JP2004507582A - アントシアニンに富む組成物の有効な製法 - Google Patents

Abstract

本発明は、植物の粗抽出物からアントシアニンに富む組成物を調製するための、一段カラムプロセスと二段カラムプロセスの両方を包含する。両方のプロセスには、臭素化ポリスチレン樹脂を用いた新規なカラム精製工程が包含される。本発明はまた、アントシアニンに富む抽出物を包含する。

Description

【０００１】
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、乾燥した植物材料又は生の植物材料からフェノール類に富む組成物を製造するのに有効な一段法又は二段法に向けられている。本発明は一層詳しく言えば、アントシアニン及びプロアントシアニンに富む組成物の製法を提供する。
【０００２】
（２．従来技術の記述）
アントシアニンは、天然に存在する化合物であって、多数の果実、野菜、穀物並びに花の赤色、紫色及び青色の原因となる化合物である。例えば、ブルーベリー、ビルベリー（ｂｉｌｂｅｒｒｉｅｓ）、イチゴ、ラズベリー、ボイゼンベリー、マリオンベリー（ｍａｒｉｏｎｂｅｒｒｉｅｓ）、クランベリー等の液果類の色は、多数の異なるアントシアニンに起因する。構造の異なる３００種を越えるアントシアニンが現実に認識されている。アントシアニンは天然に存在するため、それらは、食品及び飲料のための着色剤として使用するのに、多大の関心が寄せられてきた。
【０００３】
最近、諸アントシアニン色素に対する関心が高まってきた。なぜなら、それら色素は潜在的に食物抗酸化物質として健康上の利点があるからである。例えば、ビルベリーの諸アントシアニン色素（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ　ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ）は、視力を回復させ、また、循環障害を処置するために長い間使用されてきた。幾らかのアントシアニン及びフラボノイドは抗炎症特性を有するという実験的証拠がある。加えて、経口投与されたアントシアニンは、糖尿病及び潰瘍を処置するのに効果的であり、また、抗ウィルス活性及び抗菌力を有することがあるという報告がある。フラボノイドのこれら望ましい特性に対する化学的根拠は、それらの抗酸化能力（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｃａｐａｃｉｔｙ）に関係するものと思われている。このように、液果類及び他の諸果実並びに野菜に関連する抗酸化特性は、それらのアントシアニン含有量に起因してきた。
プロアントシアニンは、果実及び野菜の中に見出だされる、フラボノイド化合物のもう１つの種類であって、無色であり抗酸化活性を有する。
【０００４】
プロアントシアニン及びアントシアニンは上記特性及び利点を有するため、果実、野菜及び他の植物源からこれらの化合物を抽出することに多くの努力が成されてきた。植物、果実及び野菜はまた、アントシアニンの他に、他の諸化合物（例えば、鉱物塩；クエン酸又は酒石酸のような普通の有機酸；炭水化物（糖質）；フラボノイド配糖体；及びカテキン）も含有する。しばしば、これら化合物からプロアントシアニン及びアントシアニンを分離することは望ましい。アントシアニンは、植物及び果実から種々の手段によって抽出されてきた。アントシアニンを抽出する１つの抽出方法では、二酸化イオウが使用される。この抽出物は、アントシアニンを吸着するイオン交換カラムを通過し、次いで、吸着されたアントシアニンは、アセトン、アルカリ又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて溶離する。この方法の欠点には、二酸化イオウが存在することが包含される。二酸化イオウはアントシアニンの吸着を妨げ、そのため、多段カラム吸着（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）が必要である。アルカリによる溶離では、アントシアニンがかなり分解し、他方、ＤＭＦは公認の食品添加剤ではなく、従って、それらアントシアニンをあらゆる食品に添加することができる前に、アントシアニンからＤＭＦを完全に除去しなければならない。
【０００５】
シュリクハンデ（Ｓｈｒｉｋｈａｎｄｅ）は米国特許第４，４５２，８２２号明細書に、食品及び飲料のための着色剤として使用するための赤色着色剤の製法を開示する。その製法では、アントシアニンを含有する植物源材料を二酸化イオウで抽出して、アントシアニン物質から成る抽出物を形成する。この抽出物は、先ず、酵素を用いて処理して、該抽出物中に存在する固形物を減少させるか又は除去し；次いで、二酸化イオウを過酸化水素で酸化することによって処理する。ｐＨを低下させた後、該抽出物は、その中のアントシアニンを吸着するイオン交換媒体（スチレンとジビニルベンゼンポリマー又は架橋ポリメタクリル酸エステルとのコポリマー）に装填する。しかし、一旦イオウを取り入れてしまえば、そのイオウを全て除去することは非常に困難である。更に、過酸化水素は、最終製品中のアントシアニンを質的に低下させる。
【０００６】
ギャベッタ（Ｇａｂｅｔｔａ）等は米国特許第５，２００，１８６号明細書に、アントシアノシド（ａｎｔｈｏｃｙａｎｏｓｉｄｅｓ）を高含有量で有する抽出物の調製方法であって、粗抽出物を亜硫酸水素イオンで処理してアントシアニン−亜硫酸水素塩の付加物（ａｄｄｕｃｔｓ；付加化合物）を与える工程を包含する該調製方法を開示する。水性アルカリを添加することによって、抽出物のｐＨを５〜６に調整した後、抽出物は非極性ポリスチレン樹脂の上に装填し、次いで、アントシアニン−亜硫酸水素塩の付加物を溶離する。得られた溶液は、ブタノール又はアミルアルコールで繰返し抽出する。有機相を濃縮し、酸性化（ｐＨは１〜２）した後、アントシアニンを高含有量で有する抽出物は、凍結乾燥するか又は酢酸エチル等の非プロトン性溶媒を用いて沈降させることによって分離する。ここでもまた、一旦イオウを取り入れてしまえば、そのイオウ全てを除去することは困難である。加えて、ブタノール、アミルアルコール又は酢酸エチルを一旦取り入れると、これら溶媒を除去することは困難である。
【０００７】
ラングストン（Ｌａｎｇｓｔｏｎ）は米国特許第４，５００，５５６号明細書に、亜硫酸水素イオンを含有する水性抽出溶媒を接触させ、アントシアニン−亜硫酸水素イオン付加物を抽出することによって、ブドウの搾りかすからアントシアニン着色剤を製造する方法を開示する。その抽出物は、次いで、非イオン性吸着剤に接触させて、アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物を吸着させ；次いで、該吸着剤を洗浄して、可溶性の糖、有機酸、及び他の水溶性の非色素性物質を除去する。次いで、酸性化済み有機溶媒を用いて該吸着剤からアントシアニンを溶離する。ここでもまた、一旦イオウを取り入れてしまえば、そのイオウ全てを除去することは困難である。
【０００８】
リーティ（Ｌｉｅｔｔｉ）は米国特許第４，４１３，００４号明細書に、塩酸を含有する無水メタノールを用いてビルベリーを抽出し；次いで、酢酸鉛を添加して、アントシアニンを鉛塩として沈降させる；ことによって、その果実からアントシアニンを抽出する方法を開示する。しかし、鉛を使用すれば、この方法によって得られた生成物を食品に使用するのが不適切となる。
上記の諸例は、種々の植物材料からアントシアニンを抽出して分離するための、当該技術において知られている幾つかの方法を記述する。しかし、上記諸方法の各々には、毒性物質及び／又は環境に危険な物質を使用することを包含する。従って、アントシアニンを分離し精製するのに使用することのできる現行の諸方法は、有効な商業的方法であって種々の化学物質及び溶媒の廃棄を考慮すると、該方法の全体的に見た実行可能性の重要な役割を演じる該商業的方法まで容易にはスケールアップされない。更に、アントシアニンは、質的に低下（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）していくアントシアニンの自然な不安定性を最小限に抑えるやり方で分離しなければならない。
【０００９】
従って、栄養補給食品及び医薬品に使用するためのアントシアニンを含有する組成物を分離し且つ精製するための有効な方法であって、コスト効率が良く、拡張可能であり、経済的に健全であり；毒性の溶媒又は試薬を使用する必要がなく；しかも、質的に低下していくアントシアニンの自然な不安定性を最小限に抑えるやり方でアントシアニンを分離する該方法に対する必要性が依然として存在する。
【００１０】
（発明の概要）
従って、本発明によって、アントシアニンに富む組成物を抽出し、分離し、次いで、精製するための、簡略化された経済的方法が提供される。一層具体的に言えば、本発明の１つの面によれば、アントシアニンに富む組成物を調製する方法において、（ａ）アントシアニンを含有することが知られている植物又は植物の部分を抽出して、アントシアニン及び諸異質化合物を含有する粗抽出物を形成する工程と；（ｂ）亜硫酸水素イオン（ＨＳＯ_３ ⁻）源を添加して、アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物を含有する亜硫酸塩化済み抽出物を形成する工程と；（ｃ）前記亜硫酸塩化済み抽出物を濾過する工程と；（ｄ）前記の諸異物の一部を保持する第１の樹脂に、前記亜硫酸塩化済み抽出物を接触させる工程と；（ｅ）前記樹脂から、前記アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物を洗浄する工程と；（ｆ）第１の樹脂から洗浄された、部分的に精製された抽出物を酸性化して、前記アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物からアントシアニンを分離する工程と；（ｇ）アントシアニンは吸着するが、残りの異物は保持しない臭素化ポリスチレン樹脂に、前記酸性化済み抽出物を接触させる工程と；（ｈ）前記臭素化ポリスチレン樹脂からアントシアニンを溶離して、アントシアニンに富む抽出物を得る工程と；を包含する上記調製方法が提供される。
【００１１】
本発明によって、栄養補給食品及び医薬品として有用な、アントシアニン及びプロアントシアニンに富む組成物を調製する方法が更に提供される。一層詳しく言えば、本発明の１つの面によれば、アントシアニン及びプロアントシアニンに富む組成物を調製する方法において、（ａ）アントシアニンを含有することが知られている植物又は植物の部分を、酸性化された抽出溶媒で抽出して、アントシアニン及び諸異質化合物を含有する粗抽出物を形成する工程と；（ｂ）前記粗抽出物を濾過する工程と；アントシアニンは吸着するが、異物は保持しない臭素化ポリスチレン樹脂に、前記の濾過済み粗抽出物を接触させる工程と；（ｃ）前記臭素化ポリスチレン樹脂からアントシアニンを溶離して、アントシアニンに富む抽出物を得る工程と；を包含する上記調製方法が提供される。
【００１２】
本発明によると、本発明の方法によって分離された、アントシアニンに富む諸組成物が更に提供される。それら組成物は、栄養補給食品及び医薬品として有用である。
本発明の、上述の及び他の特徴と有用性と利点とは、本発明の好ましい諸態様に関する次の一層詳細な記述によって、また、諸添付図面に例示するように、更には、特許請求の範囲に詳細に示すように、明白になるものと思う。
諸添付図面は、本明細書に組み込まれており本明細書の一部を成しているが、本発明の好ましい諸態様を例示し、しかも、記述と一緒に、本発明の原理を説明するのに役立つ。
【００１３】
（発明の詳細な記述）
本発明の方法によって、天然にアントシアニンを含有する諸植物材料から、アントシアニンに富む精製済み抽出物と組成物とが生成される。本発明の方法によって、全アントシアニン及びプロアントシアニンに富む抽出物と組成物とが更に提供される。本明細書で使用する用語「抽出物（ｅｘｔｒａｃｔ）」は、天然にアントシアニンを含有する植物源に由来する物質を言い、全植物又は該植物の種々な部分（例えば、果実、葉、茎、根等）から調製される抽出物を包含する。このように、本発明の方法は、抽出物を調製するのに使用される植物の特定の部分に限定されない。加えて、植物材料は生の植物材料であっても乾燥した植物材料であってもよい。本発明の精製済み抽出物を調製するのに使用することのできる植物及び果実の諸例には、アントシアニンを含有するあらゆる植物（ブルーベリー、ビルベリー、ブラックベリー、イチゴ、アカフサスグリ、クロフサスグリ、クランベリー、サクランボ、ラズベリー、ブドウ、フサスグリの実、ニワトコの実、ハイビスカスの花、ピーマン、赤キャベツ、紫コーン及び紫サツマイモを包含する果実及び野菜が包含される）が包含される。多くの有色果実及び有色野菜は、アントシアニンを含有することが知られている。
【００１４】
本明細書に記述した、アントシアニンに富む諸組成物は、デルフィニジンクロリド標準液と比べる標準分光光度定量によって分析した。デルフィニジンクロリドはアグリコンであるのに対して、アントシアニンは配糖体（即ち、１種以上の糖質に結合したアグリコン）である。従って、本明細書に記述される、アントシアニンに富む諸組成物に対して与えられる全アントシアニン百分率は実質的に、全アグリコン百分率によって与えられている。従って、当業者には理解されると思うが、アントシアニンに富む諸組成物中の全アントシアニン（配糖体）百分率は実質的に、測定される全アグリコンより少なくとも１．４倍大きい。このように、請求項を含む本明細書の全体に渡って使用する用語「アントシアニン百分率」は、デルフィニジンクロリド標準液と比べて決定される全アグリコン百分率を言い、この測定値は全アントシアニンと関連付けることができる。
【００１５】
二段カラム精製プロセス
図１は、本発明の１つの態様の諸工程であって、アントシアニンに富む本発明の精製済み抽出物が二段カラム精製プロセス（ｔｗｏ−ｃｏｌｕｍｎ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ）によって調製することができる該諸工程を示す流れ図である。本発明の二段カラム精製プロセスには、臭素化ポリスチレン樹脂を使用して、部分的に精製した抽出物を精製する新規工程（工程６０、図１）が包含される。図１に例示する方法は、以下に詳細に解説する通り、第２のカラム精製工程（工程６０）において、当該技術で使用されている従来のポリスチレン樹脂に代えて臭素化ポリスチレン樹脂を使用することによって、他の諸ポリスチレン樹脂を使用した場合よりも純度が一層高い組成物が提供されるという発見に基づいている。
【００１６】
本明細書に記述する精製方法に先立って、植物材料からアントシアニン（典型的には、プロアントシアニンを伴う）を抽出して、粗抽出物を形成する（工程５、図１）。当業者は、バット抽出（ｖａｔ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）、パーコレーション（ｐｅｒｃｏｌａｔｉｏｎ）、向流抽出等の、文献に記載の種々の抽出方法を利用することができることを理解するであろう。採用される特定の抽出方法は、本発明の方法にとって極めて重要である訳ではない。抽出プロセスに先立って植物材料を粉砕する程度は、抽出溶媒が接触するのに十分な粒子表面積を与えるのが望ましい。
【００１７】
好ましい態様において、抽出プロセス（工程５、図１）は、生の植物材料又は乾燥した植物材料を適切な量の抽出溶媒の中に置いて、粗抽出物を形成することによって行う。１つの好ましい態様において、抽出溶媒は、水中にエタノール約０〜９５％、又は水中にメタノール約０〜１００％を有する水溶液から成る。植物材料は、ほぼ室温から７５℃、好ましくは４０℃の温度で、適切な量の時間の間、その抽出溶液に接触させる。抽出プロセスで使用する［植物材料］対［抽出溶媒］の量は、ｇ／ｍｌ基準で約２：１から約１：２０の間で変化し、約１：４〜１：８が好ましい。粗抽出物は、抽出溶媒に溶解している異物（例えば、植物ステロール、脂肪酸、トリグリセリド、糖類、有機酸、及び他のタイプのフラボノイド配糖体）の他に所望のアントシアニンを含有する。粗抽出物中に含有される植物固形物は、液体部分から分離され、次いで、該植物固形物は、上述のように再抽出するか又は廃棄する。
【００１８】
工程５（図１）の好ましい態様において、抽出プロセスの前又はその間に、ペクチナーゼを植物材料又は抽出溶媒に添加する。もう１つの方法として、ペクチナーゼは、抽出プロセスが完了した後、粗抽出物に添加することができる。ペクチナーゼは、カラム精製の間、抽出物が流動し得る状態であるように、抽出プロセスの間又はその後のいずれかの時点で該抽出物がゲル化するのを防ぐのに役立つ。添加するペクチナーゼの量は当然、抽出物を調製するのに使用する植物材料の量によって決まる。ペクチナーゼは典型的には、出発植物材料の約０〜０．１２重量％の量で添加する。
【００１９】
本発明の二段カラム精製プロセスの工程１０（図１）は、粗抽出物に亜硫酸水素イオン（ＨＳＯ_３ ⁻）を添加して、アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物を含有する抽出物を形成する工程を包含する。アントシアニンは正電荷を持つ分子であり、従って、負電荷を持つ亜硫酸水素イオンと反応するのに対し、粗抽出物に同様に存在するフラボノイド配糖体は亜硫酸水素イオンと反応しない。亜硫酸水素イオンは、好都合なやり方であれば如何なるやり方ででも（例えば、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸、ＳＯ_２ガス等を添加することによって）添加することができる。１つの態様において、二亜硫酸水素ナトリウムを水に溶解し、次いで、粗抽出物に添加する。添加する亜硫酸水素イオンの量は、好ましくは約１０〜２０当量であり、１５当量が好まれる。ここで、この粗抽出物は、抽出溶液に溶解した上述の諸異物（ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ）と一緒に、アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物を含有している。下記のように、アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物を形成することによって、粗抽出物中に存在する、複合体に形成されていない中性の（ｎｅｕｔｒａｌ；帯電していない）化合物からアントシアニンを分離することができる。
【００２０】
工程５（図１）で、粗抽出物を調製するのに、アルコール抽出溶液を使用した場合、亜硫酸塩化済み粗抽出物は工程２０において、それがアルコールを６％未満含有するまで濃縮する。濃縮の間４０℃以下の温度を維持するのが好ましい。水を添加して、濃縮された亜硫酸塩化済み粗抽出物を希釈し、次いで、希釈された亜硫酸塩化済み粗抽出物は、工程３０の前に濃縮して再び水で希釈するか；又は、第２の希釈を行わないで、工程３０に直接進む。粗抽出物を調製するときの抽出溶液として水を使用した場合は当然、濃縮工程２０は必要ではなく、また、この場合、図１の点線矢印で示す通り、工程１０からの粗抽出物は、工程３０に直接進む。
【００２１】
二段カラムプロセスの工程３０（図１）は、工程２０からの亜硫酸塩化済み粗抽出物を濾過して、該粗抽出物から沈降していたかも知れない固形分を除去する段階を包含する。濾過工程３０は、工程２０からの粗抽出物に実測量の濾過助剤を添加する段階を包含する。適切な濾過助剤の諸例には、珪藻土及びセルロースが含まれる。粗抽出物と濾過助剤の混合物は好ましくは、均一になるまで振盪するか又は撹拌する。その混合物は濾過助剤の層を通過させて濾過し、次いで、その層は脱イオン水で洗浄する。
【００２２】
濾過した亜硫酸塩化済み抽出物は、約３．５のｐＨであるが、次いで、本発明の二段カラムプロセスの第１の精製工程（工程４０、図１）で精製する。工程４０において、工程３０からの、濾過した亜硫酸塩化済み抽出物は、吸着性の材料又は樹脂であって、複合体に形成されていないフラボノイド配糖体、植物ステロール、脂肪酸及びトリグリセリドを吸着するものの、濾過した亜硫酸塩化済み抽出物中に含有されているアントシアニン−亜硫酸水素塩付加物をほとんど吸着しない該吸着性の材料又は樹脂に接触させる。第１の樹脂接触工程４０で使用する樹脂は、非イオン性の逆相架橋樹脂（ｒｅｖｅｒｓｅｄ　ｐｈａｓｅ　ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ　ｒｅｓｉｎｓ）である。第１の精製工程４０のための吸着剤として有用な非イオン性材料には、スチレン、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、アルキルビニルベンゼン、アクリルビニルベンゼン、メチルメタクリレート等の、重合によって得られた既知のマクロ孔質架橋ポリマーのあらゆる物が含まれる。１つの好ましい態様において、その樹脂は、例えばＣＧ−７１ｃｄアンバークロム（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ）［トーゾ・ハース（ＴｏｓｏＨａａｓ）；ペンシルベニア州（ＰＡ）、モンゴメリー（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）］のようなポリメタクリレート樹脂である。濾過した亜硫酸塩化済み抽出物中に存在する全アントシアニン１００ｇ当り、通常、約１リットルの樹脂が必要である。粗抽出物又は部分的に精製された抽出物を樹脂に接触させる諸工程は、カラムに装填されている樹脂にそれら抽出物を接触させるという表現で本明細書に記述するものの、そのような記述は単に説明を容易にするためのものである。従って、本発明の方法を実施するために、樹脂をカラムの中に充填する必要はない。
【００２３】
１つの態様において、工程４０（図１）の第１の樹脂をカラム中に充填し、次いで、濾過した亜硫酸塩化済み抽出物を第１の樹脂に、１分当り約１／２〜１カラム容積の速度で通過させる。即ち、工程４０の間、アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物は樹脂を通過するが、複合体に形成されていないフラボノイド配糖体、植物ステロール、脂肪酸及びトリグリセリドのような望ましくない諸異物はその樹脂に保持される。濾過した亜硫酸塩化済み抽出物の全てが樹脂を通過してしまった後、その樹脂は約１０カラム容積の脱イオン水で洗浄して、アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物の残渣を溶離する。工程４０からの装填物溶離液及び水性溶離液は、一緒にして第１の精製済み抽出物生成物を与える。第１の精製済み抽出物生成物は、その樹脂に保持されなかったアントシアニンに加えて、植物材料中に存在する糖類、塩、有機酸及び種々のフェノールだけでなく、アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物をも含有する。
【００２４】
アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物を含有する、工程４０からの第１の精製済み抽出物生成物は、濃硫酸を添加することによって、工程５０（図１）で混合しながら約１．０〜１．２５のｐＨまで酸性化する。この酸は、アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物を破壊するように作用して、結合体に形成されていないアントシアニンを与える。工程５０における酸性化済み溶液は、部分的に蒸発することによって濃縮して、酸性化の間に該付加物から放出される二酸化イオウ（ＳＯ_２）を除去する。工程５０からの酸性化済み溶液は、次いで、抽出物の第２の精製を行うために、工程６０に進める。
【００２５】
第２の精製工程（工程６０、図１）の目的は、工程５０（図１）からの酸性化済み溶液中に依然として存在する糖質、塩及び有機酸からアントシアニンを分離することである。このレベルの精製を達成するのに使用された従来の方法は、（例えば、ブタノール又はアミルアルコールのような溶媒を用いて、酸性化済み溶液を何回も抽出することによって）極性の有機溶媒の中にアントシアニンを抽出する工程を含む。しかし、ブタノール又はアミルアルコールを用いた抽出は、多くの理由により望ましくない。それら理由には、そのような溶媒は高沸点を有し、従って、蒸発によって除去することが困難であるという事実が含まれる。加えて、そのような溶媒は刺激物として分類されており、従って、特殊な廃棄処置が必要である。従って、ブタノール又はアミルアルコール用いた抽出を行うことによってアントシアニンを精製することは、望ましくないし；また、そのような溶媒の廃棄処置を検討することがプロセスの全体的実行可能性における重要な役割を演じる有効なプロセスでもない。
【００２６】
本発明の工程６０（図１）において、複合体に形成されていないアントシアニンを含有する、工程５０からの酸性化済み溶液は、第２の吸着性の材料又は樹脂に接触させる。工程６０で使用する第２の樹脂は、複合体に形成されていないアントシアニンを吸着することができるものの、酸性化済み溶液中に残存する望ましくない諸異物はほとんど保持しない。本発明者等は、三菱化学アメリカ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｍｅｒｉｃａ）によって製造されたＳＰ２０７［スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）；ペンシルベニア州（ＰＡ）、ベラフォンテ（Ｂｅｌｌａｆｏｎｔｅ）］のような臭素化ポリスチレン樹脂に工程５０からの酸性化済み溶液を接触させることにより、カラム上で該酸性化済み溶液を精製することによって、高純度のアントシアニン組成物を得るための有効で経済的な方法を発見した。ＳＰ２０７樹脂は、逆相クロマトグラフィに適用するために設計された、マクロ孔質の、臭素化スチレンポリマー・ビーズタイプの樹脂であり、約２５０〜６００μｍの粒径分布と、約１００〜３００Åの孔径範囲とを有する。芳香環を臭素化することによって、ポリスチレン樹脂の疎水性が増大し；且つ、従来のスチレン又はジビニルベンゼンポリマーの逆相保持体と比較して、疎水性分子の選択性が増大した樹脂を与えるように設計されている。臭素化ポリスチレン樹脂は強束縛特性（ｔｉｇｈｔ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を有するため、該樹脂は天然生成物を精製するのには使用されない。このように、従来のポリスチレン樹脂はアントシアニンと非常に強く結合する傾向があって、ポリスチレン樹脂からアントシアニンを溶離することは非常に困難であるということが知られていたので、臭素化ポリスチレン樹脂もアントシアニンと更に一層強く結合するものと予想された。このように、臭素化ポリスチレン樹脂がアントシアニンを精製するのに適していることは予想されなかった。しかし、本発明者等は、驚くべきことであり且つ意外なことであるが、臭素化ポリスチレン樹脂は、臭素化されていないポリスチレン樹脂と比較して一層弱くアントシアニンと結合するものの、アントシアニンよりも一層強い極性の望ましくない諸異物からアントシアニンを依然として分離するということを見出だした。
【００２７】
精製工程６０を行うために、工程５０からの濃縮された酸性化済み生成物を、カラムに充填される樹脂のような臭素化ポリスチレン樹脂と接触させる。精製工程６０のために、樹脂を充填したカラムを使用する場合、樹脂１リットル当り通常約４０ｇのアントシアニンをカラムの上に装填する。濃縮された酸性化済み生成物中の固形分濃度が２００ｇ／リットルを越える場合、水で希釈する必要があるかも知れない。
臭素化ポリスチレン樹脂の上に、濾過された酸性化済み抽出物を装填した後、吸着剤に対してほとんど又は全く親和性のない望ましくない物質（例えば、糖質、塩、有機酸等）はとりわけ、０．１％の水性酢酸を用いて該樹脂から洗浄する。次いで、所望のアントシアニンは、５０〜７５％エタノール／水、又は５０〜１００％メタノール／水のような極性有機溶媒を用いて、その樹脂から溶離する。その樹脂からアントシアニンを溶離するためには、約４〜１０カラム容積の溶離液が必要である。溶離液からのアントシアニンの回収は、蒸発、蒸留、凍結乾燥法等の好都合なやり方であれば如何なるやり方ででも達成して、本発明の富化抽出物を与えることができる。
【００２８】
本発明の二段カラムプロセスで使用する条件によって、アントシアニンに富む抽出物が与えられ、ブルーベリー抽出物の最終生成物はアントシアニンを該抽出物の少なくとも８重量％含有する。例えば、１つの態様において、富化済みブルーベリー抽出物の最終生成物は、アントシアニンを約８〜４０重量％含有する。もう１つの態様において、富化済みブルーベリー抽出物の最終生成物は、アントシアニンを約１５重量％含有する。幾つかの態様において、富化済みブルーベリー抽出物の最終生成物はまた、プロアントシアニンを少なくとも５重量％含有する。
本発明の二段カラムプロセスによって、アントシアニンを少なくとも８重量％含有するビルベリー抽出物も与えられる。１つの態様において、ビルベリー抽出物は、アントシアニンを約８〜５５重量％、一層好ましくは全アントシアニンを約２８重量％〜４５重量％含有する。幾つかの態様において、その抽出物はまた、プロアントシアニンを少なくとも５重量％含有する。上述の二段カラムプロセスによると、第１のカラムと第２のカラムの両者の上に多く装填することができ、好都合である。
【００２９】
一段カラム精製プロセス
図２は、本発明の第２の態様の諸工程であって、アントシアニンに富む本発明の精製済み抽出物が一段カラム精製プロセス（ｏｎｅ−ｃｏｌｕｍｎ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ）によって調製することができる該諸工程を示す流れ図である。本発明の一段カラム精製プロセスによって、アントシアニンに富む諸組成物であって栄養補給食品として使用するのに適した濃度の全アントシアニンを含有する該組成物が与えられる。プロアントシアニンが存在することを測定するのは困難であるが、一段カラムプロセスから分離された諸組成物もまたプロアントシアニンを含有するものと考えられている。本発明の一段カラムプロセスでは、上述の二段カラムプロセスにおいて使用する第１のカラム（工程４０、図１）を排除する。更に、本発明の一段カラムプロセスでは、本発明の二段カラム精製プロセスの亜硫酸塩化工程（工程１０、図１）が排除され、従って、亜硫酸塩化用試薬を使用する必要性が排除され、次には、二段カラムプロセスの酸性化工程５０（図１）が排除されて好都合である。このように、本発明の一段カラムプロセスによると、プロセスの幾つかの工程を排除することによって、また、プロセス中で必要とされる諸試薬の量を減少することによって、更に一層経済的で且つ有効な、アントシアニンに富む組成物を得る方法が提供され、それによって、製造コスト及び廃棄処理問題が低減される。
【００３０】
本発明の一段カラムプロセスの好ましい態様では、図２の工程１０５〜１６０に例示される通り、アントシアニンは生の植物材料又は乾燥した植物材料から抽出する（工程１０５、図２）。二段カラムプロセスで記述したように、バット抽出（ｖａｔ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）、パーコレーション、向流抽出等の、文献に記載の種々の抽出方法を利用することができる。採用される特定の抽出方法は、本発明の方法にとって極めて重要である訳ではない。抽出プロセスに先立って植物材料を粉砕する程度は、抽出溶媒が接触するのに十分な粒子表面積を与えるのが望ましい。
【００３１】
抽出プロセス（工程１０５、図２）は好ましくは、適切な量の抽出溶媒の中に、生の植物材料又は乾燥した植物材料を置くことによって達成する。１つの好ましい態様において、抽出溶媒は、水中にエタノール約０〜９５％を有する酸性化済みアルコール溶液と；約０．５〜３重量％、一層好ましくは約０．５〜１．０重量％の量の適切な酸と；を含有する。もう１つの好ましい態様において、抽出溶媒は、水中にメタノール約０〜１００％又は水中にエタノール約０〜９５％を有する酸性化済みアルコール溶液と；適切な酸約０．５〜３重量％と；を含有する。抽出工程で使用することのできる適切な酸には、硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４）又は塩酸（ＨＣｌ）が包含される。植物材料は、ほぼ室温〜７５℃、好ましくは４０℃の温度で、適切な量の時間の間、その抽出溶液に接触させる。抽出プロセスで使用する［植物材料］対［抽出溶媒］の量は、ｇ／ｍｌ基準で約２：１から約１：２０の間で変化し、約１：４〜１：８が好ましい。粗抽出物は、抽出溶媒に溶解している異物（例えば、植物ステロール；脂肪酸；トリグリセリド；並びに、アントシアニンよりも一層極性の大きい望ましくない化合物）の他に該アントシアニン（及び十中八九、プロアントシアニン）を含有する。粗抽出物中に含有される固形物残渣は、液体部分から分離し、次いで、該残渣は、上述のように再抽出するか又は廃棄する。
【００３２】
工程１０５（図２）の１つの態様において、抽出プロセスの前又はその間に、ペクチナーゼを植物材料又は抽出溶媒に添加する。もう１つの方法として、ペクチナーゼは、抽出プロセスが完了した後、粗抽出物に添加することができる。ペクチナーゼは、カラム精製の間、抽出物が流動し得る状態であるように、抽出プロセスの間又はその後のいずれかの時点で該抽出物がゲル化するのを防ぐのに役立つ。添加するペクチナーゼの量は当然、抽出物を調製するのに使用する植物材料の量によって決まる。ペクチナーゼは典型的には、植物材料の約０〜０．１２重量％の量で添加する。
【００３３】
粗抽出物を調製するのに、エタノール抽出又はメタノール抽出物を使用した場合、粗抽出物は、該粗抽出物がエタノール又はメタノールを６％未満含有するまで濃縮する。濃縮の間、４０℃以下の温度を維持するのが好ましい。水を添加して、濃縮された粗抽出物を希釈し、次いで、希釈された粗抽出物は、工程１３０の前に濃縮して再び水で希釈するか；又は、第２の希釈を行わないで、工程１３０に直接進む。粗抽出物を調製するときの抽出溶液として水を使用した場合は当然、濃縮工程１２０は必要ではなく、また、この場合、図２の点線矢印で示す通り、工程１０５からの粗抽出物は、工程１３０に直接進む。
【００３４】
一段カラムプロセスの工程１３０（図２）は、工程１２０からの粗抽出物を濾過して、該粗抽出物から沈降していたかも知れない固形分を除去する段階を包含する。本発明者等は、抽出溶液から沈降する望ましくない諸異質化合物の量は、工程１０５における抽出条件を調整することによって増大させることができることを見出だした。沈降した諸異質化合物は次いで、工程１３０の濾過によって容易に除去することができる。本発明の一段カラムプロセスの濾過工程１３０では、種々の濾過方法を採用することができる。工程１３０で採用することのできる１つの濾過方法は、計量した量の濾過助剤（例えば、珪藻土又はセルロース）を粗抽出物に添加する工程を包含する。粗抽出物と濾過助剤の混合物は、好ましくは均一になるまで振盪するか又は撹拌し、次いで、その混合物は、濾過助剤の層を通して濾過する。その層は、水性酸溶液、好ましくは約１％の水性硫酸で洗浄する。
【００３５】
工程１３０で使用することのできる他の濾過方法には、砂を通すか、又は、好ましくはガラスウールで塞がれた３０μｍのポリプロピレンフィルタを通して、粗抽出物を濾過することが包含される。更にもう１つの濾過方法には、バグフィルタ（ポリエチレン又はポリプロピレンから成る袋形状の布フィルタ）を使用することが包含される。このバグフィルタは、以下に記述するように、工程１６０の精製用カラムと直列に設置するのが好ましい場合がある。
【００３６】
工程１６０（図２）において、所望のアントシアニンと、望ましくない諸異質化合物とを含有する、工程１３０からの濾過済み抽出物は、アントシアニン（及びプロアントシアニン）を吸着することのできる、臭素化ポリスチレン吸着材又は樹脂に接触させる。二段カラムプロセスにおいて上述したように、本発明者等は、驚くべきことであり且つ意外なことであるが、臭素化ポリスチレン樹脂は、臭素化されていないポリスチレン樹脂と比較して一層弱くアントシアニンと結合するものの、糖類、塩、有機酸等の望ましくない諸異質化合物からアントシアニンを依然として完全に分離するということを見出だした。また、粗抽出物又は部分的に精製した抽出物を樹脂に接触させる諸工程は、本明細書では、カラムの中に充填した樹脂にそれら抽出物を接触させるという表現で記述しているが、そのような記述は単に説明を容易にするためのものである。要するに、本発明の方法を実施するために、樹脂をカラムの中に充填する必要はない。
【００３７】
精製工程１６０の１つの態様において、工程１３０からの濾過済み粗抽出物は、約２５０〜６００μｍの粒径分布と約１００〜３００Åの孔径範囲とを有する臭素化ポリスチレン樹脂を充填したカラムの上に装填する。カラムの上に装填する粗抽出物の量は、粗抽出物を調製するのに使用する植物材料によって決まる。例えば、粗抽出物をビルベリーから調製する場合、樹脂１リットル当り約１６〜３０ｇのアントシアニンを装填することができる。粗抽出物をブルーベリーから調製する場合、樹脂１リットル当り約９〜２５ｇのアントシアニンを装填することができる。濃縮した粗抽出物の固形分濃度が粗抽出物１リットル当り２００ｇを越える場合、該粗抽出物は装填する前に水で希釈することができる。
【００３８】
樹脂の上に濾過済み粗抽出物を装填した後、糖類、塩、有機酸等の望ましくない諸物質は、吸着剤とほとんど又は全く親和性がないが、具体的に言えば、０．１％水性酢酸を用いて樹脂から洗い落とす。それら異物を溶離するためには、約２カラム容積の０．１％水性酢酸を使用するのが好ましい。次いで、極性の有機溶離液（例えば、５０〜７５％のエタノール／水又は５０〜１００％のメタノール／水）を用いて、所望のアントシアニン（及びプロアントシアニン）を溶離する。樹脂からアントシアニンを溶離するためには、約４〜１０カラム容積の溶離液が必要である。本発明の富化抽出物を与えるためには、溶離液からのアントシアニンの回収を、例えば、蒸発、蒸留、凍結乾燥等の好都合な如何なるやり方ででも達成することができる。
【００３９】
上述の一段カラムプロセスは、アントシアニンを含有する種々の植物材料（例えば、ブルーベリー、ビルベリー、ブラックベリー、イチゴ、アカフサスグリ、クロフサスグリ、クランベリー、サクランボ、ラズベリー、ブドウ、フサスグリの実、ニワトコの実、ハイビスカスの花、ピーマン、赤キャベツ、紫コーン及び紫サツマイモ）から、栄養補給食品として使用するためのアントシアニンに十分富んだ組成物を調製するのに適している。例えば、富化抽出物を乾燥したビルベリーから調製した場合、本発明の一段カラムプロセスを使用して調製した富化済みビルベリー抽出物の最終生成物は、全アントシアニンを少なくとも８重量％含有した。例えば、１つの態様において、富化済みビルベリー抽出物の最終生成物は、全アントシアニンを約８〜５０重量％含有する。もう１つの例では、富化抽出物は、乾燥したブルーベリーから、本発明の一段カラムプロセスを使用して調製し、本発明の一段カラムプロセスを使用して調製した富化済みブルーベリー抽出物の最終生成物は、全アントシアニンを約８〜３５重量％含有した。上述のように、アントシアニンを含有する多くの植物材料はまた、他の諸フェノール化合物を含有する。従って、本発明の富化抽出物の最終生成物はまた、全フェノールを少なくとも２０重量％含有する。「全フェノール」は、本発明の方法によって調製される富化抽出物で分離される種々のフェノール化合物全ての全量を意味する。本発明の方法で使用する植物材料中に存在する諸フェノール化合物の種類は、当業者には周知であり、更に記述する必要はない。
【００４０】
本発明の二段カラムプロラス又は一段カラムプロラスのいずれかによって得られた富化抽出物を更に精製することが望ましい場合、上述の富化抽出物はアニオン交換樹脂に接触させて、富化抽出物中に依然として存在することもある有機酸を除去することができる。富化抽出物を更に精製するのに適したアニオン交換媒体には、弱アニオン交換樹脂、例えば、ジエチルアミノエタノール樹脂［例えば、ＤＥＭ−６３（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ））、又はＴｏｙｏｐｅａｒｌ　ＤＥＡＥ−６５０Ｍ（トーゾ・ハース（ＴｏｓｏＨａａｓ））］が包含される。もう１つの方法として、本発明の富化抽出物を更に精製するためには、強アニオン交換樹脂を使用することができる。強アニオン交換樹脂の例には、例えば、Ｓｕｐｅｒ　Ｑ−６５０Ｍ（トーゾ・ハース）のような第四級アミン樹脂が包含される。アニオン交換樹脂は、弱アニオン交換樹脂であるのが好ましい。アニオン交換カラムによる精製を行うために、富化抽出物は、水に溶解して、アニオン交換樹脂に接触させる。このアニオン交換樹脂は、カラム中に充填する場合もある。その樹脂は、水で洗浄して、富化抽出物を更に溶離する。乾燥したブルーベリーから分離した全アントシアニンを約２４％含有する富化抽出物は、アニオン交換樹脂を用いた更なる精製工程にかければ、更に富化された全アントシアニン約３８％になる。
【００４１】
図３及び図４は、それぞれ、５１０ｎｍ及び２８０ｎｍの一段カラムプロセスに従って調製したビルベリー抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。表１に、図３のＨＰＬＣによって同定した最終ビルベリー抽出物中の各々のアントシアニドの百分率をまとめる。
【００４２】

【００４３】
図５及び図６は、それぞれ、５１０ｎｍ及び２８０ｎｍの一段カラムプロセスに従って調製したブルーベリー抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
本発明の富化抽出物は、ピル、カプセル、又はチンキ剤として配合することができる。本発明による組成物を配合する場合、広範囲に渡る賦形剤を使用することができる。それら賦形剤の性質は当然、その組成物の意図される適用形態によって決まる。賦形剤の諸例には、防腐剤、キャリヤ、緩衝剤、増粘剤、沈澱防止剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤、及び調味料剤、とりわけ、カルボキシビニルポリマー、プロピレングリコール、エチルアルコール、水、セチルアルコール、飽和植物トリグリセリド、脂肪酸エステル又はプロピレングリコール、トリエタノールアミン、グリセロール、デンプン、ソルビトール、カルボキシメチルセルロース、硫酸ラウリル、リン酸二カルシウム、レシチン等が包含される。
【００４４】
本発明の富化抽出物は、栄養補助食品（例えば、食品の酸化防止剤）として、また、ヒト及び哺乳動物を処置するために使用することができる。例えば、本発明の富化抽出物は、視力を回復させるために、また、循環障害、糖尿病及び潰瘍を処置するために使用することができる。加えて、富化抽出物は、抗炎症剤及び抗菌剤として使用することができる。
以上の記述は、本発明の原理のみを説明するものとみなす。更に、当業者は、多くの部分的修正及び変形を容易に思い付くものと思われるので、本発明を、上述のように示される抽出の構造及びプロセスに限定することは望ましくない。従って、適切な部分的修正及び同等の物が、特許請求の範囲に規定する発明の範囲に包含されることを求める。
【００４５】
用語「包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ；含有する）」、「包含している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ；含有している）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ；含む）」、「包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｅ；含んでいる）」、及び「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ；含む）」は、本明細書で使用する場合、記載される特徴、完全体、成分、又は工程が存在することを特定するように意図されているものの、それら用語は、１つ以上の他の、特徴、完全体、成分、工程若しくはそれらの群が存在すること、又は付加されることを妨げるものではない。
【００４６】
実施例
例１−水抽出による、ビルベリーの一段カラムプロセス精製
乾燥したビルベリーの原材料１ｋｇについて、３種の抽出を行った。１つの抽出では、水６リットルを使用し、他の２つの抽出では、水４リットルを使用した。抽出は全て、酸性化して５ｇ／リットルの硫酸にした。抽出物中へのアントシアニンの回収率は約８８％であった。精確に２．３リットルの粗抽出物は、フィルタの上にガラスウール層を有する、ポリプロピレン３０μｍのフィルタを通して濾過した。そのガラスウールは一回交換し、次いで、該フィルタは脱イオン水で洗い流した。濾液の最終容量は、２．４３リットルであり、濾液中のアントシアニンの回収率は９０．９％であった。
【００４７】
カラムは、臭素化ポリスチレン樹脂ＳＰ２０７［スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）；ペンシルベニア州（ＰＡ）、ベラフォンテ（Ｂｅｌｌａｆｏｎｔｅ）］を装填し、０．１％酢酸を用いて平衡状態に保った。カラムは、２９．８ｇ／リットルの固形分濃度及び２．２ｍｌ／分の流量で、濾液２．２４リットルを装填した。装填流出（ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｌｅｅｄ）は０．９％未満であり、装填及び最初の２回のカラム洗浄によってアントシアニン４．０７％の総合損失があった。溶離工程でのアントシアニンの回収率は８８．４％であり、アントシアニンの物質収支は９２．５％であった。数百ｍｌの溶離生成物は、回転蒸発器で蒸発させて乾燥し、次いで、凍結乾燥した。最終分析は、乾燥生成物の、デルフィニジンクロライド標準液（１．０ｃｍで１０２吸光度単位／ｇ／リットル）に対する５３５ｎｍでの吸光度を標準分光光度定量することによって行った。富化組成物は、全アントシアニンを４３重量％含有した。
【００４８】
例２−７０％エタノール抽出による、ビルベリーの一段カラムプロセス精製
アントシアニンを２．０％含有した、乾燥済みビルベリーのバイオマス（６６７ｇ）は、硫酸を３％含有する７０％エタノール／水を使用したパーコレーションによって抽出した。粗抽出物は、全アントシアニンを３．９％含有した。最初の抽出容量の１リットルは、脱イオン水１００ｍｌと混合し、真空で蒸発させて、約４６０ｍｌにした。その混合物に脱イオン水（３００ｍｌ）を添加し、次いで、更に１７０ｍｌの液を蒸発させた。脱イオン水（２１０ｍｌ）を添加して、最終容量８００ｍｌにした。その水性混合物に、セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）５１２を１５０ｇ（固形分１ｇ当り、セライト０．５〜０．９ｇ）添加した。その混合物は、均一になるまで振盪した。セライト／抽出物の混合物は、真空下、湿ったセライト５１２の層３０ｇの上に注いだ。濾過が完了した時、その層は、１％水性硫酸１．２０リットルを２００ｍｌずつ用いて洗浄した。濾液容量は１８５５ｍｌであった。その濾液に脱イオン水１４５ｍｌを添加して、最終容量２．０リットルを与えた。その濾液は、臭素化ポリスチレン樹脂［スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）］１７０ｍｌを装填したカラムの上に２．２ｍｌ／分（１．３ｍｌ／ｃｍ^２／分）で装填した。装填した量は６９５ｍｌであり、カラム媒体１リットル当りアントシアニン１７ｇの装填値を与えた。カラムは、０．１％水性酢酸の１カラム容積、及びＨＯＡｃ　０．１％／エタノール１０％／水９０％の２．５カラム容積で洗浄した。アントシアニンは、７０％エタノール／水の１０カラム容積で溶離した。生成物は、６０℃及び５０ミリバールで真空蒸発し、黒色の乾燥した光沢のある非晶質固体にした。最終分析は、乾燥生成物の、デルフィニジンクロライド標準液（１．０ｃｍで１０２吸光度単位／ｇ／リットル）に対する５３５ｎｍでの吸光度を標準分光光度定量することによって行った。富化組成物を分析し、全アントシアニン純度３２重量％を含有した。
【００４９】
例３−ビルベリーの二段カラム精製
乾燥したビルベリー（１．００ｋｇ）をウィリーミル（Ｗｉｌｅｙ　ｍｉｌｌ）で約２ｍｍに粉砕した。粉砕済みバイオマスは、秤量して、１０リットル丸底フラスコの中に入れた。そのフラスコに、９０％エタノール／水を４．００リットル添加した。混合物は、大気圧下、９０回転／分（ｒｐｍ）で回転する回転蒸発器の上に置き、７４℃の温度で４時間の間保持した。混合物は、室温まで冷却し、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）＃１紙を通して濾過し、次いで、保存した。精確に２．０リットルの抽出物を、二亜硫酸ナトリウム１７．１ｇを含有する脱イオン水１５０ｍｌと混合し；回転蒸発器の上で濃縮して５００ｍｌにし；脱イオン水で希釈して７５０リットルにして；回転蒸発器の上で濃縮して４００ｍｌにし；次いで、脱イオン水で希釈して１２００ｍｌの最終容量にした。希釈済み混合物に、セライト５１２を１１０ｇ添加した。懸濁液は十分に混合し、次いで、セライト５１２の層を通して濾過した。濾過ケーキは、脱イオン水５００ｍｌで洗浄した。
【００５０】
亜硫酸塩化された濾過済み抽出物は、ポリメタクリレートのカラム［ＣＧ−７１ｃｄアンバークロム（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ）；（トーゾ・ハース（ＴｏｓｏＨａａｓ）；ペンシルベニア州、モンゴメリー）、カラム容積６０ｍｌ］の上に３０ｍｌ／分の流量で装填した。カラムは、６００ｍｌの脱イオン水で溶離し、次いで、メタノールで洗い流した。装填物溶離液及び水性溶離液は、一緒にして第１のカラム生成物を与えた。
第１のカラム生成物は、硫酸で酸性化してｐＨ１にし、回転蒸発器で濃縮して二酸化イオウを除去し、次いで、臭素化ポリスチレン樹脂（スペルコ）８０ｍｌを装填したカラムの上に装填した。装填は、アントシアニンのブリーディング（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）が激しくなるまで続けた。カラム媒体は次いで、０．１％水性ＨＯＡｃ約４００ｍｌで洗浄し、次いで、１２カラム容積のメタノールを用いてアントシアニンを溶離した。最終分析は、デルフィニジンクロライド標準液（１．０ｃｍで１０２吸光度単位／ｇ／リットル）に対する５３５ｎｍでの吸光度を標準分光光度定量することによって行った。固形分は、重量残渣によって決定した。富化組成物を分析し、全アントシアニン純度は４１．６重量％であった。
【００５１】
例４−ブルーベリー・バイオマスからの富化抽出物
１０リットル丸底フラスコに入れた、乾燥して粉砕したブルーベリー［ファン・ドリューネン・フューチャー・シューティカルズ（Ｖａｎ　Ｄｒｕｎｅｎ　ＦｕｔｕｒｅＣｅｕｔｉｃａｌｓ）；イリノイ州モメンス（Ｍｏｍｅｎｃｅ）］９４０ｇに、抽出溶媒（１．０％ｗ／ｖ硫酸／７０％水性エタノール）４．０リットルを添加した。そのフラスコは、４０℃に保持した一定温度の水浴中で、２時間の間回転させた。その混合物は、ぐるぐるかき混ぜて、真空下、セライト５１２の層１５０ｇを通して濾過した。ブルーベリー・バイオマスのケーキは、抽出溶媒５００ｍｌで洗浄した。そのケーキは、セライトの層から丁寧に削り取り、丸底フラスコの中に移し、次いで、上述の手順に従って再抽出した。３つの粗抽出物は混合した。
【００５２】
混合した抽出物（２．００リットル）は、４０℃の外部温度で真空蒸発させて１７５ｍｌにした。蒸発済み抽出物は、脱イオン水で希釈して、ブルーベリーの粗抽出物６７５ｍｌを与えた。その粗抽出物は、濾過しないで、事前に調整し（即ち、アセトンで洗浄し）平衡状態に保ったカラムであって臭素化ポリスチレン樹脂（スペルコ）１７０リットルを装填した該カラムの上に装填した。カラムは、０．１％水性酢酸で洗浄し、次いで、０．１％水性ＨＯＡｃ／１０％水性エタノールで洗浄した。次いで、７０％水性エタノールを用いてアントシアニンを溶離した。生成物のプール（ｐｏｏｌ）は、５０ミリバール及び６０℃で真空蒸発させた。最終分析は、デルフィニジンクロライド標準液（１．０ｃｍで１０２吸光度単位／ｇ／リットル）に対する５３５ｎｍでの吸光度を標準分光光度定量することによって行った。精製したブルーベリー抽出物を分析し、全アントシアニン純度は１８重量％であり、また、アントシアニンの全回収率は９５％であった。
【００５３】
例５−富化されたブルーベリー抽出物の精製
この例において、全アントシアニンを１８重量％有する、富化されたブルーベリー抽出物の一部であって例４に記述されるように調製したものを、強アニオン交換樹脂又は弱アニオン交換樹脂に通過させて残留酸を除去し、富化抽出物の純度を高めた。
約１．０ｇの富化されたブルーベリー抽出物を、水５０ｍｌに溶解し、次いで、強アニオン交換樹脂［Ｓｕｐｅｒ　Ｑ−６５０Ｍ；トーゾ・ハース；ペンシルベニア州、モンゴメリー］又は弱アニオン交換樹脂（ＤＥＭ−６３；ワットマン）を含有する９ｍｌカラムに通過させた。そのカラムは、３０〜３５ｍｌの水で洗浄した。強アニオン交換樹脂カラムの場合、その樹脂は更に、２０％エタノール２５ｍｌで洗浄し、次いで、４０％エタノールで洗浄した。強アニオン交換カラムから分離した組成物は、全アントシアニンを２８．３重量％含有し、また、回収率は８８％であった。弱アニオン交換カラムから分離した組成物は、全アントシアニンを３０．６重量％含有し、また、回収率は８８％であった。
【００５４】
例６−ペクチナーゼ処理を用いた、ビルベリー・バイオマスからの富化抽出物
凍結ビルベリー１０２４ｇに、温水５４８ｇを添加した。その混合物は、混合器にかけ、次いで、４０℃に加熱した。この後、ペクチナーゼ（Ｑｕｅｓｔ　Ｓｕｐｅｒ　７ｘ）１５０μｌを、撹拌しながら、３０分間処理の間添加した。硫酸約４ｍｌをそのスラリーの中に混合して、酸濃度０．５％を得た。次いで、その混合物は、４５℃に加熱し、次いで、撹拌を非常に遅くしながら、１５分間抽出した。抽出済み混合物に、ディカライト（Ｄｉｃａｌｉｔｅ）１６４ｇを添加した。次いで、その混合物は、２６ｇのディカライト層の上で濾過した。そのケーキは、温かい０．１％水性硫酸４００ｍｌで３回洗浄した。この抽出物は、２５μｍ圧力濾過器を通して濾過した。濾過済み抽出物（２．４リットル）は全て、ＳＰ−２０７カラム（０．９６ｍ、１７０ｍｌ）の上に装填した。装填した後、カラムは、０．１％水性酢酸で洗浄し、次いで、７０％水性エタノールで溶離した。カラム生成物は、蒸発させて乾燥し、次いで、凍結乾燥機の上に４８時間の間置いた。全アントシアニンの最終分析は、５３５ｎｍでの吸光度を標準分光光度定量することによって行った。精製したブルーベリー抽出物を分析し、全アントシアニン純度は４０重量％を含有した。アントシアニンの全回収率は約７９％であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】
２種類の異なる樹脂を使用する２つの分離精製工程を包含する、本発明の１つの態様によって富化抽出物を調製するための流れ図である。
【図２】
富化抽出物の１つの精製を包含する、本発明のもう１つの態様によって富化抽出物を調製するための流れ図である。
【図３】
富化されたビルベリー抽出物の最終生成物の、５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】
富化されたビルベリー抽出物の最終生成物の、２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】
富化されたブルーベリー抽出物の最終生成物の、５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】
富化されたブルーベリー抽出物の最終生成物の、２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。

Claims (69)

1. アントシアニンに富む組成物を調製する方法において、
   ａ）アントシアニンを含有する植物材料の粗抽出物を与える工程；
   ｂ）前記粗抽出物を濾過する工程；
   ｃ）前記アントシアニンを吸着する臭素化ポリスチレン樹脂に前記粗抽出物を接触させる工程；
   ｄ）前記樹脂を洗浄する工程；及び
   ｅ）前記臭素化ポリスチレン樹脂から前記アントシアニンを溶離して、アントシアニンに富む組成物を得る工程；
   を包含する上記調製方法。
2. 組成物がアントシアニンを少なくとも８重量％含有する、請求項１に記載の方法。
3. 組成物がアントシアニンを約８〜４０重量％含有する、請求項２に記載の方法。
4. 組成物がアントシアニンを約２５重量％含有する、請求項２に記載の方法。
5. 組成物がプロアントシアニンを更に含有する、請求項１に記載の方法。
6. 組成物がプロアントシアニンを少なくとも５重量％含有する、請求項５に記載の方法。
7. 組成物が全フェノールを更に含有する請求項１記載の方法。
8. 組成物が全フェノールを少なくとも２０重量％含有する、請求項７に記載の方法。
9. 粗抽出物は、乾燥した植物材料又は生の植物材料を酸性化済み抽出溶媒で抽出することによって調製する、請求項１に記載の方法。
10. 酸性化済み抽出溶媒は、エタノール約０〜９５重量％と酸約０．５〜３重量％とを有する水溶液を含有する、請求項９に記載の方法。
11. 酸が硫酸又は塩酸である、請求項１０に記載の方法。
12. 酸性化済み抽出溶媒は、メタノール約０〜１００重量％と酸約０．５〜３重量％とを有する水溶液を含有する、請求項９に記載の方法。
13. 酸が硫酸又は塩酸である、請求項１２に記載の方法。
14. 濾過工程は、粗抽出物に濾過助剤を添加して懸濁液を形成する段階と、該懸濁液を該濾過助剤の層に通過させて濾過する段階とを包含する、請求項１に記載の方法。
15. 濾過助剤が、珪藻土又はセルロースである、請求項１４に記載の方法。
16. 濾過工程は、粗抽出物をバグフィルタに通過させる段階を包含する、請求項１に記載の方法。
17. 樹脂は、酸を少なくとも０．１重量％含有する水で洗浄する、請求項１に記載の方法。
18. 酸が酢酸である、請求項１７に記載の方法。
19. アントシアニンは、７０：３０のエタノール／水を用いて、臭素化ポリスチレン樹脂から溶離する、請求項１に記載の方法。
20. 植物材料は、ブルーベリー、ビルベリー、ブラックベリー、イチゴ、アカフサスグリ、クロフサスグリ、クランベリー、サクランボ、ラズベリー、ブドウ、フサスグリの実、ニワトコの実、ハイビスカスの花、ピーマン、赤キャベツ、紫コーン及び紫サツマイモから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
21. 植物材料がビルベリーである、請求項２０に記載の方法。
22. 植物材料がブルーベリーである、請求項２０記載の方法。
23. 工程（ｅ）で分離した組成物をアニオン交換カラムに通過させる工程を更に包含する、請求項１に記載の方法。
24. 組成物は、賦形剤を更に混合させる請求項１記載の方法。
25. 賦形剤は、防腐剤、キャリヤ、緩衝剤、増粘剤、沈澱防止剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤及び調味料剤から成る群から選ばれる、請求項２４に記載の方法。
26. 工程（ａ）の粗抽出物はペクチナーゼを更に含有する、請求項１に記載の方法。
27. ペクチナーゼは、植物材料の約０〜０．１２重量％の量で存在する、請求項２６に記載の方法。
28. 組成物は、ヒト及び哺乳動物を処置するのに有用である、請求項１に記載の方法。
29. アントシアニンに富む組成物を調製する方法において、
    ａ）植物材料の粗抽出物を与える工程であって、該植物材料が、アントシアニンより一層極性の大きい、フラボノイド配糖体；植物ステロール；脂肪酸；トリグリセリド；及び他の不純物；の他に該アントシアニンをも含有する該工程；
    ｂ）前記粗抽出物を濾過する工程；
    ｃ）前記の濾過済み粗抽出物に、亜硫酸水素イオン源を添加して、アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物を含有する亜硫酸塩化した抽出物を形成する工程；
    ｄ）前記のフラボノイド配糖体、植物ステロール、脂肪酸、トリグリセリドを吸着し得る第１の樹脂に前記亜硫酸塩化した抽出物を接触させる工程；
    ｅ）第１の樹脂から、前記の一層極性の大きい不純物と一緒に前記アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物を溶離して、該アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物を含有する第１の生成物を形成する工程；
    ｆ）第１の生成物を酸性化する工程であって前記アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物を開裂して、複合体に形成されていないアントシアニンを与える該工程；
    ｇ）工程（ｆ）からの酸性化済み溶液を、臭素化ポリスチレン樹脂に接触させる工程であって、前記の、複合体に形成されていないアントシアニンを該樹脂に吸着させる該工程；
    ｈ）前記臭素化ポリスチレン樹脂を洗浄して、前記の一層極性の大きい不純物を除去する工程；
    ｉ）前記臭素化ポリスチレン樹脂から前記アントシアニンを溶離して、アントシアニンに富む組成物を得る工程；
    を包含する上記調製方法。
30. 組成物がアントシアニンを少なくとも８重量％含有する、請求項２９に記載の方法。
31. 組成物がアントシアニンを約８〜５５重量％含有する、請求項３０に記載の方法。
32. 組成物がアントシアニンを約２５重量％含有する、請求項３０に記載の方法。
33. 粗抽出物は、乾燥した植物材料又は生の植物材料を抽出溶媒で抽出することによって調製する、請求項２９に記載の方法。
34. 抽出溶媒は、水中のエタノール約０〜９５重量％を含有する溶液を含有する、請求項２９に記載の方法。
35. 抽出溶媒は、水中のメタノール約０〜１００重量％を含有する溶液を含有する、請求項２９に記載の方法。
36. 濾過工程は、粗抽出物に濾過助剤を添加して懸濁液を形成する段階と、該懸濁液を該濾過助剤の層に通過させて濾過する段階とを包含する、請求項２９に記載の方法。
37. 濾過助剤が、珪藻土又はセルロースである、請求項３６に記載の方法。
38. 亜硫酸水素イオン源が、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸である、請求項２９に記載の方法。
39. 第１の樹脂が逆相樹脂である、請求項２９に記載の方法。
40. 逆相樹脂は、ポリメタクリレート、スチレン、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、アルキルビニルベンゼン、アクリルビニルベンゼン及びメチルメタクリレートから成る群から選ばれる、請求項３９に記載の方法。
41. アントシアニン−亜硫酸水素塩付加物は、第１の樹脂から水を用いて溶離する、請求項２９に記載の方法。
42. 第１の生成物は、工程（ｆ）においてｐＨ１．０〜１．２５まで酸性化する、請求項２９に記載の方法。
43. アントシアニンは、７０：３０のエタノール／水を用いて、臭素化ポリスチレン樹脂から溶離する、請求項２９に記載の方法。
44. 植物材料は、ブルーベリー、ビルベリー、ブラックベリー、イチゴ、アカフサスグリ、クロフサスグリ、クランベリー、サクランボ、ラズベリー、ブドウ、フサスグリの実、ニワトコの実、ハイビスカスの花、ピーマン、赤キャベツ、紫コーン及び紫サツマイモから成る群から選ばれる、請求項２９に記載の方法。
45. 植物材料がビルベリーである、請求項４４に記載の方法。
46. 植物材料がブルーベリーである、請求項４４記載の方法。
47. 工程（ｉ）で分離した組成物をアニオン交換カラムに通過させる工程を更に包含する、請求項２９に記載の方法。
48. 組成物を賦形剤と混合させる工程を更に包含する、請求項２９に記載の方法。
49. 賦形剤は、防腐剤、キャリヤ、緩衝剤、増粘剤、沈澱防止剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤及び調味料剤から成る群から選ばれる、請求項４８に記載の方法。
50. 工程（ａ）の粗抽出物はペクチナーゼを更に含有する、請求項２９に記載の方法。
51. ペクチナーゼは、植物材料の約０〜０．１２重量％の量で存在する、請求項５０に記載の方法。
52. 組成物は、ヒト及び哺乳動物を処置するのに有用である、請求項２９に記載の方法。
53. 請求項１に記載の方法によって調製された、アントシアニンに富む組成物。
54. 賦形剤を更に含有する、請求項５３に記載の組成物。
55. 賦形剤は、防腐剤、キャリヤ、緩衝剤、増粘剤、沈澱防止剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤及び調味料剤から成る群から選ばれる、請求項５４に記載の組成物。
56. 組成物は、ヒト及び哺乳動物を処置するのに有用である、請求項５３に記載の組成物。
57. 請求項２９に記載の方法によって調製された、アントシアニンに富む組成物。
58. 賦形剤を更に含有する、請求項５７に記載の組成物。
59. 賦形剤は、防腐剤、キャリヤ、緩衝剤、増粘剤、沈澱防止剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤及び調味料剤から成る群から選ばれる、請求項５８に記載の組成物。
60. 組成物は、ヒト及び哺乳動物を処置するのに有用である、請求項５７に記載の組成物。
61. 請求項１に記載の方法によって調製された、ブルーベリーの抽出物。
62. 抽出物が、アントシアニンを該抽出物の約８〜３５重量％含有する、請求項６１に記載のブルーベリーの抽出物。
63. 請求項２９に記載の方法によって調製された、ブルーベリーの抽出物。
64. 抽出物が、アントシアニンを該抽出物の約８〜４０重量％含有する、請求項６３に記載のブルーベリーの抽出物。
65. 請求項１に記載の方法によって調製された、ビルベリーの抽出物。
66. 抽出物が、アントシアニンを該抽出物の約８〜５０重量％含有する、請求項６５に記載のビルベリーの抽出物。
67. 請求項２９に記載の方法によって調製された、ビルベリーの抽出物。
68. 抽出物が、アントシアニンを該抽出物の約８〜５５重量％含有する、請求項６７に記載のビルベリーの抽出物。
69. デルフィニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを３．３重量％、デルフィニジン−３−Ｏ−グルコシドを３．９重量％、シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを２．１重量％、デルフィニジン−３−Ｏ−アラビノシドを２．６重量％、シアニジン−３−Ｏ−グルコシドを２．８重量％、ペツニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを１．０重量％、ペツニジン−３−Ｏ−グルコシドを２．５重量％、シアニジン−３−Ｏ−アラビノシドを１．７重量％、ペオニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを０．３重量％、ペツニジン−３−Ｏ−アラビノシドを０．８重量％、マルビジン−３−Ｏ−ガラクトシド／ペオニジン−３−Ｏ−グルコシドを２．１重量％、マルビジン−３−Ｏ−グルコシドを２．５重量％、ペオニジン−３−Ｏ−アラビノースを０．１重量％、及びマルビジン−３−Ｏ−アラビノースを０．６重量％含有する、ビルベリーの抽出物。

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