CN101348510B

CN101348510B - 山茶黄酮素的制备方法

Info

Publication number: CN101348510B
Application number: CN2008100128334A
Authority: CN
Inventors: 王永奇; 唐玲; 王威; 冯宝民
Original assignee: Dalian University
Current assignee: Dalian University
Priority date: 2008-08-15
Filing date: 2008-08-15
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2028-08-15
Also published as: CN101348510A

Abstract

一种山茶黄酮素的制备方法，是首先以榨油后的南山茶种粕为原料进行溶剂提取，提取溶剂是浓度为60～90％的乙醇-水溶液，提取时间1～5h，提取温度60～100℃，料液比(g:m1)＝1:5～25，提取次数1～4次；提取物浓缩干燥后转溶于水、过滤，滤液经DiaionHP-20大孔树脂吸附后，用去离子水洗脱杂质，然后以浓度20～50％的乙醇-水溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥后得山茶黄酮素产品。由本发明所述的制备方法生产的山茶黄酮素纯度高、质量好，色泽佳；提取物纯化后黄酮含量超过50％，满足用于研制注册5类新药的含量标准；并且该方法操作简便易行，成本低，使用溶剂无毒；大孔树脂可再生重复使用，适于规模化生产。

Description

山茶黄酮素的制备方法

技术领域

本发明涉及天然植物南山茶种子中活性成分的提取制备方法，尤其涉及黄酮类物质的提取纯化方法。

背景技术

南山茶(Camellia semiserrata Chi)系山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)植物，分布于广西的东南部至广东西南部，海拔250～500米山地，是一种资源丰富的重要油料树种，种子油分质量好，且叶片漂亮、花朵硕大，作为油料和花卉树种，除野生外亦大量栽培。但药用价值国内外至今未见报道。

本发明人对山茶属植物的研究始于2002年，先后赴山茶属植物的主产区广西、云南、湖南进行了资源调查。在资源调查的基础上，发明人对采集到的种子、果皮、叶及榨油后的种粕等原料进行了抗骨质疏松、抗肿瘤、抗生育、抗真菌、抗寄生虫及抗杀软体动物的活性筛选。以维甲酸所致骨质疏松大鼠的活性筛选中发现，南山茶种粕95％乙醇提取物具有非常强的抗骨质疏松作用，明显高于阳性对照药。通过重组人雌(孕)激素受体基因酵母法对95％乙醇提取物不同萃取部位的活性筛选，确认其有效组分主要是乙酸乙酯层(黄酮含量44％)，其次是正丁醇层(多酚含量26％)。通过定性、定量及活性验证，证明其有效部位为以黄酮类成分为主的有效部位群。为了进一步研发及产品开发的需要，有必要对此类物质的提取纯化方法进行研究。

发明内容

基于上述种种因素的考虑，本发明的目的即在于提供一种制备高纯度山茶黄酮素的完整技术方案。

本发明所述的山茶黄酮素的制备方法是：首先以榨油后的南山茶种粕为原料进行溶剂提取，提取溶剂是浓度为60～90％的乙醇-水溶液，提取时间1～5h，提取温度60～100℃，料液比(g:ml)＝1:5～25，提取次数1～4次；提取物浓缩干燥后转溶于水、过滤，滤液经DiaionHP-20大孔树脂吸附后，用去离子水洗脱杂质，然后以浓度20～50％的乙醇-水溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥后得山茶黄酮素产品。

其中，所述的提取溶剂优选浓度为60～80％的乙醇-水溶液，提取时间优选1.5～2.5h，提取温度优选80～90℃，料液比(g:ml)优选1:15～25，提取次数优选2～3次。

其中，更为优选的是：提取溶剂浓度为70％的乙醇-水溶液，提取时间2.5h，提取温度80℃，料液比(g:ml)1:20，提取次数2次。

上文所述的任意一种山茶黄酮素的制备方法中，对DiaionHP-20大孔树脂纯化步骤的优选方案是以浓度20～30％的乙醇-水溶液进行洗脱；最优选25％的乙醇-水溶液。

上述方案中的DiaionHP-20大孔树脂纯化步骤中，用于洗脱杂质的去离子水用量优选3倍树脂量(ml/g)，洗脱液用量为13～14倍树脂量(ml/g)。

基于上述内容，本发明的山茶黄酮素的制备方法较为优选地包括如下技术步骤：

①将原料南山茶种粕粉碎；

②以浓度为70％的乙醇-水溶液为溶剂，按料液比(g:ml)＝1:20浸提原料2次，每次2h，提取温度80℃；

③提取液浓缩干燥后转溶于水并过滤；

④滤液经DiaionHP-20大孔树脂吸附后，用3倍树脂量(ml/g)的去离子水洗脱杂质，然后以13～14倍树脂量(ml/g)的浓度25％的乙醇-水溶液洗脱；

⑤收集洗脱液并浓缩干燥，得山茶黄酮素产品。

上述方案中，所述的DiaionHP-20大孔树脂吸附上样溶液的山茶黄酮素含量最好9.3～9.4mg/ml。

由本发明所述的制备方法生产的山茶黄酮素纯度高、质量好，色泽佳；提取物纯化后黄酮含量超过50％，满足用于研制注册5类新药的含量标准；并且该方法操作简便易行，成本低，所用溶剂无毒；大孔树脂可再生重复使用，适于规模化生产。

附图说明

本发明附图1幅，即本发明的山茶黄酮素的制备方法的工艺流程图。

具体实施方式

下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。如无特殊说明，下述实施例中均采用NaNO₂-AlCl₃显色—分光光度法测定黄酮含量。

本部分所用南山茶种子于2006年3月采集于广西省平南县六陈镇，经中科院昆明植物所裴盛基教授鉴定为南山茶(Camellia semiserrata Chi.)种子。

本部分所使用的对照品：山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基-(6→1)-2″′，4″′-O-二乙酰基-α-L-鼠李糖基-(3→1)-2″″，3″″，4″″-O-三乙酰基-α-L-鼠李糖苷(黄酮苷A)由本发明人通过下述方法从南山茶种子中得到：

①制备南山茶子(Camellia semiserrata Chi.)油粕的乙酸乙酯萃取物：以95％工业乙醇加热回流提取，料液比1:10(g:ml)，温度95℃，提取3次，每次3小时；乙醇提取物浓缩成浸膏后以3倍蒸馏水混悬，并按照体积比依次用3倍石油醚和3倍乙酸乙酯各萃取3次，得乙酸乙酯萃取物；

②以硅胶柱色谱分离上述乙酸乙酯萃取物，氯仿:甲醇15:1(体积)混合溶液等度洗脱，得混合物；

③继续以硅胶柱色谱分离上述混合物，氯仿:甲醇20:1(体积)混合溶液洗脱得南山茶黄酮苷A；

④Sephadex LH20纯化所得产物，可得黄色粉末状产品。

经质谱分析技术(ESI-MS)和核磁共振分析技术(¹H-NMR、¹³C-NMR、H-H COSY、HMBC、HMQC)对物质结构进行鉴定，提取所得物质即山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基-(6→1)-2″′，4″′-O-二乙酰基-α-L-鼠李糖基-(3→1)-2″″，3″″，4″″-O-三乙酰基-α-L-鼠李糖苷，纯度98％以上。

本发明的山茶黄酮素的制备方法是：首先以榨油后的南山茶种粕为原料按照设定的不同的乙醇-水溶液浓度、提取时间，提取温度，料液比，提取次数浸提；提取物浓缩干燥后转溶于水、过滤，滤液经DiaionHP-20大孔树脂吸附后，以设定用量的去离子水洗脱杂质，然后以设定浓度、用量条件的乙醇-水溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥后得山茶黄酮素产品。

以下具体实施例对提取及纯化步骤进行分别的详细描述。

一、南山茶黄酮提取工艺实施例(实施例1～23)

按照上述具体操作步骤，在设定条件下提取山茶黄酮素，提取溶剂为不同浓度的乙醇—水溶液，黄酮的收率计算方法为：

黄酮收率＝(提取液中黄酮质量/南山茶种粕质量)×100％

具体条件设定及提取结果见表1：

表1

实施例24

本实施例是考察提取工艺的正交实验，提取工艺步骤同前述实施例1～23，根据前述实施例1～23的结果，对4个因素分别选择适宜的3个水平，采用L₉(3⁴)正交实验安排表考察最佳工艺条件。正交实验因素水平安排见表2，实验结果分别见表3：

表2

表3

分析可知，各因素的影响依次为D>B>A>C，即提取溶剂倍量>提取时间>提取溶剂浓度>提取温度，所以最佳工艺组合为A₂B₃C₁D₂，即20倍量的70％乙醇-水为溶剂，80℃，提取2次，每次2.5小时，提取物黄酮含量为18.55％，黄酮的收率为3.42％。其中提取溶剂倍量对黄酮提取的影响比较大。

二、Diaion HP-20纯化南山茶黄酮的工艺条件及参数考察实施例

本部分实施例均包括对Diaion HP-20大孔树脂的使用前预处理及回收后处理步骤，预处理的方法是：取一定量DiaionHP-20大孔吸附树脂，95％乙醇浸泡24小时后，将其装入预先清洗干净的树脂柱内，湿法装柱，先以95％乙醇洗至流出液加3倍量水无白色混浊现象，改用去离子水冲洗至无醇味，备用。

为了优化树脂的使用，本实施例首先对树脂性能参数进行了考察，包括：

1、静态吸附量的确定：在250mL锥形瓶中加入3g预处理的DiaionHP-20大孔吸附树脂及含黄酮水溶液1.86mg/ml的样品溶液100mL。室温振荡24小时后，静置，吸附完全后，取样测定残余溶液中黄酮含量，根据下式计算物料平衡时的平衡吸附量q＝(C₀-C)V/G，式中，C₀和C分别为初始和平衡时溶液中黄酮的浓度(mg/mL)及多酚浓度，V为供试液体积(mL)，G为树脂量(g)。计算得知DiaionHP-20大孔树脂的静态吸附容量为每g大孔树脂吸附黄酮为59.5mg。

2、动态吸附量的确定：取DiaionHP-20大孔树脂20g装柱(径高比为1:10)，取上柱样品液黄酮浓度为9.275mg/ml(相当于生药浓度为0.27g/mL)以2BV/h的流速连续通过树脂柱，收集流出液，测定流出液中黄酮的浓度，结果发现：当上柱样品溶液加至210mL，即10.5倍树脂重量，DiaionHP-20大孔吸附树脂达到饱和。

实施例25～29

取实施例1～24中任一实施例的方法所制得的提取物浸膏2克，适量水溶解、过滤，滤液上DiaionHP-20大孔吸附树脂柱(树脂干重20g)，吸附完成后用去离子水冲洗，再分别用10％，20％，30％，40％，50％乙醇-水溶液以2BV/h进行梯度洗脱，富集洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩成膏状，然后放在60℃真空干燥箱中干燥至恒重，测定黄酮含量并计算其洗脱率：

其中，浸膏洗脱量的计算方法是洗脱液的重量。

黄酮洗脱率的计算方法是：(洗脱液中黄酮量)/(上样浸膏中黄酮量)×100％。

具体条件设定及结果如表4所示。

表4

实施例30

将原料南山茶种粕粉碎后以浓度为70％的乙醇-水溶液为溶剂，按料液比(g:ml)＝1:20浸提原料2次，每次2h，提取温度80℃；分离滤液和滤渣，提取液浓缩干燥后转溶于水并过滤，制成黄酮浓度9.275mg/ml的样品溶液；10.5倍于树脂量(ml:g)的样品溶液以2BV/h的流速连续通过DiaionHP-20大孔树脂柱(DiaionHP-20大孔树脂，干重20g，经预处理后湿法装柱，柱径高比1:10)吸附完全后，用3倍树脂量(ml:g)的去离子水洗脱杂质，然后以13～14倍树脂量(ml:g)的浓度25％的乙醇-水溶液洗脱；收集洗脱液用旋转蒸发仪浓缩成膏状，然后放在60℃真空干燥箱中干燥至恒重，测量所得产品中黄酮含量51.26％，DiaionHP-20大孔树脂柱色谱洗脱率27.84％。

Claims

1.山茶黄酮素的制备方法，其特征在于该方法是：首先以榨油后的南山茶种粕为原料进行溶剂提取，提取溶剂是浓度为60～90％的乙醇-水溶液，提取时间1～5h，提取温度60～100℃，料液比＝1g∶5～25ml，提取次数1～4次；提取物浓缩干燥后转溶于水、过滤，滤液经DiaionHP-20大孔树脂吸附后，用去离子水洗脱杂质，然后以浓度20～50％的乙醇-水溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥后得山茶黄酮素产品。

2.根据权利要求1所述的山茶黄酮素的制备方法，其特征在于所述的提取溶剂是浓度为60～80％的乙醇-水溶液，提取时间1.5～2.5h，提取温度80～90℃，料液比＝1g∶15～25ml，提取次数2～3次。

3.根据权利要求1所述的山茶黄酮素的制备方法，其特征在于所述的提取溶剂是浓度为70％的乙醇-水溶液，提取时间2.5h，提取温度80℃，料液比＝1g∶20ml，提取次数2次。

4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的山茶黄酮素的制备方法，其特征在于所述的DiaionHP-20大孔树脂纯化步骤中，洗脱溶剂是浓度20～30％的乙醇-水溶液。

5.根据权利要求4所述的山茶黄酮素的制备方法，其特征在于所述的洗脱溶剂是浓度25％的乙醇-水溶液。

6.根据权利要求4所述的山茶黄酮素的制备方法，其特征在于每1g树脂使用3ml去离子水，每1g树脂使用13～14ml洗脱液。

7.根据权利要求1所述的山茶黄酮素的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

①将原料南山茶种粕粉碎；

②以浓度为70％的乙醇-水溶液为溶剂，按料液比＝1g∶20ml浸提原料2次，每次2h，提取温度80℃；

③提取液浓缩干燥后转溶于水并过滤；

④滤液经DiaionHP-20大孔树脂吸附后，按照每1g树脂使用3ml去离子水的用量以去离子水洗脱杂质，然后按照每1g树脂使用13～14ml洗脱液的用量进行洗脱，洗脱液是浓度25％的乙醇-水溶液；

⑤收集洗脱液并浓缩干燥，得山茶黄酮素产品。

8.根据权利要求6或7所述的山茶黄酮素的制备方法，其特征在于所述的DiaionHP-20大孔树脂吸附上样溶液的山茶黄酮素含量9.3～9.4mg/ml。