CN115636859A - 一种从杨梅叶中同时分离纯化两种没食子酰基化杨梅苷的方法及用途 - Google Patents
一种从杨梅叶中同时分离纯化两种没食子酰基化杨梅苷的方法及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种从杨梅叶中同时分离纯化杨梅素‑3‑O‑(2''‑没食子酰基)‑α‑l‑鼠李糖苷和杨梅素‑3‑O‑(4''‑没食子酰基)‑α‑l‑鼠李糖苷的方法及在制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂中的应用，所述方法包括：醇提浓缩、固相萃取柱吸附、制备液相色谱纯化，分离制备得到高纯度的杨梅素‑3‑O‑(2''‑没食子酰基)‑α‑l‑鼠李糖苷单体和杨梅素‑3‑O‑(4''‑没食子酰基)‑α‑l‑鼠李糖苷单体，其纯度均可高达98%以上。与以往的黄酮醇分离纯化的方法相比，该工艺分离步骤简单易操作，且耗时短，对环境污染小；经活性试验发现，所述杨梅素‑3‑O‑(2''‑没食子酰基)‑α‑l‑鼠李糖苷单体和杨梅素‑3‑O‑(4''‑没食子酰基)‑α‑l‑鼠李糖苷单体能够显著抑制α‑葡萄糖苷酶的活性，可用于制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂，对杨梅叶的深入研究与进一步开发利用具有重大的意义。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物的分离纯化领域，具体涉及一种从杨梅叶中同时分离纯化杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷的方法及用途。
背景技术
近几十年来，随着人们生活方式和生活条件的改变，糖尿病及其并发症的发病率急剧上升，现已成为一个严峻的全球性健康问题。糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，长期的高血糖会导致患者体内代谢紊乱，引起肥胖、高血脂、高血压等多种代谢综合征的发生。目前，糖尿病的高患病率对各国尤其是中低收入国家造成了严重的社会和经济负担。因此，亟需采取有效的防治措施控制糖尿病等代谢综合征的快速发展。
α-葡萄糖苷酶抑制剂已被推荐作为治疗糖尿病的一线药物，是治疗糖尿病和预防相关并发症的有效方法，可改善胰岛抵抗，有效防治糖尿病、肥胖等代谢综合征。α-葡萄糖苷酶是糖苷水解酶GH31家族中的膜结合酶，主要存在于小肠绒毛粘膜刷状缘细胞中。人体进食后，α-葡萄糖苷酶可以将食物中的碳水化合物水解为葡萄糖，葡萄糖被吸收后进入血液循环引起血糖升高。糖尿病患者由于胰岛功能紊乱，血糖调节能力受损，无法有效控制餐后血糖水平的快速升高。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过延缓碳水化合物的分解吸收和葡萄糖释放，从而有效控制餐后血糖的迅速升高，改善胰岛抵抗，抑制脂肪合成。目前，临床上常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇等，但这些药物的服用通常会引起胃肠道的不良反应，如胀气、排气、腹泻等。因此，寻找抑制活性强且毒副作用更低的新型α-葡萄糖苷酶抑制剂对糖尿病、肥胖等代谢综合征的防治具有重要意义。
近年来，人们发现多种天然来源的类黄酮化合物对α-葡萄糖苷酶具有强抑制作用，引起了国内外学者的广泛关注。类黄酮泛指两个苯环(A环和B环)通过三个碳原子(C环)相互连接而成的一系列物质，即具有C6-C3-C6结构的一类化合物的总称。根据C环的氧化程度和B环的连接位置等结构特征，类黄酮又可划分为黄酮醇类、花青素类、黄酮类、黄烷酮类和黄烷醇类等。在一项关于27种膳食类黄酮的α-葡萄糖苷酶抑制活性的对比研究中，筛选出杨梅素是活性最强的抑制剂(Jia Y.,等,Journal of Agricultural and FoodChemistry 67(37):10521-10533(2019))。类似的，在另一项关于15种类黄酮的α-葡萄糖苷酶抑制活性报道中，杨梅素也呈现出最强的抑制作用，其次是漆黄素和槲皮素(He C.,等,Foods 8(9):355(2019))，这些物质均属于黄酮醇类化合物。这表明，杨梅素等黄酮醇类化合物可能是极具开发潜力的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
杨梅叶是富含杨梅素等黄酮醇的天然资源。杨梅树四季常青，枝繁叶茂，为避免因顶端优势而影响结实率，促进杨梅的持续、优质、高产，果农们在春秋两季均需对杨梅果树进行修剪，因而产生大量废弃杨梅叶。这些叶片通常被用作柴火焚烧，增加碳排放并造成环境污染。古代医书记载，杨梅叶味苦、微辛、性温，可用于治疗腹泻、黄胆肝炎、淋巴结核、慢性咽喉炎等疾病。近年来有大量研究表明杨梅叶提取物具有良好的清除自由基、抗炎、抑菌等活性。因此，对杨梅枝叶进行开发利用，既可解决废弃物处理带来的环境污染问题，也能变废为宝、增值创收，为人类健康谋福祉。杨梅叶中特异性积累杨梅素，含量可高达10mg/g鲜重以上。但在叶片中，杨梅素通常经糖基化、没食子酰化等修饰后以衍生物的形式存在。然而，由于这些黄酮醇衍生物结构相似，极性差异较小，导致高纯度单体的分离十分困难，不能对其结构进行精准表征，这极大地限制了杨梅叶药理活性的探究及其进一步的开发利用。
比如，Zhang等通过LC-MS鉴定杨梅叶中的黄酮醇化合物，但仅根据二级碎片离子图推断了其可能结构，未做精准结构解析(Zhang,Y.,PLoS One 11(12):e0167484(2016))；陈萍等(“杨梅叶中抑菌成分的筛选及分离纯化”,食品科技2011年第36期,第二卷:189-192)对杨梅叶的醇提物经多级有机溶剂分步萃取、大孔吸附树脂柱层析、凝胶柱层析，分离得到黄酮粗提物，但未能纯化得到较纯的黄酮醇单体；Kim,H.H.,等(Archives ofPharmacal Research,36(12):1533-1540(2013))对杨梅叶中的黄酮醇进行了分离纯化，杨梅叶粗提物进行反复的柱层析，再经过反向中压液相色谱，分离得到黄酮醇单体，但提取、纯化工艺复杂，提取效率低，限制了杨梅叶的综合利用。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，提供了一种从杨梅叶中同时分离纯化杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷的方法及用途。
基于此，本发明人以杨梅叶为原料，建立了醇提浓缩、固相萃取柱纯化和制备液相色谱联用的分离纯化体系，首次从杨梅叶片中分离得到了杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷(myricetin-3-O-(4”-O-galloyl)-α-L-rhamnoside，CAS号：85541-03-3)，并发现该化合物(IC50＝15.61μM)具有显著优于阳性对照药阿卡波糖(IC50＝369.15μM)以及杨梅素(IC50＝1.77μM)的α-葡萄糖苷酶抑制活性。其次，还分离得到了杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷(myricetin-3-O-(2”-O-galloyl)-α-L-rhamnoside，CAS号：56939-52-7)，发现其也能显著抑制α-葡萄糖苷酶活性(IC50＝1.32μM)。这两种化合物为同分异构体，因结构相似、极性相近，分离纯化难度大。最新报道的文献中(da Silva,G.L.,等,Natural Product Research 22:1-5(2021))发现梨形丁香叶中含有这两种化合物，但未能实现二者的分离制备，因此仅测定了含有这两种物质的混合物的活性。本发明成功建立了快速高效分离这两种化合物的纯化体系，可同时制备高纯度(纯度为98％以上)的杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷和杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体。对所纯化的两种黄酮醇单体进行活性测试发现，其具有优异的α-葡萄糖苷酶抑制活性，表明其具有开发为α-葡萄糖苷酶抑制剂，用于防治糖尿病、肥胖等代谢综合征的巨大潜力。这对杨梅叶中功能成分的进一步挖掘、药理活性探究以及提升杨梅产业附加值具有重大意义。
本发明采用如下的技术方案：
一种从杨梅叶中同时分离纯化杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷的方法，包括：
(1)醇提浓缩：将杨梅叶与醇溶液混合，经超声提取后过滤并收集滤液，将所述滤液除去醇并浓缩，得到杨梅叶黄酮醇粗提液，所述醇溶液的体积百分浓度为50～100％；
(2)固相萃取柱吸附：将所述杨梅叶黄酮醇粗提液注入固相萃取柱中，经过流动相进行第一梯度洗脱，将收集的洗脱液经后处理得到富含杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷的固相萃取粉末；优选的，所述固相萃取柱为C18固相萃取柱；
所述第一梯度洗脱的流程为：先经过体积百分浓度低于40％醇溶液进行第一次洗脱，再用体积百分浓度为40％～60％的醇溶液进行第二次洗脱，收集第二次洗脱后的洗脱液；所述第一次洗脱的醇溶液体积百分比浓度的浓度为20％以上；
优选的，采用体积百分浓度为30％醇溶液进行第一次洗脱；
优选的，采用体积百分浓度为40％醇溶液进行第二次洗脱；
(3)制备液相色谱纯化：采用固相色谱柱，将步骤(2)得到的固相萃取粉末经流动相进行第二梯度洗脱再经后处理，分别得到目标产物：杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体；优选的，所述的固相色谱柱为用C18固相色谱柱；
所述流动相：A相选自体积百分浓度为0.05％～5％的甲酸-水溶液、所述体积百分浓度为0.05％～5％的三氟乙酸-水溶液，B相选自体积百分浓度为40～60％乙腈-水溶液、体积百分浓度为40～60％酸-乙腈-水溶液，所述酸的体积百分浓度为0.05％～5％，所述的酸选自甲酸、三氟乙酸；
所述第二梯度洗脱的流程为：B相的体积百分浓度在0～10min内从20％上升至60％，在10～30min内从60％上升至90％，在30～35min内从90％上升至100％，最后在35～40min内从100％下降至20％，分别收集目标产物；
优选的，A相选自体积百分浓度为0.1％～3％的甲酸-水溶液；
优选的，步骤(3)采用制备液相柱SunFireTM C18 OBMTM柱(5μm，19×250mm)，在所述第二梯度洗脱时，分管收集27～28.5min和28.5～30min的洗脱物；更优选的，柱温为室温，流速为3-6mL/min；
优选的，将步骤(2)制得的固相萃取粉末用甲醇溶解，使其浓度达到100-200mg/mL，注入制备液相中纯化，单次进样量为50-300μL；
所述的醇溶液是指醇的水溶液，所述醇选自甲醇或乙醇；
优选的，所述醇溶液的体积百分浓度为80％；
优选的，所述超声提取的时间为30～60min；
优选的，所述杨梅叶与甲醇溶液的质量体积比为：1∶5～20；更优选的，所述杨梅叶与甲醇溶液的质量体积比为：1∶10；
优选的，所述后处理是指减压浓缩、冷冻干燥；更优选的，所述减压浓缩的条件为：37～50℃下真空旋转蒸发；
优选的，所述杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体的纯度为98％以上；优选的，所述的纯度为99％以上。
优选的，步骤(1)中，将所述滤液在37～50℃下真空旋转蒸发除去醇并浓缩，得到杨梅叶黄酮醇粗提液。
优选的，步骤(1)中，所述收集滤液的过程重复进行2～4次，合并2～4次的滤液。
优选的，步骤(2)中，所述固相萃取柱梯度洗脱，具体为：
将所述杨梅叶黄酮醇粗提液注入固相萃取柱中，先用去离子水冲洗固相萃取柱，经过流动相进行梯度洗脱，将收集的洗脱液经37～45℃下真空旋转蒸干，得到所述富含目标产物的固相萃取粉末。
其中，第一次洗脱用低于40％醇溶液冲洗的作用为去除糖酸、其它非目标性黄酮醇如杨梅苷等杂质，如果第一次洗脱的醇溶液的浓度低于20％，黄酮醇洗脱不下来。
优选的，步骤(2)中，所述固相萃取柱吸附，具体为：
C18 
固相萃取柱经活化后，每根固相萃取柱上样4.5BV杨梅叶提取液；用4BV去离子水洗去糖酸；再用10BV体积百分浓度为30％的甲醇溶液洗脱，去除部分杂质和其它非目标性黄酮醇；再用4BV体积百分浓度为40％的甲醇溶液洗脱，收集40％组分的洗脱液，37℃～50℃下真空旋转蒸干，得到富含杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷的固相萃取粉末。
优选的，步骤(3)中，B相选自体积百分浓度为50％乙腈-水溶液、体积百分浓度为50％酸-乙腈-水溶液，所述酸的体积百分浓度为0.1％～5％，所述的酸选自甲酸、三氟乙酸；优选的，所述酸的体积百分浓度为0.1％～3％。
优选的，步骤(3)中，所述制备液相色谱纯化，具体为：
使用制备液相柱SunFireTM C18 OBMTM柱(5μm，19×250mm)，流动相：A相：体积百分浓度为0.1％的甲酸-水溶液，B相：体积百分浓度为50％甲酸-乙腈-水溶液(其中，甲酸的体积百分浓度为0.1％)；柱温为室温，流速为3-6mL/min；
将步骤(2)制得的固相萃取粉末用甲醇溶解，使其浓度达到100-200mg/mL，注入制备液相中纯化，单次进样量为50-300μL；
分别分管收集27～28.5min和28.5～30min的洗脱物，合并富含纯目标产物的洗脱液，经减压浓缩、冷冻干燥，即可分别得到高纯度的杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体。
所述醇溶液为甲醇或乙醇，研究发现丙酮提取液中目标产物浓度低，不能充分提取出样品中的目标产物，乙酸乙酯、石油醚等溶剂不能提取出目标产物(杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体)，如实施例16和图9所示。
所述醇溶液的体积百分浓度为50～100％，目标产物的水溶液差，脂溶性较强，因此用体积浓度低的醇溶液会降低目标产物的提取率。
优选的，所述杨梅叶与甲醇溶液的质量体积比为：1∶5～20，料液比过低，提取不充分；料液比过高，造成不必要的试剂浪费。
优选的，所述超声提取时间为30～60min，超声时间太短提取不充分，超声时间过长导致提取溶液温度上升，影响提取效果；重复进行2～4次，提取次数太少未充分提取目标组分，提取次数过多浪费溶剂。
本发明还提供杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷作为活性成分在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的用途；优选的，所述杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷根据如前所述任何一种方法分离纯化得到。
本发明还提供杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷作为活性成分在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的用途，优选的，所述杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷根据如前所述任何一种方法分离纯化得到。
优选的，所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂为代谢综合征改善剂或药物；优选的，所述代谢综合征为2型糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗、高胰岛素血症中的至少一种疾病；优选的，所述的改善剂选自功能性食品、食品添加剂、补充剂。
本发明的药物除了含有上述本发明的杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷和/或杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷之外，还可以含有例如其它活性成分、药学上可容许的添加物等。对于本发明的药物而言，作为具体的剂型，例如可以列举出片剂、颗粒剂(包括散剂)、胶囊剂、液体制剂(包括糖浆剂)等，可以适当使用适于各剂型的添加剂或基材等，根据药典等所记载的通常方法来制造。另外，作为给药途径，没有特别限定，例如可以列举出口服给药和非口服给药。作为上述非口服给药，例如可以列举出口腔内给药、气管内给药、直肠内给药、皮下给药、肌肉内给药和静脉内给药等。
本发明代谢综合征改善剂，还可以含有各种添加剂、其它的补充剂等，例如可以含有其它活性成分，维生素C等各种维生素类，氨基酸，寡糖等。本发明的改善剂的形态没有特别限定，例如可以列举出片剂、颗粒剂(包括散剂)、胶囊剂、液体制剂(包括糖浆剂)等。
本发明的功能性食品还可以含有各种添加剂等，例如可以含有其它活性成分等。另外，本发明的功能性食品的形态没有特别限定，例如可以列举出面类、点心类和功能性饮料等。
本发明的食品添加剂还可以含有各种添加剂等，例如可以含有其它活性成分等。本发明的食品添加剂的形态没有特别限定，例如可以列举出液体状、糊状、粉末状、薄片状和颗粒状等。另外，本发明的食品添加剂还包括例如饮料用食品添加剂。
进一步的活性试验发现，分离纯化得到的杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制效果，IC50值为1.32μM，显著优于阳性药物阿卡波糖(IC50＝369.15μM)，可作为一种新型的天然来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂，用于控制餐后血糖，防治糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗等代谢综合征。
进一步的活性试验发现，分离纯化得到的杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制效果，IC50值为1.77μM，显著优于阳性药物阿卡波糖(IC50＝369.15μM)，可作为一种新型的天然来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂，用于控制餐后血糖，防治糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗等代谢综合征。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明首次从杨梅叶中分离提纯出杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体，由于杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体这两种黄酮类单体的相似，现有技术一直无法解决分离纯化的问题，本发明开创性地纯化出这两种单体，而且步骤简单易操作，且耗时短，对环境污染小，纯化得到的单体纯度高。
本发明原料易得，是从杨梅叶中分离得到，具体分离步骤简单易操作，且耗时短，对环境污染小，纯化得到的单体纯度高，也可作为其他植物活性物质的分离纯化提供参考依据，这对天然产物有效成分的研究具有十分的意义。
本发明分离得到的化合物杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷具有抗氧化等多种药用活性，且能够显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂，对杨梅叶的深入研究与进一步开发利用具有重大的意义。
附图说明
图1为实施例1中杨梅叶黄酮醇粗提液的高效液相色谱图，其中，2”代表杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体，4”代表杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体。
图2为实施例1中富含目标产物的固相萃取粉末的高效液相色谱图，其中，2”代表杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体，4”代表杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体。
图3为实施例1中最终分离纯化得到的杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体(a)和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体(b)的高效液相色谱图。
图4为实施例2中最终分离纯化得到的杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体(a)和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体(b)的高效液相色谱图。
图5为实施例3中最终分离纯化得到的杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体(a)和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体(b)的高效液相色谱图。
图6为分离纯化得到的杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体通过LC-MS鉴定的一级(图6a)和二级(图6b)离子碎片图以及NMR鉴定图谱(图6c)。
图7为分离纯化得到的杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体通过LC-MS鉴定的一级(图7a)和二级(图7b)离子碎片图以及NMR鉴定图谱(图7c)。
图8为分离纯化得到的杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体的α-葡萄糖苷酶抑制活性曲线，并给出阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性曲线作为对比。
图9为不同极性的溶剂提取杨梅叶的HPLC液相检测图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
称取20g杨梅叶，按照料液比1∶10(w/v,g/mL)的比例加入纯甲醇溶液充分混合，超声提取30min，超声结束后抽滤，得到的滤渣按上述条件重复提取一次，合并滤液，在40℃下真空旋转蒸发除去甲醇，得到黄酮醇粗提液(图1)。
先采用4BV甲醇、2BV水活化C18
固相萃取柱(waters 12cc，2g)，每根固相萃取柱再将黄酮醇粗提液用4.5BV上样；4BV去离子水洗去糖酸；分别用10BV体积百分浓度为30％的甲醇溶液、4BV体积百分浓度为40％的甲醇溶液进行洗脱，收集体积百分浓度为40％的甲醇溶液洗脱液，40℃下真空旋转蒸干，得到富含目标产物的固相萃取粉末(图2)。
使用制备液相柱SunFireTM C18 OBMTM柱(5μm，19×250mm)，流动相：A相：体积百分浓度为0.1％的甲酸-水溶液，B相：50％乙腈-水溶液(含0.1％甲酸)；柱温为25℃，流速为5mL/min，梯度为：0～10min，20％～60％ B；10～30min，60％～90％ B；30～35min，90％～100％ B；35～40min，100％～20％ B。将固相萃取粉末用甲醇溶解，使其浓度达到100mg/mL，注入制备液相中分离，单次进样量为100μL。在Waters 2998 PAD检测器下检测，分管收集27～28.5min和28.5～30min的洗脱物，分别减压浓缩，真空冷冻干燥，依次得到杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体粉末，纯度为98.86％(图3a)，和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体粉末，纯度为99％(图3b)。
实施例2
称取30g杨梅叶，按照料液比1∶10(w/v,g/mL)的比例加入80％甲醇水溶液(甲醇与水的体积比为80：20)充分混合，超声提取30min，超声结束后抽滤，得到的滤渣按上述条件重复提取一次，合并滤液，在37℃下真空旋转蒸发除去甲醇，得到黄酮醇粗提液。
先采用4BV甲醇、2BV水活化C18 
固相萃取柱，每根固相萃取柱再将黄酮醇粗提液用4.5BV上样；4BV去离子水洗去糖酸；用10BV体积百分浓度为30％的甲醇溶液、4BV体积百分浓度为40％的甲醇溶液进行洗脱，收集体积百分浓度为40％的甲醇溶液洗脱液，37℃下真空旋转蒸干，得到富含目标产物的固相萃取粉末。
使用制备液相柱SunFireTM C18 OBMTM柱(5μm，19×250mm)，流动相：A相：体积百分浓度为0.1％的甲酸-水溶液，B相：50％乙腈-水溶液(含0.1％甲酸)；柱温为25℃，流速为5mL/min，梯度为：0～10min，20％～60％ B；10～30min，60％～90％ B；30～35min，90％～100％ B；35～40min，100％～20％ B。将固相萃取粉末用甲醇溶解，使其浓度达到150mg/mL，注入制备液相中分离，单次进样量为150μL。在Waters 2998 PAD检测器下检测，分管收集27～28.5min和28.5～30min的洗脱物，分别减压浓缩，真空冷冻干燥，依次得到杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体粉末，纯度为98.19％(图4a)，和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体粉末，纯度为98.32％(图4b)。
实施例3
称取60g杨梅叶，按照料液比1∶10(w/v,g/mL)的比例加入80％甲醇水溶液(甲醇与水的体积比为80：20)充分混合，超声提取30min，超声结束后抽滤，得到的滤渣按上述条件重复提取一次，合并滤液，在37℃下真空旋转蒸发除去甲醇，得到黄酮醇粗提液。
先采用4BV甲醇、2BV水活化C18
固相萃取柱，每根固相萃取柱再将黄酮醇粗提液用4.5BV上样；4BV去离子水洗去糖酸；用10BV体积百分浓度为30％的甲醇溶液、4BV体积百分浓度为40％的甲醇溶液进行洗脱，收集体积百分浓度为40％的甲醇溶液洗脱液，37℃下真空旋转蒸干，得到富含目标产物的固相萃取粉末。
使用制备液相柱SunFireTM C18 OBMTM柱(5μm，19×250mm)，流动相：A相：纯水含0.1％甲酸体系，B相：50％乙腈含0.1％甲酸体系；柱温为25℃，流速为5mL/min，梯度为：0～10min，20％～60％ B；10～30min，60％～90％ B；30～35min，90％～100％ B；35～40min，100％～20％ B。将富含目标产物的粉末用甲醇溶解，使其浓度达到150mg/mL，注入制备液相中分离，单次进样量为200μL。在Waters 2998 PAD检测器下检测，收集并分管收集27～28.5min和28.5～30min的洗脱物，分别减压浓缩，真空冷冻干燥，依次得到杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体粉末，纯度为98.30％(图5a)，和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体粉末，纯度为98.13％(图5b)。
按照实施例1的分离方法，改变过程中的部分参数，进行如下实施例4～13(说明：表格中的浓度均为体积百分浓度，2”单体是指杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体；4”单体是指杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体)。
实施例14
利用高分辨LC-MS和NMR技术解析上述三个实施例中分离得到的两种化合物单体的结构，高分辨LC-MS鉴定的一级和二级离子碎片图以及NMR鉴定图谱见附图6和7。由此确定所纯化的两种单体为同分异构体，分别为杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷。
杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷.13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ177.44(C-4),164.94(COO),164.19(C-7),161.25(C-5),157.49(C-2),156.39(C-9),145.78(C-3'/5'),145.44(C-3"'/5"'),138.53(C-4"'),136.55(C-4'),133.32(C-3),119.38(C-1'),119.24(C-1"'),108.84(C-2'/6'),107.93(C-2"'/6"'),103.97(C-10),98.70(C-6),98.33(C-1"),93.54(C-8),71.75(C-4"),71.68(C-2"),70.65(C-5"),68.55(C-3"),17.56(C-6").
杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷.13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ177.78(C-4),165.70(COO),164.30(C-7),161.30(C-5),157.63(C-2),156.47(C-9),145.81(C-3'/5'),145.38(C-3"'/5"'),138.27(C-4"'),136.50(C-4'),134.85(C-3),120.00(C-1"'),119.61(C-1'),108.99(C-2'/6'),107.93(C-2"'/6"'),104.03(C-10),102.71(C-1"),98.70(C-6),93.57(C-8),73.90(C-4"),70.87(C-2"),68.61(C-3"),67.78(C-5"),17.46(C-6").
实施例15
α-葡萄糖苷酶可将4-硝基苯基-d-吡喃葡萄糖苷(4-Nitrophenylβ-D-glucopyranoside,PNPG)水解生成对硝基苯酚(pNP)，碱性条件下pNP在405nm处有最大吸收值，用酶标仪测定反应液中pNP浓度，可检测样品抑制α-葡萄糖苷酶的活性。
α-葡萄糖苷酶用0.1mol/L缓冲液(pH＝6.8)稀释为0.2U/mL。测定时，96孔板中加入112μL磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH＝6.8)和20μLα-葡萄糖苷酶(0.2U/mL)，随后加入8μL抑制剂，即梯度浓度的杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体或杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体或阿卡波糖，于37℃静置15min，再加入20μL浓度为2.5mmol/L PNPG，37℃反应15min后，加入80μL Na2CO3溶液(2.5mmol/L)，酶标仪测定405nm下的吸光度(ODtest)。未加酶的为空白对照(ODblank)，未加样品但加酶的为controlODtest，未加样品且未加酶的为controlODblank，阿卡波糖为阳性对照。酶活抑制率的计算公式为：
根据梯度浓度下受试单体对α-葡萄糖苷酶的酶活抑制率利用SPSS计算IC50值。结果表明，杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体、杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体均对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制效果，IC50值分别为1.32μM和1.77μM，显著优于阳性药物阿卡波糖(IC50＝369.15μM)。这表明杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷是良好的α-葡萄糖苷酶抑制剂，可用于糖尿病治疗药物的开发，可应用于改善胰岛抵抗，防治糖尿病、肥胖等代谢综合征。
实施例16
提取溶剂的筛选
称取0.1g杨梅叶冷冻干燥粉末，分别溶于1mL选定的5种有机溶剂中，超声提取30min后，10000rpm离心10min取上清，按照上述步骤再提取一次，合并两次上清液，用于HPLC检测分析。
等浓度提取液可通过HPLC检测的峰面积确定溶液中指定化合物的相对含量。如图9所示，发现丙酮提取液中目标产物浓度低，不能充分提取出样品中的目标产物，乙酸乙酯、石油醚提取液中未检测到目标产物，所述的目标产物是指：杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体，因此甲醇、乙醇更适合杨梅叶中两种目标产物的提取。
对比例1
称取20g杨梅叶，按照料液比1∶10(w/v,g/mL)的比例加入纯甲醇溶液充分混合，超声提取30min，超声结束后抽滤，得到的滤渣按上述条件重复提取一次，合并滤液，在40℃下真空旋转蒸发除去甲醇，得到黄酮醇粗提液。
先采用4BV甲醇、2BV水活化C18
固相萃取柱(waters 12cc，2g)，每根固相萃取柱再将黄酮醇粗提液用4.5BV上样；4BV去离子水洗去糖酸；分别用10BV体积百分浓度为10％的甲醇溶液、4BV体积百分浓度为40％的甲醇溶液进行洗脱，收集体积百分浓度为40％的甲醇溶液洗脱液，40℃下真空旋转蒸干，得到富含目标产物的固相萃取粉末。
使用制备液相柱SunFireTM C18 OBMTM柱(5μm，19×250mm)，流动相：A相：体积百分浓度为0.1％的甲酸-水溶液，B相：50％乙腈-水溶液(含0.1％甲酸)；柱温为25℃，流速为5mL/min，梯度为：0～10min，20％～60％ B；10～30min，60％～90％ B；30～35min，90％～100％ B；35～40min，100％～20％ B。将固相萃取粉末用甲醇溶解，使其浓度达到100mg/mL，注入制备液相中分离，单次进样量为100μL。在Waters 2998 PAD检测器下检测，分管收集27～28.5min和28.5～30min的洗脱物，分别减压浓缩，真空冷冻干燥，依次得到杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体粉末，纯度为80.18％，和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体粉末，纯度为75.25％。
对比例2
称取20g杨梅叶，按照料液比1∶10(w/v,g/mL)的比例加入纯甲醇溶液充分混合，超声提取30min，超声结束后抽滤，得到的滤渣按上述条件重复提取一次，合并滤液，在40℃下真空旋转蒸发除去甲醇，得到黄酮醇粗提液。
先采用4BV甲醇、2BV水活化C18
固相萃取柱(waters 12cc，2g)，每根固相萃取柱再将黄酮醇粗提液用4.5BV上样；4BV去离子水洗去糖酸；分别用10BV体积百分浓度为20％的甲醇溶液、4BV体积百分浓度为30％的甲醇溶液进行洗脱，收集体积百分浓度为30％的甲醇溶液洗脱液，40℃下真空旋转蒸干，发现所得固相萃取粉末中不含目标产物。
对比例3
称取20g杨梅叶，按照料液比1∶10(w/v,g/mL)的比例加入石油醚溶液充分混合，超声提取30min，超声结束后抽滤，得到的滤渣按上述条件重复提取一次，合并滤液，发现所得粗提液中不包含目标产物。
Claims (10)
1.一种从杨梅叶中同时分离纯化杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷的方法，其特征在于，包括：
(1)醇提浓缩：将杨梅叶与醇溶液混合，经超声提取后过滤并收集滤液，将所述滤液除去醇并浓缩，得到杨梅叶黄酮醇粗提液，所述醇溶液的体积百分浓度为50～100％；
(2)固相萃取柱吸附：将所述杨梅叶黄酮醇粗提液注入固相萃取柱中，经过流动相进行第一梯度洗脱，将收集的洗脱液经后处理得到富含杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷的固相萃取粉末；优选的，所述固相萃取柱为C18固相萃取柱；
所述第一梯度洗脱的流程为：先经过体积百分浓度低于40％醇溶液进行第一次洗脱，再用体积百分浓度为40％～60％的醇溶液进行第二次洗脱，收集第二次洗脱后的洗脱液；所述第一次洗脱的醇溶液体积百分比浓度的浓度为20％以上；
优选的，采用体积百分浓度为30％醇溶液进行第一次洗脱；
优选的，采用体积百分浓度为40％醇溶液进行第二次洗脱；
(3)制备液相色谱纯化：采用固相色谱柱，将步骤(2)得到的固相萃取粉末经流动相进行第二梯度洗脱再经后处理，分别得到目标产物：杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体；优选的，所述的固相色谱柱为用C18固相色谱柱；
所述流动相：A相选自体积百分浓度为0.05％～5％的甲酸-水溶液、所述体积百分浓度为0.05％～5％的三氟乙酸-水溶液，B相选自体积百分浓度为40～60％乙腈-水溶液、体积百分浓度为40～60％酸-乙腈-水溶液，所述酸的体积百分浓度为0.05％～5％，所述的酸选自甲酸、三氟乙酸；
所述第二梯度洗脱的流程为：B相的体积百分浓度在0～10min内从20％上升至60％，在10～30min内从60％上升至90％，在30～35min内从90％上升至100％，最后在35～40min内从100％下降至20％，分别收集目标产物；
优选的，A相选自体积百分浓度为0.1％～3％的甲酸-水溶液；
优选的，步骤(3)采用制备液相柱SunFireTM C18 OBMTM柱(5μm，19×250mm)，在所述第二梯度洗脱时，分管收集27～28.5min和28.5～30min的洗脱物；更优选的，柱温为室温，流速为3-6mL/min；
优选的，将步骤(2)制得的固相萃取粉末用甲醇溶解，使其浓度达到100-200mg/mL，注入制备液相中纯化，单次进样量为50-300μL；
所述的醇溶液是指醇的水溶液，所述醇选自甲醇或乙醇；
优选的，所述醇溶液的体积百分浓度为80％；
优选的，所述超声提取的时间为30～60min；
优选的，所述杨梅叶与甲醇溶液的质量体积比为：1∶5～20；更优选的，所述杨梅叶与甲醇溶液的质量体积比为：1∶10；
优选的，所述后处理是指减压浓缩、冷冻干燥；更优选的，所述减压浓缩的条件为：37～50℃下真空旋转蒸发；
优选的，所述杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体的纯度为98％以上；优选的，所述的纯度为99％以上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将所述滤液在37～50℃下真空旋转蒸发除去醇并浓缩，得到杨梅叶黄酮醇粗提液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述收集滤液的过程重复进行2～4次，合并2～4次的滤液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述固相萃取柱梯度洗脱，具体为：
将所述杨梅叶黄酮醇粗提液注入固相萃取柱中，先用去离子水冲洗固相萃取柱，经过流动相进行梯度洗脱，将收集的洗脱液经37～45℃下真空旋转蒸干，得到所述富含目标产物的固相萃取粉末。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述固相萃取柱吸附，具体为：
C18
固相萃取柱经活化后，每根固相萃取柱上样4.5BV杨梅叶提取液；用4BV去离子水洗去糖酸；再用10BV体积百分浓度为30％的甲醇溶液洗脱，去除部分杂质和其它非目标性黄酮醇；再用4BV体积百分浓度为40％的甲醇溶液洗脱，收集40％组分的洗脱液，37℃～50℃下真空旋转蒸干，得到富含杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷的固相萃取粉末。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，B相选自体积百分浓度为50％乙腈-水溶液、体积百分浓度为50％酸-乙腈-水溶液，所述酸的体积百分浓度为0.1％～5％，所述的酸选自甲酸、三氟乙酸；优选的，所述酸的体积百分浓度为0.1％～3％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述制备液相色谱纯化，具体为：
使用制备液相柱SunFireTM C18 OBMTM柱(5μm，19×250mm)，流动相：A相：体积百分浓度为0.1％的甲酸-水溶液，B相：体积百分浓度为50％甲酸-乙腈-水溶液(其中，甲酸的体积百分浓度为0.1％)；柱温为室温，流速为3-6mL/min；
将步骤(2)制得的固相萃取粉末用甲醇溶解，使其浓度达到100-200mg/mL，注入制备液相中纯化，单次进样量为50-300μL；
分别分管收集27～28.5min和28.5～30min的洗脱物，合并富含纯目标产物的洗脱液，经减压浓缩、冷冻干燥，即可分别得到高纯度的杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体和杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷单体。
8.杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷作为活性成分在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的用途；优选的，所述杨梅素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷根据权利要求1～7任一项所述的方法分离纯化得到。
9.杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷作为活性成分在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的用途，优选的，所述杨梅素-3-O-(4”-没食子酰基)-α-L-鼠李糖苷根据权利要求1～7任一项所述的方法分离纯化得到。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂为代谢综合征改善剂或药物；优选的，所述代谢综合征为2型糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗、高胰岛素血症中的至少一种疾病；优选的，所述的改善剂选自功能性食品、食品添加剂、补充剂。
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