CN105343158A - 一种具有广谱抗肿瘤活性的槐角总黄酮提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种具有广谱抗肿瘤活性的槐角总黄酮提取物及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105343158A
CN105343158A CN201510880419.5A CN201510880419A CN105343158A CN 105343158 A CN105343158 A CN 105343158A CN 201510880419 A CN201510880419 A CN 201510880419A CN 105343158 A CN105343158 A CN 105343158A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fructus sophorae
extractive
general flavone
preparation
ethanol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510880419.5A
Other languages
English (en)
Inventor
王志玲
刘景东
王憬
刘会敏
许光军
勾凌燕
秦葵
刘元昀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BETHUNE MEDICAL MATTER OFFICER SCHOOL OF PEOPLES LIBERATION ARMY
Original Assignee
BETHUNE MEDICAL MATTER OFFICER SCHOOL OF PEOPLES LIBERATION ARMY
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BETHUNE MEDICAL MATTER OFFICER SCHOOL OF PEOPLES LIBERATION ARMY filed Critical BETHUNE MEDICAL MATTER OFFICER SCHOOL OF PEOPLES LIBERATION ARMY
Priority to CN201510880419.5A priority Critical patent/CN105343158A/zh
Publication of CN105343158A publication Critical patent/CN105343158A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A61K36/489—Sophora, e.g. necklacepod or mamani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/39—Complex extraction schemes, e.g. fractionation or repeated extraction steps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/51—Concentration or drying of the extract, e.g. Lyophilisation, freeze-drying or spray-drying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/53—Liquid-solid separation, e.g. centrifugation, sedimentation or crystallization
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/55—Liquid-liquid separation; Phase separation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了一种具有广谱抗肿瘤活性的槐角总黄酮提取物及其制备方法与应用，该槐角总黄酮提取物至少含有槲皮素、染料木素、山奈酚、异鼠李素四种组分，其各组分的质量比为2~3∶14~16∶15~17∶0.5~1，具有良好的体外抗氧化作用，并具有广谱的抗肿瘤活性，对人食道癌、肝癌、乳腺癌和人淋巴瘤等具有显著的抑制作用。其制备方法是采用秋季槐角果夹部分为原料，先后以80%、60%和40%体积分数的乙醇为溶剂进行梯度超声提取、大孔吸附树脂吸附、洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥。该方法显著提高了槐角总黄酮的提取率，并简化了提取步骤，降低了杂质干扰。

Description

一种具有广谱抗肿瘤活性的槐角总黄酮提取物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种天然植物总黄酮及其制备方法与应用，尤其是涉及一种具有广谱抗肿瘤活性的槐角总黄酮提取物及其制备方法与应用。
背景技术
槐角(FructusSophorae)是《中华人民共和国药典》(以下简称药典)收载的常用中药材，为豆科植物槐(SophorajaponicaL.)的干燥成熟果实。按照药典规定，药用槐角通常应采用冬季采收的成熟荚果。冬至以后采摘的干燥槐角荚果，其呈圆柱形，有时弯曲，种子间缢缩成连珠状，包皮后，呈棕色或者黄褐色，其种子呈棕黑色；中医理论认为，槐角性寒、味苦，归肝、大肠经，有清热泻火、凉血止血的功能，适用于肠热便血，痔肿出血，肝热头痛，眩晕目赤。
关于槐角的化学研究早有报道，前人已经从槐角中分离得到数种黄酮类、生物碱类、三萜类、氨基酸和糖类等成分，其中黄酮类成分含量较高，且高于其他植物中的黄酮类化合物的含量。目前，应用LC/MS方法研究发现槐角中的黄酮化合物有27种，而这些黄酮类化合物水解后的苷元主要有4种，分别是槲皮素(quercetin)、染料木素(genistein)、山奈酚(kaempferol)和异鼠李素(isorhamnetin)。现代医学研究表明，槐角黄酮类成分主要用于预防或治疗骨质疏松症、女性更年期综合症、老年痴呆症、高血脂症、高血压症、冠心病、脑血栓、肿瘤等病症，还用于抗衰老和防止皮肤老化、面部色斑或雀斑等方面。近年来，人们对槐角中的黄酮类化合物及其提取方法做了大量的研究，ZL200810068891.9公开了从槐角中提取黄酮类成分并提取山奈素的方法，通过将槐角热水提取、硅藻土过滤、大孔树脂吸附、乙醇洗脱制得槐角黄酮提取物，并将槐角黄酮提取物水解、过滤、对滤渣进行萃取得到高纯度的山奈素，为槐角中有效成分的合理利用提供了新途径，但是采用热水提取对黄酮类化合物的提取率较低，反而容易将可溶于水的杂质如糖类等提取出，加大了分离的困难；ZL200380110595.6公开了一种含异黄酮的槐角提取物的制备方法，通过对槐角进行热水提取、酶处理及乙醇提取制备出生物可吸收性好的高浓度苷元型异黄酮的槐角提取物，但是采用酶处理不仅对提取设备的要求较高，而且在提取过程中，有可能改变槐角中某些成分的结构，产生新的化学物质，影响提取物的纯度及收率；ZL201210323298.0提供了一种从槐角中综合提取染料木素和山奈酚的方法，通过对原料进行酸水水解得到山奈酚和染料木素的混合物，再通过碱水液提取将两者分离，该方法进行的是单一成分的提取，没有对总黄酮的提取进行研究。近年来对槐角总黄酮的提取工艺研究较少且停留在水提阶段，提取率低，也有以乙醇为溶剂，采用超声辅助提取的报道，但为常规提取工艺，选用单一浓度的乙醇进行提取，所提取的槐角总黄酮的应用也鲜有报道。
综上所述，槐角的研究历史较早，化学成分复杂，药理作用显著，临床应用广泛，目前对槐角的研究中，染料木素和山奈酚的研究相对较多，而关于槐角总黄酮的提取制备方法的研究报道较少，尤其是缺少能够快速、有效提取制备具有良好抗癌活性的槐角总黄酮提取物的方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种具有广谱抗肿瘤活性的槐角总黄酮提取物。
本发明的另一目的是提供一种能够快速、有效提取制备具有良好抗癌活性的槐角总黄酮提取物的方法。
本发明的进一步的目的是提供槐角总黄酮提取物在抗肿瘤方面的应用。
本发明的目的是这样实现的：
一种具有广谱抗肿瘤活性的槐角总黄酮提取物，所述提取物中至少含有槲皮素、染料木素、山奈酚、异鼠李素四种组分，其各组分的质量比为2～3∶14～16∶15～17∶0.5～1。
另一方面，本发明提供上述槐角总黄酮提取物的制备方法，包括以下步骤：
a、取秋季槐角果夹，洗净，吸干水分，50～60℃烘干，备用；
b、干燥后的槐角果夹加入80％乙醇，浸渍2～3天，过滤，得乙醇浸渍液；将滤出的槐角果夹，除去其中的种子，留取槐角皮，然后将槐角皮和乙醇浸渍液置于匀浆机中，加入5～8倍体积的80％乙醇，高速匀浆，得槐角皮匀浆液；
c、将槐角皮匀浆液置于超声波提取器中超声提取1次，离心留上清液，所得残渣用6倍体积量的60％乙醇超声提取1次，离心留上清液；所剩残渣再加入6倍体积量的40％乙醇超声提取1次，离心留上清液，合并上述各上清液；
d、将合并后的上清液进行真空抽滤，得到总黄酮粗提物；
e、将总黄酮粗提物溶于水中，离心过滤，去除不溶物，滤液上大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗去除多糖，再用65％～70％乙醇洗脱，收集洗脱液；将洗脱液加温真空旋转蒸发去除乙醇溶液，干燥即得到槐角总黄酮提取物。
优选地，所述步骤c中每次超声提取时间均为1h，超声功率为300W，超声频率为40KHz。
更优选地，所述步骤e中的大孔吸附树脂为AB-8大孔吸附树脂。
再一方面，本发明提供所述槐角总黄酮提取物在抗肿瘤方面的应用，具体地说，所述肿瘤为人食道癌、肝癌、乳腺癌或人淋巴瘤。
本发明提供的槐角总黄酮提取物具有良好的体外抗氧化作用，并具有广谱的抗肿瘤活性，对人食道癌、肝癌、乳腺癌和人淋巴瘤等具有显著的抑制作用，应用价值非常广泛；本发明提供的制备方法以秋季采摘的槐角为原料，采用梯度浓度乙醇溶液分级萃取的方式，能够快速、有效地从槐角中提取出具有良好抗肿瘤活性的槐角总黄酮成分，且该制备方法简化了提取工艺，降低了提取成本，同时显著提高了槐角总黄酮提取物的得率。
附图说明
图1是槐角总黄酮提取物紫外光谱图。
图2是黄酮标准品HPLC色谱图。
图3是盐酸水解的槐角总黄酮提取物HPLC色谱图。
图4是不同浓度槐角总黄酮提取物对人BL2淋巴瘤细胞死亡率的流式细胞分析图，其中，A～F分别代表浓度为0，0.03mg/mL，0.1mg/mL，0.3mg/mL，1mg/mL，3mg/mL槐角总黄酮提取物对BL2淋巴瘤细胞死亡率的影响效果，Q2代表早期凋亡的细胞，Q4代表细胞死亡，以两者之和计算细胞死亡率。
图5是不同浓度槐角总黄酮提取物对Eca-109细胞周期的影响效果对比图，其中A～F分别代表浓度为0，0.156mg/mL，0.313mg/mL，0.625mg/mL，1.250mg/mL，2.500mg/mL槐角总黄酮提取物对Eca-109细胞周期的影响效果，横坐标代表DNA含量，纵坐标代表细胞数。
图6是不同浓度槐角总黄酮提取物对Eca-109细胞凋亡的影响效果对比图，其中A～F分别代表浓度为0，0.156mg/mL，0.313mg/mL，0.625mg/mL，1.250mg/mL，2.500mg/mL槐角总黄酮提取物对Eca-109细胞凋亡的影响效果，横坐标代表DNA含量，纵坐标代表细胞数。
图7是不同浓度槐角总黄酮提取物对Eca-109细胞凋亡率的影响关系图。
具体实施方式
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂未标明来源、规格的均为市售分析纯或化学纯。
实施例1
1)槐角总黄酮提取物的制备
采摘及处理：将秋季采摘的槐角(9月15日～10月15日之间采自石家庄地区的国槐)用自来水洗净，吸干水分，60℃烘干备用。秋季槐角呈扁圆柱形，长约1～6cm，直径约0.6～1cm,有的略微弯曲，种子间缢缩成连珠状，颜色呈绿或黄绿色；果肉肉质柔软多汁而粘；内有个数不等种子，约1～6枚，种子长约8～10mm，宽约5～8mm，厚约5mm，饱满光滑呈淡黄色，肾形，一侧有椭圆形的种脐，旁有圆形珠孔，另一旁有略显凸起的种脊。与冬季槐角比较单个槐角平均湿重和干重，考察其成熟度，确定秋季槐角已成熟，只是含水量高于冬季槐角，约是冬季槐角的3倍。
原料预处理：取干燥的槐角250g，按1:2料液比加入80％乙醇，浸渍2天，手工分离槐角皮与种子或将其置于匀浆机中低速旋转，使槐角皮与种子分离，将槐角皮与浸渍后的乙醇液置于匀浆机中，加入8倍体积的80％乙醇高速匀浆，得槐角皮匀浆液。
超声提取：将槐角皮匀浆液置于超声波提取器中，超声提取1h(超声功率：300W，超声频率：40KHz)，将超声后的匀浆液高速离心(离心条件：转速：10000r/min，离心时间：10分钟，离心力：11179牛顿)，收集上清液；残渣用6倍量的60％乙醇按前述条件继续超声提取1小时，离心取上清液；剩余残渣再用6倍量的40％乙醇按前述条件继续超声提取1小时，离心取上清液，残渣干燥后称重；合并所有上清液，置于旋转蒸发器中，加温减压去除水醇，温度分两级控制，首先为55～60℃，真空度控制为-0.04～-0.05MPa，去除其中大部分醇，再将温度控制为85～90℃，真空度控制为-0.08～-0.09MPa，去除水分至干燥，得总黄酮粗提物。
粗提物纯化：取AB-8大孔吸附树脂(净品级)1000g，用蒸馏水反复漂洗，动态装柱(柱径4cm，柱长150cm，柱床高度120cm)，并用10倍柱体积水快速冲洗后备用；将干燥的槐角总黄酮粗提物用3L蒸馏水溶解，高速离心(离心条件：转速：10000r/min，离心时间：10分钟，离心力：11179牛顿)去除不溶物，上清液以10～15mL/min流速上样，上样完毕后用蒸馏水冲洗，至流出液无颜色。用70％乙醇洗脱，流速控制在10～15mL/min，收集洗脱液，洗至大孔树脂无色；将洗脱液置于旋转蒸发器中，减压回收乙醇，干燥后即得到槐角总黄酮提取物，称重计算得率为23.47％。
2)槐角总黄酮提取物光谱分析
对所得槐角总黄酮提取物进行紫外光谱分析，取槐角总黄酮提取物，配制成0.01mg/mL溶液，应用紫外-可见分光光度计，在200～500nm波长范围进行扫描，结果如图1所示，所得槐角总黄酮提取物具有两个主峰，其中之一出现在261.21nm处，为由A-环苯酰系统引起的吸收峰，另一个在342.14nm处，为由B-环肉桂酰系统引起的吸收峰，因此本方法制备的槐角总黄酮提取物符合典型黄酮类化合物的紫外光谱特征。
3)采用RP-HPLC法对制备的槐角总黄酮提取物进行含量测定及成分分析
黄酮标准品溶液制备：应用甲醇(色谱纯)配制浓度分别为30μg/mL，30μg/mL，30μg/mL，20μg/mL的槲皮素、染料木素、山奈酚和异鼠李素4种标准黄酮化合物溶液(槲皮素、山柰酚、染料木素与异鼠李素标准品为中国药品生物制品检定所产品，批号分别为100081-200406、110861-200606、111704-200501、110860-201109)。
样品处理：取100mg槐角总黄酮提取物，溶解在50mL甲醇-25％HCl(4:1)中，回流30min，加甲醇定容至100mL，样品用0.22μm滤膜过滤备用，用前适当稀释。
色谱条件：应用高效液相色谱仪(美国Waters1525，配置高压双泵、2487型双波长紫外检测器和Breeze色谱数据系统)，选用DiamonsilC18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为50％甲醇-0.2％磷酸-(v/v)，流速为1.0mL·min-1，检测波长为360nm，仪器灵敏度：0.00001AUFS，柱温：室温(20℃)，进样量10μL。
黄酮标准品和水解的槐角总黄酮提取物HPLC色谱图分别为图2、图3所示，将各峰面积积分值代入对照品回归方程分别计算槲皮素、染料木素、山柰酚与异鼠李素的含量，含量分析结果见表1。计算公式为：黄酮化合物(mg)/每克(g)槐角总黄酮提取物＝槐角总黄酮提取物中某黄酮化合物的峰面积积分值/某标准黄酮化合物的峰面积积分值×某标准黄酮化合物的含量×稀释倍数。
表1槐角总黄酮提取物中主要黄酮苷元含量分析
结论：以本法测得每克按照上述提取方法制备的槐角总黄酮提取物含有槲皮素22.8mg，染料木素151.6mg，山奈酚165.6mg，和异鼠李素7.72mg。推算本发明制备的槐角总黄酮提取物中总苷元形式的黄酮化合物约占槐角果夹干重的4.87％。
对比例1
取干燥的槐角细粉1kg，加入3L浓度为60％的乙醇，加热回流提取1.5小时，纱布过滤，药渣再以60％乙醇加热回流提取2次，每次1小时，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇后浓缩至干，得浓缩物。取浓缩物，加适量甲醇溶解后，拌入大孔树脂，减压抽干溶剂，加入到已处理好的D101大孔树脂柱上，用不同浓度的乙醇水梯度洗脱，流速约5～8mL/min；先以浓度约10％的乙醇洗脱至流出液色很淡为止，再以浓度为50％～75％的乙醇洗脱，直至流出液色很淡为止，最后以95％乙醇洗脱再生树脂柱，合并含黄酮的流出液，减压回收乙醇后浓缩至干，低温干燥；干燥物以丙酮作溶剂回流提取，得总黄酮提取物，得率为9.21％。
实施例2
体外抗氧化试验
1)槐角总黄酮提取物总抗氧化能力(T-AOC)测定
精确称取实施例1制备的槐角总黄酮提取物，以D-Hank’s液配制成1mg/mL作为测定样品，按照南京建成生物公司总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒(货号A015)说明书所述方法进行测定，反应完成后，以波长520nm，1cm光径，超纯水调零，测定各管吸光度值(A)。总抗氧化能力按公式计算如下：总抗氧化能力(单位/mg)＝(测定A值-对照A值)/0.01/30×(反应液总量/取样量)/[被测样品浓度(mg/mL)]。总抗氧化能力的定义为：在37C时，每分钟每毫克样品，使反应体系的吸光度(A)值，每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。
实施例1制备的槐角总黄酮提取物总抗氧化能力为5.07±0.07单位/mg。
2)抑制羟基自由基能力测定及结果
精确称取实施例1制备的槐角总黄酮提取物，以D-Hank’s液配制成1mg/mL作为测定样品，按照南京建成生物公司羟基自由基试剂盒(货号A018)说明书所述方法进行测定，反应完成后，以波长550nm，1cm光径，超纯水调零，测定各管吸光度值(A)。抑制羟基自由基能力按公式计算如下：抑制羟基自由基能力(U/mg)＝(对照A值-测定A值)/(标准A值-空白A值)×标准品浓度/[被测样品浓度(mg/mL)×取样量(mL)]。抑制羟基自由基能力的定义：规定每毫克样品在37℃时下反应1分钟，使反应体系中H2O2的浓度降低1mmol/L为一个抑制羟基自由基能力单位。
实施例1制备的槐角总黄酮提取物抑制羟基自由基能力为21.53±0.78单位/mg。
3)槐角总黄酮提取物抗超氧阴离子自由基活力测定
精确称取实施例1制备的槐角总黄酮提取物，以D-Hank’s液配制成1mg/mL作为测定样品，按照南京建成生物公司抗超氧阴离子自由基试剂盒(货号A052)说明书所述方法进行测定，反应完成后，以波长550nm，1cm光径，超纯水调零，测定各管吸光度值(A)。抗超氧阴离子自由基活力按公式计算如下：抗超氧阴离子自由基活力(U/mg)＝(对照A值-测定A值)/(标准A值-空白A值)×标准品浓度/[被测样品浓度(mg/mL)×取样量(mL)]。抗超氧阴离子自由基活力的定义：在反应体系中，每克样品在37℃反应40分钟所抑制的超氧阴离子自由基相当于1mg的维生素C所抑制的超氧阴离子自由基的变化值为一个活力单位。
实施例1制备的槐角总黄酮提取物抗超氧阴离子自由基活力为775±7.07单位/mg。
实施例3
体外抗肿瘤试验
1)试验材料
受试样品：实施例1中制备的提取物、对比例1中制备的提取物。
细胞株：人食道癌细胞(Eca-109)和肝癌细胞(SMMC-7721)株购自河北医科大学肿瘤研究所；乳腺癌细胞(MDA-MB-231)细胞株购自中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心；乳腺癌细胞(MCF-7)细胞株为白求恩国际和平医院检验科赠送；淋巴瘤细胞(BL2)取自加拿大李红兵博士实验室。
试剂和仪器：10％胎牛血清(FBS，Hyclone公司产品)；青霉素(Sigma，USA)；MTT(中杉金桥生物公司产品，北京)；酶联仪、恒温CO2培养箱。
2)细胞培养：细胞株Eca-109、SMMC-7721和MCF-7细胞分别生长在DMEM培养基中(GibcoGlasgow，UK产品)，添加10％胎牛血清、100mg/mL链霉素和100IU/mL青霉素；MDA-MB-231细胞生长在RPMI-1640培养基中(GibcoGlasgow，UK产品)，添加10％胎牛血清、100mg/mL链霉素和100IU/mL青霉素；BL2细胞生长在RPMI1640培养基中，加10％胎牛血清、100mg/mL链霉素和100IU/mL青霉素。培养条件均为37℃，5％CO2和100％相对湿度，每周更换培养液2次。
3)细胞活性测定
将肿瘤细胞按5×103/孔密度接种于96孔板，培养24h。用20％乙醇溶液配制系列浓度的槐角总黄酮提取物处理细胞72h，对照组加入等体积的20％乙醇溶液；加入MTT溶液20μL/孔，37℃保温4h；弃去培养液，加入150μLDMSO，用酶联仪492nm波长测定吸光度值。
按公式计算细胞活性：细胞活性(％)＝(处理组吸光度值-空白吸光度值)/(对照组吸光度值-空白吸光度值)×100％。
试验结果见表2。
表2提取物对细胞活性的影响
4)BL2细胞死亡率测定
将4×105/mLBL2细胞接种于6孔板中，1mL/孔，分别加入浓度为0mg/mL，0.06mg/mL，0.2mg/mL，0.6mg/mL，2mg/mL和6mg/mL的槐角总黄酮提取物，1mL/孔，使其终浓度分别为0mg/mL，0.03mg/mL，0.1mg/mL，0.3mg/mL，1mg/mL和3mg/mL，37℃，5％CO2培养48h。收集细胞，用冷PBS洗涤1次，加入100μLAnnexinV-Cy5和7-AAD混合液，混匀后室温孵育5min，每管加400μL结合缓冲液，做流式细胞分析(LSRII，BDBiosciences)。以Q2+Q4相细胞所占百分比表示不同处理组BL2细胞死亡率，结果如图4和表3所示，图4显示的是流式细胞分析给出的不同浓度槐角总黄酮提取物对人BL2淋巴瘤细胞死亡率的影响结果，Q2代表早期凋亡的细胞，Q4代表细胞死亡，以两者之和计算细胞死亡率。
表3提取物对BL2细胞死亡率的影响
实施例4
抗肿瘤作用机制研究
主要试剂：一抗：anti-cdk2(sc-163)，anti-α-tubulin(sc-8035)，anti-bcl-2(sc-7382)，和anti-bax(sc-7480)为SantaCruz公司(美国)产品；Anti-cyclinB1(BA0766)为Boster生物公司(中国，武汉)。HRP-羊抗兔二抗、HRP-羊抗鼠二抗为中杉金桥生物公司产品(中国，北京)。
实验材料：实施例1制备的提取物。
细胞培养：将2×105/mLEca-109细胞接种于25cm2培养瓶中，37℃，5％CO2培养24h。
1)Eca-109细胞周期及凋亡率测定：
用浓度为0、0.156mg/mL、0.313mg/mL、0.625mg/mL、1.25mg/mL、2.50mg/mL的槐角提取物处理细胞72h，对照组用等体积的20％乙醇溶液处理。细胞用胰蛋白酶消化，D-Hank′s液洗涤3次，70％乙醇固定。取100μL密度为1×106/mL细胞悬液，用1mL溴化乙锭染液(50mg/Lpropidiumiodide，含1.0％TritonX-100)染色，4℃，30min。用流式细胞仪测定DNA含量(FACScanBeckmanCoulterEpics-XLII，BeckmanCoulterCorp.，Hialeah，FL，USA)，应用MulticycleAV软件(Coulter)分析细胞周期和凋亡率，结果如表4、图5、图6所示，图5为流式细胞分析得到的不同浓度(分别为A-F)槐角总黄酮提取物对Eca-109细胞周期的影响，可以看出处理细胞72h，随着槐角提取物浓度增加，G0/G1细胞逐渐减少，S期细胞逐渐增多，甚至出现S期阻滞。相伴随的是细胞凋亡率逐渐增加，图6为流式细胞分析得到的不同浓度槐角总黄酮提取物对Eca-109细胞凋亡的影响，处理细胞72h，随着槐角总黄酮提取物浓度增加，细胞凋亡率增加，如图7所示。
表4槐角总黄酮提取物对Eca-109细胞周期的影响
浓度(mg/mL) 0.000 0.156 0.313 0.625 1.250 2.500
G1(％) 59.2 47.3 45.5 36.1 37.7 17.9
S(％) 31.4 43.8 42.4 46.7 45.7 79.5
G2+M(％) 9.41 8.88 12.1 17.2 16.6 2.64
2)凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的检测
用浓度为1.25、2.5、5.0mg/mL的槐角提取物处理细胞72h，对照组用等体积的20％乙醇溶液处理。细胞用胰蛋白酶消化，D-Hank′s液洗涤3次，70％乙醇固定。取100μL密度为1×106/mL细胞悬液用100μL稀释的鼠抗Bax单克隆抗体或鼠抗Bcl-2单克隆抗体，室温孵育30min。细胞用D-Hank′s液洗两次，再加100μL稀释的FITC-标记的羊抗鼠抗体室温孵育30min，PBS洗两次。信号用流式细胞仪检测(FACScanBeckmanCoulterEpics-XLII，BeckmanCoulterCorp.，Hialeah，FL，USA)，并用Expo32ADC软件(Beckman，SanJose，CA，USA)分析，信号为X-mode值。Bcl-2或Bax的表达以荧光指数(fluorescenceindex，FI)表示，其计算公式为FI＝(处理组logX-mode值×340)/(对照组logX-mode值×340)，FI≥1.0表示高表达，FI≦1.0表示低表达，结果如表5所示，与对照组比较，凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达均增高，但Bcl-2/Bax比值下降，细胞仍表现凋亡趋势。
表5槐角总黄酮提取物对Eca-109细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的影响
3)细胞周期相关蛋白检测
用浓度为1.25、2.5、5.0mg/mL的槐角提取物处理细胞24h、48h和72h。细胞用D-Hank′s液洗2次，加入细胞裂解液将细胞刮下，充分振荡后，4℃，12,000×g离心30min，取上清液-70℃备用。样品蛋白质测定采用Bradford法，取各试验组等量蛋白样品，经10％SDS-PAGE进行分离，电泳后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。用WesternBlot方法检测Cdk2和cyclinB1表达，首先用5％脱脂奶粉/PBST(含0.1％Tween-20的PBS)封闭过夜。再用0.5％牛血清白蛋白(BSA)/PBST稀释的抗dk2或抗cyclinB1单克隆抗体孵育，25℃，1h，PBST漂洗3次后，加0.5％牛血清白蛋白(BSA)/PBST稀释的辣根过氧化酶标记的二抗孵育，25℃，1h，PBST漂洗3次，用增强化学发光试剂盒检测目标蛋白。同法检测β-actin作为上样量控制，结果如表6所示。
表6槐角总黄酮提取物对Eca-109细胞细胞周期调节蛋白的影响
结论：本发明制备的槐角总黄酮提取物可引起Cdk2和cyclinB1两种蛋白表达下降，诱导细胞周期阻滞；可使Bcl-2和Bax的表达量(FI值)呈现剂量依赖性增加，Bcl-2和Bax两者比值下降，均低于对照组，细胞向凋亡趋势发展，呈现细胞凋亡指数增加，从而抑制细胞活性。

Claims (6)

1.一种具有广谱抗肿瘤活性的槐角总黄酮提取物，其特征在于，所述提取物中至少含有槲皮素、染料木素、山奈酚、异鼠李素四种组分，其各组分的质量比为2~3∶14~16∶15~17∶0.5~1。
2.一种具有广谱抗肿瘤活性的槐角总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、取秋季槐角果夹，洗净，吸干水分，50~60℃烘干，备用；
b、干燥后的槐角果夹加入80%乙醇，浸渍2~3天，过滤，得乙醇浸渍液；将滤出的槐角果夹，除去其中的种子，留取槐角皮，然后将槐角皮和乙醇浸渍液置于匀浆机中，加入5~8倍体积的80%乙醇，高速匀浆，得槐角皮匀浆液；
c、将槐角皮匀浆液置于超声波提取器中超声提取1次，离心留上清液，所得残渣用6倍体积量的60%乙醇超声提取1次，离心留上清液；所剩残渣再加入6倍体积量的40%乙醇重复超声提取1次，离心留上清液，合并上述各上清液；
d、将合并后的上清液进行真空抽滤，得到总黄酮粗提物；
e、将总黄酮粗提物溶于水中，离心过滤，去除不溶物，滤液上大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗去除多糖，再用65%~70%乙醇洗脱，收集洗脱液；将洗脱液中的乙醇去除，干燥即得到槐角总黄酮提取物。
3.根据权利要求2所述的具有广谱抗肿瘤活性的槐角总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤c中超声提取时间为1h，超声功率为300W，超声频率为40KHz。
4.根据权利要求2所述的具有广谱抗肿瘤活性的槐角总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤e中的大孔吸附树脂为AB-8大孔吸附树脂。
5.权利要求1所述的槐角总黄酮提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为人食道癌、肝癌、乳腺癌或人淋巴瘤。
CN201510880419.5A 2015-12-03 2015-12-03 一种具有广谱抗肿瘤活性的槐角总黄酮提取物及其制备方法与应用 Pending CN105343158A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510880419.5A CN105343158A (zh) 2015-12-03 2015-12-03 一种具有广谱抗肿瘤活性的槐角总黄酮提取物及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510880419.5A CN105343158A (zh) 2015-12-03 2015-12-03 一种具有广谱抗肿瘤活性的槐角总黄酮提取物及其制备方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105343158A true CN105343158A (zh) 2016-02-24

Family

ID=55319318

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510880419.5A Pending CN105343158A (zh) 2015-12-03 2015-12-03 一种具有广谱抗肿瘤活性的槐角总黄酮提取物及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105343158A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108383885A (zh) * 2018-05-02 2018-08-10 孙波 从槐角中提取槐角苷的工艺及其在抗炎症中的用途
CN115260142A (zh) * 2022-07-12 2022-11-01 湖南原草生物技术有限公司 一种槐角中染料木素与山柰酚的分离纯化方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1437951A (zh) * 2003-01-27 2003-08-27 吉林天药科技股份有限公司 槐属苷的抗肿瘤作用及其药物制剂
CN1490321A (zh) * 2003-09-03 2004-04-21 魏先华 槐角黄酮有效部位、生产方法及其应用
CN1860238A (zh) * 2003-10-31 2006-11-08 雷克斯基因生物科技有限公司 含异黄酮的槐角提取物的制备方法
CN102746265A (zh) * 2011-04-21 2012-10-24 西安通江生物科技有限责任公司 从槐角提取废渣中提取高纯度山柰酚的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1437951A (zh) * 2003-01-27 2003-08-27 吉林天药科技股份有限公司 槐属苷的抗肿瘤作用及其药物制剂
CN1490321A (zh) * 2003-09-03 2004-04-21 魏先华 槐角黄酮有效部位、生产方法及其应用
CN1860238A (zh) * 2003-10-31 2006-11-08 雷克斯基因生物科技有限公司 含异黄酮的槐角提取物的制备方法
CN102746265A (zh) * 2011-04-21 2012-10-24 西安通江生物科技有限责任公司 从槐角提取废渣中提取高纯度山柰酚的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"槐角中黄酮化合物的提取分离研究: "槐角中黄酮化合物的提取分离研究", 《东南大学学报（医学版）》 *
吕元琦等: "毛细管电泳法研究槐角生长过程中黄酮类化合物含量变化", 《德州学院学报》 *
季宇彬: "《抗癌中药药理与应用》", 28 February 1999, 黑龙江科学技术出版社 *
杨超等: "《食道癌细胞在异鼠李素处理中应激作用的研究》", 《四川大学学报》 *
王本祥: "《现代中药药理与临床》", 30 June 2004, 天津科技翻译出版公司 *
马磊等: "槐角中的抗癌活性成分", 《中国天然药物》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108383885A (zh) * 2018-05-02 2018-08-10 孙波 从槐角中提取槐角苷的工艺及其在抗炎症中的用途
CN108383885B (zh) * 2018-05-02 2021-07-23 孙波 从槐角中提取槐角苷的工艺及其在抗炎症中的用途
CN115260142A (zh) * 2022-07-12 2022-11-01 湖南原草生物技术有限公司 一种槐角中染料木素与山柰酚的分离纯化方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101787061B (zh) 曲札茋苷在制备防治心脑缺血疾病制剂中的应用及其制备方法
AU2003295856B2 (en) Efficient method for producing compositions enriched in total phenols
CN101244129B (zh) 拉萨大黄提取物、其制备方法及其在制备治疗心脑血管疾病制剂中的应用
CN101863871B (zh) 蔷薇红景天总苷及其医药用途和制备方法
CN103804443A (zh) 黄酮苷类化合物及其制备方法
CN102286056A (zh) 一种齐墩果酸衍生物及其制备方法
CN104644882A (zh) 一种含苯乙醇苷的裸花紫珠提取物及其制备方法
CN101935359B (zh) 一种短葶山麦冬多糖及其制备方法
CN108610387B (zh) 一种具有神经细胞保护活性的四个异黄烷苷类化合物及其制备方法
CN111018821A (zh) 双黄酮类化合物及其制备方法和用途
Hou et al. Separation of constituents from Bergenia stracheyi (Hook. F. & Thoms.) Engl. by high‐speed countercurrent chromatography with elution mode and its antidiabetic and antioxidant in vitro evaluation
CN104622865A (zh) 巨大戟二萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用
CN101380379B (zh) 千里香叶总黄酮及其制备方法及用途
CN107929544B (zh) 白及属植物中militarine部位及单体的制备方法及其应用
CN105343158A (zh) 一种具有广谱抗肿瘤活性的槐角总黄酮提取物及其制备方法与应用
CN111704641B (zh) 一种环烯醚萜苷类化合物及其制备方法和应用
CN111635442B (zh) 从药用植物地梢瓜中制备三种单体化合物的方法及其体外抗氧化作用
CN111150740A (zh) 竹节参中的降脂活性成分和降脂组合物及其应用
CN105535219A (zh) 文冠木黄酮提取物及其制备方法、质量检测方法和应用
CN111303225A (zh) 一种环烯醚萜苷类化合物及其制备方法和应用
CN111732619B (zh) 一种环烯醚萜苷类化合物及其制备方法和应用
CN104224952A (zh) 一种各种成分比例稳定均一的大黄总蒽醌的制备方法
CN108623645B (zh) 一种黄酮类化合物及其制备方法与应用
CN105287704A (zh) 一种抗癌药物组合物及其在制备抗癌药物中的应用
CN107308270A (zh) 一种抗癌药物组合物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160224