同时定性和定量检测九种花青素的问题。本方法：一、提取蓝靛果中花青素，制备样品溶液；二、用9种花青素标准品配制标准溶液；三、以甲酸水溶液和乙腈作为流动相，设定梯度洗脱程序对各种标准品进行高效液相色谱检测，记录它们的保留时间及浓度和峰面积，并分别绘制各种标准品的浓度与峰面积之间的标准曲线；四、在相同条件下检测样品溶液的液相色谱，通过比对和计算完成定性和定量检测。本发明的方法可在20分钟内完成蓝靛果中9种花青素检测，用时短，可用于检测领域。

Description

一种同时对蓝靛果中9种花青素进行定性和定量检测的方法
技术领域
本发明涉及蓝靛果中花青素的检测方法。
背景技术
蓝靛果(Lonicera caerulea L.var.edulis)属于被子植物门、双子叶植物纲、茜草目、忍冬科、忍冬属多年生落叶小灌木，学名又称蓝果忍冬；俗称山茄子、羊奶子、黑瞎子果等。适生于高寒地区，耐-55℃左右低温，是一种我国东北林区非常有特点的野生浆果。蓝靛果中含有丰富的花青素，花青素具有抗氧化、降血脂、抗癌、抗疲劳等多种功效，是蓝靛果中重要的功能营养成份。蓝靛果中含有多种花青素，如矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-芸香糖苷、芍药素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-芸香糖苷等，目前已经报道的蓝靛果花青素检测方法只能检测其中少数几种花青素，同时对9种花青素进行定性、定量检测的方法较少，影响了蓝靛果及蓝靛果相关产品中花青素的检测，也在一定程度上限制了蓝靛果花青素的研究与应用。
发明内容
本发明是要解决现有的蓝靛果花青素检测方法难于同时定性和定量检测矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-芸香糖苷、芍药素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-芸香糖苷这九种花青素的问题，提供一种同时检测蓝靛果中9种花青素的方法，该方法成本低、易于操作、检测线性范围宽，可准确高效的对蓝靛果中的花青素进行定性、定量分析。
本发明一种同时对蓝靛果中9种花青素进行定性和定量检测的方法，按以下步骤进行：
一、提取蓝靛果中花青素，用去离子水溶解，再用滤膜过滤，得到样品溶液；
二、分别配制矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷标准品、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷标准品、飞燕草素-3-O-芸香糖苷标准品、芍药素-3,5-双葡萄糖苷标准品、矢车菊素-3-O-芸香糖苷标准品、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷标准品、芍药素-3-O-葡萄糖苷标准品、芍药素-3-O-芸香糖苷标准品和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品的标准溶液；
三、采用高效液相色谱仪对各个标准溶液在相同的条件下进行检测，其中高效液相色谱仪的色谱柱的参数如下：
色谱柱：以十八烷基键合硅胶为填充剂的C18色谱柱；
柱温：30～35℃；
流动相A：质量百分数为2％～4％的甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
进样量：10μL；
流动相梯度洗脱程序为：洗脱时间为15～20min，从开始洗脱至洗脱结束这段洗脱时间内，流动相A的体积百分数从89％～91％均匀降低至85％～87％；流动相B的体积百分数9％～11％均匀提高至13％～15％；洗脱过程中的任意时刻流动相A与流动相B的体积百分数之和为100％；
流动相流速为：0.8～1.2mL/min；
二极管阵列检测器(DAD)的检测波长为：520nm和210～600nm；
分别记录各种标准品的保留时间及浓度和峰面积，并分别绘制各种标准品的浓度与峰面积之间的标准曲线；
四、采用与步骤三的标准品相同的测试条件，测试步骤一制备的样品溶液的各峰的保留时间和峰面积，通过与标准品的保留时间或紫外-可见光谱对照，对各种花青素进行定性分析，根据样品溶液中各峰的峰面积从标准曲线中计算出各种花青素的浓度，从而完成各种花青素的定量分析。
本发明采用反向高效液相色谱法，通过选用特定浓度的甲酸溶液和乙腈并采用特殊洗脱程序，可在20min内完成对蓝靛果中矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-芸香糖苷、芍药素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-芸香糖苷9种花青素的定性和定量检测，该方法具有检测成本低、检测线性范围宽、用时短、准确度较高的优点，本发明可有效解决蓝靛果中花青素种类和含量不明确的问题，为蓝靛果花青素提取物与花青素相关产品中花青素的检测和蓝靛果花青素检测标准的建立提供了参考和依据。检测方法简单快速、灵敏可靠；高效液相色谱HPLC仪器较普及，利于推广和应用。
附图说明
图1是实施例1的样品溶液的高效液相色谱图；
图2是实施例1中的样品溶液与标准品混合液的高效液相色谱对比图；
图3是实施例1中的样品溶液中第1个特征峰与矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷标准品的紫外可见光谱对照图；
图4是实施例1中的样品溶液中第2个特征峰与飞燕草素-3-O-葡萄糖苷标准品的紫外可见光谱对照图；
图5是实施例1中的样品溶液中第3个特征峰与飞燕草素-3-O-芸香糖苷标准品的紫外可见光谱对照图；
图6是实施例1中的样品溶液中第4个特征峰与芍药素-3,5-双葡萄糖苷标准品的紫外可见光谱对照图；
图7是实施例1中的样品溶液中第5个特征峰与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品的紫外可见光谱对照图；
图8是实施例1中的样品溶液中第6个特征峰与矢车菊素-3-O-芸香糖苷标准品的紫外可见光谱对照图；
图9是实施例1中的样品溶液中第7个特征峰与天竺葵素-3-O-葡萄糖苷标准品的紫外可见光谱对照图；
图10是实施例1中的样品溶液中第8个特征峰与芍药素-3-O-葡萄糖苷标准品的紫外可见光谱对照图；
图11是实施例1中的样品溶液中第9个特征峰与芍药素-3-O-芸香糖苷标准品的紫外可见光谱对照图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一种同时对蓝靛果中9种花青素进行定性和定量检测的方法，按以下步骤进行：
一、提取蓝靛果中花青素，用去离子水溶解，再用滤膜过滤，得到样品溶液；
二、分别配制矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷标准品、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷标准品、飞燕草素-3-O-芸香糖苷标准品、芍药素-3,5-双葡萄糖苷标准品、矢车菊素-3-O-芸香糖苷标准品、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷标准品、芍药素-3-O-葡萄糖苷标准品、芍药素-3-O-芸香糖苷标准品和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品的标准溶液；
三、采用高效液相色谱仪对各个标准溶液在相同的条件下进行检测，其中高效液相色谱仪的色谱柱的参数如下：
色谱柱：以十八烷基键合硅胶为填充剂的C18色谱柱；
柱温：30～35℃；
流动相A：质量百分数为2％～4％的甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
进样量：10μL；
流动相梯度洗脱程序为：洗脱时间为15～20min，从开始洗脱至洗脱结束这段洗脱时间内，流动相A的体积百分数从89％～91％均匀降低至85％～87％；流动相B的体积百分数9％～11％均匀提高至13％～15％；洗脱过程中的任意时刻流动相A与流动相B的体积百分数之和为100％；
流动相流速为：0.8～1.2mL/min；
二极管阵列检测器(DAD)的检测波长为：520nm和210～600nm；
分别记录各种标准品的保留时间及浓度和峰面积，并分别绘制各种标准品的浓度与峰面积之间的标准曲线；
四、采用与步骤三的标准品相同的测试条件，测试步骤一制备的样品溶液的各峰的保留时间和峰面积，通过与标准品的保留时间或紫外-可见光谱对照，对各种花青素进行定性分析，根据样品溶液中各峰的峰面积从标准曲线中计算出各种花青素的浓度，从而完成各种花青素的定量分析。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的蓝靛果中花青素的提取方法，按以下步骤进行：
一、将蓝靛果研磨成果浆，每1g果浆中加入4mL酸化甲醇溶液，将果浆和酸化甲醇的混合液于室温震荡提取1h，再离心分离，分别留取上清液和沉淀；将沉淀再重复以上步骤进行提取，合并上清液，再用旋转蒸发仪，在40℃、0.1 MPa的条件下旋蒸60min，得到提取液；
二、分别用10mL的质量百分数≥99.5％的甲醇溶液和10mL体积分数为0.01％的盐酸水溶液注入C-18 Sep-Pak cartridge固相萃取柱进行淋洗活化，然后将步骤一得到的提取液注入固相萃取柱中，使花青素吸附到固相萃取柱上，再用体积分数为0.01％的盐酸水溶液淋洗以去除其中的糖、酸和其他水溶性化合物；将固相萃取柱干燥，再用体积分数0.01％的盐酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用旋转蒸发仪在温度为40℃的条件下水浴蒸干，然后用酸化去离子水复溶，进行冷冻干燥处理，得到蓝靛果花青素提取物冻干粉。
其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤一中所述的酸化甲醇溶液是在质量百分浓度≥99.5％的甲醇溶液中加入10g2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)和30mL的质量百分浓度≥99.5％的甲酸，用质量百分浓度≥99.5％的甲醇溶液定容至1 L得到的。其它与具体实施方式二相同。
本实施方式的酸化甲醇溶液中，BHT的含量为10g/L，甲酸的含量为30mL/L。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是步骤二中所述的体积分数为0.01％的盐酸水溶液是将质量分数为36.5～37％的盐酸0.01mL(即10μL)加入到100mL去离子水中得到的；其它与具体实施方式二或三至三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是步骤二中所述的体积分数为0.01％的盐酸甲醇溶液是将0.01mL(即10μL)质量分数为36.5～37％的盐酸加入到100mL质量百分数≥99.5％的甲醇溶液中得到的；其它与具体实施方式二至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是步骤二中所述的酸化去离子水是将0.1mL质量百分浓度≥99.5％的甲酸加入到100mL去离子水配制而成的；其它与具体实施方式二至五之一相同。
本实施方式的酸化去离子水中盐酸的体积分数是0.1％。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤二中所述滤膜的孔径为0.2～0.3μm；其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤三中所述的均匀提高是指匀速提高或者按阶梯程序提高；均匀降低是指匀速降低或者按阶梯程序降低；其它与具体实施方式一至六之一相同。
用下的实施例验证本发明的有益效果：
实施例1：本实施例一种同时对蓝靛果中9种花青素进行定性和定量检测的方法，按以下步骤进行：
一、提取蓝靛果中花青素并配制成样品溶液，具体步骤如下：
a、配制溶液：
(1)酸化甲醇溶液：向质量百分数≥99.5％的甲醇溶液中加入10g2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)和30mL的质量百分数≥99.5％的甲酸，用甲醇定容至1升；该酸化甲醇溶液中BHT的含量为10g/L，甲酸的含量为30mL/L；
(2)0.01％盐酸水溶液：将0.01mL(即10μL)质量分数为37％的盐酸加入到100mL去离子水中，混合均匀；
(3)0.01％盐酸甲醇溶液：将0.01mL(即10μL)质量分数为36.5～37％的盐酸加入到100mL质量百分数≥99.5％的甲醇溶液中，混合均匀；
(4)酸化去离子水：将0.1mL质量百分数≥99.5％的甲酸加入到100mL去离子水配制而成，该酸化去离子水中甲酸的体积分数是0.1％。
b、将14g蓝靛果鲜果研磨成果浆，按果浆与酸化甲醇溶液的体积比1:4混合，得到混合液；将混合液于室温震荡提取1h，离心分离，分别留取上清液和沉淀；将沉淀再重复以上提取步骤3次合并上清液；用旋转蒸发仪在40℃、0.1 MPa的条件下旋蒸60min，得到浓缩提取液；
c、分别用10mL的甲醇和10mL0.01％盐酸水溶液对C-18 Sep-Pak cartridge固相萃取柱进行淋洗活化，然后将2mL经步骤b得到的提取液注入固相萃取柱中，使花青素吸附到固相萃取柱上；用10mL质量百分浓度为0.01％的盐酸水溶液淋洗以去除其中的糖、酸和其他水溶性化合物；将固相萃取柱干燥，再用5mL0.01％盐酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；将洗脱液再用旋转蒸发仪在温度为40℃的条件下水浴蒸干，用酸化去离子水复溶，再进行冷冻干燥处理，得到24mg蓝靛果花青素提取物冻干粉；
d、将10mg蓝靛果花青素提取物冻干粉用10mL去离子水溶解，取1mL1.0 mg/mL蓝靛果花青素溶液用等体积的去离子水稀释后，再用0.22μm滤膜过滤，得到0.5mg/mL蓝靛果花青素溶液。
二、分别称取1mg矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷标准对照品、1mg飞燕草素-3-O-葡萄糖苷标准对照品、1mg飞燕草素-3-O-芸香糖苷标准对照品、1mg芍药素-3,5-双葡萄糖苷标准对照品、1mg矢车菊素-3-O-芸香糖苷标准对照品、1mg天竺葵素-3-O-葡萄糖苷标准对照品、1mg芍药素-3-O-葡萄糖苷标准对照品、1mg芍药素-3-O-芸香糖苷标准对照品，分别加去离子水溶解，定容于10mL容量瓶中，即得到8种浓度为0.1mg/mL的标准对照溶液；称取10mg矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准对照品加去离子水溶解，定容于10mL容量瓶中，得到的浓度为1.0mg/mL的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准溶液；用去离子水稀释9种标准溶液，制备一系列不同浓度梯度的9种标准溶液；
其中矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷标准对照品的纯度为质量分数≥95.0％、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷标准对照品的纯度为质量分数≥95.0％、飞燕草素-3-O-芸香糖苷标准对照品的纯度为质量分数≥90.0％、芍药素-3,5-双葡萄糖苷标准对照品的纯度为质量分数≥90.0％、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准对照品的纯度为质量分数≥98.0％、矢车菊素-3-O-芸香糖苷标准对照品的纯度为质量分数≥95.0％、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷标准对照品的纯度为质量分数≥90.0％、芍药素-3-O-葡萄糖苷标准对照品的纯度为质量分数≥90.0，芍药素-3-O-芸香糖苷标准对照品的纯度为质量分数≥95.0％；
三、采用高效液相色谱仪对各个标准溶液在相同的条件下进行检测，其中高效液相色谱仪的参数如下：
色谱柱：十八烷基键合硅胶为填充剂的C18色谱柱，XDB-C18 4.6×250mm，5μm；
柱温：30℃；
流动相A：质量百分数为3％的甲酸水溶液；流动相B：色谱纯乙腈；
流动相梯度洗脱程序为：洗脱时间为20min，从开始洗脱至洗脱结束这20min内，流动相A的体积百分数从90％匀速降低至86％；流动相B的体积百分数10％匀速提高至14％；洗脱过程中的任意时刻流动相A与流动相B的体积百分数之和为100％；
进样量：10μL；
流动相流速为1.0mL/min；
二极管阵列检测器(DAD)的检测波长为520nm和210～600nm；
记录矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-芸香糖苷、芍药素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-芸香糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷各样品的标准溶液保留时间，并绘制各种标准对照品标准溶液的浓度与峰面积之间的标准曲线；
本步骤三中，九种花青素标准对照品的浓度与峰面积关系的线性范围、线性回归方程、检出限、定量限、相对标准偏差和加标回收率如表1所示；线性回归方程中x为样品浓度，单位是mg/L，y液相色谱检测的峰面积。
表1九种花青素标准对照品的线性范围、线性回归方程、检出限、定量限、相对标准偏差和加标回收率
四、采用与步骤三的标准品相同的测试条件，测试步骤一制备的样品溶液的高效液相色谱图，如图1所示，得到9个特征峰，根据各峰的保留时间与九种花青素标准对照品的保留时间对比，得知与各峰对应的花青素种类如表2所示，完成对各种花青素进行定性分析；根据9个特征峰的峰面积，利用表1中各种花青素的线性回归方程，计算出各种花青素的浓度，列于表2中，完成各种花青素进行定量分析。
表2样品溶液中各峰的保留时间、花青素种类和浓度
峰的标号 保留时间/min 鉴定后花青素种类 花青素浓度(mg/L)
1 4.300 矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷 33.59
2 5.744 飞燕草素-3-O-葡萄糖苷 5.94
3 6.240 飞燕草素-3-O-芸香糖苷 5.46
4 7.153 芍药素-3,5-双葡萄糖苷 10.96
5 8.121 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷 680.35
6 8.983 矢车菊素-3-O-芸香糖苷 14.74
7 11.125 天竺葵素3-O-葡萄糖苷 1.05
8 13.287 芍药素-3-O-葡萄糖苷 7.00
9 14.298 芍药素-3-O-芸香糖苷 0.80
根据样品溶液计算出各种花青素的浓度，按下列各式可以计算蓝靛果花青素提取物中9种花青素的质量含量：
再按下列各式可以计算100g蓝靛果鲜果中9种花青素的质量含量：
将根据上述公式计算得到的花青素提取物中9种花青素的含量，以及每100g蓝靛果鲜果中9种花青素的含量，结果列于表3中。
表3花青素提取物及100g鲜果中各种花青素含量
从表3中可以计算出100g蓝靛果鲜果中总花青素含量为149.41mg。
将步骤三中的8种0.1mg/mL和1种1.0mg/mL的标准对照品储备液混合，得到混合液，采用与步骤三的标准品相同的测试条件，测试混合液的高效液相色谱图，并与本实施例的样品溶液的高效液相色谱绘制在一张图上，如图2所示，从图2可以看出，标准对照品中各花青素与样品溶液中的各花青素的保留时间能够一一对应，从而可知，本发明的方法鉴定准确。
本步骤四中，也可以根据样品溶液中与各保留时间对应的物质的紫外-可见光谱，与各种标准品的紫外-可见光谱相对比，从而进行定性鉴定。
与第1个特征峰对应的物质的紫外-可见光谱与矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷标准品的紫外可见光谱对照图如图3所示，从图3可以看出，两个谱图基本一致，从而可知，样品中含有矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷。
与第2个特征峰对应的物质的紫外-可见光谱与飞燕草素-3-O-葡萄糖苷标准品的紫外可见光谱对照图如图4所示，从图4可以看出，两个谱图基本一致，从而可知，样品中含有飞燕草素-3-O-葡萄糖苷。
与第3个特征峰对应的物质的紫外-可见光谱与飞燕草素-3-O-芸香糖苷标准品的紫外可见光谱对照图如图5所示，从图5可以看出，两个谱图基本一致，从而可知，样品中含有飞燕草素-3-O-芸香糖苷。
与第4个特征峰对应的物质的紫外-可见光谱与芍药素-3,5-双葡萄糖苷标准品的紫外可见光谱对照图如图6所示，从图6可以看出，两个谱图基本一致，从而可知，样品中含有芍药素-3,5-双葡萄糖苷。
与第5个特征峰对应的物质的紫外-可见光谱与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品的紫外可见光谱对照图如图7所示，从图7可以看出，两个谱图基本一致，从而可知，样品中含有矢车菊素-3-O-葡萄糖苷。
与第6个特征峰对应的物质的紫外-可见光谱与矢车菊素-3-O-芸香糖苷标准品的紫外可见光谱对照图如图8所示，从图8可以看出，两个谱图基本一致，从而可知，样品中含有矢车菊素-3-O-芸香糖苷。
与第7个特征峰对应的物质的紫外-可见光谱与天竺葵素3-O-葡萄糖苷标准品的紫外可见光谱对照图如图9所示，从图9可以看出，两个谱图基本一致，从而可知，样品中含有天竺葵素3-O-葡萄糖苷。
与第8个特征峰对应的物质的紫外-可见光谱与芍药素-3-O-葡萄糖苷标准品的紫外可见光谱对照图如图10所示，从图10可以看出，两个谱图基本一致，从而可知，样品中含有芍药素-3-O-葡萄糖苷。
与第9个特征峰对应的物质的紫外-可见光谱与芍药素-3-O-芸香糖苷标准品的紫外可见光谱对照图如图11所示，从图11可以看出，两个谱图基本一致，从而可知，样品中含有芍药素-3-O-芸香糖苷。
以上的对照证明，本申请的方法，不仅可以用样品的保留时间对其中的物质进行定性鉴定，还可以通过对比光谱图进行定性分析样品溶液中的物质。

Claims (7)

1.一种同时对蓝靛果中9种花青素进行定性和定量检测的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、提取蓝靛果中花青素，用去离子水溶解，再用滤膜过滤，得到样品溶液；
二、分别配制矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷标准品、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷标准品、飞燕草素-3-O-芸香糖苷标准品、芍药素-3,5-双葡萄糖苷标准品、矢车菊素-3-O-芸香糖苷标准品、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷标准品、芍药素-3-O-葡萄糖苷标准品、芍药素-3-O-芸香糖苷标准品和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品的标准溶液；
三、采用高效液相色谱仪对各个标准溶液在相同的条件下进行检测，其中高效液相色谱仪的色谱柱的参数如下：
色谱柱：以十八烷基键合硅胶为填充剂的C18色谱柱；
柱温：30～35℃；
流动相A：质量百分数为2％～4％的甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
进样量：10μL；
流动相梯度洗脱程序为：洗脱时间为15～20min，从开始洗脱至洗脱结束这段洗脱时间内，流动相A的体积百分数从89％～91％均匀降低至85％～87％；流动相B的体积百分数9％～11％均匀提高至13％～15％；洗脱过程中的任意时刻流动相A与流动相B的体积百分数之和为100％；
流动相流速为：0.8～1.2mL/min；
二极管阵列检测器的检测波长为：520nm和210～600nm；
分别记录各种标准品的保留时间及浓度和峰面积，并分别绘制各种标准品的浓度与峰面积之间的标准曲线；
四、采用与步骤三的标准品相同的测试条件，测试步骤一制备的样品溶液的各峰的保留时间和峰面积，通过与标准品的保留时间或紫外-可见光谱对照，对各种花青素进行定性分析，根据样品溶液中各峰的峰面积从标准曲线中计算出各种花青素的浓度，从而完成各种花青素的定量分析。
2.根据权利要求1所述的一种同时对蓝靛果中9种花青素进行定性和定量检测的方法，其特征在于步骤一中所述的蓝靛果中花青素的提取方法，按以下步骤进行：
一、将蓝靛果研磨成果浆，每1g果浆中加入4mL酸化甲醇溶液，将果浆和酸化甲醇的混合液于室温震荡提取1h，再离心分离，分别留取上清液和沉淀；将沉淀再重复以上步骤进行提取，合并上清液，再用旋转蒸发仪，在40℃、0.1MPa的条件下旋蒸60min，得到提取液；
二、分别用10mL的质量百分数≥99.5％的甲醇溶液和10mL体积分数为0.01％的盐酸水溶液注入C-18 Sep-Pak cartridge固相萃取柱进行淋洗活化，然后将步骤一得到的提取液注入固相萃取柱中，使花青素吸附到固相萃取柱上，再用体积分数为0.01％的盐酸水溶液淋洗以去除其中的糖、酸和其他水溶性化合物；将固相萃取柱干燥，再用体积分数0.01％的盐酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用旋转蒸发仪在温度为40℃的条件下水浴蒸干，然后用酸化去离子水复溶，进行冷冻干燥处理，得到蓝靛果花青素提取物冻干粉。
3.根据权利要求2所述的一种同时对蓝靛果中9种花青素进行定性和定量检测的方法，其特征在于步骤二中所述的酸化甲醇溶液是在质量百分浓度≥99.5％的甲醇溶液中加入10g2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和30mL的质量百分浓度≥99.5％的甲酸，再用质量百分浓度≥99.5％的甲醇溶液定容至1L得到的。
4.根据权利要求2或3所述的一种同时对蓝靛果中9种花青素进行定性和定量检测的方法，其特征在于步骤二中所述的体积分数为0.01％的盐酸水溶液是将0.01mL质量分数为36.5～37％的盐酸加入到100mL去离子水中得到的。
5.根据权利要求2或3所述的一种同时对蓝靛果中9种花青素进行定性和定量检测的方法，其特征在于步骤二中所述的体积分数为0.01％的盐酸甲醇溶液是将0.01mL质量分数为36.5～37％的盐酸加入到100mL质量百分数≥99.5％的甲醇溶液中得到的。
6.根据权利要求2或3所述的一种同时对蓝靛果中9种花青素进行定性和定量检测的方法，其特征在于步骤二中所述的酸化去离子水是将0.1mL质量百分浓度≥99.5％的甲酸加入到100mL去离子水配制而成的。
7.根据权利要求1或2所述的一种同时对蓝靛果中9种花青素进行定性和定量检测的方法，其特征在于步骤一中所述滤膜的孔径为0.2～0.3μm。
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