KR20090010172A - 녹차 종을 포함하는 추출물 및 방법 - Google Patents

녹차 종을 포함하는 추출물 및 방법 Download PDF

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KR20090010172A
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로버트 티. 고우
조지 더블유. 사이퍼트
댄 리
랜달 에스. 알버트
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허발사이언스 싱가포르 피티이 리미티드
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Abstract

본 발명은 초임계 CO2 추출 방법에 의해 제조된 녹차 종 식물 물질의 추출물에 관한 것이다.

Description

녹차 종을 포함하는 추출물 및 방법 {EXTRACTS AND METHODS COMPRISING GREEN TEA SPECIES}
관련 출원
본 출원은 2006년 3월 23일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 60/785,178을 우선권으로 주장하며, 상기 미국 가출원은 그 전체내용이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 녹차 종(green tea species)의 추출물, 순차적 추출 단계를 사용하여 이를 제조하는 방법, 및 이의 처리 방법에 관한 것이다.
약 4000년전 중국 남부에서 유래된 차(tea)는 세계 인구의 3분의 2가 넘는 수의 사람들에 의해 소비되고 있다. 차는 매혹적인 향기, 뛰어난 맛 및 건강 촉진 효과를 지니며, 이는 차가 단지 물에 이어 2번째로 세계에서 가장 인기있는 음료가 되게 한다. 기원전 3000년에 이미 차는 중국인에 의해 약용 음료로서 사용되었다. 차의 의약적 용도는 명 왕조 (16세기) 동안 쓰여진 고대 중국 약전 "Ben Cao Gang Mo"에 기록되어 있다. 차의 공급원은 식물인 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)이다. 사실상 수 백 가지의 차가 현재 카멜리아 시넨시스의 잎으로부터 생산되고 있고, 일반적으로 다음 3가지 주요 범주로 분류된다: 발효되지 않은 녹 차, 부분 발효된 우롱(oolong), 및 완전 발효된 홍차.
테아세애(Teaceae)과의 일원인 카멜리아 시넨시스는 30 피트의 높이까지 자랄 수 있는 상록 관목 또는 상록수이다. 그러나, 이는 차 잎을 위해 재배시에 일반적으로 1 내지 5 피트의 높이로 잘려진다. 이러한 식물은 빽빽히 가지가 나는데, 암녹색이고 털이 있고 직사각형-달걀형(oblong-ovate) 잎이 재배되고 우선적으로 어린 순(young shoot)으로서 채취된다. 보다 오래된 잎은 열등한 품질을 지니는 것으로 일반적으로 간주된다.
녹차 및 홍차 둘 모두가 식물인 카멜리아 시넨시스로부터 유래되지만, 이러한 2가지 유형의 차를 구별짓는 것은 잎의 처리과정이다. 홍차의 경우, 잎을 채취한 후, 시들게 한 다음 롤링(rolling)한다. 이러한 잎을 발효시켜서, 차 폴리페놀 (카테킨)을 플로바펜(phlobaphene)으로 전환시키고 방향족 고리를 형성시킨다. 폴리페놀 옥시데이트를 포함하는 잎 효소가 차 폴리페놀, 특히 카테닌과 반응함에 따라 발효가 일어난다 [1]. 녹차 생산의 경우, 어린 잎을 산화되게 하지 않는다. 그 대신, 잎을 스팀처리(steaming)하여 산화 효소를 비활성화시킴으로써 차 카테킨을 보존한다.
녹차 잎의 화학 성분으로는 폴리페놀, 메틸크산틴, 아미노산, 유기산, 탄수화물, 단백질, 리그닌, 지질, 엽록소 및 그 밖의 색소, 회분 및 정유(essential oil)가 있다 (표 1 참조) [2,3]. 상업적 및 생물학적 관점에서, 관습적으로 폴리페놀 및 카페인이 그 밖의 성분 보다 중요한 것으로 간주되어 왔다. 그러나, 테아닌, 정유 및 수용성-에탄올 불용성 다당류와 같은 그 밖의 화학 성분이 중요한 생 물학적으로 유리한 효과를 지니는 것으로 최근 밝혀졌다 (하기 개요 부분 참조).
표 1. 녹차 잎의 주요 화학 성분
화학 성분 건조 중량 % --------------------------------------------------------------- 정유 분획 (주로 휘발성 오일) 0.1 폴리페놀 39.0 카테킨 25.0 카테킨 (C) (0.2) 에피카테킨 (2.2) 에피카테킨 갈레이트 (ECG) (1.9) 갈로카테킨 (GC) (8.7) 에피갈로카테킨 갈레이트 (EGCG) (10.9) 에피갈로카테킨 (EGC) (9.7) 카페인산 유도체 흔적량 카페인산 클로로겐산 플라보놀 & 플라보놀 글리코시드 3.0 퀘르세틴 (0.4) 루틴 (1.5) 캠프페롤 (0.5) 그 밖의 페놀산 (탄닌) 12.0 메틸크산틴 3.5 카페인* 3.3 테오브로민 0.1 아미노산 4.0 테아닌 0.6 옥살산* 0.6 다당류 13.0 단당류 4.0 셀룰로오스 7.0 단백질 15.0 유기산 0.5 리그닌 6.0 지질 3.0 엽록소 & 다른 색소 0.5 회분 5.0 --------------------------------------------------------------- *독성
녹차는 질량 건조 중량%로 30 내지 42%의 폴리페놀을 함유한다. 가장 높은 생물학적으로 유리한 활성을 지니는 것으로 또한 보고된 대부분의 이러한 폴리페놀은 "카테킨"으로 알려진 플라보놀이다. 주요 카테킨으로는 (-)-에피갈로카테킨-3- 갈레이트 (EGCG), (-)-에피갈로카테킨 (EGC), (-)-카테킨 갈레이트 (CG), 및 에피카테킨 (EC)가 있다. 최대 농도는 감소하는 순서로 EGCG에 이어 EGC, ECG, EC의 순이다. (+)-갈로카테킨 (GC), (-)-갈로카테킨 갈레이트 (GCG), (-)-카테킨 갈레이트 (CG) 및 (+)-카테킨 (C)을 포함하는 그 밖의 카테킨이 소량으로 존재한다. 카테킨의 다수의 유리한 생물학적 효과가 연구되었다. 이러한 효과로는 산화방지 활성, 항돌연변이 효과, 항암 효과, 니트로소화(nitrosation) 억제, 및 정상 세포가 아닌 종양 및 무한증식 세포의 성장 억제 작용이 있다. 그러나, 그 밖의 화학 성분 군 또한 생물학적으로 유리한 효과를 나타낸다. 예를 들어, 정유 (EO) 화학 성분은 산화방지 활성, 항히스타민 활성, 항균 활성, 항바이러스 활성, 항암 활성, 면역 증강 활성, 혈당강하 활성, 지질감소 활성, 항염증 활성, 항피부염 활성, 항여드름 활성, 및 항죽상경화증 활성을 지닌다. 테아닌 (T)은 불안 감소 및 기분 고양 (mood enhancing) 활성, 인지력 향상 활성, 항암 활성, 뇌허혈 및 뇌졸중에 대한 신경보호, 및 체중 감소 활성을 지닌다. 또한, 녹차 다당류 (P)는 산화방지 및 산소 자유 라디칼 소거 활성, 항당뇨병 활성 및 면역 증강 활성을 지닌다.
녹차의 화학 성분의 치료적 가치를 간단히 요약하기 위해, 최근 학술 조사 및 임상 실험은 다음과 같은 것들을 포함하는 녹차의 다양한 화합물, 화학 분획 및 조야한(gross) 추출 생성물의 하기 치료적 효과를 입증하였다: 강력한 산화방지, 산소 자유 라디칼 소거, 및 니트로소화 억제 (EO, 카테킨-주로 ECGC & ECG, P, 추출물) [4-7]; 항돌연변이 활성 (EO, 카테킨, 추출물) [7-12]; 정상 세포에는 영향을 미치지 않는 항암 활성 (EO, 카테킨, T, 추출물) [7-13]; 피부 보호 (EO, 카테 킨, P, 추출물) [8, 10, 11, 14, 15]; 항심혈관질병 (EO, 카테킨, 추출물) [4-7, 16,17]; 항고지질혈증 (추출물) [16]; 항뇌졸중 및 뇌 보호 (EO, 카테킨, T, P, 추출물) [18, 19]; 항치주질병 (추출물) [20]; 항골다공증 (추출물) [21]; 면역 증강 (추출물) [22]; 항바이러스, 항-HIV, 및 항균 (EO, 카테킨, 추출물) [23]; 체중 감소 및 열발생 (카테킨, 카페인, T, 추출물) [23,24]; 노화방지 (카테킨-ECGC, 추출물) [23]; 불안 감소, 기분 고양, 및 인지력 향상 (T, 추출물) [25,26]; 및 항당뇨병 (P, 추출물) [27].
녹차가 매우 고용량에서 일반적으로 안전하고 비독성이지만, 녹차 음료 및 의약품 소비에 따른 한 가지 잠재적인 결과는 심부정맥, 위장 장애 및 지터리니스(jitterness), 범불안장애, 불면증으로 나타나는 카페인 독성과 같은 카페인 관련 장애의 발생이다. 더욱이, 카페인의 과도한 소비는 스트레스 및 스트레스 관련 호르몬 방출을 지나치게 증가시킨다. 카페인을 과도하게 섭취한 경우, 혈압이 상승할 수 있고, 심장발작 및 뇌졸중의 위험이 증가한다.
현재 이용가능한 추출 공정에서 광범위한 선택성이 부족하다는 점에서, 현재 이용가능한 녹차 생성물은 이의 화학적 조성이 의심스럽다. 따라서, 정제된 정유, ECGC 비율이 높은 카테킨, 테아닌 및 다당류 화학 성분 분획과 생성될 수 있는 낮은 카페인 농도가 결합된 신규하고 재현가능한 녹차 추출 조성물로서, 표준화되고 신뢰할 만한 양의 이러한 상승적으로 [14,28] 작용하는 생리학적으로 그리고 의학적으로 유리한 녹차 화학 성분을 지니는 녹차 추출 조성물이 필요한 실정이다.
발명의 개요
한 가지 일면에서, 본 발명은 도 6 내지 25중의 어느 하나의 실시간 직접분석(Direct Analysis in Real Time, DART) 질량 분석 크로마토그램을 갖는 분획을 포함하는 녹차 종(green tea species) 추출물에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 추출물은 정유, 폴리페놀, 다당류 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 정유는 n-헥사데칸산, 테트라데칸산, 9-헥사데카놀, 1-운데카놀, 1-헥사데카놀, 올레일 알코올, 9-옥타데센-1-올, 노나데카놀 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 폴리페놀은 카테킨, 플라바놀, 플라보놀 글리코시드 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 카테킨은 카테킨 (C), 에피카테킨 (EC), 에피카테킨 갈레이트 (ECG), 갈로카테킨 (GC), 에피갈로카테킨 갈레이트 (EGCG), 에피갈로카테킨 (EGC) 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 플라바놀은 퀘르세틴(quercetin) 및 루틴(rutin)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 플라보놀 글리코시드는 캠프페롤(kaempferol)이다. 또 다른 구체예에서, 다당류는 글루코오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 람노오스, 크실로오스 우론산 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 녹차 종은 카페인, 옥살산 또는 탄닌을 실질적으로 비함유한다.
또 다른 구체예에서, 정유의 함량은 2 중량% 이상이다. 또 다른 구체예에서, 정유의 함량은 25 중량% 내지 90 중량%이다. 또 다른 구체예에서, 정유의 함량은 50 중량% 내지 90 중량%이다. 또 다른 구체예에서, 정유의 함량은 75 중량% 내지 90 중량%이다.
또 다른 구체예에서, 폴리페놀의 함량은 40 중량% 이상이다. 또 다른 구체예에서, 폴리페놀의 함량은 50 중량% 내지 90 중량%이다. 또 다른 구체예에서, 정유의 함량은 75 중량% 내지 90 중량%이다.
또 다른 구체예에서, 다당류의 함량은 15 중량% 이상이다. 또 다른 구체예에서, 다당류의 함량은 25 중량% 내지 90 중량%이다. 또 다른 구체예에서, 다당류의 함량은 50 중량% 내지 90 중량%이다. 또 다른 구체예에서, 다당류의 함량은 75 중량% 내지 90 중량%이다.
또 다른 구체예에서, 녹차 종 추출물은 2 중량% 내지 97 중량%의 정유, 15 중량% 내지 98 중량%의 카테킨, 4 중량% 내지 90 중량%의 테아닌, 및 9 중량% 내지 98 중량%의 다당류를 포함한다.
또 다른 일면에서, 본 발명은 본 발명의 녹차 종 추출물을 포함하는 식품 또는 의약에 관한 것이다.
또 다른 일면에서, 본 발명은 a) 녹차 종 식물 물질을 초임계 이산화탄소 추출에 의해 추출하여 정유 분획 및 제 1 잔류물을 수득하는 단계; b) 녹차 종 식물 물질 또는 상기 단계 a)로부터의 제 1 잔류물을 알코올 추출에 의해 추출하여 폴리페놀 분획 및 제 2 잔류물을 얻는 단계; 및 c) 상기 단계 b)로부터의 제 2 잔류물을 물 추출에 의해 추출하고 다당류를 알코올로 침전시켜서 다당류 분획을 수득하는 단계에 의해 녹차 종 식물 물질을 순차적으로 추출함으로써 정유 분획, 폴리페놀 분획 및 다당류 분획을 수득하는 것을 포함하여, 하나 이상의 소정의 특징을 갖는 녹차 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 단계 a)로부터의 제 1 잔류물은 초임계 이산화탄소 추출에 의해 추가로 카페인이 제거된다. 또 다른 구체예에서, 폴리페놀 분획은 친화성 흡착 크로마토그래피에 의해 추가로 정제된다.
또 다른 구체예에서, 단계 a)는, 1) 추출 용기에 분쇄된 녹차 종 식물 물질을 로딩(loading)하는 단계; 2) 초임계 조건하에서 이산화탄소를 첨가하는 단계; 3) 녹차 종 식물 물질과 이산화탄소를 소정의 시간동안 접촉시키는 단계; 및 4) 수집 용기내에 정유 분획을 수집하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 단계 a)는 초임계 이산화탄소 분획 분리 시스템을 사용하여 정유 분획을 분별(fractionation)함에 의해 정유 화합물 비율을 변경시키는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 초임계 조건은 35℃ 내지 90℃에서 60 바아(bar) 내지 800 바아를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 초임계 조건은 40℃ 내지 80℃에서 60 바아 내지 500 바아를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 시간은 30분 내지 2.5시간이다. 또 다른 구체예에서, 시간은 1시간이다.
또 다른 구체예에서, 단계 b)는, 1) 폴리페놀 화학 성분을 추출하기에 충분한 시간 동안 분쇄된 녹차 종 식물 물질 또는 단계 a)부터의 제 1 잔류물을 알코올성 용액과 접촉시키는 단계; 2) 단계 1)로부터의 추출된 폴리페놀 화학 성분의 수용액을 친화성 흡착 수지 컬럼에 통과시켜 폴리페놀 성분을 흡착시키는 단계; 3) 산성 용리 용매를 사용하여 친화성 흡착제로부터 카페인 화합물을 용리하는 단계; 및 4) 히드로-알코올성 용리 용매를 사용하여 친화성 흡착 수지로부터 폴리페놀 화학 성분을 용리하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히드로-알코올성 용액은 에탄올과 물을 포함하여, 여기서 에탄올 농도는 10 내지 95 중량%이다. 또 다른 구체예에서, 히드로-알코올성 용액은 에탄올과 물을 포함하며, 여기서 에탄올 농도는 25 중량% 이다. 또 다른 구체예에서, 단계 1)은 30℃ 내지 100℃에서 수행된다. 또 다른 구체예에서, 단계 1)은 60℃ 내지 100℃에서 수행된다. 또 다른 구체예에서, 시간은 1 내지 10시간이다. 또 다른 구체에에서, 시간은 1 내지 5시간이다. 또 다른 구체예에서, 시간은 2시간이다.
또 다른 구체예에서, 단계 c)는, 1) 다당류를 추출하기에 충분한 시간 동안 단계 b)로부터의 제 2 잔류물을 물과 접촉시키는 단계; 및 2) 알코올 침전에 의해 수용액으로부터 다당류를 침전시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 물은 70℃ 내지 90℃이다. 또 다른 구체예에서, 물은 80℃ 내지 90℃이다. 또 다른 구체예에서, 시간은 1 내지 5시간이다. 또 다른 구체예에서, 시간은 2 내지 4시간이다. 또 다른 구체예에서, 시간은 2시간이다. 또 다른 구체예에서, 알코올은 에탄올이다.
또 다른 일면에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 녹차 종 추출물에 관한 것이다.
또 다른 일면에서, 본 발명은 피로갈롤, 피로갈롤의 25 내지 35 중량%의 테오필린/테오브로민, 피롤갈롤의 0.1 내지 5 중량%의 시킴산(schikimic acid), 피로갈롤의 0.1 내지 5 중량%의 쿠마르산, 및 피로갈롤의 0.1 내지 5 중량%의 3-메톡시-l-티로신을 포함하는 녹차 종 추출물에 관한 것이다.
또 다른 일면에서, 본 발명은 테아닌, 테아닌의 20 내지 30 중량%의 테오필린/테오브로민, 테아닌의 1 내지 10 중량%의 카테킨/에피카테킨, 테아닌의 1 내지 10 중량%의 갈산, 테아닌의 0.1 내지 5 중량%의 카테킨 퀴논, 테아닌의 0.1 내지 5 중량%의 신남알데히드, 및 테아닌의 1 내지 10 중량%의 3-메톡시-l-티로신을 포함하는 녹차 종 추출물에 관한 것이다.
또 다른 일면에서, 본 발명은 테아닌, 테아닌의 45 내지 55 중량%의 테오필린/테오브로민, 테아닌의 1 내지 10 중량%의 카테킨/에피카테킨, 테아닌의 0.1 내지 5 중량%의 카르노스산(carnosic acid), 테아닌의 1 내지 10 중량%의 갈산, 테아닌의 0.5 내지 5 중량%의 카테킨 퀴논, 테아닌의 1 내지 10 중량%의 신남알데히드, 테아닌의 0.1 내지 5 중량%의 메틸 신남산, 테아닌의 1 내지 10 중량%의 신나미드, 및 테아닌의 1 내지 10 중량%의 3-메톡시-l-티로신을 포함하는 녹차 종 추출물에 관한 것이다.
또 다른 일면에서, 본 발명은 피롤갈롤, 피로갈롤의 1 내지 10 중량%의 테오필린/테오브로민, 피로갈롤의 0.1 내지 5 중량%의 테아닌, 피로갈롤의 1 내지 10 중량%의 카테킨/에피카테킨, 피로갈롤의 5 내지 15 중량%의 캠프페롤, 피로갈롤의 0.1 내지 5 중량%의 미리시틴, 피로갈롤의 0.1 내지 5 중량%의 갈로카테킨 퀴논, 피로갈롤의 65 내지 75 중량%의 갈산, 피로갈롤의 0.5 내지 5 중량%의 카테킨 퀴논, 피로갈롤의 1 내지 10 중량%의 바닐산, 및 피로갈롤의 1 내지 5 중량%의 3-메톡시-l-티로신을 포함하는 녹차 종 추출물에 관한 것이다.
또 다른 일면에서, 본 발명은 캠프페롤, 캠프페롤의 1 내지 10 중량%의 테아닌, 캠프페롤의 95 내지 105 중량%의 카테킨/에피카테킨, 캠프페롤의 20 내지 30 중량%의 퀘르세틴, 캠프페롤의 5 내지 15 중량%의 미리시틴, 캠프페롤의 5 내지 10 중량%의 갈로카테킨 퀴논, 캠프페롤의 55 내지 65 중량%의 갈산, 캠프페롤의 1 내지 10 중량%의 카테킨 퀴논, 캠프페롤의 10 내지 20 중량%의 쿠마르산, 캠프페롤의 1 내지 10 중량%의 바닐산, 및 캠프페롤의 15 내지 25 중량%의 3-메톡시-l-티로신을 포함하는 녹차 종 추출물에 관한 것이다.
또 다른 일면에서, 본 발명은 피로갈롤, 피로갈롤의 0.5 내지 5 중량%의 테오필린/테오브로민, 피로갈롤의 95 내지 105 중량%의 카테킨/에피카테킨, 피로갈롤의 55 내지 65 중량%의 캠프페롤, 피로갈롤의 20 내지 30 중량%의 퀘르세틴, 피로갈롤의 10 내지 20 중량%의 미리시틴, 피로갈롤의 20 내지 30 중량%의 갈로카테킨 퀴논, 피로갈롤의 50 내지 60 중량%의 갈산, 피로갈롤의 15 내지 25 중량%의 카테킨 퀴논, 피로갈롤의 15 내지 25 중량%의 쿠마르산, 피로갈롤의 1 내지 10 중량%의 바닐산, 및 피로갈롤의 0.5 내지 5 중량%의 3-메톡시-l-티로신을 포함하는 녹차 종 추출물에 관한 것이다.
또 다른 일면에서, 본 발명은 피로갈롤, 피로갈롤의 0.5 내지 5 중량%의 테오필린/테오브로민, 피로갈롤의 95 내지 105 중량%의 카테킨/에피카테킨, 피로갈롤의 55 내지 65 중량%의 캠프페롤, 피로갈롤의 20 내지 30 중량%의 퀘르세틴, 피로갈롤의 10 내지 20 중량%의 미리시틴, 피로갈롤의 20 내지 30 중량%의 갈로카테킨 퀴논, 피로갈롤의 50 내지 60 중량%의 갈산, 피로갈롤의 15 내지 25 중량%의 카테킨 퀴논, 피로갈롤의 15 내지 25 중량%의 쿠마르산, 피로갈롤의 1 내지 10 중량%의 바닐산, 및 피로갈롤의 0.5 내지 5 중량%의 3-메톡시-l-티로신을 포함하는 녹차 종 추출물에 관한 것이다.
또 다른 일면에서, 본 발명은 피로갈롤, 피로갈롤의 중량의 테아닌, 피로갈롤의 90 내지 100 중량%의 카테킨/에피카테킨, 피로갈롤의 65 내지 75 중량%의 캠프페롤, 피로갈롤의 15 내지 25 중량%의 퀘르세틴, 피로갈롤의 5 내지 15 중량%의 미리시틴, 피로갈롤의 5 내지 15 중량%의 갈로카테킨 퀴논, 피로갈롤의 65 내지 75 중량%의 갈산, 피로갈롤의 5 내지 15 중량%의 카테킨 퀴논, 피로갈롤의 10 내지 20 중량%의 쿠마르산, 피로갈롤의 1 내지 10 중량%의 바닐산, 및 피로갈롤의 1 내지 10 중량%의 3-메톡시-l-티로신을 포함하는 녹차 종 추출물에 관한 것이다.
본 발명의 추출물은 비제한적으로 산화방지 활성, 산소 자유 라디칼 소거, 니트로소화 억제, 항돌연변이 활성 (암 예방), 항암 활성 (암 치료), 피부 보호, 노화방지, 항심혈관질병, 항뇌졸중 및 치료, 뇌 보호, 항고지질혈증, 항치주질병, 항골다공증, 면역 증강, 항바이러스, 항-HIV 및 항균 활성, 항진균 활성, 항바이러스 활성, 체중 조절 및 열발생, 항당뇨병, 및 불안 감소, 기분 고양 및 인지력 향상을 포함하는 생리학적 및 의학적 효과를 제공하는 데에 있어서 유용하다.
본 발명의 이러한 구체예, 그 밖의 구체예 및 이들의 특징은 하기 상세한 설명, 도면 및 청구의 범위로부터 명백해진다.
도 1은 본 발명에 따른 정유의 초임계 이산화탄소 추출 (단계 1) 및 녹차의 카페인제거 (단계 2)의 예시적 개략도를 도시한다.
도 2는 본 발명에 따른 미정제 녹차 카테킨 화학 성분 분획의 에탄올 추출의 예시적 개략도이다.
도 3은 본 발명에 따른 친화성 흡착 추출 공정의 예시적 개략도이다.
도 4는 본 발명에 따른 L-테아닌 및 다당류에 대한 물 침출 추출(leaching extraction)의 예시적 개략도이다.
도 5는 본 발명에 따른 L-테아닌 및 다당류의 정제의 예시적 개략도이다.
도 6은 본 발명의 방법의 단계 6으로부터의 녹차 다당류 분획에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (양이온 모드).
도 7은 본 발명의 방법의 단계 6으로부터의 녹차 다당류 분획에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (음이온 모드).
도 8은 본 발명의 방법의 단계 6으로부터의 녹차 다당류 분획에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (양이온 모드).
도 9는 본 발명의 방법의 단계 6으로부터의 녹차 다당류 분획에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (음이온 모드).
도 10은 본 발명의 방법의 단계 6으로부터의 녹차 다당류 분획에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (양이온 모드).
도 11은 본 발명의 방법의 단계 6으로부터의 녹차 다당류 분획에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (음이온 모드).
도 12는 시판되는 녹차 (Kai Hua Long Ding)에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙 트럼을 도시한다 (양이온 모드).
도 13은 본 발명의 방법의 단계 3으로부터의 95% 에탄올 침출에 의한 녹차 미정제 추출물에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (양이온 모드).
도 14는 XAD 7HP 탈착 충전(packing) 물질을 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의한 본 발명의 방법의 단계 4로부터의 녹차 페놀산 공급물에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (양이온 모드).
도 15는 XAD 7HP 탈착 충전 물질을 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의한 본 발명의 방법의 단계 4로부터의 녹차 정제된 F2 분획에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (양이온 모드).
도 16은 XAD 7HP 탈착 충전 물질을 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의한 본 발명의 방법의 단계 4로부터의 녹차 정제된 F3 분획에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (양이온 모드).
도 17은 XAD 7HP 탈착 충전 물질을 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의한 본 발명의 방법의 단계 4로부터의 녹차 정제된 F4 분획에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (양이온 모드).
도 18은 XAD 7HP 탈착 충전 물질을 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의한 본 발명의 방법의 단계 4로부터의 녹차 정제된 F5 분획에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (양이온 모드).
도 19는 시판되는 녹차 (Kai Hua Long Ding)에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (음이온 모드).
도 20은 본 발명의 방법의 단계 3으로부터의 95% 에탄올 침출에 의한 녹차 미정제 추출물에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (음이온 모드).
도 21은 XAD 7HP 탈착 충전 물질을 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의한 본 발명의 방법의 단계 4로부터의 녹차 페놀산 공급물에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (음이온 모드).
도 22는 XAD 7HP 탈착 충전 물질을 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의한 본 발명의 방법의 단계 4로부터의 녹차 정제된 F2 분획에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (음이온 모드).
도 23은 XAD 7HP 탈착 충전 물질을 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의한 본 발명의 방법의 단계 4로부터의 녹차 정제된 F3 분획에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (음이온 모드).
도 24는 XAD 7HP 탈착 충전 물질을 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의한 본 발명의 방법의 단계 4로부터의 녹차 정제된 F4 분획에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (음이온 모드).
도 25는 XAD 7HP 탈착 충전 물질을 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의한 본 발명의 방법의 단계 4로부터의 녹차 정제된 F5 분획에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 도시한다 (음이온 모드).
발명의 상세한 설명
정의
단수 용어는 본 명세서에서 한개 또는 한개를 초과하는 (즉, 적어도 한개의) 대상을 칭하는 것이다. 예를 들어, "구성요소(element)"는 하나의 구성요소 또는 하나를 초과하는 구성요소를 의미한다.
본원에 사용되는 "공중부(aerial part)"라 함은 잎과 줄기를 포함하는 카멜리아 시넨시스의 구성부를 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "카테킨 분획"은 녹차로부터 수득되거나 유래되는 수용성이고 에탄올 가용성인 카테킨 화합물을 포함하며, 비제한적으로 ECGC, EGC, ECG, EC, GC, GCC, GC 및 C와 같은 화합물을 추가로 포함한다.
용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 포괄적이고 개방 의미로 사용되는 것으로, 추가 구성요소가 포함될 수 있음을 의미한다.
용어 "이루어지는"은 구성요소를 대개 이와 관련된 불순물을 제외하고 기술된 것들로 제한하는데 사용된다.
용어 "필수적으로 포함하는(consisting essentially of)"은 구성요소를 기술된 것, 및 물질 또는 단계의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치치 않는 것으로 제한하는데 사용된다.
본원에 사용되는 용어 "카페인이 제거된"은 녹차 잎 식물 물질에서 발견되는 농도 보다 낮은 카페인 농도를 지닌 녹차 추출 조성물을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 요망되는 생물학적 반응을 도출하는데 필요한 양을 칭하는 것이다. 당업자에게 인식되는 바와 같이, 복합 물질 또는 생체활성 물질의 유효량은 요망되는 생물학적 종점, 전달되는 생체활성 물질, 캡슐화 매트릭스의 조성, 표적 조직 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "정유 분획(essential oil fraction)"은 녹차로부터 수득되거나 유래되는 지용성이고 수불용성인 화합물을 포함하며, 이의 예로는 비제한적으로 n-헥사데칸산, 테트라데칸산, 9-헥사데카놀, E, 올레일 알코올, 1-옥타데카놀, 피톨(phytol) 및 디히드로악티니디올리드(dihydroactinidiolide)로 분류되는 화합물이 있다.
본원에서 사용되는 용어 "공급원료(feedstock)"는 일반적으로 전체 식물 자체를 포함하거나 비제한적으로 주뿌리(main root), 말단 뿌리(tail root) 및 수염 뿌리(fiber root), 줄기, 잎, 씨 및 꽃을 포함하는 잎, 뿌리를 포함하는 식물의 하나 이상의 구성부와 함께 가공되지 않은 식물 물질(raw plant material)을 말하며, 여기서, 식물 또는 구성부는 미가공되거나, 건조되거나, 스팀처리되거나, 가열되거나, 처리를 용이하게 하기 위해 다른 방식으로 물리적 처리된 물질을 포함할 수 있으며, 온전하거나, 절단되거나, 다져지거나, 썰리거나, 분쇄되거나, 식물 물질의 크기 및 물리적 완전성에 영향을 미치도록 다른 방식으로 처리된 물질을 추가로 포함할 수 있다. 경우에 따라, "공급원료"라는 용어는 추가의 추출 공정을 위한 공급원으로 사용하고자 하는 추출 생성물을 특성화하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "분획(fraction)"은 특정한 물리적 성질, 화학적 성질, 또는 물리적 또는 화학적 성질에 의해 특징화되는 특정 그룹의 화합물을 포함하는 추출 조성물을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "녹차"는 카멜리아 시넨시스 식물종으로부터 유래된 잎 또는 공중부 식물 물질을 의미한다. 또한, 녹차라는 용어는 카멜리아 시넨시스 종과 상호교환적으로 사용되며, 이러한 식물, 클론(clone), 변이체(variant) 및 변종(sport) 등을 의미한다. 녹차는 녹차 잎을 생성하도록 처리된 카멜리아 시넨시스 종 식물 물질의 통상적인 추출 생성물에 대한 약명(pharmaceutical name)이다.
본원에서 사용되는 용어 "녹차 성분"은 녹차 종에서 발견되는 화합물을 의미할 수 있고, 상기 확인된 모든 화합물 뿐만 아니라 비제한적으로 정유 화학 성분, 카테킨, 테아닌 및 다당류를 포함하는 녹차 종에서 발견되는 다른 화합물도 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "하나 이상의 화합물"은 n-헥사데칸산 (녹차의 지용성 정유 화학 성분), 또는 ECGC (녹차의 수용성이고 물-에탄올 가용성인 카테킨), 또는 테아닌 (녹차의 수용성 아미노산) 또는 녹차의 수용성-에탄올 불용성 다당류 분자와 같은 적어도 하나의 화합물을 의미하거나, n-헥사데칸산 및 ECGC와 같은 하나 이상의 화합물을 의미한다. 당 분야에 알려진 바와 같이, 용어 "화합물"은 하나의 분자를 의미하지 않고, 하나 이상의 화합물을 의미할 수 있다. 당 분야에 알려진 바와 같이, "화합물"이란 용어는 독특한 화학적 및 물리적 특성을 지닌 특정 화학 성분을 의미하며, "화합물(들)"은 하나 이상의 화학 성분을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "다당류 분획"은 녹차로부터 수득되거나 유래되는 수용성-에탄올 불용성 다당류 화합물을 포함한다. 다당류의 비제한적 예로는 글루코오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 람노오스, 크실로오스 우론산 및 이들의 조합물이 있다.
녹차의 다른 화학 성분이 또한 이러한 추출 분획에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "프로파일"은 추출 분획내의 화합물의 질량 중량% 비율 또는 최종 녹차 추출 조성물 중의 각각의 4개의 녹차 분획 화학 성분의 질량 중량% 비율을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "정제된" 분획 또는 조성물은 분획 또는 조성물의 화학 성분이 50% 이상으로 농축된 특정 물리-화학적 성질 또는 물리적 성질 또는 화학적 성질에 의해 특징화되는 특정 그룹의 화학물을 포함하는 분획 또는 조성물을 의미한다. 다시 말해서, 정제된 분획 또는 조성물은 분획 또는 조성물을 규정하는 특정의 요망되는 물리-화학적 성질, 또는 물리적 또는 화학적 성질에 의해 특징화되지 않은 50% 미만의 화학 성분을 포함한다.
용어 "상승적(synergistic)"은 당업계에 인식되어 있고, 전체 효과가 성분들의 총합 보다 크도록 두개 이상의 성분들이 함께 작용하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "테아닌 분획"은 녹차로부터 수득되거나 유래되는 아미노산인 수용성 테아닌을 포함한다.
용어 "치료(treating)"는 당업계에 인식되어 있고, 임의의 질병 또는 질환의 적어도 하나의 증상을 치료할 뿐만 아니라 완화시키는 것을 의미한다.
추출물
본 발명은 하나 이상의 녹차 공급원료로부터의 정유, 카테킨, 테아닌 및 다당류의 단리되고 정제된 분획의 추출물을 포함한다. 이러한 개개의 분획은 유리한 배합물을 제공하도록 특정 비율 (프로파일)로 배합될 수 있어서, 현재 공지된 추출 생성물에서 발견되지 않는 추출 생성물을 제공할 수 있다. 예를 들어, 하나의 종 으로부터의 정유 분획이 동일하거나 상이한 종으로부터의 카테킨 분획과 배합될 수 있고, 이러한 배합물은 동일하거나 상이한 녹차 공급원료 물질로부터의 테아닌 분획 또는 다당류 분획과 배합되거나 배합되지 않을 수 있다. 이러한 추출물은 정유, 카테킨, 테아닌 또는 다당류 분획 중 하나 이상의 소정량을 지닌 분획을 포함한다. 구체예는 옥살산을 비함유하는 녹차의 추출물을 포함한다. 구체예는 카페인이 제거된 녹차의 추출물을 포함한다.
추가의 구체예는 본래의 식물 물질에서 발견되는 프로파일 또는 현재 이용가능한 녹차 추출 생성물에 비해 녹차의 화학 성분의 프로파일 (비율 분포)이 변경된 추출물을 포함한다. 예를 들어, 정유 분획 농도는 카테킨 및/또는 테아닌 및/또는 다당류 농도에 비해 증가되거나 감소될 수 있다. 유사하게, 특정한 생물학적 효과를 위한 신규한 성분 화학 프로파일 조성물을 제공하도록 카테킨 또는 테아닌 또는 다당류가 다른 추출물 성분 분획에 비해 증가되거나 감소될 수 있다.
한 가지 구체예에서, 본 발명의 추출물은 2 질량 중량% 이상의 정유 화학 성분을 포함할 수 있다. 이러한 추출물의 또 다른 구체예는 소정의 카테킨 농도를 포함하는데, 여기서 카테킨 농도는 본래의 식물 물질 또는 통상적인 녹차 종 추출물에서 발견되는 농도 보다 높다. 예를 들어, 추출물은 추출물의 30 질량 중량% 이상의 농도로 신규한 녹차 카테킨을 포함할 수 있다. 이러한 추출물의 또 다른 구체예는 본래의 식물 물질 또는 현재 이용가능한 추출 생성물의 천연 녹차 L-테아닌의 농도 보다 높은 2 질량 중량% 이상의 L-테아닌 농도를 포함할 수 있다.
개개의 녹차 종의 유리한 화학 성분의 농도 관계 (화학적 프로파일)의 변경 은 특정한 인간 질병 또는 질환을 위해 설계되는 독특하거나 신규한 녹차 종 추출 생성물을 제조할 수 있게 한다. 예를 들어, 산화방지, 산소 자유 라디칼 소거 및 니트로소화 억제 활성을 위한 신규하고 강력한 녹차 조성물은 본래의 녹차 식물 물질 또는 통상의 공지된 추출 생성물에서 발견되는 농도에 비해 질량 중량% 기준으로 보다 많은 정제된 정유, 카테킨, 및 다당류 조성 및 감소된 L-테아닌 조성을 지닐 수 있다. 대조적으로, 암 예방을 위한 녹차 추출물은 본래의 녹차 식물 물질 또는 통상의 공지된 추출 생성물에서 발견되는 농도에 비해 질량 중량% 기준으로 보다 많은 정제된 정유 및 카테킨 분획 및 감소된 L-테아닌 및 다당류 분획을 지닐 수 있다. 항뇌졸중 및 뇌 보호를 위한 신규한 녹차 추출물 프로파일의 또 다른 예는 본래의 녹차 식물 물질 또는 통상의 공지된 추출 생성물에서 발견되는 농도에 비해 질량 중량% 기준으로 보다 많은 정제된 정유, 카테닌, L-테아닌 및 다당류 조성을 지니는 추출물 프로파일일 수 있다. 노화 방지 활성의 경우, 본래의 녹차 식물 물질 또는 통상의 추출 생성물에서 발견되는 농도에 비해 질량 중량%를 기준으로 높은 카테킨 분획 및 감소된 정유, 테아닌 및 다당류 분획이 바람직할 수 있다. 대조적으로, 불안 감소, 기분 고양 및 인지력 향상의 경우, 본래의 녹차 식물 물질 또는 통상의 추출 생성물에서 발견되는 농도에 비해 질량 중량%를 기준으로 보다 많은 정제된 테아닌 분획 및 감소된 정유, 카테킨 및 다당류 분획이 최적 조성 생성물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 카테킨 화학 성분의 신규한 하위분획(sub-fraction)을 포함하는 추출물이며, 여기서 전체 카테킨은 고도로 정제되고 (예를 들어, 95 질량 중량% 초과), ECGC와 같은 고도로 생체활성인 특정 카테킨 화합물의 농도는 나머지 카테킨 화합물에 비해 증가된 농도를 지닌다 (프로파일링(profiling)된 하위분획). 이러한 신규하고 정제된 카테킨 하위분획 추출물은 단독으로 사용되거나 다른 녹차 정제된 분획, 다른 식물성 화학 성분 또는 약학용 화합물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 신규한 카테킨 하위분획은 암 및 노화를 예방하기 위해 현저히 유리할 수 있다.
본 발명의 방법은 인간 질환의 치료 및 예방을 위한 신규한 녹차 추출물을 제공하는 것을 포함한다. 예를 들어, 산화방지 활성 및 심혈관 보호를 위한 신규한 녹차 추출물은 본래의 녹차 식물 물질 또는 통상의 공지된 추출 생성물에서 발견되는 농도에 비해 중량%를 기준으로 증가된 카테킨 분획 농도, 증가된 정유 분획 농도, 감소된 테아닌 농도, 및 증가된 다당류 분획 농도를 지닐 수 있다. 뇌졸중 예방 및 치료를 위한 신규한 녹차 종 추출물은 본래의 녹차 식물 물질 또는 통상의 공지된 추출 생성물에서 발견되는 농도에 비해 중량%를 기준으로 증가된 카테킨 분획, 정유 분획, 테아닌 분획 및 다당류 분획 농도를 지닐 수 있다. 불안 및 우울증의 치료를 위한 신규한 녹차 추출물의 또 다른 예는 본래의 녹차 식물 물질 또는 공지된 추출 생성물에서 발견되는 농도에 비해 증가된 테아닌 분획 농도 및 감소된 정유 분획, 및 감소된 카테킨 농도, 및 감소된 다당류 분획을 지닌 조성물을 포함한다.
천연 녹차와 관련된 추출물
구체예는 본래의 녹차 식물 물질 또는 현재 이용가능한 추출 생성물에서 발 견되는 농도에 비해 높은 함량으로 존재하는 정유, 카테킨, 테아닌, 또는 다당류 농도 중 하나 이상을 지닌 녹차의 추출물을 포함한다. 또한, 구체예는 정유, 카테킨, 테아닌 또는 다당류를 포함하는 분획 중 하나 이상이 본래의 녹차 식물 물질에서 발견되는 농도 보다 높은 농도로 발견되는 조성물을 포함한다. 또한, 구체예는 정유, 카테킨, 테아닌 또는 다당류를 포함하는 분획 중 하나 이상이 본래의 녹차 식물 물질에서 발견되는 농도 보다 낮은 농도로 발견되는 추출물을 포함한다. 녹차의 생체활성 화학 성분 분획의 공지된 함량 (표 1)이 본 발명의 예로서 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 추출물은 정유의 농도가 본래의 녹차 식물 물질 농도의 0.001 내지 200배인 분획, 및/또는 카테킨의 농도가 본래의 녹차 식물 물질 농도의 0.001 내지 4배인 조성물, 및/또는 테아닌의 농도가 본래의 녹차 식물 물질 농도의 0.001 내지 200배인 추출물, 및/또는 다당류의 농도가 본래의 녹차 식물 물질 농도의 0.001 내지 40배인 추출물, 및/또는 카페인의 농도가 본래의 녹차 식물 물질의 농도의 0.001 내지 0.99배인 추출물을 포함한다. 본 발명의 추출물은 정유의 농도가 본래의 녹차 농도의 0.01 내지 200배인 분획, 및/또는 카테킨의 농도가 본래의 녹차의 0.01 내지 4배인 추출물, 및/또는 테아닌의 농도가 본래의 녹차 농도의 0.01 내지 200배인 추출물, 및/또는 다당류의 농도가 본래의 녹차 식물 물질 농도의 0.01 내지 40배인 추출물을 포함한다. 또한, 본 발명의 추출물은 본래의 녹차 식물 물질 카테킨 화학 성분에서 발견되는 농도 보다 높거나 낮은 함량으로 존재하는 본래의 식물 물질 카테킨 화학 성분에 존재하는 적어도 하나 이상의 화합물을 지닌 카테킨 화학 성분의 하위분획을 포함한다. 예를 들어, 화합물 ECGC는 카테킨 하위분획이 본래의 녹차 식물 물질 중의 전체 카테킨 화학 성분의 50% 질량 중량%의 이의 농도로부터 하위분획에서 60% 질량 중량%로 증가된 농도를 지닐 수 있다. 대조적으로, C는 카테킨 하위분획이 본래의 식물 물질 중의 전체 카테킨 화학 성분의 2.2% 질량 중량%의 이의 농도로부터 하위분획의 0.1% 질량 중량% 미만으로 감소된 농도를 지닐 수 있다. 본 발명의 추출물은 이러한 신규한 카테킨 하위분획 중의 특정 화합물의 농도가 본래의 녹차 카테킨 화학 성분에서 발견되는 농도에 비해 약 1.1 내지 약 2배 증가하거나 약 0.1 내지 100배 감소한 추출물을 포함한다.
이러한 추출물의 또 다른 구체예는 천연 녹차 종 건조된 식물 물질 또는 통상의 녹차 종 추출 생성물에서 발견되는 농도에 비해 실질적으로 증가된 소정의 다당류 농도를 포함한다. 예를 들어, 추출물은 추출물의 3 질량 중량% 이상의 수용성이고 에탄올 불용성인 다당류 분획을 포함할 수 있다. 또한, 구체예는 정유 화합물, 카테킨, L-테아닌 또는 다당류를 포함하는 하나 이상의 분획이 본래의 녹차 식물 물질에서 발견되는 농도 보다 낮은 농도로 발견되는 추출물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 추출물은 정유가 본래의 녹차 식물 물질 농도의 0.001 내지 100배인 추출물, 및/또는 카테킨의 농도가 본래의 녹차 식물 물질 농도의 0.001 내지 14배인 추출물, 및/또는 L-테아닌의 농도가 본래의 녹차 식물 물질 농도의 0.001 내지 100배인 추출물, 및/또는 다당류 농도가 본래의 녹차 식물 물질 농도의 0.001 내지 80배인 추출물을 포함한다. 배합된 추출물을 제조하는 경우, 약 0.001mg 내지 약 200mg의 정유 분획이 사용될 수 있다. 또한, 약 0.001mg 내지 약 500mg의 정제된 카테킨 분획이 사용될 수 있다. 또한, 약 0.001mg 내지 약 500mg 의 정제된 L-테아닌 분획이 사용될 수 있다. 마지막으로, 약 0.001mg 내지 약 500mg의 수용성이고 에탄올 불용성인 다당류 분획이 사용될 수 있다.
추출물의 순도
하기 본 발명에 교시된 방법은 정유 분획, 카테킨 분획, 카테킨 하위분획, L-테아닌 분획 및 다당류 분획의 정제 (농축) 뿐만 아니라 카테킨, L-테아닌 및 다당류 분획의 카페인제거를 가능하게 한다. 요망되는 화학 성분의 89 질량 중량%의 높은 정유 분획 순도가 정제된 분획 중의 주요 비정유(non-essential oil) 성분으로서 카페인을 함유한 상태로 달성될 수 있다. SCCO2는 녹차 공급원료에서 카페인을 제거하기 위한 우수한 수단인 것으로 입증되었는데, 이는 공급원료 물질에서 약 85 질량 중량%의 카페인을 제거한다. 카테킨 분획의 공정 크로마토그래피 정제의 하위분획 모두를 합친 경우, 합쳐진 추출물의 63 내지 68 질량 중량%의 전체 카테킨 순도가 수득될 수 있으며, ECGC 농도 (프로파일)는 전체 카테킨의 질량 중량을 기준으로 57 내지 69%이다. 선택된 친화성 흡착 공정 크로마토그래피 용리 하위분획을 합친 경우, 카테킨 하위분획의 91 내지 99 질량 중량%의 전체 카테킨 순도를 포함하는 고도로 정제된 카테킨 하위분획이 적당히 고수율로 용이하게 수득되며, ECGC 농도는 전체 카테킨의 62 내지 70 질량 중량%이다. 수율을 포기하는 경우, 보다 높은 수준의 전체 카테킨 순도 및 ECGC 농도를 포함하는 하위분획이 수득될 수 있다. 분획의 90 질량 중량%의 L-테아닌 농도를 포함하는 정제된 L-테아닌 분획 및 분획의 90 질량 중량% 이상의 다당류 농도를 포함하는 정제된 다당류 분획이 본 발명에 교시된 방법을 이용하여 또한 고수율로 수득된다. 사용되는 특정한 추 출 환경, 추출 속도, 용매 및 추출 기술은 원료 물질의 출발 화학 성분 프로파일 및 최종 추출 생성물에서 요망되는 정제 수준에 좌우된다. 본 발명에 교시된 특정 방법은 단지 특정한 특징을 지닌 산출 물질로 처리되는 출발 물질의 특징의 샘플 변화를 초래하도록 공정을 조정하는 데에 전형적인 정례적 실험을 이용하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 녹차 종 식물 물질의 특정 로트(lot)에서, 정유 화학 성분, 카페인, 카테킨, L-테아닌 및 다당류의 초기 농도는 본 발명에 교시된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 측정된다. 당업자는 최종 녹차 종 조성물 생성물에서 요망되는 농도에 도달하도록 본원에 기재된 추출 방법을 이용하여 카테킨 성분의 초기 농도로부터 예를 들어 최종 추출 생성물에 대한 카테킨 화학 성분의 소정량까지의 변화량을 측정할 수 있다. 유사하게, 이러한 변화는 카페인제거 수준에 대해 그리고 정유 화합물, L-테아닌 및 다당류 분획 조성에 대해 이루어질 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 방법 및 조성물은 소정의 특징을 지닌 추출된 녹차 종 조성물을 제조하기 위한 방법을 포함한다. 이러한 추출된 녹차 종 조성물은 주어진 생성물에 대해 요망되는 유리한 생물학적 효과(들)에 따라 4개의 농축된 추출 분획 중 어느 1개, 2개, 3개 또는 4개 모두를 포함할 수 있다. 전형적으로, 4개의 정제된 녹차 종 추출 분획 모두를 함유하는 조성물이 일반적으로 바람직한데, 이는 이러한 신규한 조성물이 본래의 식물 물질에서 발견되는 주요한 생물학적으로 유리한 화학 성분 4개 모두를 함유하는 최초의 고도로 정제된 녹차 종 추출 생성물을 나타내기 때문이다. 본 발명의 구체예는 소정의 특징이 별개의 추출 분획에서 녹 차 종의 정유 화합물, 카테킨, L-테아닌 및 다당류의 소정의 선택적으로 증가된 농도를 포함하는 방법을 포함한다. 최종 조성물에서 생물학적으로 유리한 화학 성분 그룹 4개 모두를 지니는 것의 중요성은 고도로 정제된 하나의 화합물 또는 관련 화합물의 그룹과 관련하여 발견되는 효과에 비해 녹차 화학 성분의 요망되는 생리학적 및 의학적 효과를 향상시키는 데에 있어서 이들 화합물의 상승적 상호작용과 관련된다.
추출 방법
추출을 위한 출발 물질은 하나 이상의 카멜리아 시넨시스 종으로부터의 식물 물질이다. 식물 물질은 식물의 임의의 부분일 수 있지만, 잎, 줄기 또는 그 밖의 식물 부분을 포함하는 식물의 공중부가 바람직하다. 잎이 가장 바람직한 출발 물질이다.
카멜리아 시넨시스 종 식물 물질은 이러한 물질이 임의의 특정한 형태가 되게 하기 위해 예비추출(pre-extraction) 단계를 거칠 수 있고, 추출에 유용한 임의의 형태가 본 발명에 의해 고려된다. 카멜리아 시넨시스 잎 물질은 녹차 제조를 위해 카테킨을 플로브펜(phlobphene)으로 전환시키는 효소를 비활성화시키도록 바람직하게는 스팀처리된다. 이러한 예비추출 단계는 비제한적으로 물질이 절단되거나, 다져지거나, 썰리거나, 파쇄되거나, 분쇄되거나, 분말화되거나, 절단되거나, 찢겨지고, 출발 물질이 예비추출 단계 전에 건조되거나 새로운 식물 물질인 단계를 포함한다. 바람직한 예비추출 단계는 카멜리아 시넨시스 종 잎 물질을 미세한 분말로 분쇄시키고/거나 분말화시키는 것을 포함한다. 출발 물질 또는 물질은 예비 추출 단계 후에 건조되거나 이에 수분이 첨가될 수 있다. 녹차 식물 물질이 추출을 위한 형태로 존재하는 경우, 본 발명에 의한 추출 방법이 고려된다.
일반적으로, 본 발명의 방법은 부분적으로 녹차 식물 물질이 초임계 이산화탄소 (SCCO2)로도 일컬어지는 초임계 유체 추출 (SFE)에 이어 비제한적으로 물, 히드로알코올 및 친화성 중합체 흡착 추출 공정과 같은 하나 이상의 용매 추출 단계를 이용하여 추출되는 방법을 포함한다. 본 발명을 위해 고려되는 추가의 다른 방법은 그 밖의 유기 용매, 냉각제(refrigerant) 화학물질, 압축성 가스, 초음파, 가압 액체 추출, 고속 역류 크로마토그래피, 분자 각인된 중합체(molecular imprinted polymer), 및 그 밖의 공지된 추출 방법을 이용하여 녹차 식물 물질을 추출하는 것을 포함한다. 이러한 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 한 가지 일면에서, 본 발명의 조성물은 도 1 내지 5에 개략적으로 도시된 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 SCCO2 기술을 이용하여 녹차 식물 물질로부터 정유 및 그 밖의 지용성 화합물을 농축 (정제)하고 프로파일링하기 위한 방법을 포함한다. 본 발명은 SCCO2 처리를 이용하여 녹차 식물 물질을 카페인 제거하는 것을 포함한다. 본 발명에 교시된 바와 같이 SCCO2를 이용하여 녹차 식물 물질의 정유 화학 성분을 추출하고 녹차 식물 물질을 카페인 제거하는 경우 독성 유기 용매를 사용하는 것이 배제된다. 이산화탄소는 천연의 안전한 생물학적 생성물이며, 다수의 식품 및 음료의 성분이다.
정유는 향수 산업, 약학 분야 및 식품과 인간 영양학 분야에서 널리 사용되는 방향성 물질이다. 이는 기본적으로 휘발성 분획과 비휘발성 잔류물의 2개 분획으로 분류될 수 있는 200개 이상의 화합물의 혼합물이며, 여기서 휘발성 분획은 전체 정유의 90 내지 95%를 차지하며 모노테르펜(monoterpene)과 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 탄화수소 및 이들의 산소화된 유도체를 지방족 알데히드와 함께 함유하고, 비휘발성 잔류물은 전체 정유의 5 내지 10%를 차지하며 탄화수소, 지방산, 스테롤, 카로테로이드, 왁스, 쿠마린, 소랄린(psoraline) 및 플라보노이드를 함유한다.
정유의 단리, 농축 및 정제는 이러한 화합물의 광범위한 사용의 결과로써 수 년간 중요한 공정이 되어 왔다. 지금까지 사용되는 일반적인 방법은 주로 용매 추출 및 스팀 증류를 기초로 하고 있다. 이러한 통상적인 기술의 사용은 주된 단점 (열불안정성 화합물의 손실 위험) 및 2가지 중요한 결점 (자동화가 가능하지 않고, 추출에 장시간이 소요된다는 점)을 지닌다. 농축을 위해 사용되는 상업적 방법은 분별 진공 증류 및 선택적 용매 추출 및 크로마토그래피 분리이다. 이러한 모든 방법은 중요한 단점을 지니는데, 이러한 단점의 예로는 낮은 수율, 부산물의 형성 (고온에 노출되는 시간으로 인한 것임) 및 추출물에 독성 유기 잔류물이 존재한다는 점이다.
초임계 유체 추출 (SFE)는 통상적인 기술과 결부된 단점을 회피하기 위해 식물로부터 정유를 추출하는 데에 최근 사용되어 왔다. 추출을 위한 이의 유용성은 기체와 유사한 물질 전달 특성과 액체와 유사한 용매화 특성을 겸비하며 액체 용매 의 확산 계수 보다 높은 확산 계수를 지니기 때문이다. 또한, SFE는 분별(fractionation)에 의한 통상의 추출 방법에 의해 수득되는 정유의 양을 향상시키기에 적합한 기술이다.
세계에서 가장 많이 소비되는 알칼로이드인 카페인은 코카(coca) 콩 (0.2%), 커피 콩 (0.9-2.4%) 및 차 잎 (1.5-2.5%)과 같은 일부 천연 생성물에서 고농도로 발견된다. 카페인은 인간 건강 및 환경에 유해한 것으로 간주되는 디클로로메탄 및 헥산과 같은 유기 용매를 사용하는 추출에 의해 일반적으로 수득된다. 물이 우수하지만 카페인에 대해서는 비선택적인 용매이다. 물에 의한 추출은 용해를 초래하며, 이는 후속하여 녹차의 폴리페놀 (카테킨)과 같은 다른 가치있는 성분을 소실시킨다.
본 발명의 경우, 초임계 이산화탄소가 카페인을 추출하기 위한 (녹차의 카페인 제거) 주요 공정으로서 선택되었다. 이러한 공정은 카페인을 제거하기 위해 용매로서 고온의 압축된 가스를 사용하는 것을 포함한다. 상업적 규모로, 이산화탄소가 커피 콩으로부터 카페인을 추출하기 위해 사용된다. 초임계 CO2는 통상적으로 사용되는 유기 용매와 비교하여 비오염성이고 비독성이다. 수 개의 특허가 CO2를 사용한 커피 콩으로부터의 카페인 추출에 대해 허여되었으며, 이러한 특허는 이미 논의되었다. 조셀(Zosel) (미국 특허 4,247,570)은 상업적 규모로 카페인을 제거하는 조작을 상세히 기재하였다. 0.7 내지 3%의 커피 콩 중의 카페인 함량은 약 0.02% 카페인으로 감소되었다. 추출 공정은 70 내지 90℃ 및 160 내지 200 바아에서 수행되었다 (CO2 밀도는 0.4-0.65 g/cc임).
초임계 이산화탄소는 카페인에 대해 매우 선택적이지만, 카페인의 용해도는 유기 용매 보다 낮아서 대량의 CO2의 사용을 초래하며, 이로써 고정 및 운영 비용 둘 모두를 현저히 증가시킨다. 커피 콩의 경우 관찰되는 바와 같이, 물은 가치있는 공용매(co-solvent)로서 작용하여 실질적으로 개선된 추출 수율을 초래할 수 있다.
녹차 식물 물질의 생물학적으로 활성인 화학 성분의 추출 방법의 개략도는 도 1 내지 5에 도시되어 있다. 추출 공정은 전형적으로 6 단계이지만, 이에 제한되지 않는다. 참고로, 텍스트(text)와 관련하여, 진한 숫자 X가 텍스트에 나타난 경우, 이러한 숫자는 도 1 내지 5에 기재된 숫자를 나타낸다. 추출 공정에 사용된 분석 방법은 예증 섹션에 제시된다.
단계 1: 녹차 정유의 초임계 유체 이산화탄소 추출
정유의 소수성 성질로 인해, 제한되지는 않지만, SCCO2, 헥산, 석유 에테르, 및 에틸 아세테이트를 포함하는 비극성 용매가 본 추출 공정에 사용될 수 있다. 정유의 일부 성분은 휘발성이므로, 스팀 증류가 또한 추출 공정으로서 사용될 수 있다.
SCCO2를 이용하여 녹차 잎으로부터 정유 화학 성분을 추출하는 일반화된 설명은 도 1-단계 1에 도해되어 있다. 공급원료 [10]는 건조되고 절단된 녹차 잎이다 (105㎛ 이상의 크기). 추출 용매 [210]는 순수한 이산화탄소이다. 물이 공용매로서 사용될 수 있다. 공급원료를 SFE 추출 용기 [20]내로 로딩(loading)한다. 퍼지(purge) 및 누출 시험 후, 공정은 냉각기를 통해 저장 용기로부터 CO2 펌프로 유동하는 액화 CO2를 포함한다. CO2를 요망되는 압력으로 압축하고, 압력 및 온도가 요망되는 수준으로 유지되는 추출 용기내에서 공급 원료를 통해 유동시킨다. 추출을 위한 압력은 약 60 바아 내지 800 바아이며, 온도는 약 35℃ 내지 약 90℃이다. 본원에 교시된 SCCO2 추출은 바람직하게는 적어도 100 바아의 압력 및 적어도 35℃의 온도, 더욱 바람직하게는 약 60 바아 내지 300 바아의 압력 및 약 40℃ 내지 약 60℃의 온도에서 수행한다. 추출의 단일 스테이지를 위한 추출 시간은 약 30분 내지 약 2.5시간, 약 1시간이다. 용매 대 공급물 비는 각각의 SCCO2 추출에 대해 전형적으로 약 20-60 대 1이다. CO2는 상업적 추출 처리를 위해 재순환시킨다. 그 후, 추출되고 정제되고 프로파일링된 정유 화학 성분 [30]을 수집기 또는 분리기에서 수집하고, 광보호 유리병에서 보존시키고, 어두운 냉장고에서 4℃에서 저장한다. 녹차 공급원료 [10] 물질을 단단계 공정으로 추출하는데 (도 1, 단계 1A), 여기서 생성된 추출되고 정제된 녹차 정유 분획 [30]이 하나의 수집기 SFE 또는 SCCO2 시스템 [20]에서 수집된다. 또한, 분별 SFE 시스템에서와 같이, SCCO2 추출된 녹차 공급원료 물질을 수집기 용기 (분리기)내로 분리하여, 각각의 수집기내에는 수집된 정제된 정유 하위분획 각각에서 상이한 상대 비율의 정유 화학 성분 조성 (프로파일)이 존재하게 한다. 잔류물 (나머지) [40]을 수집하고, 보존시키고, 비제한적으로 카페인제거 및 녹차 카테킨, 테아닌 및 다당류의 정제된 분획을 수득하기 위한 처리를 포함하는 추가의 처리를 위해 사용한다. 본 발명의 구체예는 60 바아 내지 800 바아의 압력 및 35℃ 내지 90℃의 온도에서 다중 스테이지 SCCO2 추출을 이용하여 녹차 공급원료 물질을 추출하고, 각각의 스테이지 후에 추출된 녹차 물질을 수집하는 것을 포함한다. 본 발명의 두 번째 구체예는 60 바아 내지 800 바아의 압력 및 35℃ 내지 90℃의 온도에서 분별 SCCO2 추출을 이용하여 녹차 종 공급원료 물질을 추출하고, 소정의 조건 (압력, 온도 및 밀도) 및 소정의 간격 (시간)에서 상이한 수집기 용기에서 추출된 녹차 물질을 수집하는 것을 포함한다. 각각의 다중 스테이지 추출기로부터의 또는 상이한 수집기 용기 (분별 시스템)내의 생성된 추출된 녹차 정제된 정유 하위분획 조성물은 회수되어 독립적으로 사용될 수 있거나, 합쳐져서 본래의 식물 물질에서 발견되는 농도 보다 높거나 낮은 소정의 정유 오일 화학 성분 농도를 포함하는 하나 이상의 녹차 정유 조성물을 형성할 수 있다. 전형적으로, 단단계 SCCO2 추출을 이용한 녹차 식물 물질로부터의 정유 분획의 전체 수율은 추출물의 85 질량 중량% 이상의 정유 화학 성분 순도를 지니는 약 0.4 중량% (정유 화학 성분의 95% 초과)이다. 이러한 추출 공정의 결과는 하기 표 2 내지 4에 제시되어 있다. 절차는 실시예 1을 참조할 수 있다.
표 2. 40℃ 및 200 바아에서의 제 1 스테이지 처리의 결과.
Figure 112008073723240-PCT00001
1. F1 = 중국 녹차; F4 = 중국 녹차; JPGT = 일본 녹차.
2. 공급물로부터 추출된 카페인 = 추출물 중의 카페인/공급물 중의 카페인 x 100.
표 3. 녹차의 정유 추출물의 조성
Figure 112008073723240-PCT00002
Figure 112008073723240-PCT00003
Figure 112008073723240-PCT00004
표 4. 상이한 녹차 공급원료로부터의 녹차 정유 화합물 분포 (GC-MS로부터의 피크 면적 %)
Figure 112008073723240-PCT00005
Figure 112008073723240-PCT00006
Figure 112008073723240-PCT00007
40℃ 및 100-200 바아에서 SCCO2를 이용하여 녹차 잎 정유 분획 중의 전체 73개의 화합물을 추출하였다. SCCO2 추출이 건조 또는 습윤 녹차 잎으로 수행되고, 카페인이 이러한 공정에서 추출되는 지의 여부는 문제가 되지 않는 것으로 여겨진다. 이러한 정유 분획 중의 카페인 농도는 정유 분획의 약 11 내지 80 질량 중량%이다. 카페인 이외에, 정유 분획에서 발견되는 다른 주요 화합물로는 포화 지방 알코올, 예를 들어 1-운데카놀, 1-헥사데카놀, 올레일 알코올, 및 노나데카놀 및 지방산, 예를 들어 헥사데칸산이 있다. 흥미롭게도, 중국 녹차 F1에서는 정유 화합물이 거의 발견되지 않았다. 대조적으로, 중국 녹차 F2, F3 및 F4는 모두 SCCO2 정유 추출 분획을 구성하는 50 질량 중량% 이상의 지방 알코올 및 지방산을 지니는 것으로 밝혀졌다. 일본 녹차 공급원료로부터의 SCCO2 정유 분획의 경우, 40 질량 중량% 이하의 지방 알코올 및 지방산이 추출 분획을 구성하였다.
단계 2. 녹차의 초임계 이산화탄소 카페인제거
SCCO2를 이용하여 녹차 잎으로부터의 화학 성분의 카페인제거에 관한 일반화된 설명은 도 1-단계 2에 도해되어 있다. 공급원료 [10 또는 40]인 건조되고 절단된 녹차 잎 (105㎛ 이상의 크기) 또는 단계 1의 정유 분획 추출 후의 잔류물을 1 베드 부피(bed volume)의 증류수에 침지시킨다. 추출 용매 [210]는 순수한 이산화탄소이다. 물이 공용매로서 사용될 수 있다. 공급원료를 SFE 추출 용기 [50]내로 로딩(loading)한다. 퍼지 및 누출 시험 후, 공정은 냉각기를 통해 저장 용기로부터 CO2 펌프로 유동하는 액화 CO2를 포함한다. CO2를 요망되는 압력으로 압축하고, 압력 및 온도가 요망되는 수준으로 유지되는 추출 용기내에서 공급 원료를 통해 유동시킨다. 추출을 위한 압력은 약 60 바아 내지 800 바아이며, 온도는 약 35℃ 내지 약 90℃이다. 본원에 교시된 SCCO2 추출은 바람직하게는 적어도 200 바아의 압력 및 적어도 35℃의 온도, 더욱 바람직하게는 약 30 바아 내지 700 바아의 압력 및 약 60℃ 내지 약 80℃의 온도에서 수행한다. 추출의 단일 스테이지를 위한 추출 시간은 약 2시간 내지 약 6시간, 약 4시간이다. 용매 대 공급물 비는 각각의 SCCO2 추출에 대해 전형적으로 약 240 대 1이다. CO2는 상업적 추출 처리를 위해 재순환된다. 그 후, 추출된 카페인 화학 성분 [70]을 수집하고, 카페인 함량에 대해 측정하고, 폐기한다. 잔류물 (나머지) 또는 카페인 제거된 녹차 추출물 [60]을 수집하고, 보존시키고, 비제한적으로 녹차 카테킨, 테아닌 및 다당류의 정제된 분획을 수득하기 위한 처리를 포함하는 추가의 처리를 위해 사용한다. 전형적으로, 단단계 SCCO2 추출을 이용한 녹차 식물 물질로부터의 카페인의 전체 수율 은 카페인 추출물의 약 29 질량 중량%의 카페인 화학 성분 순도를 지니는 약 4.5 중량% (공급원료에 존재하는 카페인 화학 성분의 약 85%)이다. 이러한 카페인제거 공정은 카페인 제거된 녹차 공급원료 중의 카페인 함량을 공급원료 물질 중의 카페인 함량의 약 55 내지 85 질량 중량% 만큼 감소시킨다. 낮은 카페인 함량을 지닌 녹차 공급원료의 경우, 83 내지 85 질량 중량%의 카페인이 제거될 수 있다. 카페인 함량이 높은 녹차 공급원료에서 카페인 함량을 감소시키기 위해, 보다 높은 용매/공급물 비가 공급원료 물질을 80 질량 중량% 이상 카페인을 제거하는 데에 필요하다. 이러한 추출 공정의 결과는 하기 표 5 및 6에 제시되어 있다. 절차는 실시예 2를 참조할 수 있다.
표 5. 상이한 공용매 및 공급원료에 따른 전체 및 카페인 추출 수율의 결과
Figure 112008073723240-PCT00008
Figure 112008073723240-PCT00009
1. 공급물로부터 추출된 카페인 = 추출물 중의 카페인/공급물 중의 카페인 x 100.
2. 결과는 3회의 반복 실행의 평균이다 (표준 편차 +/- 5%).
표 6. 카페인 제거된 F1, F4 및 JPGT 녹차 잔류물 대 미가공 (천연) 녹차 공 급원료 각각에서 화학 성분의 비교 HPLC 분석 측정
Figure 112008073723240-PCT00010
카페인의 추출 수율은 공용매의 첨가에 의해 증가되었다. 초임계 유체 이산화탄소/공용매 혼합물 중의 카페인의 용해도는 순수한 이산화탄소 단독 (Kopcak 2005)에서 보다 3 내지 5배 높다. 카페인 추출의 관점에서, 75% 에탄올/물이 매우 효율적이다. 그러나, 카페인제거 추출물 중의 9.3 질량 중량%의 카페인 이외에, 공급원료로부터의 가치있는 페놀산 화합물, 예를 들어 카페인제거 추출의 질량 중량%를 기준으로 4% EGCG, 2.6% EGC 및 0.9% ECG이 또한 추출된다. 물이 녹차 잎 공급원료 물질의 카페인제거를 위해 에탄올 보다 우수한 공용매이다. 습윤 녹차 잎, 공용매로서 물 그리고 240의 S/F 비를 사용하는 경우, F1 공급원료 및 일본 녹차 (JPGC) 공급원료에서 카페인의 80% 이상이 공급원료 물질로부터 가치있는 페놀산 또는 테아닌 중 어느 하나를 제거하지 않으며 제거(카페인제거)될 수 있다. 이는 F1 공급원료 중의 1.3 질량 중량%에서 F1 카페인 제거된 물질 중의 0.18%로의 카페인 함량 감소 또는 JPGT 공급원료 중의 2.2 질량 중량%에서 카페인 제거된 녹차 물질 중의 0.36%로의 카페인 함량 감소에 필적하며, 카페인 함량이 6 내지 7배 감소된 것이다. 카페인 함량이 3.3 질량 중량%로 높은 F4 녹차 잎 공급원료의 경 우, 전체 카페인 감소는 F4 카페인 제거된 공급원료의 1.46 질량 중량% 이하였다. 그러나, 가치있는 카테킨 및 테아닌은 카페인 제거된 잔류 물질에 보존되었다. 따라서, 가치있는 카테킨 및 테아닌 화학 성분을 보유하는 카페인 제거된 잔류물이 그 후 정제된 카테킨, 테아닌 및 다당류 분획을 수득하기 위한 추가 처리를 위해 사용될 수 있다.
흥미롭게도, 단지 약 55% 카페인제거가 동일한 SFE 카페인제거 조건하에서 카페인 함량이 높은 F4 공급원료에 대해 관찰되었다. 이러한 차이는 F4 녹차 잎의 보다 높은 카페인 함량 또는 상이한 매트릭스 구조 또는 둘 모두에 기인하는 것으로 여겨진다. 관찰결과에 기초해 볼 때, F4 공급원료 잎이 물 침지에 의해 덜 습윤된다. 다시 말해, 물은 F4 잎 내부 매트릭스내로 침투하는 대신 잎의 표면에 남아있는 경향이 있다. 따라서, F4 녹차 잎은 80% 이상의 카페인제거를 달성하기 위해 보다 많은 물 및/또는 보다 긴 침지 시간 뿐만 아니라 아마도 보다 높은 용매/공급물 비를 필요로 한다.
단계 3. 미정제 녹차 잎 카테킨 화학 성분 분획의 에탄올 추출
한 가지 일면에서, 본 발명은 생체활성 카테킨 화학 성분의 추출 및 농축을 포함한다. 이러한 단계의 일반화된 설명은 도 2-단계 3에 도해되어 있다. 이러한 단계 3 추출 공정은 용매 침출 공정이다. 이러한 추출을 위한 공급원료는 절단된 녹차 잎 물질 [10] 또는 단계 1 SCCO2 추출된 정유 분획 [30] 또는 단계 2 SCCO2 카페인 제거된 녹차 잎 물질 [60]으로부터의 잔류물이다. 추출 용매 [220]는 95% 에탄올이다. 추출 용매는 10 내지 95% 수성 알코올일 수 있으며, 95% 수성 에탄올 이 바람직하다. 이러한 방법에서, 녹차 공급원료 물질 및 추출 용매를 가열되고 교반된 추출 용기 [100]내로 로딩한다. 이러한 용기는 90℃, 약 80℃, 약 70℃ 또는 약 60℃로 가열할 수 있다. 추출은 약 1 내지 10시간, 약 1 내지 4시간, 약 2시간 동안 수행된다. 생성된 유체 추출물을 원심분리하고 [110], 여과시킨다 [120]. 여액 (상층액) [300, 310]을 생성물로서 수집하고, 부피를 측정하고, 용매의 증발 후에 고형물 함량 건조 질량을 측정한다. 추출 잔류 물질 [130 또는 140]을 보유하고, 추가의 처리를 위해 보존시킨다 (단계 4 참조). 추출은 필요에 따라 또는 요망에 따라 여러 차례 반복할 수 있다. 이는 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상 등으로 반복할 수 있다. 하나 이상의 스테이지가 추출을 위해 사용되는 경우, 각각의 스테이지로부터의 미정제 카테킨 분획을 생성물을 위해 합치거나 [320], 카테킨 분획의 추가 정제를 위해 보유할 수 있다 (단계 4 참조). 예를 들어, 도 2-단계 3은 2 스테이지 공정을 나타내는데, 여기서 제 2 스테이지는 동일한 방법 및 조건을 사용한다. 결과는 하기 표 7 및 8에 제시되어 있다. 절차는 실시예 3을 참조할 수 있다.
표 7. F1 녹차 카페인제거 잔류물의 95% 에탄올 2 스테이지 침출 추출의 결과
Figure 112008073723240-PCT00011
표 8. 본래의 (미가공) 녹차 공급원료 및 중국 녹차 F1, 중국 녹차 F4 및 일본 녹차 (JPGT)에 대한 SFE 카페인 제거된 잔류물로부터의 95% 에탄올 2 스테이지 침출 추출 생성물의 화학 성분 함량 비교
Figure 112008073723240-PCT00012
이러한 결과는 SFE 카페인제거 공정이 잔류물 중의 다른 가치있는 화합물에 영향을 미치지 않으며 녹차 공급원료로부터 카페인을 제거함을 입증한다. 또한, 95% 에탄올을 사용하여 잔류물을 추출하는 것은 정제된 테아닌 및 다당류 분획을 위한 추가 처리를 위해 사용될 수 있는 잔류물 중의 L-테아닌 및 수용성-에탄올 불용성 다당류를 보존한다. 마지막으로, 2 스테이지 침출 공정은 4가지 주요 카테킨 (PA, 표 8)의 농도를 본래의 녹차 공급원료 중의 약 7 내지 12 질량 중량%에서 추출물 중의 약 26 내지 39 질량 중량%로 증가시키는데, 이는 순도의 약 3.5배 증가이다. 추출 수율은 최초의 녹차 공급원료를 기준으로 하여 19 내지 36 질량 중량%였다. 친화성 흡착 공정 크로마토그래피 공정을 이용하여 카테킨 화학 성분 분획의 추가의 순도가 수득될 수 있다 (하기 참조).
단계 4. 친화성 흡착 추출 공정
본원에 교시된 바와 같이, 녹차 공급원료의 히드로알코올성 추출물 (단계 3)을 고체 친화성 중합체 흡착 수지와 접촉시켜서 히드로알코올성 추출에 함유된 활성 카테킨을 친화성 흡착제상으로 흡착시킴으로써 녹차로부터의 고도로 정제된 카테킨 분획 추출물이 수득될 수 있다. 결합된 화학 성분은 후속하여 본원에 교시된 방법에 의해 용리된다. 카테킨 분획 화학 성분을 용리하기 전에, 요망되는 화학 성분이 흡착된 친화성 흡착제가 임의의 편리한 방식으로, 바람직하게는 흡착제와 접촉시키는 방법으로 추출물의 나머지와 분리될 수 있고, 분리는 수성 추출물을 추출 컬럼 또는 흡착제 물질층을 통과시킴으로써 수행된다. 또한, 카테킨 분획 화학 성분을 용리하기 전에, 카페인 화합물은 용리시키지만 카테킨 화합물은 용리시키지 않는 특정 용매를 사용함으로써 친화성 흡착제상으로 흡착된 임의의 카페인 화합물이 카테킨과 분리될 수 있다 (정제된 카테킨 분획의 카페인제거).
다양한 친화성 흡착제가 녹차 식물 물질의 카테킨 화학 성분을 정제하기 위해 사용될 수 있는데, 이의 예로는 비제한적으로 "Amberlite XAD-2" (Rohm & Hass), "Duolite S-30" (Diamond Alkai Co.), "SP207" (Mitsubishi Chemical), ADS-5 (Nankai University, Tianjin, China), ADS-17 (Nankai University, Tianjin, China), Dialon HP 20 (Mitsubish, Japan), 및 Amberlite XAD7 HP (Rohm & Hass)가 있다. 바람직하게는 녹차의 카테킨 화학 성분에 대한 높은 친화성으로 인해 Amberlite XAD 7HP가 사용된다. 이는 입자 크기가 560 내지 710㎛인 비이온성 지방족 아크릴 중합체이며, 이의 흡착 특성은 이의 거대망상(macroreticular) 구조 (연속 중합체상과 연속 기공상 둘 모두를 함유함), 높은 표면적 및 이의 표면의 지방족 성질로부터 유래된다. 이러한 거대망상 구조가 중합체 에스테르기를 지님에 따라, XAD 7HP는 극성 화합물을 흡착할 수 있어서 페놀산 (카테킨)에 대해 높은 친화성을 나타낸다.
다양한 용리액이 흡착제로부터 카테킨 화학 성분을 회수하기 위해 사용될 수 있지만, 본 발명의 한 가지 일면에서 용리액은 비제한적으로 메탄올, 에탄올 또는 프로판올을 포함하는 저분자량 알코올을 포함한다. 두 번째 일면에서, 용리액은 저분자량 알코올을 물과의 혼합물로 포함한다. 세 번째 일면에서, 용리액은 저분자량 알코올, 제 2 유기 용매 및 물을 포함한다. 또 다른 일면에서, 흡착제상으로 흡착된 카테킨을 카페인제거하기 위해 사용되는 용리액은 비제한적으로 10% 에탄올 중의 5% H2SO4와 같은 산성 용매를 포함한다. 따라서, 2-스테이지 용리 공정이 녹차의 카테킨 화학 성분 분획의 정제를 위해 설계되었다. 제 1 스테이지는 카페인의 염기 특성 및 카테킨의 산 특성을 이용함으로써 칼럼상에 흡착된 화학 성분을 카페인제거하기 위해 산성 용액을 사용하는 것이다. 제 2 스테이지는 카페인제거된 카테킨을 용리하기 위해 에탄올/물 용리액을 사용하는 것이다.
녹차 공급원료는 수성 카테킨 화학 성분 함유 추출물을 친화성 흡착제 물질과 접촉시키기 전에 비제한적으로 단계 1, 2 및 3에 기재된 공정과 같은 하나 이상의 예비 정제 공정을 거치거나 거치지 않을 수 있다.
본 발명에 교시된 친화성 흡착 공정을 사용하는 경우 천연 식물 물질 또는 시판되는 추출 생성물에 보통 존재하는 다른 화학 성분을 현저히 비함유하는 녹차의 고도로 정제되고 프로파일링되고 카페인제거된 카테킨 화학 성분 분획이 생성된다. 예를 들어, 본 발명에 교시된 공정은 95 건조 질량 중량%를 초과하는 전체 카테킨 화학 성분을 함유하는 정제된 카테닌 추출물을 생성시킬 수 있다.
중합체 친화성 흡착 수지 비드를 사용하는 녹차 잎으로부터의 카테킨의 추출 및 정제에 관한 일반화된 설명은 도 3-단계 4에 도해되어 있다. 이러한 추출 공정을 위한 공급원료는 천연 녹차 공급원료 [10] 또는 단계 3 95% 에탄올 침출 추출물 [320]로부터의 카테킨을 함유하는 수용액일 수 있다. 적절한 중량의 흡착 수지 비드 (흡착 수지 gm 당 카테킨 12mg)를 컬럼내로 로딩 [410, 420]하기 전 및 후에 4 내지 5 BV 에탄올 [220] 및 4 내지 5 BV 증류수 [230]으로 세척한다. 세정된 흡착 수지 비드를 컬럼내로 충전시킨다 [430]. 그 후, 카테킨 함유 수용액 [320]을 2 내지 4 베드 부피 (BV)/시간의 유속으로 컬럼에 충전시킨다 [440]. 컬럼이 완전히 로딩된 경우, 컬럼을 2 내지 3 BV/시간의 유속으로 증류수 [230]로 세척하여 [450], 흡착된 카테킨으로부터 임의의 불순물을 제거한다. 유출 잔류물 [500] 및 세척 잔류물 [510]을 수집하고, 질량 함량(mass content), 카테킨 함량, 카페인 함량에 대해 측정하고, 폐기하였다. 흡착된 카페인 화합물의 용리 [460]는 2 내지 4 BV/시간의 유속으로 용리 용액 [240]으로서 10% 에탄올 중의 5% H2SO4를 사용하여 등용매 방식으로 수행한다. 용출물 [520]을 수집하고, 질량 함량, 카테킨 함량, 카페인 함량에 대해 측정하고, 폐기하였다. 이러한 카페인제거 스테이지 후에, 컬럼을 10 BV/시간의 유속으로 8 BV의 증류수 [230]를 사용하여 세척하였다 [470]. 세척물 [530]은 이것이 중성이 될 때까지 pH 페이퍼로 시험하고, 수집하고, 페기하였다. 흡착된 카테킨의 용리 [480]는 2 내지 4 BV/시간의 유속으로 용리 용액 [250]으로서 80% 에탄올/물 용액을 사용하여 등용매 방식으로 수행하였고, 용리 곡선을 용리 추출물 [540]에 대해 기록하였다. 용리 부피 [480]는 대략 15 내지 30분 마다 수집할 수 있고, 이러한 샘플을 HPLC를 이용하여 분석하고, 고형물 함량 및 순도에 대해 시험한다. 결과는 표 9 내지 11에 제시되어 있다. 절차는 실시예 4를 참조할 수 있다.
표 9. F1 SFE 카페인제거된 95% 에탄올 침출 녹차 추출물의 XAD 7HP 컬럼 공정 크로마토그래피의 분석 결과
Figure 112008073723240-PCT00013
Figure 112008073723240-PCT00014
표 10. F4 SFE 카페인제거된 95% 에탄올 침출 녹차 추출물의 XAD-7HP 컬럼 공정 크로마토그래피의 분석 결과
Figure 112008073723240-PCT00015
표 11. JPGT SFE 카페인제거된 95% 에탄올 침출 녹차 추출물의 XAD-7HP 컬럼 공정 크로마토그래피의 분석 결과
Figure 112008073723240-PCT00016
산성 용리 용매가 카테킨을 추가로 카페인제거하기 위한 우수한 공정인 것으로 입증되었는데, 이는 최종 생성물 중의 카페인 농도를 추출물의 1 이하 내지 0.2의 질량 중량%로 낮게 감소시킨다. 90%가 넘는 순도를 지니며 전체 수율이 최초의 녹차 공급원료의 1.9 질량 중량%인 카테킨의 정제된 분획이 수득될 수 있다. 또한, 하위분획이 수득될 수 있는데, 여기서 EGCG의 농도는 사용된 최초의 녹차 공급원료와 무관하게 60%가 넘게 증가하며 카테킨 순도는 95%를 넘는다. F1, F4 및 JPGT의 합쳐진 공정 크로마토그래피 용출물에서의 카테킨 순도 및 ECGC 프로파일의 요약은 표 12에 제시되어 있다.
표 12. 3개의 상이한 SFE 카페인제거된 녹차 공급원료의 2-스테이지 95% 에탄올 침출로부터 유래된 합쳐진 (F2-F5 또는 F6) 공정 크로마토그래피 용출물에서의 카테킨 순도 및 ECGC 프로파일*의 비교
Figure 112008073723240-PCT00017
Figure 112008073723240-PCT00018
다른 전형적인 실험에서, 작업 용액(working solution)은 미가공 또는 최초의 녹차 잎 공급원료 물질의 단계 3 95% 침출 추출 후에 수득된 투명한 수용액이었다. 이러한 실험을 위해, 70℃에서 스테이지 당 2시간인 2-스테이지로 250ml의 95% 에탄올을 사용하여 25gm의 미가공 녹차 잔류물을 침출 추출하였다 (20/1의 용매/공급물 비). 이러한 2-스테이지 추출로부터의 2개의 상층 용액을 합치고, 회전 증발기를 사용하여 에탄올 추출 용매를 제거하였다. 에탄올의 제거 (증류) 후, 일부 고형 침전물이 생성되었는데, 이는 단계 3에 기재된 원심분리 및 여과를 이용하여 제거되었다. 상층액을 수집한 후, 증류수를 농축된 상층액에 첨가하여 16 내지 30mg/ml의 최종 농도를 달성하였다. 그 후, 카테킨을 함유하는 이러한 투명한 수용액을 단게 4의 친화성 흡착 공정 크로마토그래피를 이용하는 추가 정제를 위해 사용하였다. 이러한 단계 3 침출 추출의 결과는 표 13에 나타나 있으며, 여기서 미가공 또는 최초의 녹차 잎의 침출이 단계 2로부터의 SFE 카페인제거된 잔류물의 침출과 비교된다. 미가공 녹차 식물 물질의 경우, 에탄올 증류 동안 침전이 발생하였는데, 이는 SFE 카페인제거된 잔류물과 관련하여 관찰되지 않았음을 주목해야 한다. 따라서, 이러한 침전물의 원심분리 및 여과는 최초의 공급원료 물질을 기준으로 하여 32.8에서 26.9% 질량 중량%로 전체 수율을 감소시켰다. 전체 수율이 침 출 추출된 미가공 녹차 공급원료 보다 높다고 하더라도, 카테킨 화학 성분의 순도는 유사하다. 또한, 카페인 농도는 미가공 녹차 침출 추출 생성물에서 매우 높다. 이러한 2-스테이지 95% 에탄올 침출의 결과는 표 13 및 14에 제시되어 있다.
표 13. F1 미가공 녹차 잎의 단계 3 95% 에탄올 침출 추출물 (Raw) 대 단계 2의 F1 SFE 카페인제거된 녹차 잔류물의 수율 및 순도 비교
Figure 112008073723240-PCT00019
Figure 112008073723240-PCT00020
표 14. F1, F4 및 JPGT 미가공 녹차 침출 공급원료의 2-스테이지 95% 침출 추출물의 수율 및 순도
Figure 112008073723240-PCT00021
전형적인 흡착 실험을 개방 배치(batch) 시스템에서 실온에서 수행하였다. 약 30g의 PA XAD7HP를 에탄올로 세척하여 단량체 및 불순물을 제거한 후, 충전하기 전에 증류수에 16시간 동안 침지시켰다. 그 후, 세정된 PA 수지 비드를 10mm (ID) x 350mm (L) 유리 컬럼내로 충전시켰다. 16 내지 30mg/ml의 농도를 지닌 100ml의 수용액 (탈에탄올화된(de-ethanolized) 침출 용액)을 1.8ml/min, 2 BV/hr의 유속으로 충전된 컬럼내로 로딩하였다. 로딩 후, 150ml의 증류수를 사용하여 10 BV/hr의 유속으로 컬럼을 세척하였다. 그 후, 200ml의 10% 에탄올 중의 5% 황산을 사용하여 2.2 BV/hr의 유속으로 컬럼을 용리 (카페인제거)하였다. 이러한 용리 후, 250ml의 증류수를 사용하여 컬럼으로부터의 세척물이 pH 7에 도달할 때까지 10 BV/hr로 컬럼을 세척하였다. 그 후, 100ml의 80% 에탄올을 사용하여 2 BV/hr의 유속으로 컬럼을 용리 (탈착)하였다. 전체 처리 시간은 300분이었다. 순차적 용출물 분획을 수집하였다. 각각의 용출물 분획을 HPLC에 의해 검정하였는데, 결과는 표 15 내지 17에 제시되어 있다.
표 15. 단계 3 침출에 이은 단계 4 공정 크로마토그래피에 대한 공급원료로서 F1 녹차 미가공 잎의 추출 분획의 수율 및 순도
Figure 112008073723240-PCT00022
표 16. 단계 3 침출에 이은 단계 4 공정 크로마토그래피에 대한 공급원료로서 F4 녹차 미가공 잎의 추출 분획의 수율 및 순도
Figure 112008073723240-PCT00023
Figure 112008073723240-PCT00024
표 17. 단계 3 침출에 이은 단계 4 공정 크로마토그래피에 대한 공급원료로서 일본 녹차 미가공 잎의 추출 분획의 수율 및 순도
Figure 112008073723240-PCT00025
Figure 112008073723240-PCT00026
미가공 (카페인제거되지 않은) 녹차 식물 물질로 출발하는 카테킨의 단계 4 친화성 흡착 정제에서, 산성 용리 용매를 사용하여 카페인의 95%를 제거하며 흡착제에 대한 카테킨의 결합을 보존할 수 있다. 예를 들어, 약 12 질량 중량%의 카페인을 함유하는 미정제 침출 추출물을 공정 크로마토그래피 추출 분획에서 0.3%로 카페인제거하는 것이 가능하다. 공급원료 중의 카페인 농도가 높을 수록, 보다 큰 부피의 산 용액 용리액이 추출 분획을 카페인제거하기 위해 필요하다.
흥미롭게도, 80% 에탄올을 사용한 카테킨의 용리는 추출 분획에서 질량 중량%를 기준으로 EGC 보다 높은 EGCG, ECG 및 C의 수율을 생성시킨다. 최대 수율 및 순도는 0.6 내지 2 BV 분획에서 발견된다. 고도로 정제된 분획의 전체 카테킨 순도는 미정제 침출 추출물의 약 1.7배였다. 카테킨 순도의 수준은 SFE 카페인제거된 잔류물의 단계 4 공정 크로마토그래피로 수득되는 것 만큼 높지 않았다. 그러나, 최초의 녹차 공급원료를 기준으로 하여 11 질량 중량% 보다 높은 전체 추출 분획 수율이 수득되는데, 전체 카테킨 순도는 녹차 공급원료에 따라 71% 내지 93%이다. 마지막으로, 4가지 주요 카테킨의 화학 분배 프로파일은 변경되는데, EGCG, ECG 및 C의 질량 중량%의 우선적 증가 및 EGC의 감소를 나타낸다. 예를 들어, EGCG는 전형적으로 합쳐진 추출 분획에서 전체 카테킨의 65 질량 중량% 이상이며, 추출 하위분획에서 75 질량 중량%로 높을 수 있다.
정제된 카테킨 분획 및 하위분획 중의 옥살산의 분석시에, 95% 에탄올 침출 공급원료 중에 옥살산이 존재함에도 불구하고 이러한 분획 또는 하위분획 중 어느 것에서도 옥살산을 검출할 수 없었다. 실제로, 옥살산은 공급원료 용액에서 6 질량 중량%로 높게 발견되었다. 그러나, 옥살산 화합물은 친화성 흡착제상으로 흡착되지 않았고, 유출액에서 발견되었다.
단계 5. 테아닌 및 다당류를 위한 물 침출
녹차의 화학 성분의 다당류 추출 분획은 학술 문헌에서 "수용성이고 에탄올 불용성인 추출 분획"으로서 규정되었다. L-테아닌 및 다당류 둘 모두 수용성이다. 물 용매 침출을 사용하여 녹차 식물 물질의 추출물로부터의 테아닌 및 다당류의 추출에 관한 일반화된 설명은 도 4-단계 5에 도해되어 있다 (부록 1). 공급원료 [140]은 단계 3의 95% 침출 추출 공정으로부터의 고형 잔류물이다. 이러한 공급원료는 2-스테이지로 침출 추출된다. 용매는 증류수 [260]이다. 이러한 방법에서, 녹차 추출 잔류물 [140] 및 추출 용매 [260]를 추출 용기 [600]내로 로딩하고, 가열하고 교반하였다. 이러한 용기를 100℃, 약 80℃, 또는 약 60-80℃로 가열할 수 있다. 추출은 약 1 내지 4시간, 약 2 내지 4시간, 또는 약 2시간 동안 수행한다. 상층 추출 용액 [700]을 원심분리하고 [610], 여과하고 [620], 수집한다. 잔류물 [630]을 보유하고, 추가 처리를 위해 보존한다. 추출은 필요에 따라 또는 요망에 따라 여러 차례 반복할 수 있다. 이는 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상 등으로 반복할 수 있다. 예를 들어, 도 4-단계 5는 2-스테이지 공정을 나타내는데, 여기서 제 2 스테이지는 동일한 방법 및 조건을 사용한다. 최종 잔류물 [650]은 페기한다. 이러한 추출 단계의 예는 실시예 5에서 발견되며, L-테아닌 함량에 대한 질량 측정 및 HPLC 분석결과는 하기 표 18에 제시되어 있다.
표 18. 상이한 녹차 공급원료로부터 수득된 물 침출, 다당류 정제 및 테아닌 정제 결과
Figure 112008073723240-PCT00027
Figure 112008073723240-PCT00028
물 침출 공정의 전체 수율은 최초의 녹차 공급원료 물질의 3.6 내지 12.5 질량 중량%였다. L-테아닌의 농도는 침출 추출물의 13.2 내지 18.2 질량 중량%였다. 질량 중량 기준으로 85% 이상의 수율의 최초의 녹차 잎 공급원료 중의 테아닌이 2-스테이지 침출 공정으로 추출될 수 있다. 학술 문헌과 일관되게 (29), 다른 화학 성분은 대부분 다당류이다. 다당류 화학 성분으로부터 테아닌을 분리하기 위해 추 가의 단계 6을 이용할 수 있다.
단계 6. L-테아닌 및 다당류 분획의 정제
물 용매 공정을 이용한 녹차의 추출물로부터의 다당류 및 테아닌 분획의 추출 및 정제에 관한 일반화된 설명은 도 5-단계 6에 도해되어 있다. 공급원료는 단계 5 물 침출 추출로부터의 물 침출 상층 용액 [700+710]이다. 합쳐진 용액을 증발시켜서 [800] 물의 60%를 제거하였다. 그 후, 용매인 무수 에탄올 [280]을 농축된 용액에 첨가하여 최종 에탄올 농도가 75%가 되게 하였다. 용액을 정치시킨 경우, 대량의 침전물 [810]이 관찰된다. 용액을 원심분리하고 [820], 경사분리(decanting)하고 [830], 테아닌 분획의 추가 처리 및 정제를 위해 상층액 [910]을 수집한다. 침전 생성물 [900]은 참조 표준물(reference standard)으로서 덱스트란 5,000-410,000 분자량을 사용함으로써 비색법을 이용하여 다당류에 대해 분석될 수 있는 정제된 다당류 분획이다. 추출된 다당류 분획의 순도는 다양한 분자량의 덱스트란을 기준으로 하여 약 23 내지 50%이며, 전체 수율은 최초의 본래의 녹차 잎 공급원료의 1.15% 질량 중량%이다 (표 18). 다양한 덱스트란 등가물 순도를 합친 것은 정제된 다당류 분획의 90 질량 중량% 이상의 전체 다당류 순도와 일치한다.
상층 용액 중의 테아닌 순도는 약 31 내지 42%이다. 보다 높은 수준의 테아닌 순도를 달성하기 위해, 추가의 처리가 필요하다. 상층 용액 [910]을 건조한다. 건조된 생성물을 충분한 증류수 [260]에 용해시켜서 10% 용액 [850]이 되게 한다. 이러한 용액에 4 부피의 무수 에탄올 [270]을 첨가하고, 혼합한다. 이러한 히드로 알코올성 용액을 약 1시간 동안 정치시킨 후, 원심분리하고 [860], 임의의 침전물 [910]을 폐기한다. 상층액 [920]을 약 60℃에서 진공 회전 증발기 [870]를 사용하여 농축시켜서 80% 용액을 수득하였다. 이러한 80% 용액을 실온으로 냉각시킨 후, 4 부피의 무수 에탄올 [280]을 상기 용액에 첨가하고, 이를 0℃에서 24시간 동안 냉장한다 [880]. 형성된 결정을 수집하고, 60℃에서 진공 건조하여 [890] 정제된 테아닌 분획 [930]을 수득한다. 정제된 테아닌 분획 수율은 최초의 녹차 공급원료의 약 0.51 내지 1.95 질량 중량%이며 순도는 약 90 내지 92%이다 (표 18). 실제 절차는 실시예 6을 참조할 수 있다.
녹차 다당류 수율은 최초의 녹차 잎 공급원료를 기준으로 하여 1.2 내지 8.5 질량 중량%였다. 다당류 분획의 순도는 다양한 분자량의 덱스트란을 기준으로 하여 23 내지 50%였는데, 이는 90%가 넘는 분획 중의 녹차 다당류 화학 성분의 전체 순도를 나타낸다. 다수의 다양한 실험 방법을 기초로 하는 경우, 질량 중량을 기준으로 1.2 내지 8.5% 수율이 천연 녹차 종 공급원료 물질 중의 90% 이상의 수용성이고 에탄올 불용성인 다당류라고 결론내리는 것이 매우 타당하다.
녹차 L-테아닌 수율은 최초의 녹차 공급원료를 기준으로 하여 0.5 내지 2.0 질량 중량%였는데, 이는 최초의 공급원료 중의 테아닌의 약 70% 이다. 90%의 테아닌 순도가 이러한 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
용액으로부터 알코올을 제거하기 위한 다수의 방법이 당 분야에 공지되어 있다. 재순환을 위해 알코올을 유지하는 것이 요망되는 경우, 추출 후에 정상 대기압 또는 감소된 대기압하에서 증류에 의해 알코올을 용액으로부터 분리할 수 있다. 이러한 알코올은 재사용할 수 있다. 또한, 수용액 또는 알코올이 이미 분리된 용액인 용액으로부터 물을 제거하기 위한 다수의 방법이 당 분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 비제한적으로 수용액을 적절한 담체, 예를 들어 비제한적으로 탄산 마그네슘 또는 말토덱스트린상으로 분무 건조하는 것을 포함하거나 동결 건조 또는 굴절 윈도우(refractive window) 건조에 의해 액체를 건조시킬 수 있다
앞서 기술된 추출 방법을 수행하는 경우, 녹차 및 관련 종의 최초의 건조된 잎 공급원료에 존재하는 정유 화학 성분의 80% 이상의 순도를 지닌 정유 화학 성분의 질량 중량을 기준으로 90% 이상의 수율이 정유 SCCO2 추출 분획에서 추출될 수 있는 것으로 밝혀졌다 (단계 1). 단계 2 (SCCO2 카페인제거 공정)에 교시된 방법을 이용하는 경우, 녹차 식물 물질로부터의 카페인의 전체 수율은 카페인 추출물의 약 29 질량 중량%의 카페인 화학물질 순도를 지닌 약 4.5 질량 중량% (최초의 녹차 공급원료에 존재하는 카페인 화합물의 약 85%)이다. 이러한 카페인제거 공정은 카페인제거된 녹차 공급원료 중의 카페인 함량을 카페인제거된 녹차 물질의 0.2% 질량 중량% 이하로 감소시킨다. 더욱이, 본 발명에 교시된 방법을 이용하는 경우, 녹차 공급원료의 80% 카페인제거를 달성하며, 정제된 카테킨, 테아닌 및 다당류 분획을 수득하기 위한 추가 처리를 위해 사용될 수 있는 공급원료 중의 가치있는 카테킨, 테아닌 및 다당류 화학 성분을 유지시킬 수 있다.
본 발명의 단계 3에 교시된 방법을 이용하는 경우, 에탄올 침출 분획이 최초의 녹차 종 공급원료로부터 질량 중량을 기준으로 19 내지 31% 수율로 수득된다. 카테킨 화학 성분의 수율은 최초의 녹차 공급원료에 존재하는 카테킨의 90 질량 중 량% 이상이다 (표 8 및 A1-부록 1 참조). 또한, 에탄올 침출 공정은 4가지 주요 카테킨을 실험된 본래의 녹차 잎 공급원료 중의 7 내지 12 질량 중량%에서 카테킨 추출 분획 중의 약 25 내지 39 질량 중량%로 증가시키는데, 이는 카테킨 농도의 3.5배 증가이다 (ECGC, ECG, EGC 및 C의 합계). 마지막으로, 에탄올 침출 추출은 정제된 테아닌 및 다당류 분획을 위한 추가 처리 (단계 5 & 6)를 위해 사용될 수 있는 고형 잔류물에서 테아닌 및 다당류 화합물을 보존한다.
본 발명의 단계 4에 교시된 방법 (친화성 흡착 추출 공정)을 이용하는 경우, 추출 분획의 건조 질량%로 90% 이상의 순도를 지닌 카테킨 분획이 수득될 수 있다. 95% 에탄올 침출 추출 공급원료로부터 카테킨의 56 내지 86%를 추출하는 것이 가능하다. 이는 카테킨 화학 성분 기준으로서 ECGC, ECG, EGC 및 C를 사용하여 본래의 녹차 종 식물 물질에서 발견되는 카테킨 화학 성분의 50 내지 77% 수율에 필적한다. 이들을 기준으로서 사용한 이러한 페놀산 분획의 HPLC 분석을 기초로 하는 경우, 페놀산 화학 성분의 순도는 페놀산 분획 추출 생성물의 약 40%이다. 또한, 산성 용리 용매가 정제된 카테킨 분획의 추가의 카페인제거를 위한 우수한 공정인 것으로 입증되었는데, 이는 최종 카테킨 분획 생성물 중의 카페인을 추출 분획의 1 이하의 질량 중량% 내지 0.2 질량 중량%로 낮게 감소시킨다. 또한, EGCG의 농도가 65 내지 75 질량 중량%로 증가되고 카테킨 순도가 추출 하위분획의 95 질량 중량% 이상인 하위분획을 수득될 수 있다. 데이터는 추출 분획에서 EGCG, ECG 및 C의 질량 중량%를 우선적으로 증가시키고 EGC를 감소시킴으로써 카테킨 추출 분획을 프로파일링하는 친화성 흡착 공정 크로마토그래피의 능력을 뒷받침한다.
단계 5에 교시된 방법 (물 침출 공정)을 이용하는 경우, 최초의 녹차 잎 공급원료를 기준으로 하여 약 3.6 질량 중량%의 수용성 화학 성분의 고수율이 달성된다. 이러한 미정제 추출물 중의 L-테아닌의 농도는 약 17 질량 중량%이다. 잔류 수용성 화합물은 대부분 다당류인데, 이는 녹차 잎 중의 다당류의 농도가 60% 에탄올 침전을 사용한 경우 약 2.42 질량 중량%와 86.8%의 순도였음이 보고된 그 밖의 연구 (29)의 결과와 일치한다.
본 발명의 단계 6에 교시된 방법 (L-테아닌 및 다당류 추출 및 정제 공정)을 이용하는 경우, 수용성이고 에탄올 불용성인 다당류의 전체 수율은 최초의 공급원료를 기준으로 하여 약 1.2 질량 중량%이다. 다당류 추출 분획의 순도는 참조 표준물로서 다양한 분자량의 덱스트란을 사용하는 비색법을 기준으로 하여 약 56-76%이다. 이러한 데이터는 95% 이상의 전체 다당류 순도와 일치한다.
또한, 단계 6에 교시된 방법을 이용하는 경우, L-테아닌의 수율은 55% 이상의 L-테아닌이 존재하는 최초의 녹차 잎 공급원료를 기준으로 하여 약 0.8 질량 중량%이다. 정제된 테아닌 추출 분획의 90 질량 중량%의 테아닌 순도가 이러한 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
식품 및 의약
본 발명의 식품 형태로서, 과립 상태, 그레인(grain) 상태, 페이스트 상태, 겔 상태, 고체 상태 또는 액체 상태와 같은 임의의 선택적 형태로 제조될 수 있다. 이러한 형태에서, 식품에 첨가될 수 있는 것으로 당업자에게 통상적으로 공지된 다양한 종류의 물질, 예를 들어 결합제, 붕해제, 증점제, 분산제, 재흡수 촉진제, 감 미제, 완충제, 계면활성제, 용해 보조제, 방부제, 에멀젼화제, 등장제(isotonicity agent), 안정화제 또는 pH 조절제 등이 임의로 함유될 수 있다. 식품에 첨가하고자 하는 엘더베리 추출물의 양은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 체중이 약 60kg인 성인에 의해 수용되는 양으로서 1일 당 약 10mg 내지 5g, 바람직하게는 50mg 내지 2g일 수 있다.
특히, 건강 유지를 위한 식품, 기능성 식품 등으로서 사용되는 경우, 본 발명의 유효 성분을 본 발명의 소정의 효과가 충분히 나타날 정도의 양으로 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명의 의약은 예를 들어 정제, 과립, 가루약, 캡슐 등과 같은 고체 약물, 또는 주사제 등과 같은 액체 약물로서 통상적으로 공지된 방법에 따라 임의로 제조될 수 있다. 이러한 의약의 경우, 결합제, 붕해제, 증점제, 분산제, 재흡수 촉진제, 감미제, 완충제, 계면활성제, 용해 보조제, 방부제, 에멀젼화제, 등장제, 안정화제 또는 pH 조절제와 같은 임의의 물질을 사용하여 제조될 수 있다.
의약 중의 유효 성분 (녹차 추출물)의 투여량은 종류, 약물 형태, 환자의 연령, 체중 또는 적용하려는 증상 등에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어 경구 투여되는 경우, 이는 체중이 약 60kg인 성인에 대해 1일 당 1회 내지 수 회 투여되고, 1일 당 약 10mg 내지 5g, 바람직하게는 약 50mg 내지 2g의 양으로 투여된다. 유효 성분은 녹차 추출물 중 하나 또는 수 가지 성분일 수 있다.
방법은 또한 이러한 추출물을 1일 1회 이상, 1일 2회 이상, 1일 3회 이상으로 그리고 1일 1회 내지 15회로 투여하는 것을 포함한다. 이러한 투여는 수 일, 수 주, 수 개월 또는 수 년 동안 매일 이루어지는 것과 같이 연속적일 수 있거나, 특정 질환을 치료하거나 예방하기 위해 특정 시점에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 사람은 정신집중 (mental focus), 인지력 및 기억력을 위해, 2형 당뇨병을 예방하고 치료하기 위해, 심혈관질병 뇌졸중을 예방하기 위해, 또는 위장 장애를 치료하기 위해, 또는 통풍(gout)을 포함하는 관절염 및 염증 장애를 치료하기 위해, 또는 감기(common cold), 세균 및 진균 감염을 치료하기 위해 수 년간 1일 1회 이상 녹차 종 추출물을 투여받을 수 있다.
상기 설명은 본 발명을 수행하기 위한 최상의 현재 고려되는 형태를 포함한다. 이러한 설명은 본 발명의 일반 원리를 예시하기 위해 이루어진 것이며, 제한적인 의미로 파악되지 않아야 한다. 본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되는데, 이러한 실시예는 어떠한 식으로든 본 발명의 범위에 제한을 부과하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 반대로, 본원에 기재된 설명을 숙지한 후에 그 자체로 암시될 수 있는 그 밖의 다양한 구체예, 변형예 및 균등물이 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 당업자에 의해 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
본원에 사용된 모든 용어는 당업자에 의해 이들이 일반적으로 받아들여지는 의미로 해석되는 것으로 간주된다. 본원에 인용된 특허 및 특허 출원은 그 전체내용이 모두 참조로 포함된다.
예증
재료
식물: 4가지 유형의 중국 녹차 및 한 가지 유형의 일본 녹차를 본 발명에서 사용하였다.
F1: 중국 녹차 잎을 Nam Wan Tea Co Pte Ltd (Singapore)로부터 구입하였다.
F2: 중국 지앙수 프로빈스 (Jiangsu Province)에서 생산된 고급 중국 녹차 "Baifu Tea".
F3: Zhejing Kai Hua Co.에 의해 생산되고 봄철에 채취된 고급 중국 녹차 "Kai Hua Long Ding".
F4: Zhejing Kai Hua Co.에 의해 생산되고 가을철에 채취된 고급 중국 녹차 "Kai Hua Long Ding".
JPGT: 고급 일본 녹차.
표 19. 녹차의 활성 성분*
Figure 112008073723240-PCT00029
Figure 112008073723240-PCT00030
*정유는 2시간 동안 헥산 중의 공급원료 1g으로 초음파 추출에 의해 평가하였고; 카테킨, 카페인, 테오브로민 및 클로로겐산은 2시간 동안 메탄올 중의 공급원료 1g으로 초음파 추출에 의해 평가하였고; L-테아민 및 옥살산은 2시간 동안 물 중의 공급원료 1g으로 초음파 추출에 의해 평가하였다.
유기 용매
HPLC용 아세토니트릴(75-05-8), 구배 등급(gradient grade) > 99.9% (GC) (000687); 헥산 (110-54-3), 95+%, 분광광도 등급 (248878), 에탄올, 4.8% 이소프로판올로 변성됨 (02853); 에탄올 (64-17-5), 무수, (02883); 메탄올 (67-56-1), 99.93%, ACS HPLC 등급, (4391993); 및 물 (7732-18-5), HPLC 등급, (95304); 이들 모두 시그마-알드리치 컴퍼니로부터 구입하였다.
산 및 염기:
포름산 (64-18-6), 50% 용액 (09676); 페놀 (108-95-2) (P3653); 황산 (7664-93-9), ACS 시약, 95 - 97% (44719); 트리플루오로아세트산 (76-05-1), 99.8% 분광광도 등급 (302031) 인산 (7664-38-2), 물 중의 85% 용액 (438081); 이들 모두 시그마-알드리치 컴퍼니로부터 구입하였다. 인산 칼륨, 1가 (7778-77-0), >99% 순도 (205925000, Lot#: A019842601)을 아크로스 오가닉스 컴퍼니 (Acros Organics Co.)로부터 구입하였다.
화학 참조 표준물:
(+)-카테킨 (154-23-4), 순도 95% (03310); (-)-에피카테킨 (490-46-0), 순도 93.6% (05125); (-)-에피카테킨 갈레이트 (1257-08-5), 순도 99% (05135); (-)-에피갈로카테킨 (970-74-1), 순도 98.3% (05145); (-)-에피갈로카테킨 갈레이트 (989-51-5), 순도 94% (05151); L-테아닌 (3086-61-6), 순도: 99.0% (20250-001); 이들 모두 크로마덱스(Chromadex) (www.chromadex.com)로부터 구입하였다. 카페인 (58-0802), 푸룸(purum), 무수, >99% (27600); 테오브로민 (83-67-0), 순도 >99% (T4500); 및 클로로겐산 (327-97-9), 최소 95% 적정(titration) (C3878)을 시그마-알드리치 컴파니로부터 구입하였다. DIN에 따라 인증된 덱스트란 표준 5000 (00269), 50,000 (00891) 및 410,000 (00895)을 플루카 컴파니 (Fluka Co.)로부터 구입하였다. 옥살산 (144-62-7), 98% 순도 (194131)을 시그마 알드리치 컴퍼니로부터 구입하였다. 표준물의 구조는 표 20에 제시되어 있다.
표 20. 녹차에 대한 참조 표준물의 물리적 특성
Figure 112008073723240-PCT00031
방법
HPLC 방법
카테킨 및 알칼로이드 분석.
크로마토그래피 시스템: LClOADVP 펌프와 SPD-M 1OAVP 포토 다이오드 어레이 검출기가 장착된 시마주(Shimadzu) 고성능 액체 크로마토그래피 LC-10AVP 시스템. 수득된 추출 생성물을 역상 주피터(Jupiter) C18 컬럼 (250x4.6 mm I. D., 5μ, 300 Å) (페노메넥스(Phenomenex), 파트(Part) #: 00G-4053-E0, serial No: 2217520-3, Batch No.: 5243-17)에서 측정하였다. 이동상은 A (0.5% (v/v) 포름산 수용액) 및 B (아세토니트릴)로 이루어진다. 구배는 다음과 같이 프로그래밍시켰다: 처음 6분내에, A를 100%에서 유지, 6-10분, 용매 B를 0%에서 12%로 선형적으로 증가, 그리고 10-35분, B를 12%에서 21%로 선형적으로 증가, 그 후 35-40분, B를 21%에서 25%로 선형적으로 증가, 그리고 40-50분, B를 100%로 선형적으로 증가. 주입 부피는 10 μl이고 이동상의 유속은 l ml/min이었다. 컬럼 온도는 50℃였다.
C (카테킨), EGC (에피갈로카테킨), ECG (에피카테킨 갈레이트), EGCG (에피갈로카테킨 갈레이트), 카페인, 테오브로민, 클로로겐산의 메탄올 저장 용액을 1mg/ml의 농도로 제조하였다. 표준 용액의 1밀리리터 분취액을 10ml 부피 플라스크내로 옮겨서 혼합된 표준 용액을 수득하였다. 그 후, 혼합된 참조 표준 용액을 단계적으로 희석하여 최종 농도가 각각 0.5, 0.2, 0.1, 0.05 및 0.01mg/ml인 일련의 용액을 수득하였다. 표준 곡선을 이러한 5가지 농도에 대해 작도하는데, 선형 회귀법을 이용하여 상응하는 농도에 대해 피크 면적을 플롯팅하여 표준 곡선을 생성시켰다. 결과는 표 21에 요약되어 있다.
표 21. 메탄올 중의 0.1mg/ml의 농도의 녹차 참조 표준물에 대한 HPLC 분석 결과
Figure 112008073723240-PCT00032
Figure 112008073723240-PCT00033
테아닌 분석.
테아닌 분석을 역상 주피터 C18 컬럼 (250x4.6 mm I. D., 5μ, 300 Å) (페노메넥스(Phenomenex), 파트(Part) #: 00G-4053-E0, serial No: 2217520-3, Batch No.: 5243-17)에서 측정하였다. 이동상은 0.1%의 농도의 트리플루오로아세트산으로 조절되는 물이었다. 이동상의 유속은 1ml/min이었다. 검출기는 203nm의 파장으로 설정되었다.
옥살산 분석
옥살산 분석을 역상 주피터 C18 컬럼 (250x4.6 mm I. D., 5μ, 300 Å) (페노메넥스(Phenomenex), 파트(Part) #: 00G-4053-E0, serial No: 2217520-3, Batch No.: 5243-17)에서 측정하였다. 이동상은 A (0.5% KH2PO4 (w/v) 수용액) 및 B (아세토니트릴)로 구성되었다. 0.5% KH2PO4 (w/v) 수용액의 이동상은 고체 KH2PO4를 증류수에 용해시킴으로써 제조하였다. 그 후, 이를 1.0 mol/L H3PO4의 용액으로 pH 2.80으로 조정하였다. 구배는 다음과 같이 프로그래밍시켰다: 용매 B를 15분내에 10%에서 40%로 선형적으로 증가시킨 후, 추가 5분내에 40%에서 10%로 감소시킴. 주입 부피는 10 μl이고 이동상의 유속은 l ml/min이었다. 컬럼 온도는 25℃였다. 검출된 파장은 262nm였다. 0.1mg/ml 내지 10mg/ml의 물 중의 상이한 옥살산 농도를 검정하였다. 표준 곡선을 이들 농도에 대해 작도하는데, 선형 회귀법을 이용하여 상응하는 농도에 대해 피크 면적을 플롯팅하여 표준 곡선을 생성시켰다. 샘플 용액 중의 옥살산의 함량은 샘플 용액 중의 피크 면적을 공지된 표준물의 피크 면적과 비교함으로써 정량하였다.
GC-MS 방법
GC-MS 분석을 시마주 GCMS-QP2010 시스템을 사용하여 수행하였다. 시스템은 고성능 기체 크로마토그래프, 직접 결합된 GC/MS 인터페이스, 독립적인 온도 조절기능을 가진 전자 충격(EI) 이온 소스, 및 4중극자 질량 여과기 등을 포함한다. 데이터 획득 및 실행후(post run) 분석을 위해 시스템을 GCMS 솔루션 Ver. 2 소프트웨어로 제어하였다. 분리는 아래의 온도 프로그램을 사용하여 아길렌트(Agilent) J&W DB-5 용융(fused) 실리카 모세관 컬럼(30 m x 0.25 mm i.d., 0.25 μm 막 두께) (카탈로그: 1225032, serial No: US5285774H) 상에서 수행하였다. 초기 온도는 60℃이었고, 1분간 유지, 다음에 3℃/min의 속도에서 180℃로 증가시키고, 35분간 유지, 총 실행 시간은 약 76분이었다. 샘플 주입 온도는 220℃이고, 1μl의 샘플을 1분 간 비분할 모드(splitless mode)에서 자동 주입기에 의해 주입하였다. 운반 기체는 헬륨이었고, 유속은 40.1KPa에서 압력에 의해 제어하였다. 이러한 압력하에서, 유속은 0.79ml/min이었고, 선형 속도는 32.5cm/min이었다. MS 이온 소스 온도는 230℃였고, GC/MS 인터페이스 온도는 230℃였다. MS 검출기는 1000 AMU/초의 스캔 속도에서 50 내지 500의 m/z에서 스캐닝하였다. 용매 차단(cut off) 온도는 3.5분이었다.
다당류 분석
분광광도계 시스템: 시마주 UV-1700 자외선 가시광선 분광광도계 (190 - 1100 nm, 1mm 분해능)를 본 연구에 사용하였다. 비색법 (Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A. and Smith, F., Colorimetric Method for Determination of Sugars and related substances, Analytical chemistry, 1956, 28(3): 350-356)을 다당류 분석에 사용하였다. 0.1 mg/ml 덱스트란 (Mw = 5000, 50,000 및 410,000) 저장 용액을 제조하였다. 0.08, 0.16, 0.24, 0.32, 0.40 ml의 저장 용액을 취하고 증류수로 0.4 ml 부피로 만들었다. 그 후, 0.2 ml의 5% 페놀 용액 및 1ml의 농축된 황산을 첨가하였다. 혼합물은 UV 스캐닝을 수행하기 전에 10분간 방치하였다. 최대 흡광도는 488 nm에서 발견되었다. 그 후, 파장을 488 nm로 설정하고, 각 샘플에 대해 흡광도를 측정하였다. 결과는 표 21에 제시되어 있다. 표준 보정(calibration) 곡선을 각각의 덱스트란 용액에 대하여 하기와 같이 얻었다: 덱스트란 5000, 흡광도 = 0.01919 + 0.027782 C (μg), R2 = 0.97 (N = 5); 덱스트란 50,000, 흡광도 = 0.0075714 + 0.032196 C (μg), R2 = 0.96 (N = 5); 및 덱스트란 410,000, 흡광도 = 0.03481 + 0.036293 C (μg), R2 = 0.98 (N = 5).
표 22. 덱스트란 표준물에 대한 비색 분석.
Figure 112008073723240-PCT00034
녹차 추출물의 DART-MS 분석
JEOL AccuTOF-DART 질량 분석기 (Jeol USA, Peabody, MA)를 녹차 추출물의 질량 분광 분석에서 사용하였다. 이러한 비행시간(Time-of-Flight) (TOF) 질량 분석 기술은 샘플 제조를 필요로 하지 않고 (그렇지 않으면 최소의 샘플 제조를 필요로 함), 0.00001 질량 단위까지의 정확도로 질량을 산출해낸다. 양이온 모드 (DART+)의 경우, 니들(needle) 전압을 3500V로 설정하고, 가열 엘리먼트를 300℃로 설정하고, 전극 1을 150V로 설정하고, 전극 2를 250V로 설정하고, 헬륨 가스 흐름 을 3.69 리터/min (LPM)으로 설정하였다. 질량 분석기의 경우, 하기 설정치를 로딩하였다: 오리피스 1을 20V로 설정하고, 고리 렌즈(Ring Lens) 전압을 5V로 설정하고, 오리피스 2를 5V로 설정하였다. 약 100m/z에서 출발하는 분해능을 제공하기 위해 피크 전압을 1000V로 설정하였다. 마이크로채널 플레이트 검출기 (MCP) 전압은 2550V로 설정하였다. 보정은 100 내지 1000 질량 단위의 요구되는 질량 범위 전체에 걸쳐 질량 마커를 제공하는 PEG 600의 10% 용액을 사용하여 각각의 샘플에 대해 내부적으로 수행하였다.
녹차 샘플을 보로실리케이트 유리 융점 모세관의 폐쇄된 단부를 사용하여 분말로서 DART 헬륨 플라즈마내로 도입하였다. 샘플은 모세관상에서 박막으로서 모아져서 균일한 표면적이 He 플라즈마 빔에 노출될 수 있으며, 이는 TOF내로의 전달을 극대화시킨다. 모세관을 He 플라즈마에서 분석 당 약 3 내지 5초간 유지시킨다. 샘플의 열분해는 분석 동안 관찰되지 않았다.
음이온 모드 (DART-)의 경우, DART 및 AccuTOF-MS를 음이온 모드로 전환시켰다. 니들 전압은 3500V이고, 가열 엘리먼트는 300℃이고, 전극 1은 150V이고, 전극 2는 250V이고, 헬륨 가스 흐름은 3.69 LPM이었다. 질량 분석기의 경우, 하기 설정치를 로딩하였다: 오리피스 1을 -20V로 설정하고, 고리 렌즈 전압을 -5V로 설정하고, 오리피스 2를 -5V로 설정하였다. 음이온 모드에서 보다 낮은 m/z 범위에서 적절한 분해능을 달성하기 위해 피크 전압을 600V로 설정하였다. MCP 전압은 2600V로 설정하였다. 샘플을 양이온 모드와 정확히 동일한 방식으로 도입하였다. 보정은 퍼플루오르화 카르복실산의 용액을 사용하여 각각의 샘플에 대해 내부적으 로 수행하였다.
분자식은 JEOL AccuTOF DART-MS를 구비한 원소 조성 및 동위원소 매칭 프로그램에 의해 확인하였다. 녹차 성분의 검색가능한 데이터베이스를 문헌에 기초하여 개발하였다. 질량 스펙트럼에서의 모든 화학적 확인 (확인되거나 미확인됨)에 90% 이상의 신뢰 수준이 부여된다.
실시예 1
단계 1의 예: 녹차 정유의 단단계 SFE 추출 및 정제
모든 SFE 추출은 각각 690 바아 및 200℃까지의 압력 및 온도를 위해 설계된 SFT 250 (Supercritical Fluid Technologies, Inc., Newark, Delaware, USA) 상에서 수행하였다. 이 장치는 동적 또는 정적 모드에서 조작되기 위한 유연성을 지니며 초임계 조건에서 간단하고 유효한 추출을 가능하게 한다. 이 장치는 3개의 모듈, 즉, 오븐, 펌프와 제어부, 및 수집 모듈로 구성된다. 오븐은 1개의 예열 컬럼 및 1개의 100 ml 추출 용기를 갖는다. 펌프 모듈은 300 ml/min의 일정한 유량 용량을 갖는 압축 공기구동(air-driven) 펌프를 갖는다. 수집 모듈은 추출된 생성물의 회수를 위해 캡(cap) 및 격벽(septa)으로 밀봉된 40ml의 유리 바이알이다. 이 장치에는 마이크로미터 밸브 및 플로우 미터(flow meter)가 추가로 구비된다. 추출 용기 압력 및 온도는 +/- 3 바아 및 ± 1℃내에서 모니터하고 제어한다.
전형적 실험예에서, 140 메쉬 스크린에 의해 체질된 105 μm 이상의 크기를 갖는 절단된 녹차 잎 25g을 각각의 실험을 위해 100ml 추출 용기내로 로딩하였다. 충전된 용기가 로딩되기 전에 오븐을 요망되는 온도로 예열하였다. 용기가 오븐내 로 연결된 후, 시스템을 CO2 (850 psig)로 가압함으로써 누출에 대해 시험하고, 퍼징하였다. 시스템을 폐쇄하고, 공기구동 액체 펌프를 사용하여 요망되는 추출 압력으로 가압하였다. 그 후, 시스템을 약 3분간 평형을 이루도록 유지시켰다. 샘플링 바이알 (40ml)을 칭량하고, 샘플링 포트(port)에 연결하였다. CO2를 5 SLPM (9.8g/min)의 속도로 유동시킴으로써 추출을 개시하였는데, 이는 계량 밸브에 의해 제어된다. 사용된 전체 CO2 대 로딩된 미가공 물질의 중량의 중량비로 규정되는 용매/공급물 비를 계산하였다. 추출 공정 동안, 추출된 샘플을 5분 마다 칭량하였다. 추출은 샘플의 중량이 2회의 칭량 측정치 사이에 5% 이상 변화하지 않는 경우 완료된 것으로 추정되었다. 수율은 전체 추출물 대 미가공 공급원료 물질의 공급물의 중량비로 규정되었다.
이러한 실험예에서, 추출 조건은 설정되었는데, 여기서 온도는 40℃로 설정되고 압력이 200 바아로 설정되었다. CO2 유속은 9.8g/min이었다.
실시예 2
단계 2의 예: 녹차 식물 물질의 단단계 SFE 카페인제거
모든 SFE 추출은 SFT 250 (Supercritical Fluid Technologies, Inc., Newark, Delaware, USA) 상에서 수행하였다. 전형적인 실험예에서, 25gm의 증류수 공용매로 습윤된 절단된 녹차 잎으로부터 추출된 정유 25그램을 각각의 실험을 위해 100ml 추출 용기내로 로딩하였다. 충전된 용기가 로딩되기 전에 오븐을 요망되는 온도로 예열하였다. 용기를 오븐내로 연결한 후, 시스템을 CO2 (850 psig)로 가 압함으로써 누출에 대해 추출 시스템을 시험하고, 퍼징하였다. 그 후, 시스템을 약 3분간 평형을 이루도록 유지시켰다. 샘플링 바이알 (40ml)을 칭량하고, 샘플링 포트에 연결하였다. CO2를 5 SLPM (9.8g/min)의 속도로 유동시킴으로써 추출을 개시하였는데, 이는 계량 밸브에 의해 제어된다. 3ml의 공용매를 매 분 마다 시스템내로 투여하였다. 추출 시간은 4시간이었다. 사용된 전체 CO2 대 로딩된 미가공 물질의 중량의 중량비로 규정되는 용매/공급물 비를 계산하였다. 수율은 전체 추출물 대 미가공 공급원료 물질의 공급물의 중량비로 규정되었다. 추출 조건은 70℃ 및 500바아로 설정하였다.
실시예 3
단계 3의 예: 95% 에탄올 침출 추출
녹차 잎 물질의 카테킨 화학 성분의 2-스테이지 용매 추출의 전형적인 예는 다음과 같다: 공급원료는 단계 2 SCCO2 카페인제거로부터의 절단된 녹차 잎 SFE 잔류물 또는 미가공 녹차 잎 공급원료 25gm이었다. 용매는 250ml의 95% 에탄올이었다. 이러한 방법으로, 공급원료 물질 및 250ml의 95% 에탄올을 500ml 추출 용기내로 개별적으로 로딩하고, 70℃의 가열된 수조에서 2시간 동안 혼합하였다. 4 내지 8㎛의 입자 보유 크기를 지닌 피셔브랜드(Fisherbrand) P4 여과지를 사용하여 추출 용액을 여과하고, 3000rpm에서 20분간 원심분리하고, 미립자 잔류물을 추가의 추출을 위해 사용하였다. 여액 (상층액)을 수율 계산 및 HPLC 분석을 위해 수집하였다. 상기 언급된 방법을 이용하여 스테이지 1의 잔류물을 2시간 동안 추출하였 다 (스테이지 2). 상층 추출물을 합치고, 회전 증발기를 사용하여 에탄올을 분리하였다. 카테킨 분획의 추가 정제가 요망되는 경우, 알코올 비함유 미정제 카테킨 추출 생성물을 단계 4 처리를 위해 250ml의 증류수에 용해시킨다. 스테이지 2 추출의 잔류물은 테아닌 및 다당류 분획을 위한 추가 처리 (단계 5 참조)에 대해서와 동일하였다.
실시예 4
단계 4의 예: 카테킨 분획의 친화성 흡착 추출
전형적인 실험에서, 작업 용액은 단계 3의 녹차 2-스테이지 95% 에탄올 침출 추출의 투명한 수용액이었다. 이들 예의 경우, 25gm의 녹차 SFE 카페인제거된 잔류물을 단계 3에 기술된 바와 같이 70℃에서 250ml의 95% 에탄올을 사용하여 2-스테이지 침출 추출하였다 (용매 공급물 비 20/1). 2-스테이지 추출물을 합치고, 회전 증발기를 사용하여 에탄올을 분리하였다. 그 후, 증류수를 첨가하여 용액의 최초 농도 (500ml 부피)를 재구성하였다.
친화성 흡착 중합체 수지는 XAD7HP였다 (부록 1 참조). 30gm의 친화성 흡착제를 10mm의 ID 및 350mm의 길이를 지닌 유리 컬럼내로 충전시키기 전 및 후에 95% 에탄올 (4 내지 5 BV) 및 증류수 (4 내지 5 BV)로 예비세척하였다. 흡착제의 BV (베드 부피)는 35ml이었다. 4.8 내지 9.6mg/ml의 용액 농도를 지닌 100ml의 수용액 (탈에탄올화된 단계 3 침출 용액)을 1.2ml/min의 유속 (2 BV/hr)으로 충전된 컬럼내로 로딩하였다. 로딩 시간은 85분이었다. 로딩된 컬럼을 10 BV/hr의 유속으로 150ml의 증류수로 세척하였는데, 세척 시간은 25분이었다. 로딩된 컬럼을 카페 인제거하기 위해, 100ml의 10% 에탄올 중의 5% H2SO4를 사용하여 2.2ml/min (2 BV/hr)의 유속으로 카페인 화합물을 용리하였다. 용출물을 폐기하였다. 그 후, 250ml의 증류수를 사용하여 6ml/min (12 BV/hr)의 유속으로 또는 세척물 용액이 중성 pH가 될 때가지 컬럼을 세척하였다. 100ml의 80% 에탄올을 사용하여 1.2ml/min (2 BV/hr)의 유속으로 로딩된 컬럼으로부터 카테킨을 용리하였는데, 용리 시간은 85분이었다. 용리 동안, 6개의 분획 (F1 내지 F6)을 각각 0-0.7 (F1), 0.8-1.0 (F2), 1.0-1.1 (F3), 1.1-1.3 (F4), 1.3-1.6 (F5) 및 1.6-3 (F6) BV로 수집하였다. 그 후, 3 BV의 무수 에탄올을 사용하여 컬럼상의 잔류 화학물질을 3.6 BV/hr의 유속으로 씻어낸 후, 3 BV 증류수를 사용하여 3.8 BV/hr로 세척하였다. 로딩, 유출물, 세척물, 및 카페인 용출물을 모두 수집하고, 질량 함량에 대해 측정하고, HPLC를 사용하여 분석하여 카테킨 (EGCG, EGC, ECG, C), 카페인, 테오브로민 및 클로로겐산에 대해 측정하였다. 각각의 용리 분획을 수집하고, HPLC에 의해 분석하였다.
실시예 5
단계 5의 예: 다당류 및 테아닌의 추출을 위한 물 침출 공정
물 침출 공정의 전형적인 실험예에서, 단계 3의 95% 에탄올 침출 공정으로부터의 20gm의 잔류물 및 400ml의 증류수를 500ml 추출 용기내로 개별적으로 로딩하고, 70℃의 가열된 수조에서 2시간 동안 혼합하였다. 상부 투명층을 경사분리하고, 고형 잔류물의 제 2 스테이지 추출물을 동일한 방법을 이용하여 400ml의 증류수로 추출하였다. 2-스테이지 추출 용액을 2000rpm에서 10분간 원심분리하고, 피셔브랜드(Fisherbrand) P4 여과지 (4 내지 8㎛의 입자 보유 크기)를 사용하여 여과 하였다. 2-스테이지 경사분리된 상층 용액을 수집하고, 테아닌 함량에 대한 수율 계산 및 HPLC 분석을 위해 합쳤다.
실시예 6
단계 6의 예: 다당류 분획 및 테아닌 추출 및 정제
녹차의 수용성이고 에탄올 불용성인 정제된 다당류 분획 화학 성분 및 테아닌 화학 성분의 용매 추출 및 정제의 전형적인 실험예는 다음과 같다: 단계 3의 2 스테이지 95% 에탄올 침출 추출로부터의 20gm의 고형 잔류물을 단계 5에서 상기 기술된 바와 같이 2 스테이지 증류수 침출을 이용하여 추출하였다. 단계 5 2 스테이지 추출 용액을 합쳐졌다. 진공 회전 증발을 사용하여 투명한 상층 추출 용액을 농축시켜서 물 용매의 60%를 제거하였다. 그 후, 무수 에탄올을 첨가하여 75%의 최종 에탄올 농도가 되게 하였다. 이러한 용액을 1시간 동안 정치시켰고, 침전이 관찰되었다. 추출 용액을 2,000rpm에서 10분간 원심분리하고, 상층액을 경사분리하고, 동결건조시키고, 추가의 처리를 위해 보존하였다. 다당류 침전물을 수집하고, 동결건조시켰다. 건조된 다당류 분획을 칭량하고, 참조 표준물으로서 덱스트란을 사용하는 비색법을 이용한 다당류 순도의 분석을 위해 물에 용해시켰다. 또한, AccuTOF-DART 질량 분석법을 사용하여 다당류 분획을 구성하는 화합물의 분자량을 추가로 프로파일링하였다. 결과는 도 6 내지 11에 도시되어 있다.
L-테아닌을 함유하는 건조된 상층 생성물을 증류수에 용해시켜서 10% 용액이 되게 하였다. 이러한 용액에 4 부피의 무수 에탄올을 첨가하고, 혼합하고, 1시간 동안 정치시켰다. 그 후, 용액을 6,000rpm에서 10분간 원심분리하고, 경사분리하 였다. 침전물을 폐기하였다. 수집된 상층 용액을 60℃에서 진공 회전 증발을 이용하여 80% 에탄올 용액으로 농축시켰다. 이러한 80% 에탄올 용액을 실온으로 냉각되게 하였다. 그 후, 4 부피의 에탄올을 상기 용액에 첨가하였다. 이러한 용액을 테아닌 화합물의 결정화를 위해 0℃에서 24시간 동안 냉장고에 넣어두었다. 이러한 용액을 2000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 결정을 수집하고, 진공하에서 60℃에서 건조시켰다.
실시예 7
하기 성분들을 포뮬레이션(formulation)을 위해 혼합한다
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녹차의 추출물 150.0 mg
정유 분획 (10 mg, 7% 건조 중량)
카테킨 분획 (90 mg, 60% 건조 중량)
테아닌 분획 (20, 13% 건조 중량)
다당류 (30mg, 20% 건조 중량)
스테비오시드 (스테비아(Stevia 추출물) 12.5 mg
카복시메틸셀룰로스 35.5 mg
락토오스 77.0 mg
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총 275.0 mg
신규한 녹차의 추출물은 천연 근경(rhizome) 물질 또는 통상의 추출 생성물 에서 발견되는 것 보다 높은 질량 중량%로 정제된 정유 분획, 카테킨 분획, 테아닌 분획 및 다당류 분획을 포함한다. 포뮬레이션은 임의의 경구 투여 형태로 제조될 수 있고, 요망되는 생리학적, 정신적, 의학적 효과 (산화방지, 산소 자유 라디칼 소거, 및 니트로소화 억제 활성, 면역 증강, 항골다공증, 심혈관 질병 예방 및 치료, 뇌혈관 질병 예방 및 치료, 콜레스테롤 저하 활성, 암의 예방 및 치료, HIV의 치료 및 바이러스 질병, 체중 감소 및 열발생, 노화 방지, 당뇨병 관리, 기억력 및 인지력 증가, 불안 감소, 및 기분 고양)를 위해 필요한 경우 매일 또는 1일 당 15회까지 투여될 수 있다.
실시예 8
하기 성분들을 포뮬레이션(formulation)을 위해 혼합한다
---------------------------------------------------------------
녹차의 추출물 150.0 mg
정유 분획 (5mg, 3% 건조 중량)
페놀산 분획 (90.0mg, 60% 건조 중량)
테아닌 (10.0mg, 7% 건조 중량)
다당류 (45.0mg, 30% 건조 중량)
비타민 C 15.0 mg
수크랄로스(sucralose) 35.0 mg
녹두(Mung Bean) 분말 10:1 50.0 mg
모카 착향제 40.0 mg
쵸코렛 착향제 10.0 mg
---------------------------------------------------------------
총 300.0 mg
녹차의 신규한 추출 조성물은 천연 식물 물질 또는 통상의 추출 생성물에서 발견되는 것 보다 높은 질량 중량%로 정제된 정유, 카테킨, 테아닌 및 다당류 화학 성분 분획을 포함한다. 포뮬레이션은 임의의 경구 투여 형태로 제조될 수 있고, 요망되는 생리학적, 정신적, 의학적 효과를 위해 필요한 경우 1일 당 15회까지 안전하게 투여될 수 있다.
인용된 참고문헌:
Figure 112008073723240-PCT00035
Figure 112008073723240-PCT00036

Claims (55)

  1. 도 6 내지 25중의 어느 하나의 실시간 직접분석(Direct Analysis in Real Time, DART) 질량 분석 크로마토그램을 갖는 분획을 포함하는 녹차 종(green tea species) 추출물.
  2. 제 1항에 있어서, 추출물이 정유(essential oil), 폴리페놀, 다당류 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 포함하는 것인 녹차 종 추출물.
  3. 제 2항에 있어서, 정유가 n-헥사데칸산, 테트라데칸산, 9-헥사데카놀, 1-운데카놀, 1-헥사데카놀, 올레일 알코올, 9-옥타데센-1-올, 노나데카놀 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 녹차 종 추출물.
  4. 제 2항에 있어서, 폴리페놀이 카테킨, 플라바놀, 플라보놀 글리코시드 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 녹차 종 추출물.
  5. 제 4항에 있어서, 카테킨이 카테킨 (C), 에피카테킨 (EC), 에피카테킨 갈레이트 (ECG), 갈로카테킨 (GC), 에피갈로카테킨 갈레이트 (EGCG), 에피갈로카테킨 (EGC) 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 녹차 종 추출물.
  6. 제 4항에 있어서, 플라바놀이 퀘르세틴(quercetin) 및 루틴(rutin)으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 녹차 종 추출물.
  7. 제 4항에 있어서, 플라보놀 글리코시드가 캠프페롤(kaempferol)인 녹차 종 추출물.
  8. 제 2항에 있어서, 다당류가 글루코오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 람노오스, 크실로오스 우론산 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 녹차 종 추출물.
  9. 제 1항에 있어서, 카페인, 옥살산 또는 탄닌을 실질적으로 비함유하는 녹차 종 추출물.
  10. 제 2항에 있어서, 정유의 함량이 2 중량% 이상인 녹차 종 추출물.
  11. 제 2항에 있어서, 정유의 함량이 25 중량% 내지 90 중량%인 녹차 종 추출물.
  12. 제 2항에 있어서, 정유의 함량이 50 중량% 내지 90 중량%인 녹차 종 추출물.
  13. 제 2항에 있어서, 정유의 함량이 75 중량% 내지 90 중량%인 녹차 종 추출물.
  14. 제 2항에 있어서, 폴리페놀의 함량이 40 중량% 이상인 녹차 종 추출물.
  15. 제 2항에 있어서, 폴리페놀의 함량이 50 중량% 내지 90 중량%인 녹차 종 추출물.
  16. 제 2항에 있어서, 폴리페놀의 함량이 75 중량% 내지 90 중량%인 녹차 종 추출물.
  17. 제 2항에 있어서, 다당류의 함량이 15 중량% 이상인 녹차 종 추출물.
  18. 제 2항에 있어서, 다당류의 함량이 25 중량% 내지 90 중량%인 녹차 종 추출물.
  19. 제 2항에 있어서, 다당류의 함량이 50 중량% 내지 90 중량%인 녹차 종 추출물.
  20. 제 2항에 있어서, 다당류의 함량이 75 중량% 내지 90 중량%인 녹차 종 추출물.
  21. 제 1항에 있어서, 추출물이 2 중량% 내지 97 중량%의 정유, 15 중량% 내지 98 중량%의 카테킨, 4 중량% 내지 90 중량%의 테아닌(theanine) 및 9 중량% 내지 98 중량%의 다당류를 포함하는 것인 녹차 종 추출물.
  22. 제 1항에 따른 녹차 종 추출물을 포함하는 식품 또는 의약.
  23. a) 녹차 종 식물 물질을 초임계 이산화탄소 추출에 의해 추출하여 정유 분획 및 제 1 잔류물을 수득하는 단계;
    b) 녹차 종 식물 물질 또는 상기 단계 a)로부터의 제 1 잔류물을 알코올 추출에 의해 추출하여 폴리페놀 분획 및 제 2 잔류물을 얻는 단계; 및
    c) 상기 단계 b)로부터의 제 2 잔류물을 물 추출에 의해 추출하고 다당류를 알코올로 침전시켜서 다당류 분획을 수득하는 단계에 의해 녹차 종 식물 물질을 순차적으로 추출함으로써 정유 분획, 폴리페놀 분획 및 다당류 분획을 수득하는 것을 포함하여, 하나 이상의 소정의 특징을 갖는 녹차 종 추출물을 제조하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 단계 a)로부터의 제 1 잔류물이 초임계 이산화탄소 추출물에 의해 추가로 카페인이 제거되는 방법.
  25. 제 23항에 있어서, 폴리페놀 분획이 친화성 흡착 크로마토그래피에 의해 추가로 정제되는 방법.
  26. 제 23항에 있어서, 단계 a)가,
    1) 추출 용기에 분쇄된 녹차 종 식물 물질을 로딩(loading)하는 단계;
    2) 초임계 조건하에서 이산화탄소를 첨가하는 단계;
    3) 녹차 종 식물 물질과 이산화탄소를 소정의 시간동안 접촉시키는 단계; 및
    4) 수집 용기내에 정유 분획을 수집하는 단계를 포함하는 방법.
  27. 제 23항에 있어서, 초임계 이산화탄소 분획 분리 시스템을 사용하여 정유 분획을 분별(fractionation)함에 의해 정유 화합물 비율을 변경시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제 26항에 있어서, 초임계 조건이 35℃ 내지 90℃에서 60 바아(bar) 내지 800 바아의 압력을 포함하는 방법.
  29. 제 26항에 있어서, 초임계 조건이 40℃ 내지 80℃에서 60 바아 내지 500 바아의 압력을 포함하는 방법.
  30. 제 26항에 있어서, 시간이 30분 내지 2.5시간인 방법.
  31. 제 26항에 있어서, 시간이 1시간인 방법.
  32. 제 23항에 있어서, 단계 b)가,
    1) 폴리페놀 화학 성분을 추출하기에 충분한 시간 동안 분쇄된 녹차 종 식물 물질 또는 단계 a)부터의 제 1 잔류물을 알코올성 용매와 접촉시키는 단계;
    2) 단계 1)로부터의 추출된 폴리페놀 화학 성분의 수용액을 친화성 흡착 수지 컬럼에 통과시켜 폴리페놀 성분을 흡착시키는 단계;
    3) 산성 용리 용매를 사용하여 친화성 흡착제로부터 카페인 화합물을 용리하는 단계; 및
    4) 히드로-알코올성 용리 용매를 사용하여 친화성 흡착 수지로부터 폴리페놀 화학 성분을 용리하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 히드로-알코올성 용액이 에탄올과 물을 포함하며, 여기서 에탄올 농도가 10 내지 95 중량%인 방법.
  34. 제 32항에 있어서, 히드로-알코올성 용액이 에탄올과 물을 포함하며, 여기서 에탄올 농도가 25 중량%인 방법.
  35. 제 32항에 있어서, 단계 1)이 30℃ 내지 100℃에서 수행되는 방법.
  36. 제 32항에 있어서, 단계 1)이 60℃ 내지 100℃에서 수행되는 방법.
  37. 제 32항에 있어서, 시간이 1 내지 10시간인 방법.
  38. 제 32항에 있어서, 시간이 1 내지 5시간인 방법.
  39. 제 32항에 있어서, 시간이 2시간인 방법.
  40. 제 23항에 있어서, 단계 c)가,
    1) 다당류를 추출하기에 충분한 시간 동안 단계 b)로부터의 제 2 잔류물을 물과 접촉시키는 단계; 및
    2) 알코올 침전에 의해 수용액으로부터 다당류를 침전시키는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 물이 70℃ 내지 90℃인 방법.
  42. 제 40항에 있어서, 물이 80℃ 내지 90℃인 방법.
  43. 제 40항에 있어서, 시간이 1 내지 5시간인 방법.
  44. 제 40항에 있어서, 시간이 2 내지 4시간인 방법.
  45. 제 40항에 있어서, 시간이 2시간인 방법.
  46. 제 40항에 있어서, 알코올이 에탄올인 방법.
  47. 제 23항에 따른 방법에 의해 제조된 녹차 종 추출물.
  48. 피로갈롤, 피로갈롤의 25 내지 35 중량%의 테오필린/테오브로민, 피롤갈롤의 0.1 내지 5 중량%의 시킴산(schikimic acid), 피로갈롤의 0.1 내지 5 중량%의 쿠마르산, 및 피로갈롤의 0.1 내지 5 중량%의 3-메톡시-l-티로신을 포함하는 녹차 종 추출물.
  49. 테아닌, 테아닌의 20 내지 30 중량%의 테오필린/테오브로민, 테아닌의 1 내지 10 중량%의 카테킨/에피카테킨, 테아닌의 1 내지 10 중량%의 갈산, 테아닌의 0.1 내지 5 중량%의 카테킨 퀴논, 테아닌의 0.1 내지 5 중량%의 신남알데히드, 및 테아닌의 1 내지 10 중량%의 3-메톡시-l-티로신을 포함하는 녹차 종 추출물.
  50. 테아닌, 테아닌의 45 내지 55 중량%의 테오필린/테오브로민, 테아닌의 1 내지 10 중량%의 카테킨/에피카테킨, 테아닌의 0.1 내지 5 중량%의 카르노스산(carnosic acid), 테아닌의 1 내지 10 중량%의 갈산, 테아닌의 0.5 내지 5 중량% 의 카테킨 퀴논, 테아닌의 1 내지 10 중량%의 신남알데히드, 테아닌의 0.1 내지 5 중량%의 메틸 신남산, 테아닌의 1 내지 10 중량%의 신나미드, 및 테아닌의 1 내지 10 중량%의 3-메톡시-l-티로신을 포함하는 녹차 종 추출물.
  51. 피로갈롤, 피로갈롤의 1 내지 10 중량%의 테오필린/테오브로민, 피로갈롤의 0.1 내지 5 중량%의 테아닌, 피로갈롤의 1 내지 10 중량%의 카테킨/에피카테킨, 피로갈롤의 5 내지 15 중량%의 캠프페롤, 피로갈롤의 0.1 내지 5 중량%의 미리시틴, 피로갈롤의 0.1 내지 5 중량%의 갈로카테킨 퀴논, 피로갈롤의 65 내지 75 중량%의 갈산, 피로갈롤의 0.5 내지 5 중량%의 카테킨 퀴논, 피로갈롤의 1 내지 10 중량%의 바닐산, 및 피로갈롤의 1 내지 5 중량%의 3-메톡시-l-티로신을 포함하는 녹차 종 추출물.
  52. 캠프페롤, 캠프페롤의 1 내지 10 중량%의 테아닌, 캠프페롤의 95 내지 105 중량%의 카테킨/에피카테킨, 캠프페롤의 20 내지 30 중량%의 퀘르세틴, 캠프페롤의 5 내지 15 중량%의 미리시틴, 캠프페롤의 5 내지 10 중량%의 갈로카테킨 퀴논, 캠프페롤의 55 내지 65 중량%의 갈산, 캠프페롤의 1 내지 10 중량%의 카테킨 퀴논, 캠프페롤의 10 내지 20 중량%의 쿠마르산, 캠프페롤의 1 내지 10 중량%의 바닐산, 및 캠프페롤의 15 내지 25 중량%의 3-메톡시-l-티로신을 포함하는 녹차 종 추출물.
  53. 피로갈롤, 피로갈롤의 0.5 내지 5 중량%의 테오필린/테오브로민, 피로갈롤의 95 내지 105 중량%의 카테킨/에피카테킨, 피로갈롤의 55 내지 65 중량%의 캠프페롤, 피로갈롤의 20 내지 30 중량%의 퀘르세틴, 피로갈롤의 10 내지 20 중량%의 미리시틴, 피로갈롤의 20 내지 30 중량%의 갈로카테킨 퀴논, 피로갈롤의 50 내지 60 중량%의 갈산, 피로갈롤의 15 내지 25 중량%의 카테킨 퀴논, 피로갈롤의 15 내지 25 중량%의 쿠마르산, 피로갈롤의 1 내지 10 중량%의 바닐산, 및 피로갈롤의 0.5 내지 5 중량%의 3-메톡시-l-티로신을 포함하는 녹차 종 추출물.
  54. 피로갈롤, 피로갈롤의 0.5 내지 5 중량%의 테오필린/테오브로민, 피로갈롤의 95 내지 105 중량%의 카테킨/에피카테킨, 피로갈롤의 55 내지 65 중량%의 캠프페롤, 피로갈롤의 20 내지 30 중량%의 퀘르세틴, 피로갈롤의 10 내지 20 중량%의 미리시틴, 피로갈롤의 20 내지 30 중량%의 갈로카테킨 퀴논, 피로갈롤의 50 내지 60 중량%의 갈산, 피로갈롤의 15 내지 25 중량%의 카테킨 퀴논, 피로갈롤의 15 내지 25 중량%의 쿠마르산, 피로갈롤의 1 내지 10 중량%의 바닐산, 및 피로갈롤의 0.5 내지 5 중량%의 3-메톡시-l-티로신을 포함하는 녹차 종 추출물.
  55. 피로갈롤, 피로갈롤의 중량%의 테아닌, 피로갈롤의 90 내지 100 중량%의 카테킨/에피카테킨, 피로갈롤의 65 내지 75 중량%의 캠프페롤, 피로갈롤의 15 내지 25 중량%의 퀘르세틴, 피로갈롤의 5 내지 15 중량%의 미리시틴, 피로갈롤의 5 내지 15 중량%의 갈로카테킨 퀴논, 피로갈롤의 65 내지 75 중량%의 갈산, 피로갈롤의 5 내지 15 중량%의 카테킨 퀴논, 피로갈롤의 10 내지 20 중량%의 쿠마르산, 피로갈롤 의 1 내지 10 중량%의 바닐산, 및 피로갈롤의 1 내지 10 중량%의 3-메톡시-l-티로신을 포함하는 녹차 종 추출물.
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