JP4536360B2

JP4536360B2 - 抗血栓剤

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Publication number: JP4536360B2
Application number: JP2003400191A
Authority: JP
Inventors: 勉坂井田; 潔松村; 和寿大隅; 正孝岸; 宗和飯沼
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2003-11-28
Filing date: 2003-11-28
Publication date: 2010-09-01
Anticipated expiration: 2023-11-28
Also published as: JP2005162627A

Description

本発明は、抗血栓作用を有する新規な抗血栓成分に関する。本発明の抗血栓成分は主として黒霊芝に含有する。

血小板は血栓形成において極めて重要な因子である。すなわち、血栓の形成は、血管内の損傷などに起因してアラキドン酸などが活性され血小板の凝集能が高まることにより血栓形成に至るといわれている。血栓が大量に形成されると、その形成部位から先の血流が著しく悪くなり、組織に重大な障害を引き起こし、血栓症が起こる。
例えば、心臓や脳の血管が血栓でつまると、心筋梗塞、脳梗塞を引き起こし、生命に危険をもたらす。

従って、血栓の形成を防止し、血栓に起因する種々の疾患を治療するには血小板凝集を抑制することが有効である。

従来の血栓治療剤としては、アセチルサリチル酸、パナルジンなどが使用されている。最近では、天然物に薬効を望む傾向もあるが、現在に至るまで有効に予防や改善できる天然物は存在しなかった。

黒霊芝は、担子菌類ヒダナシタケ目サルノコシカケ科マンネンタケ属に属し、マンネンタケの一種である。マンネンタケの代表として、赤霊芝（霊芝）が一般的であり、従来技術として、マンネンタケ（霊芝）の抗血栓効果が知られている（特許文献１）。この成分は、熱水に可溶であり、アルコールに不溶な成分であることが記載されている。また、霊芝の水溶性成分のアデノシンやその誘導体に血小板凝集抑制効果があることが知られている（非特許文献１）。

これらの文献は、赤霊芝の成分がほとんどであり、黒霊芝の成分については不明なところも多く、抗血栓効果に関しては報告されていない。

一般にマンネンタケは、赤霊芝、白霊芝、黄霊芝、紫霊芝の他、黒霊芝（黒芝）があげられ、これらは子実体の色が赤、白、黄、紫、黒であることから単純に命名されたものであるが、最近では、黒霊芝を霊芝や紫芝などと区別して研究されている。例えば、非特許文献２によると、黒霊芝には赤芝や紫芝に含有する代表的なトリテルペン成分（ガノデリン酸類）は含有されず、味も全く異なると報告されている。以上のことから、黒霊芝の薬効について更に深く研究する余地があった。

また、赤霊芝とは学名も成分も異なる、黒霊芝中に含有する成分の抗血栓効果については従来全く知られていなかった。また、本願発明の黒霊芝の特定の成分は、特許文献１の成分とは紫外吸収スペクトルや溶媒に対する溶解性も異なり、全く異なる構造の成分である。

特開昭５７−１１２３３１号公報Ｓｈｉｍｉｚｕ．Ａ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ，Ｖｏｌ．３３，３０１２−３０１５，１９８５日本醸造協会誌，８５（６），３８５−３９２，１９９０

本発明は、血栓の形成を予防や改善できるような天然の抗血栓剤を提供することを目的とする。

この様な事情により、本発明者らは鋭意研究検討した結果、主として黒霊芝に含有する特定成分に抗血栓効果が高いことを発見し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、次の事項によって特徴付けられるものである。
１．
下記に示される、（１）〜（６）のすべての条件を満たす成分を含有することを特徴とする、抗血栓剤。
（１）黒霊芝又は黒霊芝の抽出物に含有する成分である。
（２）赤外吸収スペクトルを測定すると（ＫＢｒ法）、２９２５、１７００、１６００、１４５５、１１７０、８３５ｃｍ ^−１に吸収の極大を示す。
（３）本成分をエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定すると、２８０〜３３０ｎｍに吸収の極大を示す。
（４）分子内に芳香環を含有する。
（５）本成分に酢酸エチルを加えたとき、酢酸エチル可溶分の溶液は着色性であり、茶色〜赤褐色を示す。
（６）加水分解すると、ヒドロキシケイヒ酸を遊離する。
２．
下記（Ａ）〜（Ｆ）の条件にてＨＰＬＣ分析を行い、図１に示される、保持時間が１０〜２５分のブロードなピークを有する成分を含有することを特徴とする、請求項１に記載の抗血栓剤。
分析条件
（Ａ）ＨＰＬＣカラム：ＯＤＳ（オクタデシル化シリカゲル）
（Ｂ）ＨＰＬＣカラム温度：４０℃
（Ｃ）展開溶媒
０．２％リン酸／０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを用い、０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを２０％から１００％に２０分かけて直線的に溶媒を変化させ、１００％で２５分保持する（４５分分析）。
（Ｄ）流速：１ｍＬ／分
（Ｅ）検出：３１３ｎｍ
（Ｆ）試料：試料１０ｍｇを１ｍＬのエタノールに溶解し、２０マイクロＬ導入

上記のうち、（４）は^１Ｈ、^１３Ｃ−ＮＭＲ分析により判別可能である。すなわち、溶媒を重メタノール（ＣＤ_３ＯＤ）を用いて測定した場合、６〜８ｐｐｍ（^１Ｈ−ＮＭＲ）、１００〜１５０ｐｐｍ（^１３Ｃ−ＮＭＲ）に芳香族に置換した水素原子のスペクトル吸収が認められる。上記のスペクトル分析値は分析器、手法、ピークの幅広さなどにより、若干数値の誤差がある場合がある。（５）については、本成分約１〜１０ｍｇに酢酸エチル１ｍＬを加えることで着色性を判別できる。

また、本発明の抗血栓成分は、定法により加水分解を行うと、ヒドロキシケイヒ酸を遊離する性質がある。例えば、水酸化ナトリウム水溶液などを用いた定法より加水分解でき、ＨＰＬＣなどで分析することで確認できる。

本発明の抗血栓成分は、以下に示した高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により確認できる（図１参照）。本分析によれば、保持時間が約１０〜２５分の幅広のピーク群が本発明の抗血栓成分である（分析条件により、保持時間、パターンは若干変化することがある）。
（Ａ）カラム：オクタデシル化シリカゲル（内径４．５ｍｍ×２５０ｍｍ）
（Ｂ）カラム温度：４０℃
（Ｃ）展開溶媒：０．２％リン酸／０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを用い、０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを２０％から１００％に２０分かけて直線的に溶媒を変化させ、１００％で２５分保持する（計４５分分析）。
（Ｄ）流速：１ｍＬ／分
（Ｅ）検出：３１３ｎｍ
（Ｆ）試料：試料１０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液を２０マイクロＬ導入

本発明に用いられる黒霊芝は、マンネンタケ科（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｔａｃｅａｅ）、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）に属し、学名は、Ｇ．ａｔｒｕｍ、Ｇ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｇ．ｓｉｎｅｎｓｅなどといわれている。また、マンネンタケ属のキノコについては、中国の薬学古書である「本草綱目」や「神農本草経」には、黒霊芝（黒芝）のほか、赤霊芝（霊芝）、紫霊芝（紫芝）、青霊芝（青芝）、黄霊芝（黄芝）及び白霊芝（白芝）が存在すると記載されている。黒霊芝は広く中国や日本市場などで流通しているものを用いることができるし、自生品や栽培品を用いても良い。

なお、黒霊芝は紫霊芝と外観が似ているために紫霊芝として市場に流通していることもある。この場合、例えば、上記の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析することにより、本発明の抗血栓成分の検出が可能である。

本発明に用いられる黒霊芝などは、子実体、菌糸体、天産物、栽培物、及び培養物などを問わず使用することができる。また、必要に応じてそのままの状態、破砕物、或いは乾燥物などを適宜選択して抽出操作に付することができる。

本発明の抗血栓成分の抽出方法の一例として、好ましくは黒霊芝の子実体を溶媒抽出物することにより得ることができる。

抽出する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノールなど）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなど）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトンなど）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチルなど）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、石油エーテルなど）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテルなど）が挙げられる。好ましくは、低級アルコール、ケトン類、アセトニトリル、エステル類などや、これらの含水溶媒が良く、特に好ましくは、安全性の面からエタノール又は含水エタノールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。また、塩基性下で抽出することも好ましい。

本発明の抗血栓成分をさらに精製する方法として、互いに混合しない溶媒で液・液分配抽出により溶媒分画精製することもできる。

液・液分配抽出に用いる溶媒としては、上記の溶媒を用いることが可能である。例えば、（水又は含水アルコール）・炭化水素系、（水又は含水アルコール）・エーテル系、（水又は含水アルコール）・エステル系、水・ブタノール系などを採用できる。上記にとらわれず、互いに混合しない溶媒系であれば採用できる。好ましくは、溶媒抽出物（固形物）に含水低級アルコールと炭化水素溶媒を加えて抽出し、炭化水素溶媒可溶分を除去した残液にエステル溶媒を加えて抽出することにより本発明の抗血栓成分を精製することができる。また、酸や塩基による分別抽出を行うこともできる。

本発明の抗血栓成分をさらに精製する方法として、マンネンタケ抽出物又は上記の溶媒分画物を吸着剤に吸着させ、溶媒により溶出させることにより、抗血栓成分を精製することができる。

吸着剤としては、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂、イオン交換樹脂、オクタデシル化シリカゲル（ＯＤＳ）、シリカゲル、セルロース、デキストラン、修飾デキストランなどの吸着剤が挙げられる。中でも、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂やＯＤＳが好ましい。

吸着方法としては、吸着剤をカラムに充填し、これに抽出物の溶液を通す方法や、抽出物の溶液に吸着剤をそのまま混合する方法などがあるが、特に限定されない。

吸着剤の溶出溶媒としては、各吸着剤の特性により選択できるが、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノールなど）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなど）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトンなど）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチルなど）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、石油エーテルなど）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテルなど）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコールなどの溶媒が良く、特に好ましくは、水やエタノールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。更に、上記溶出溶媒に酸やアルカリを添加してｐＨ調整して用いても良い。

上記抽出物や精製物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、希釈、ろ過、活性炭などによる脱色、脱臭、エタノール沈殿などの処理をして用いても良い。更には、抽出や精製した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥などの処理を行い、乾燥物として用いても良い。

特に好ましい例を挙げると、上記の液・液分配抽出（上記の好ましいとされる溶媒系で抽出）を行なった後、上記の合成吸着樹脂（スチレン−ジビニルベンゼン系、上記の好ましいとされる溶媒で溶出）で精製して本発明の抗血栓成分を精製することができる。

ただし、本発明の抗血栓成分は、使用目的に応じ、抽出物のままでも良いし、液・液分配抽出や吸着剤による精製を単独又は組み合わせることができる。

本発明の抗血栓剤には、上記抽出物や吸着剤などによる精製物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲内で、希釈剤を用いることができ、希釈剤としては固体、液体、半固体でもよく、たとえば次のものがあげられる。すなわち、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、香料、保存料、溶解補助剤、溶剤などである。具体的には、乳糖、ショ糖、ソルビット、マンニット、澱粉、沈降性炭酸カルシウム、重質酸化マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、セルロース又はその誘導体、アミロペクチン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、界面活性剤、水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、カカオ脂、ラウリン脂、ワセリン、パラフィン、高級アルコールなどである。

本発明の抗血栓剤は、医薬部外品、医薬品などに用いることができ、その剤形としては、例えば、経口用として散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤などである。非経口用として注射液にすることが出来る。また、座薬とすることも出来る。

本発明に用いる抗血栓成分の摂取量は、投与形態、使用目的、年齢、体重などによって異なるが、０．１〜５，０００ｍｇ／日、好ましくは１〜５００ｍｇ／日の範囲で１日１回から数回経口投与できる。もちろん前記したように、投与方法や投与量は種々の条件で変動するので、上記投与範囲より少ない量で十分な場合もあるし、また、範囲を超えて投与する必要がある場合もある。また、製剤化における抗血栓成分の添加法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。

本発明の新規な成分は、抗血栓作用が非常に高かった。

本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、本発明の処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量の部とは重量部をし、％は重量％を示す。

製造例１黒霊芝の溶媒分画精製物
黒霊芝子実体の乾燥物１Ｋｇにエタノール１５Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、黒霊芝のエタノール抽出物を２０ｇ得た。このエタノール抽出物２．０ｇをエタノール３５０ｍＬに溶解し、同容量の精製水とヘキサンを加えて抽出した。水層部分を１／２に濃縮し、同容量の酢酸エチルを加えて抽出した後、濃縮乾固し、ヘキサン画分０．８４ｇ、酢酸エチル画分０．５６ｇ、水画分０．６０ｇ得た。このうち、酢酸エチル画分を黒霊芝の溶媒分画精製物とする。

製造例２黒霊芝のカラム精製物
黒霊芝子実体の乾燥物１Ｋｇにエタノール１５Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、黒霊芝のエタノール抽出物を２０ｇ得た。このエタノール抽出物１０．０ｇを５０％エタノールに溶解し、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂５００ｍＬを充填したカラムに通液した。次いで、精製水、１０、２０、５０、８０、９０、１００％エタノール各１Ｌで溶出させた後、それぞれを濃縮乾固した。黒霊芝の抗血栓成分は、８０％以上のエタノール画分に多く含まれており、８０％以上のエタノール画分をまとめ、黒霊芝のカラム精製物を約２ｇ得た。

比較製造例１霊芝（赤芝）の熱水抽出物
霊芝（赤芝）子実体の乾燥物１００ｇに２Ｌの精製水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮後、凍結乾燥して、霊芝（赤芝）の熱水抽出物を６．０ｇ得た。

比較製造例２霊芝（赤芝）の溶媒分画精製物
製造例１の黒霊芝を霊芝（赤芝）に変えて同様に行い、酢酸エチル画分（溶媒分画精製物）を０．６４ｇ得た。

ＨＰＬＣ分析
製造例１の中間製造物である黒霊芝のエタノール抽出物を用い、下記の分析条件で本発明抗血栓成分のＨＰＬＣクロマトグラムを示した（図１参照）。図５において、保持時間が１０〜２５分のピーク群が本発明の抗血栓成分である。
（Ａ）カラム：ＯＤＳ（内径４．５ｍｍ×２５０ｍｍ、デベロジル・野村化学製）
（Ｂ）カラム温度：４０℃
（Ｃ）展開溶媒
０．２％リン酸／０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを用い、０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを２０％から１００％に２０分かけて直線的に溶媒を変化させ、１００％で２５分保持する（４５分分析）。
（Ｄ）流速：１ｍＬ／分
（Ｅ）検出：３１３ｎｍ
（Ｆ）試料：エタノール抽出物１０ｍｇを１ｍＬのエタノールに溶解し、２０マイクロＬ導入

赤外吸収スペクトル分析
製造例１の黒霊芝の溶媒分画物をＫＢｒ法で赤外吸収スペクトルを測定した（図２）。その結果、約３２９４、２９２６、１６９８、１６０４、１４５６、１１６９、８２３ｃｍ^−１に吸収の極大を示した。

紫外吸収スペクトル分析
製造例１の黒霊芝の溶媒分画物５ｍｇを１００ｍＬのエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定した（図３）。その結果、２９５、３１３ｎｍに吸収の極大を示した。

ＮＭＲ分析
製造例１の黒霊芝の溶媒分画物を用い、定法により^１Ｈ、^１３Ｃ−ＮＭＲ分析した結果、６．６〜７．６ｐｐｍ（^１Ｈ−ＮＭＲ）、１００〜１５０ｐｐｍ（^１３Ｃ−ＮＭＲ）にスペクトル吸収を認め、芳香環の存在が確認された（図４、５参照）。なお、溶媒は重メタノール（ＣＤ_３ＯＤ）を用いた。

溶液の色
製造例１の黒霊芝の溶媒分画物１０ｍｇに５ｍＬの酢酸エチルを加えた。酢酸エチル可溶分を濾過した後、溶液の色を目視にて確認した。その結果、溶液の色は、赤褐色を示した。

可視吸収スペクトル分析
製造例１の黒霊芝の溶媒分画物２ｍｇを２ｍＬのエタノールに溶解し、可視吸収スペクトルを測定した（図６）。その結果、吸収の極大を示さない物質であった。

血小板凝集抑制作用
文献（嘉久志寿人，四家勉，早崎洋子，松原尚志，内田清久，本間義春，川角浩，竹内良夫，日本薬理学雑誌，Ｖｏｌ．９５，３３５−３４６，１９９０、Ｂｏｒｎ，Ｇ．Ｖ．Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．１９４，９２７−９２９，１９６２）を参考に行った。
エーテル麻酔下でモルモットの心臓より３．８％クエン酸ナトリウム１容に対し血液９容の割合で採血し、室温で１，０００ｒｐｍ、１５分遠心後上清を採取し多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ＲｉｃｈＰｌａｓｍａ：ＰＲＰ）とした。残りの血液は室温で３，０００ｒｐｍ、１５分遠心し乏血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ＰｏｏｒＰｌａｓｍａ：ＰＰＰ）を得、ＰＲＰとＰＰＰをなど量混合したもの（Ａ液とする）を試験に用いた。
血小板凝集反応はＢｏｒｎの方法に準じて、血小板凝集計（ＮＢＳＨＥＭＡＴＲＡＣＥＲ６０１、二光バイオサイエンス）を用いて測定した。すなわちＡ液１８０マイクロＬに試験試料溶液２０マイクロＬを加え、３７℃で１分間撹拌（１，０００ｒｐｍ）予備加熱後血小板凝集惹起物質（ＡＤＰ）２２マイクロＬを添加し、血小板の凝集により生じた透光度の変化を経時的に記録した。血小板の凝集率はＰＲＰ及びＰＰＰの透光度をそれぞれ０％及び１００％とし、凝集剤添加後の最大透光度を最大凝集率とした。血小板凝集阻害率は以下の式で算出した。
血小板凝集阻害率（％）＝｛１−（凝集剤添加後の最大透光度）／（凝集剤添加前の最大透光度）｝×１００

これらの実験結果を表１に示した。その結果、本発明の抗血栓成分は霊芝（赤芝）の熱水抽出物と比較して優れた血小板凝集阻害作用を示した。特に、黒霊芝の溶媒分画精製物は、赤霊芝の溶媒分画精製物と比較して顕著な作用を示した。以上により、黒霊芝の抗血栓成分は、非常に高い血小板凝集阻害作用を示した。

本発明の抗血栓成分は、処方例として下記の製剤化を行うことができる。また、これらの製剤は、血栓症の予防や改善に有効である。

処方例１錠剤
処方配合量
１．黒霊芝のカラム精製物（製造例２）４部
２．乾燥コーンスターチ２５
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム２０
４．微結晶セルロース４１
５．ポリビニルピロリドン７
６．タルク３
［製法］成分１〜４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成形する。成形した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。

処方例２飲料
処方配合量
１．黒霊芝の溶媒分画物（製造例１）０．１部
２．エタノール２
３．ステビア０．０５
４．リンゴ酸５
５．香料０．１
６．精製水９２．７５
［製法］成分１及び２を混合する。次いで、成分３、４、５及び６を加えて混合する。

本発明の新規な抗血栓成分は、高い抗血栓作用を有するため、血栓症の予防や改善に有効である。

黒霊芝の抗血栓成分のＨＰＬＣチャートを示す。横軸：保持時間（分）、縦軸：強度黒霊芝の抗血栓成分の赤外吸収スペクトルを示す。横軸：波数（ｃｍ^−１）、縦軸：透過率黒霊芝の抗血栓成分の紫外吸収スペクトルを示す。横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：吸光度黒霊芝の抗血栓成分の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。横軸：波数（ｐｐｍ）、縦軸：強度黒霊芝の抗血栓成分の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。横軸：波数（ｐｐｍ）、縦軸：強度黒霊芝の抗血栓成分の可視吸収スペクトルを示す。横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：吸光度

Claims

下記に示される、（１）〜（６）のすべての条件を満たす成分を含有することを特徴とする、抗血栓剤。
（１）黒霊芝又は黒霊芝の抽出物に含有する成分である。
（２）赤外吸収スペクトルを測定すると（ＫＢｒ法）、２９２５、１７００、１６００、１４５５、１１７０、８３５ｃｍ ^−１に吸収の極大を示す。
（３）本成分をエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定すると、２８０〜３３０ｎｍに吸収の極大を示す。
（４）分子内に芳香環を含有する。
（５）本成分に酢酸エチルを加えたとき、酢酸エチル可溶分の溶液は着色性であり、茶色〜赤褐色を示す。
（６）加水分解すると、ヒドロキシケイヒ酸を遊離する。
下記（Ａ）〜（Ｆ）の条件にてＨＰＬＣ分析を行い、図１に示される、保持時間が１０〜２５分のブロードなピークを有する成分を含有することを特徴とする、請求項１に記載の抗血栓剤。
分析条件
（Ａ）ＨＰＬＣカラム：ＯＤＳ（オクタデシル化シリカゲル）
（Ｂ）ＨＰＬＣカラム温度：４０℃
（Ｃ）展開溶媒
０．２％リン酸／０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを用い、０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを２０％から１００％に２０分かけて直線的に溶媒を変化させ、１００％で２５分保持する（４５分分析）。
（Ｄ）流速：１ｍＬ／分
（Ｅ）検出：３１３ｎｍ
（Ｆ）試料：試料１０ｍｇを１ｍＬのエタノールに溶解し、２０マイクロＬ導入