CN103736296A - 一种制备高纯度丹参酮化合物的双柱循环分离系统及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备高纯度丹参酮化合物的双柱循环分离系统及其方法，双柱循环分离系统包括三个逆流色谱柱，三个泵，三个检测器，三个收集器和三个六通阀。以第一逆流色谱柱做起始分离柱，第二逆流色谱柱和第三逆流色谱柱做相互独立的循环分离柱，通过调节第二六通阀和第三六通阀即可实现丹参酮类化合物多维循环分离。丹参酮类化合物包括二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯。本发明提取分离简单、时间短，产物纯度高，可连续化操作，适于工业化生产。

Description

一种制备高纯度丹参酮化合物的双柱循环分离系统及其方法

技术领域

本发明涉及一种制备高纯度丹参酮化合物的双柱循环分离系统及其方法。

背景技术

逆流色谱（Counter-current chromatography CCC）是一种不需要固体支持物的液液分配色谱，因此可以避免固体支持物带来的缺点，例如样品损失，活性变化，拖尾以及污染。相比于高效液相色谱（High performance liquid chromatography HPLC），CCC拥有更大的制备装载量和更好的选择性。因此，从微量分析到制备分离甚至工业生产，CCC仍是一种重要的分离纯化技术。然而，逆流色谱的分辨率仍然远远小于HPLC、气相色谱（Gaschromatography GC）和毛细管电泳（Capillary electrophoresis CE）。但是研究者采取了很多方法改善这一缺点，到目前为止，已经在柱子排列顺序，提高离心力，采用不同形状绕线圈等方面进行了改进。

通常情况下，增加柱子长度会提高分离效率，但是单纯增加柱子的物理长度不仅需要占用更大空间，同时需要耗费更多成本增加仪器及溶剂。循环分离则是一种有效的解决方法，它没有增加柱子的物理长度，而是将尾端洗脱液进入首端进行循环分离，这样既可以节省空间，又可以节约试剂，循环分离最大的风险是分开的物质因循环后导致混合在一起，因此如何避免返混是利用循环分离的最大技术难点。现有的循环色谱多是用单柱进行循环，同时采用填充柱色谱，柱尾端压力较大导致材料要求高，也因死吸附等使样品容易损失；有些循环分离中没有将检测器放在循环中，因此无法实时检测分离情况。

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）是唇形科植物丹参的干燥根和茎，始载于《神农本草经》，被列为上品。其味苦，性微寒，归心、肝二经，具有活血通络，祛瘀止痛、凉血消痈、除烦安神等功效，中医有“一味丹参饮，功同四物汤”之说。丹参酮（Tanshinones）是丹参中具有橙黄色和橙红色特征的脂溶性二萜类化合物，按其结构不同分为丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、羟基丹参酮、丹参酮甲酯、异丹参酮、异隐丹参酮等10多种成分。由于醌类成分已被还原成二酚类衍生物，后者又被氧化为醌，因此起到电子传递的作用。它们作为新陈代新的产物，通过促进或干扰生物多种生化反应，表现出多种生物活性。药理活性研究表明，丹参酮在抗肿瘤、心血管疾病、抗菌消炎等方面均有良好的治疗作用。

丹参酮易溶于乙醇、甲醇等有机溶剂。传统的制备方法是粉碎浸泡提取后用柱层析（薄层色谱、硅胶柱色谱、制备液相色谱）反复富集纯化，但是这些制备方法经常耗时而且会因为柱填料的吸附而造成样品损失，专利CN200610017897.4提供一种用正相硅胶柱、乙酸乙酯、苯、氯仿、60-90规格的石油醚多次提取的方法分离丹参酮，其分离次数过多，操作繁琐，且使用了苯、氯仿等对环境污染较大的溶剂；专利CN201210549910.6中提供的丹参酮提取物及其水溶物的制备方法中只是用乙醇浸提、回流提取、减压浓缩、纯水洗涤等步骤，得到的产物中丹参酮ⅡA含量仅有10.0%～15.0%，隐丹参酮物质含量为8.0%～11.0%。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有丹参酮分离制备过程中分离流程长、所用溶剂环境危害性大、回收率不高等缺陷，而提供一种提取分离简单、可连续化操作的制备高纯度丹参酮化合物的双柱循环分离系统及其方法。

本发明的目的是这样实现的：

本发明的制备高纯度丹参酮化合物的双柱循环分离系统，包括三个逆流色谱柱，三个泵，三个检测器，三个收集器和三个六通阀；其中第一六通阀做进样阀，该进样阀与第一逆流色谱柱首端及第一泵相连，第一逆流色谱柱的尾端与第一检测器的输入端相连，第一检测器的输出端与第二六通阀的第Ⅱ节点相连，第二六通阀的第Ⅰ节点与第一收集器相连；第二六通阀的第Ⅲ节点与第二泵的输入端相连，第二泵的输出端与第二逆流色谱柱的首端相连，第二逆流色谱柱的尾端与第二检测器的输入端相连，第二检测器的输出端与第三六通阀的第Ⅰ节点相连，第三六通阀的第二节点与第二收集器相连；第三六通阀的第Ⅴ节点与盛装流动相容器相连，第三六通阀的第VI节点与第三泵的输入端相连，第三泵的输出端与第三逆流色谱柱的首端相连，第三逆流色谱柱的尾端与第三检测器的输入端相连，第三检测器的输出端与第二六通阀的第Ⅳ节点相连，第二六通阀的第Ⅴ节点与第三收集器相连。

利用本发明的双柱循环分离系统制备高纯度丹参酮化合物的方法，该丹参酮类化合物包括结构式(1)二氢丹参酮Ⅰ、结构式(2)三叶鼠尾酮B和结构式(3)甲基丹参酮酯，

其制备包括以下步骤：

（1）将丹参根茎粉碎后，用体积浓度95%的乙醇充分浸泡提取；

（2）减压浓缩乙醇提取液，得到的浓缩物用正相硅胶拌样，再依次用石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水进行洗脱，得到富含二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯的丹参酮提取物；

（3）配制四元溶剂体系：将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按体积百分比分别为68.70%、24.91%、3.64%和2.75%配制的四元溶剂体系作为上相，按体积百分比分别为2.53%、24.77%、49.04%和23.66%配制的四元溶剂体系作为下相，将配制好的上下相分别加入到三个逆流色谱柱中，加入到每个逆流色谱柱中上相的量为其柱体积的60%，下相的量为其柱体积的40%，其中上相做固定相，下相做流动相；

（4）将步骤（2）制得的富含二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯的丹参酮提取物首先经过第一逆流色谱柱进行第一维分离，得到含有二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯的洗脱液；

（5）观察第一检测器，当含有二氢丹参酮Ⅰ的洗脱液从第一逆流色谱柱开始被洗出后，调节第二六通阀将第一逆流色谱柱的尾端与第二逆流色谱柱的首端连接，在线直接将含二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯的洗脱液转入第二逆流色谱柱中，观察第一检测器（4），当洗脱液完全进入第二逆流色谱柱后，调节第二六通阀将第一逆流色谱柱的尾端与第二逆流色谱柱的首端断开，同时将第二逆流色谱柱的首端与第三逆流色谱柱的尾端连接，使二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯在第二逆流色谱柱中进行第二维分离；

（6）观察第二检测器，当含二氢丹参酮Ⅰ的洗脱液从第二逆流色谱柱开始被洗出后，调节第三六通阀将第二逆流色谱柱与第三逆流色谱柱连接，在线直接将含二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯的洗脱液转入第三逆流色谱柱进行第三维分离；

（7）观察第三检测器，当含二氢丹参酮Ⅰ的洗脱液从第三逆流色谱柱开始洗出后，通过第二六通阀将第三逆流色谱柱的尾端与第二逆流色谱柱的首端连接，使二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯进入第二逆流色谱柱进行第一次循环分离；

（8）观察第二检测器，当含二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B的洗脱液从第二逆流色谱柱洗出后，再次通过第三六通阀进入第三逆流色谱柱分离；观察第二检测器，当含甲基丹参酮酯的洗脱液从第二逆流色谱柱洗出后，调节第三六通阀将第二逆流色谱柱的尾端与第三逆流色谱柱的首端断开，第二收集器收集第二逆流色谱柱中的甲基丹参酮酯；

（9）观察第三检测器，进入第三逆流色谱柱分离的二氢丹参酮Ⅰ和三叶鼠尾酮B从第三逆流色谱柱尾端洗出后，调节第二六通阀将第二逆流色谱柱首端与第三逆流色谱柱尾端断开，第三收集器收集第三逆流色谱柱中的二氢丹参酮Ⅰ和三叶鼠尾酮B。

本发明的有益效果在于：

1）采用循环分离，不仅可以节省溶剂，也可以简化寻找合适溶剂系统的过程，从而可以使用样品溶解度大的溶剂以加大上样量，提高了单位时间的产量；

2）采用双柱循环分离，能够满足不增加分离柱物理长度的情况下实现复杂样品的纯化，同时降低了循环分离中已分开样品交叉污染的风险；

3）通过设计仪器组合使得三维分离与循环分离结合在一起，通过调节第二六通阀与第三六通阀即可实现三维分离与循环分离的切换，操作简单，节省分离时间。

4）分离柱即可用逆流色谱，也可用常见的高效液相色谱，应用范围广。

附图说明

图1为双柱循环分离系统示意图，图中：A1为第一逆流色谱柱，B1为第二逆流色谱柱，C1为第三逆流色谱柱，1为第一泵，2为第二泵，3为第三泵，4为第一检测器，5为第二检测器，6为第三检测器，7为第一收集器，8为第二收集器，9为第三收集器，10为第一六通阀，11为第二六通阀，12为第三六通阀，13为盛装流动相的容器。

图2为六通阀处于位置1状态示意图；

图3为六通阀处于位置2状态示意图；

图4为实施例样品HPLC分析图，图中：1为二氢丹参酮Ⅰ，2为三叶鼠尾酮B，3为甲基丹参酮酯；

图5为实施例分离过程在线检测示意图，其中：图（a）A1体系分离；图（b）B1体系分离；图（c）C1体系分离。

图6为纯化的二氢丹参酮Ⅰ液相色谱分析。

图7为纯化的三叶鼠尾酮B液相色谱分析。

图8为纯化的甲基丹参酮酯液相色谱分析。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

参照图1，本发明的制备高纯度丹参酮化合物的双柱循环分离系统，包括三个逆流色谱柱A1、B1、C1，三个泵1、2、3，三个检测器4、5、6，三个收集器7、8、9和三个六通阀10、11、12；其中第一六通阀10做进样阀，该进样阀与第一逆流色谱柱A1首端及第一泵1相连，第一逆流色谱柱A1的尾端与第一检测器4的输入端相连，第一检测器4的输出端与第二六通阀11的第Ⅱ节点相连，第二六通阀11的第Ⅰ节点与第一收集器7相连；第二六通阀11的第Ⅲ节点与第二泵2的输入端相连，第二泵2的输出端与第二逆流色谱柱B1的首端相连，第二逆流色谱柱B1的尾端与第二检测器5的输入端相连，第二检测器5的输出端与第三六通阀12的第Ⅰ节点相连，第三六通阀12的第二节点与第二收集器8相连；第三六通阀12的第Ⅴ节点与盛装流动相容器相连，第三六通阀12的第VI节点与第三泵3的输入端相连，第三泵3的输出端与第三逆流色谱柱C1的首端相连，第三逆流色谱柱C1的尾端与第三检测器6的输入端相连，第三检测器6的输出端与第二六通阀11的第Ⅳ节点相连，第二六通阀11的第Ⅴ节点与第三收集器9相连。

实施例1

利用双柱循环分离系统制备高纯度丹参酮化合物的方法，该丹参酮类化合物包括结构式(1)二氢丹参酮Ⅰ、结构式(2)三叶鼠尾酮B和结构式(3)甲基丹参酮酯，

步骤如下：

1.提取和富集：

取干燥丹参根茎9.5公斤，粉碎成60目的粗粉，室温下置于30L体积浓度95%乙醇浸提3次，每次24小时，定期搅拌，合并浸提液减压浓缩，得到丹参粗提物，取出30g用正相硅胶拌样，然后用石油醚、乙酸乙酯洗脱，收集富含丹参酮化合物的洗脱液，减压浓缩冻干，得到富含二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯的粗品（HPLC分析图见图4），用于制备分离。

2.配制溶剂系统：

按照正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积百分比分别是68.70%、24.91%、3.64%、2.75%的比例配制上相800ml，按照四者体积百分比分别是2.53%、24.77%、49.04%、23.66%的比例配制下相2L，其中上相做固定相，下相做流动相。

3.双柱循环逆流色谱制备：

（1）配好溶剂系统后，上相和下相分别用第一泵1同时推入三个逆流色谱柱（A1-220ml，B1-180ml，C1-210ml）内，加入到第一逆流色谱柱A1中上相的量为132ml，下相的量为88ml，加入到第二逆流色谱柱B1中上相的量为108ml，下相的量为72ml，加入到第三逆流色谱柱C1中上相的量为126ml，下相的量为84ml。

（2）将步骤（1）制得的富含二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯的丹参酮提取物61mg用5ml上相与5ml下相溶解后注入进样阀，开启三个逆流色谱，下相做流动相并以3ml/min流速洗脱。将第二六通阀11置于位置1（如图2），第三六通阀12置于位置2（如图3），样品首先进入第一逆流色谱柱A1进行分离，观察第一检测器4，36min时被分离物开始洗出，58min时，二氢丹参酮Ⅰ开始被洗出，调节第二六通阀11处于位置2（如图3），将第一逆流色谱柱A1尾端与第二逆流色谱柱B1首端连接，使含有二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯的洗脱液进入第二逆流色谱柱B1进行第二维分离；观察第一检测器4，85min时，洗脱液完全进入第二逆流色谱柱B1，同时观察第二检测器5，含二氢丹参酮Ⅰ的洗脱液从第二逆流色谱柱B1开始洗出，调节第二六通阀11返回位置1，第三六通阀仍处于位置2，将第一逆流色谱柱A1尾端与第二逆流色谱柱B1首端断开，同时第二逆流色谱柱B1首端与第三逆流色谱柱C1尾端连接，第二逆流色谱柱B1尾端与第三逆流色谱柱C1首端连接，使含有二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯的洗脱液在相连的第二逆流色谱柱B1与第三逆流色谱柱C1内进行循环分离；观察第三检测器6，250min时，含二氢丹参酮Ⅰ和三叶鼠尾酮B的洗脱液完成两个循环从第三逆流色谱柱C1洗出，调节第二六通阀11处于位置2，第三六通阀12处于位置2，将第一逆流色谱柱A1尾端与第二逆流色谱柱B1首端，第二逆流色谱柱B1与第三逆流色谱柱C1尾端相连，第三收集器9收集第三逆流色谱柱C1中的二氢丹参酮Ⅰ和三叶鼠尾酮B；观察第二检测器5，276min时，含甲基丹参酮酯的洗脱液完成一个半循环从第二逆流色谱柱B1洗出，调节第二六通阀11处于位置2，第三六通阀12处于位置1，将第二逆流色谱柱B1与第三逆流色谱柱C1断开，第一逆流色谱柱A1与第二逆流色谱柱B1相连，第二收集器8直接收集第二逆流色谱柱中的甲基丹参酮酯（分离过程在线检测图见图5）。

浓缩冻干后测定纯度，二氢丹参酮Ⅰ的纯度为100%(见图6)；三叶鼠尾酮B的纯度为97.6%(见图7)；甲基丹参酮酯的纯度为95.6%(见图8)。

Claims (2)

1.一种制备高纯度丹参酮化合物的双柱循环分离系统，其特征在于包括三个逆流色谱柱（A1、B1、C1），三个泵（1、2、3），三个检测器（4、5、6），三个收集器（7、8、9）和三个六通阀（10、11、12）；其中第一六通阀（10）做进样阀，该进样阀与第一逆流色谱柱（A1）首端及第一泵（1）相连，第一逆流色谱柱（A1）的尾端与第一检测器（4）的输入端相连，第一检测器（4）的输出端与第二六通阀（11）的第Ⅱ节点相连，第二六通阀（11）的第Ⅰ节点与第一收集器（7）相连；第二六通阀（11）的第Ⅲ节点与第二泵（2）的输入端相连，第二泵（2）的输出端与第二逆流色谱柱（B1）的首端相连，第二逆流色谱柱（B1）的尾端与第二检测器（5）的输入端相连，第二检测器（5）的输出端与第三六通阀（12）的第Ⅰ节点相连，第三六通阀（12）的第二节点与第二收集器（8）相连；第三六通阀（12）的第Ⅴ节点与盛装流动相容器相连，第三六通阀（12）的第VI节点与第三泵（3）的输入端相连，第三泵（3）的输出端与第三逆流色谱柱（C1）的首端相连，第三逆流色谱柱（C1）的尾端与第三检测器（6）的输入端相连，第三检测器（6）的输出端与第二六通阀（11）的第Ⅳ节点相连，第二六通阀（11）的第Ⅴ节点与第三收集器（9）相连。

2.利用权利要求1所述的双柱循环分离系统制备高纯度丹参酮化合物的方法，该丹参酮类化合物包括结构式(1)二氢丹参酮Ⅰ、结构式(2)三叶鼠尾酮B和结构式(3)甲基丹参酮酯，

其制备包括以下步骤：

（1）将丹参根茎粉碎后，用体积浓度95%的乙醇充分浸泡提取；

（2）减压浓缩乙醇提取液，得到的浓缩物用正相硅胶拌样，再依次用石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水进行洗脱，得到富含二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯的丹参酮提取物；

（3）配制四元溶剂体系：将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按体积百分比分别为68.70%、24.91%、3.64%和2.75%配制的四元溶剂体系作为上相，按体积百分比分别为2.53%、24.77%、49.04%和23.66%配制的四元溶剂体系作为下相，将配制好的上下相分别加入到三个逆流色谱柱（A1、B1、C1）中，加入到每个逆流色谱柱中上相的量为其柱体积的60%，下相的量为其柱体积的40%，其中上相做固定相，下相做流动相；

（4）将步骤（2）制得的富含二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯的丹参酮提取物首先经过第一逆流色谱柱（A1）进行第一维分离，得到含有二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯的洗脱液；

（5）观察第一检测器（4），当含有二氢丹参酮Ⅰ的洗脱液从第一逆流色谱柱（A1）开始被洗出后，调节第二六通阀（11）将第一逆流色谱柱（A1）的尾端与第二逆流色谱柱（B1）的首端连接，在线直接将含二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯的洗脱液转入第二逆流色谱柱（B1）中，观察第一检测器（4），当洗脱液完全进入第二逆流色谱柱（B1）后，调节第二六通阀（11）将第一逆流色谱柱（A1）的尾端与第二逆流色谱柱（B1）的首端断开，同时将第二逆流色谱柱（B1）的首端与第三逆流色谱柱（C1）的尾端连接，使二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯在第二逆流色谱柱（B1）中进行第二维分离；

（6）观察第二检测器（5），当含二氢丹参酮Ⅰ的洗脱液从第二逆流色谱柱（B1）开始被洗出后，调节第三六通阀（12）将第二逆流色谱柱（B1）与第三逆流色谱柱（C1）连接，在线直接将含二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯的洗脱液转入第三逆流色谱柱（C1）进行第三维分离；

（7）观察第三检测器（6），当含二氢丹参酮Ⅰ的洗脱液从第三逆流色谱柱（C）开始洗出后，通过第二六通阀（11）将第三逆流色谱柱（C1）的尾端与第二逆流色谱柱（B1）的首端连接，使二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B和甲基丹参酮酯进入第二逆流色谱柱（B1）进行第一次循环分离；

（8）观察第二检测器（5），当含二氢丹参酮Ⅰ、三叶鼠尾酮B的洗脱液从第二逆流色谱柱（B1）洗出后，再次通过第三六通阀（12）进入第三逆流色谱柱（C1）分离；观察第二检测器（5），当含甲基丹参酮酯的洗脱液从第二逆流色谱柱（B1）洗出后，调节第三六通阀（12）将第二逆流色谱柱（B1）的尾端与第三逆流色谱柱（C1）的首端断开，第二收集器收集第二逆流色谱柱（B1）中的甲基丹参酮酯；

（9）观察第三检测器（6），进入第三逆流色谱柱（C1）分离的二氢丹参酮Ⅰ和三叶鼠尾酮B从第三逆流色谱柱（C1）尾端洗出后，调节第二六通阀（11）将第二逆流色谱柱（B1）首端与第三逆流色谱柱（C1）尾端断开，第三收集器收集第三逆流色谱柱（C1）中的二氢丹参酮Ⅰ和三叶鼠尾酮B。

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