CN108409804A - 一种分离东魁杨梅叶中杨梅素3-o(3〞-o-没食子酰基)-鼠李糖吡喃糖苷的方法 - Google Patents

一种分离东魁杨梅叶中杨梅素3-o(3〞-o-没食子酰基)-鼠李糖吡喃糖苷的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分离东魁杨梅叶中杨梅素3‑O(3〞‑O‑没食子酰基)‑鼠李糖吡喃糖苷的方法，结合Sephadex凝胶色谱柱与HSCCC实现了东魁杨梅叶中杨梅素3‑O(3〞‑O‑没食子酰基)‑鼠李糖吡喃糖苷的分离纯化，其精密度和重现性相对传统的分离纯化方法得到了提升，同时克服了传统固相载体带来的样品吸附、损失与污染的不良影响，降低了耗材价格，且原料易得，分离步骤简单易操作，耗时短，适用范围广，制备量大，对环境污染小，易于工业推广，也可为其他植物活性物质的分离纯化提供参考依据，对天然产物有效成分的研究具有十分重要的意义。

Description

一种分离东魁杨梅叶中杨梅素3-O(3〞-O-没食子酰基)-鼠李 糖吡喃糖苷的方法
技术领域
本发明属于天然化合物提取分离工艺技术领域，具体涉及一种使用高速逆流色谱分离东魁杨梅叶中杨梅素3-O(3〞-O-没食子酰基)-鼠李糖吡喃糖苷的方法。
背景技术
杨梅(Myrica rubra)是双子叶纲杨梅科杨梅属常绿灌木或小乔木，主要分布在我国的浙江、江苏、福建、云南、贵州、广东和湖南等省份，在日本，韩国、印度等国也有少量栽培。杨梅的干燥叶片收载于《中华本草》，其味苦、微辛，性温，具有燥湿祛风和止痒的功效。杨梅叶中主要含有黄酮类、原花色素类、挥发油类和多酚类化学成分，其中黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、降血糖和防癌抗癌等多种药理作用。东魁杨梅(Myrica rubra cv.DongKuiOrient Pear)，是杨梅科下的一个单独品种，素有“杨梅王”之称，具有成熟早、色美、味甜、核小、高产稳产等特点，近年来需求量和种植量逐年上升。但采摘过程中东魁杨梅叶大多作为废物丢弃。而东魁杨梅叶与一般品种的杨梅叶相比，含有多种独特的香味成分(如石竹烯、橙花叔醇等)和抗菌成分等活性物质。因此，如能将废弃的东魁杨梅叶加以利用，不仅能解决废物排放问题，也能实现资源再利用，带来一定的经济价值。
高速逆流色谱法(High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)是一种不用固态支撑体或载体的液液分配色谱和能实现连续有效的分配功能的实用新型分离技术。它利用了一种特殊的流体力学现象，即单向流体动力平衡现象，在这种平衡体系中，两种互不混溶的溶剂相在转动螺旋管中单向分布。在高速逆流色谱仪工作时，重力和螺旋管转动组合形成的阿基米德螺线力促使固定相移向螺旋管的入端，使得固定相予以保留，同时两相溶剂在螺旋管中得以混合，溶质在两相溶剂中得以分配平衡，从而使得不同成分得以分离。HSCCC不需要固体支撑体，因而避免了固体固定相不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等问题，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段，具有适用范围广、制备量大、操作简单、高效快速等优点，广泛应用于天然产物分离纯化、生物医药、环境分析、材料、化工、海洋生物和食品等领域，并已制备出包括黄酮类、蒽醌类、皂苷类、大环内酯类、儿茶素类、多酚类、糖蛋白类、多糖类在内的数百种单体成分。
近年来，国内外应用HSCCC分离天然植物中活性物质的研究已有很多，但针对东魁杨梅叶中有效成分的提取分离，目前还较少见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种分离东魁杨梅叶中杨梅素3-O(3〞-O-没食子酰基)-鼠李糖吡喃糖苷的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种分离东魁杨梅叶中杨梅素3-O(3〞-O-没食子酰基)-鼠李糖吡喃糖苷的方法，包括：
1)取东魁杨梅叶，水提得到水提粗提物；
2)取步骤1)得到的水提粗提物用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，除去溶剂，得到乙酸乙酯萃取物；
3)取步骤2)得到的乙酸乙酯萃取物用甲醇溶解后，过凝胶色谱柱，以甲醇为洗脱剂洗脱；
4)取步骤3)中洗脱时间为3810～4830min的组份进行高速逆流色谱分离：溶剂体系为体积比4～6:1～3:6～8的乙酸乙酯、正丁醇、水，充分混合后静置分层，分离上相与下相；取所述步骤3)中洗脱时间为3810～4830min的组份，用上相溶解为浓度500～540mg/mL；以上相为固定相，以下相为流动相，流速2～4mL/min，正接正转，转速800～900r/min；温度34～36℃；检测波长364～366nm；收集171～195min出峰对应的组份，得到所述杨梅素3-O(3〞-O-没食子酰基)-鼠李糖吡喃糖苷。
一实施例中：所述步骤1)中，取东魁杨梅叶，冻干，粉碎，置于水中煮沸提取4～8次，合并提取物，得到所述水提粗提物。
一实施例中：所述步骤3)中，凝胶色谱柱为Sephadex LH-20，柱长90～110cm，内直径8～12cm，填料LH20为1800～2200g。
一实施例中：所述步骤3)中，过柱流速为0.4～0.6mL/min。
一实施例中：所述步骤4)中，高速逆流色谱系统为TBE-300B。
一实施例中：所述步骤4)中，以上相为固定相，以下相为流动相，用35～45mL/min的流速将固定相泵满，调节转速为800～900r/min，温度34～36℃，以2～4mL/min的流速向柱中泵入流动相，当流动相从主机出口稳定流出时，证明体系已经达到流体动力学平衡；随后再用于所述高速逆流色谱分离。
一实施例中：所述步骤4)中，溶剂体系为体积比5:2:7的乙酸乙酯、正丁醇、水。
一实施例中：所述步骤4)中，上样量为8～12mL。
一实施例中：所述步骤4)中，流速3mL/min，转速850r/min；温度35℃；检测波长365nm。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
1.本发明结合葡聚糖凝胶色谱柱与HSCCC实现了东魁杨梅叶中杨梅素3-O(3〞-O-没食子酰基)-鼠李糖吡喃糖苷的分离纯化，其精密度和重现性相对传统的分离纯化方法得到了提升。
2.本发明采用的HSCCC克服了传统固相载体带来的样品吸附、损失与污染的不良影响；HSCCC因其独特的分离原理，在分离不同种类物质只需更换溶剂系统，而不是色谱柱，避免了柱效下降等问题，降低了耗材价格，易于工业推广。
3.本发明原料易得，是从东魁杨梅叶中首次利用HSCCC技术分离得到的，具体分离步骤简单易操作，耗时短，适用范围广，制备量大，对环境污染小，易于工业推广，也可作为其他植物活性物质的分离纯化提供参考依据，这对天然产物有效成分的研究具有十分的意义。
4.本发明分离得到的化合物杨梅素3-O(3〞-O-没食子酰基)-鼠李糖吡喃糖苷具有抗氧化等多种药用活性，具有潜在的应用价值。本发明的制备方法不仅能够实现大量东魁杨梅叶的废物利用，也为该化合物的大规模开发利用提供了可能。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为杨梅素3-O(3〞-O-没食子酰基)-鼠李糖吡喃糖苷的高速逆流色谱HSCCC分离色谱图。
图2为杨梅素3-O(3〞-O-没食子酰基)-鼠李糖吡喃糖苷的UPLC分析图。
图3为杨梅素3-O(3〞-O-没食子酰基)-鼠李糖吡喃糖苷的MS图。
图4为杨梅素3-O(3〞-O-没食子酰基)-鼠李糖吡喃糖苷的1H-NMR图谱。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
1)将湿重10Kg东魁杨梅叶冻干后，以粉碎机打碎，置于5000mL烧杯中，在水中煮沸提取6次，合并提取物，得到水提粗提物；
2)取步骤1)得到的水提粗提物加入乙酸乙酯，液液萃取，静置分层，取位于上层的乙酸乙酯层，以旋转蒸发仪抽干溶剂，得到乙酸乙酯萃取物(43.5g)；
3)取乙酸乙酯萃取物(43.5g)用甲醇溶解，过层析Sephadex LH-20(长100cm，内直径10cm，填料LH20为2000g)柱，用甲醇做洗脱剂，过柱流速为L＝0.5mL/min，按照出峰顺序分成6组份；
4)取步骤3)中洗脱时间为3810～4830min的第四组份(15.64g)进行高速逆流色谱HSCCC分离；
高速逆流色谱系统TBE-300B；溶剂体系为乙酸乙酯：正丁醇：水＝5:2:7(V/V)，按比例将三种溶剂混合配制好，摇匀，超声30min使其充分混合，静置过夜使上下相充分饱和平衡，分层，然后分离上相与下相；
开主机；以上相为固定相，以下相为流动相，用40mL/min的流速将固定相泵满聚四氟乙烯管，调节转速为850r/min，温度35℃，以3mL/min的流速向柱中泵入流动相，当流动相从主机出口稳定流出时，证明体系已经达到流体动力学平衡；
取上述步骤3)中洗脱时间为3810～4830min的第四组份(15.64g)，用上相溶解为浓度520mg/mL；进样量10mL(5.2g)；以上相为固定相，以下相为流动相，流速3mL/min泵入柱中，仪器为正接正转，转速850r/min；温度35℃；检测波长：365nm；收集171～195min出峰对应的组份，得到黄酮类化合物(21mg)，其高速逆流色谱HSCCC分离色谱如图1所示。
本实施例得到的黄酮类化合物采用UPLC分析，UPLC参数如下，UPLC图谱如图2所示。
UPLC型号：Nexera X2岛津；
检测器：SPD-M20A；
色谱柱：YMC-Triart C18柱，50×3.0mm l.D S-1.9μm；
液相条件：
流动相：甲醇:水＝40:60，18min；
流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：2.0μL
检测波长：265nm。
本实施例得到的黄酮类化合物为黄色粉末状，由负离子分辨质谱(MS类型为ESI源)确定其分子式为C28H24O16([M-H-]m/z测得值615.1013，计算值616.1014)，MS图谱如图3，1H-NMR图谱如图4，H-NMR图谱表明：
δH(CD3OD)：6.23(1H,d,J＝2.0Hz，H6)，6.40(1H,d,J＝2.0Hz,H8)，6.96(2H,s,H2＇and H6＇)，5.28(1H,d,J＝1.9Hz,H1")，4.48(1H，dd,J＝3.4and 1.9Hz,H2")，5.25(1H,dd,J＝9.3and 3.4Hz,H3")，3.67(1H,t,J＝9.3Hz,H4")，3.72(1H，m,H5")，1.00(3H,d,J＝5.8Hz,H6")，7.06(2Hs,H2”’and H6”’)。
根据上述图谱分析，本实施例得到的化合物为杨梅素3-O(3〞-O-没食子酰基)-鼠李糖吡喃糖苷(Myricetin3-O(3〞-O-galloyl)-rhamnopyranoside)，相对分子量为616，其结构式如下式所示：
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (9)

1.一种分离东魁杨梅叶中杨梅素3-O(3〞-O-没食子酰基)-鼠李糖吡喃糖苷的方法，其特征在于：包括：
1)取东魁杨梅叶，水提得到水提粗提物；
2)取步骤1)得到的水提粗提物用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，除去溶剂，得到乙酸乙酯萃取物；
3)取步骤2)得到的乙酸乙酯萃取物用甲醇溶解后，过凝胶色谱柱，以甲醇为洗脱剂洗脱；
4)取步骤3)中洗脱时间为3810～4830min的组份进行高速逆流色谱分离：溶剂体系为体积比4～6:1～3:6～8的乙酸乙酯、正丁醇、水，充分混合后静置分层，分离上相与下相；取所述步骤3)中洗脱时间为3810～4830min的组份，用上相溶解为浓度500～540mg/mL；以上相为固定相，以下相为流动相，流速2～4mL/min，正接正转，转速800～900r/min；温度34～36℃；检测波长364～366nm；收集171～195min出峰对应的组份，得到所述杨梅素3-O(3〞-O-没食子酰基)-鼠李糖吡喃糖苷。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，取东魁杨梅叶，冻干，粉碎，置于水中煮沸提取4～8次，合并提取物，得到所述水提粗提物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，凝胶色谱柱为SephadexLH-20，柱长90～110cm，内直径8～12cm，填料LH20为1800～2200g。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，过柱流速为0.4～0.6mL/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，高速逆流色谱系统为TBE-300B。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，以上相为固定相，以下相为流动相，用35～45mL/min的流速将固定相泵满，调节转速为800～900r/min，温度34～36℃，以2～4mL/min的流速向柱中泵入流动相，当流动相从主机出口稳定流出时，证明体系已经达到流体动力学平衡；随后再用于所述高速逆流色谱分离。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，溶剂体系为体积比5:2:7的乙酸乙酯、正丁醇、水。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，上样量为8～12mL。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，流速3mL/min，转速850r/min；温度35℃；检测波长365nm。
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