CN104644882A - 一种含苯乙醇苷的裸花紫珠提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种含苯乙醇苷的裸花紫珠提取物及其制备方法。包括：裸花紫珠叶用水加热回流提取，提取液过滤后浓缩，浓缩液加入澄清剂澄清，澄清溶液通过大孔树脂柱，先用纯水进行洗脱，再以低浓度乙醇洗脱，最后以高浓度乙醇洗脱，收集高浓度乙醇洗脱液，干燥，即得。本发明的裸花紫珠提取物，其总苯乙醇苷含量可达60-80％，连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷三个组分的含量之和可达50％-70％。

Description

一种含苯乙醇苷的裸花紫珠提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种含苯乙醇苷的裸花紫珠提取物及其制备方法。

背景技术

世界卫生组织统计报道，全球乙肝病毒(HBV)携带者近3.5亿人，而中国就有1.2亿。乙型传染性肝炎(病毒性肝炎)已位列我国传染病发病率的第二位，死亡人数的第三位。流行病学调查表明,肝损伤是严重危害人类健康的疾病临床常见疾病之一。目前,对于病毒性肝炎的治疗仍存在很大问题，虽然用于临床治疗乙型病毒性肝炎的药物不少，但尚无确切有效的药物。现多提倡综合治疗,虽然可以通过保护肝实质细胞，减轻肝损伤,减缓肝功能的衰退,控制病情,但现有的药物只是治标不治本。因此,亟需寻找更为安全有效的药物对抗肝脏损伤。

裸花紫珠为马鞭草科紫珠属植物裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook Et Arn.的干燥叶，为海南大宗药材之一，其味苦、微辛，性平。具有消炎，解毒，收敛，止血功效。用于化脓性炎症、急性传染性肝炎、外治烧、烫伤，外伤出血等疾病的治疗。现代药理学研究表明，裸花紫珠叶不仅具有止血、抗菌、收敛、抗炎、镇痛及促进创面愈合的活性,还具有保肝降酶效果,可促进胆红素及蛋白质代谢，对四氯化碳和扑热息痛所致急性肝损伤试验中表现出显著的降酶和抗肝损伤作用，能提高肝脏的解毒功能,减轻肝脏的损伤，有利于肝功能的恢复，也适用于各型病毒性肝炎的治疗。

紫珠属植物的化学成分研究表明，苯乙醇苷类成分是该属植物的主要类群成分之一。现代研究表明，苯乙醇苷类化合物是一类含有(羟基、甲氧基)取代苯乙基和(羟基、甲氧基)肉桂酰基，通常以β–葡萄糖为母核的含有酯键及氧苷键的天然糖苷，广泛存在于双子叶植物中，受到植物化学及药学工作者的高度重视。近年来许多研究表明,该类化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、增强记忆、保肝、强心等作用。苯乙醇苷类的代表性成分——毛蕊花糖苷具有免疫调节、抗凋亡、抗肾炎、抗肿瘤、抗转移、抗动脉粥样硬化和心肌保护等多种药理作用。因此推测苯乙醇苷类成分可能是其发挥保肝降酶活性的主要类群成分之一，对于免疫性肝损伤的具有一定的调节作用。

除了毛蕊花糖苷，裸花紫珠中还含有连翘酯苷B、异毛蕊花糖苷等多种苯乙醇苷类成分，裸花紫珠中主要苯乙醇苷类成分结构式如下：

Cf：

中国专利CN200910186345.X公开了一种具有止血作用的裸花紫珠有效部位提取物及其药物制剂的制备方法，该专利公开了应用溶剂萃取法或过柱纯化法对裸花紫珠的水提取物粗溶液进行富集纯化得到裸花紫珠黄酮有效部位，该方法的提取物总黄酮含量大于50％。

裸花紫珠主要产于海南定安、儋州、澄迈、白沙、五指山、昌江、东方、三亚、陵水、保亭及琼中等地，价格低廉，药材中苯乙醇苷类成分含量较高，从裸花紫珠叶中制备中具有保肝降酶活性的苯乙醇苷类成分，开发具有治疗乙型病毒性肝炎的药物具有广阔的前景。

发明内容

本发明公开了一种裸花紫珠提取物，其总苯乙醇苷含量为60-80％，本发明的百分比均为重量百分比。

本发明的裸花紫珠提取物中，连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷三个组分的含量之和为50％-70％。

本发明同时公开了上述裸花紫珠提取物的制备方法，包括：裸花紫珠叶用水加热回流提取，提取液过滤后浓缩，浓缩液加入澄清剂澄清，澄清溶液通过大孔树脂柱，先用纯水进行洗脱，再以低浓度乙醇洗脱，最后以高浓度乙醇洗脱，收集高浓度乙醇洗脱液，干燥，即得。

上述制备方法中，裸花紫珠叶药材量与提取用水的重量比优选1:10-1:25。

优选提取液浓缩至以生药量计浓度为0.1-1.0g/mL。

澄清剂优选壳聚糖、101果汁澄清剂、YC-1澄清剂或ZTC 1+1Ⅱ型澄清剂。

提取后浓缩液与澄清剂体积比优选1:0.06-1:0.15，澄清温度优选50-80℃。优选加入澄清剂时搅拌溶液。搅拌速度优选50-300r/min。

大孔树脂优选SP-207、AB-8、X-5、D-101或SP-825。

所述低浓度乙醇浓度优选10％-40％；所述高浓度乙醇浓度优选45％-85％。

水洗脱体积优选为树脂体积的1-5倍，低浓度乙醇洗脱体积优选为树脂体积的3-7倍，高浓度乙醇洗脱体积优选为树脂体积5-15倍。

用本发明制备的裸花紫珠提取物，其总苯乙醇苷含量大于60％，可高达80％。且连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷三个组分的含量之和可达50％-70％。

本发明制备方法中总苯乙醇苷含量高，因此其药理活性明显增强。下面是本发明提取物与市售裸花紫珠片药效学试验比较。

药物对刀豆蛋白致小鼠免疫性肝损伤的保护作用：

乙型肝炎病毒感染引起的肝损伤主要与机体免疫应答有关。因此采用在病理生理上更接近于病毒性肝炎的免疫性肝损伤模型来评价裸花紫珠苯乙醇总苷的护肝作用。ConA是一种在人体内对肝细胞具有特异性毒性作用的植物凝集素，其基本病理特点是能在体外激活T细胞的丝裂原，活化T淋巴细胞而致免疫性肝损伤。静脉注射小鼠体内后，大部分在肝脏内聚集，表明肝脏是ConA体内诱导毒性的靶器官。此种造模方法简便易行，在短时间内即可造模成功，并且持续时间较久，适用于从免疫途径评价药物对肝损伤的保护作用。

本实验以裸花紫珠苯乙醇总苷提取物为研究对象,采用ConA诱导小鼠免疫性肝损伤模型,选择肝功能生化指标,免疫功能观察指标,分别从脂质过氧化和免疫调节水平方面,探讨裸花紫珠苯乙醇总苷对免疫性肝损伤的保护作用,以期为裸花紫珠苯乙醇总苷在病毒性肝炎等免疫性肝损伤中的应用提供实验依据。

试验药物：实施例1方法制备的裸花紫珠苯乙醇总苷提取物；市售联苯双酯滴丸；市售裸花紫珠片(裸花紫珠片是中成药，为裸花紫珠水提取物浸膏加辅料制成的片剂)

模型建立与动物分组：70只KM小鼠，雄性，30±2g，按体重随机分为7组：正常组、模型组、本发明提取物给药组(0.1g/kg、0.2g/kg、0.4g/kg)、联苯双酯阳性对照组(0.2g/kg)、裸花紫珠片阳性对照组(1.0g/kg)，按各组实验设计剂量连续给药7d,末次给药后1h，除空白组，其余各组按20mg/kg一次性尾静脉注射Con A，诱导免疫性肝损伤。

肝脏和脾脏指数：尾静脉注射Con A，禁食不进水8h，称量各个分组中小鼠的个体体重，摘眼球取血，脱颈处死小鼠，并迅速取解剖，滤纸擦拭，称取脾脏和肝脏质量，计算肝脏、脾脏系数。

血清指标检测：摘眼球法取血1.5mL，室温静置30min，4000r/min离心10min,分离血清，然后按检测试剂盒说明分别测定血清中ALT、AST、NO和iNOS。

肝组织氧化和抗氧化指标检测：取小鼠肝脏同一部位组织于冰盐水中漂洗，除去血液，滤纸吸干，分别准确称量0.2g，放入玻璃匀浆管，加2mL冰生理盐水，用匀浆机1000-1500r/min上下研磨制备10％组织匀浆，测定肝匀浆中MDA，SOD含量。

统计学分析：应用统计软件SPSS17.0进行数据分析，数据用表示。用单因素方差分析进行组间比较，方差齐采用LSD检验，方差不齐采用Tamhane’s T2检验。等级数据采用非参数检验进行组间比较。

裸花紫珠苯乙醇总苷对免疫性肝损伤脏器指数的影响：以试验前后“脏器重量除以体重”计算脏器指数，实验结果见表1。

表1  裸花紫珠苯乙醇总苷对ConA致肝损伤小鼠脏器指数的影响(n＝10)

注:与正常组比较^a)p<0.05，^b)p<0.01；与模型组比较^c)p<0.05，^d)p<0.01

结果显示，与正常组相比，模型组小鼠肝、脾指数明显升高(p＜0.01)，不同剂量的裸花紫珠苯乙醇总苷可不同程度降低肝、脾指数。

裸花紫珠苯乙醇总苷对免疫性肝损伤血清ALT、AST、NO、iNOS活力的影响：与对照组相比，模型组血清ALT，AST水平升高，给予裸花紫珠苯乙醇总苷(50，100，200mg/kg)和联苯双酯(200mg/kg)均能降低免疫性肝损伤小鼠血清中升高的ALT、AST水平(p＜0.01)。与正常组比较,模型组小鼠血清NO含量升高,iNOS活力增强，与模型组比较,裸花紫珠苯乙醇总苷各剂量组均能降低免疫性肝损伤小鼠升高的血清NO、iNOS水平(p<0.05～0.01)。实验结果见表2。

表2  裸花紫珠苯乙醇总苷对ConA致肝损伤小鼠血清ALT、AST、NO、iNOS的影响(n＝10)

注:与正常组比较^a)p<0.05，^b)p<0.01；与模型组比较^c)p<0.05，^d)p<0.01

裸花紫珠苯乙醇总苷对免疫性肝损伤小鼠肝匀浆SOD和MDA的影响：与正常组比较,模型组小鼠肝匀浆中MDA含量明显升高,SOD活性明显下降(p<0.01),表明ConA致免疫性肝损伤小鼠与氧化应激有一定的联系。与模型组比较,裸花紫珠苯乙醇总苷对肝组织MDA的含量均有不同程度的降低,SOD的活性有不同程度的升高(p<0.01),表现出较好的抗氧化作用.结果见表3。

表3  裸花紫珠苯乙醇总苷对ConA致肝损伤小鼠肝匀浆SOD和MDA的影响(n＝10)

注:与正常组比较^a)p<0.05，^b)p<0.01；与模型组比较^c)p<0.05，^d)p<0.01

综合以上试验结果，本发明的裸花紫珠苯乙醇总苷连续给药能够降低ConA所致免疫性肝损伤小鼠血清酶活力升高,对免疫性肝损伤表现出一定的保护作用,其机制与抗氧化应激有关。

本发明还公开了采用紫外分光光度法测定裸花紫珠提取物中苯乙醇总苷的含量的方法，还公开了裸花紫珠提取物中连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量测定方法。

附图说明

图1是裸花紫珠苯乙醇总苷含量测定线性方程

图2是混合对照品色谱图(其中1、连翘酯苷B；2、毛蕊花糖苷；3、异毛蕊花糖苷)

图3是裸花紫珠叶苯乙醇苷提取物色谱图(其中1、连翘酯苷B；2、毛蕊花糖苷；3、异毛蕊花糖苷)

图4是连翘酯苷B含量测定线性方程

图5是毛蕊花糖苷含量测定线性方程

图6是异毛蕊花糖苷含量测定线性方程

具体实施方式

实施例1

一、制备

提取：取裸花紫珠叶300g，加6000mL蒸馏水，浸泡2小时，加热提取1小时，过滤，滤渣加4500mL蒸馏水加热提取2次，每次1小时，合并3次提取液,提取液经300目纱布滤过。

除杂：滤液加热浓缩至600mL(0.5g/mL)，按药液和澄清剂体积比比例1:0.15加入壳聚糖澄清剂，温度为60℃，搅拌30min，搅拌速度150r/min，搅拌后静置2小时，离心(3000r/min，10min)。

精制：取离心后上清液，按树脂量与药材量1:0.8上SP-207大孔树脂，按照2BV/h的吸附流速进行动态吸附，其中径高比为1:10，分别用3BV蒸馏水、3BV30％乙醇、5BV50％乙醇以2BV/h的流速进行洗脱，收集50％乙醇洗脱部分并减压蒸干，温度不高于60℃，真空干燥后即得裸花紫珠叶苯乙醇苷类提取物。

二、含量测定

1、苯乙醇总苷的测定

采用紫外分光光度法测定苯乙醇总苷的含量。

对照品溶液的制备：精密称取毛蕊花糖苷对照品2.68mg，置50mL量瓶中，加50％甲醇溶液适量，超声使溶解，得对照品储备液，精密吸取对照品储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL，置10mL量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品系列溶液。

供试品溶液的制备：取裸花紫珠苯乙醇苷类部位提取物15.6mg，精密称定，置25mL量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液储备液，吸取储备液0.5mL置10mL量瓶中，加入50％甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

最大吸收波长的确定：分别取对照品溶液和供试品溶液适量在200-400nm波长范围扫描，紫外扫描结果，确定测定裸花紫珠苯乙醇总苷含量的检测波长为332nm。

苯乙醇总苷含量测定线性方程的制备：取毛蕊花糖苷系列对照品溶液，分别在332nm波长下测定吸光度值。以裸花紫珠量(μg)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得线性方程，见图1。

含量测定：取供试品溶液，在332nm波长下测定吸光度值，根据线性方程计算裸花紫珠叶提取物中苯乙醇总苷含量为77％。

2、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量测定

色谱条件：色谱柱采用Luna C₁₈(2)(150mm×4.6mm,5μm)，流动相为乙腈-0.1％醋酸(15:85)，流速为1.0mL/min，检测波长为332nm，柱温为30℃，进样量为10μL。

混合对照品溶液的制备：精密称取连翘酯苷B 1.27mg、毛蕊花糖苷2.35mg、异毛蕊花糖苷2.36mg，置25mL量瓶中，加入50％甲醇稀释至刻度，摇匀，取适量过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：取裸花紫珠提取物10.5mg，精密称定，置25mL量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，取适量过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

分别取混合对照品溶液和供试品溶液各10μL进样，得对照品溶液和供试品溶液色谱图，见图2和图3。

标准曲线的绘制：取对照品溶液，分别进样1，2，4，8，10，16，20μL，记录色谱图峰面积，绘制标准曲线，得连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的标准曲线图，如图4-图6所示。

含量测定：分别精密吸取上述对照品溶液及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得裸花紫珠叶中含连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷之和为63％。

实施例2

提取：取裸花紫珠叶300g，加4500mL蒸馏水，浸泡2小时，加热提取2小时，过滤，滤渣加3000mL蒸馏水加热提取每次2小时，合并2次提取液,提取液经300目纱布滤过。

除杂：滤液加热浓缩至1200mL(0.25g/mL)，按药液和澄清剂体积比比例1:0.08加入101果汁澄清剂，温度为70℃，搅拌15min，搅拌速度120r/min，搅拌后静置12小时，离心(3000r/min，10min)。

精制：取离心后上清液，按树脂量与药材量1:1.0上SP-825大孔树脂，按照1BV/h的吸附流速进行动态吸附，其中径高比为1:8，分别用3BV蒸馏水、4BV 20％乙醇、6BV 60％乙醇以1BV/h的流速进行洗脱，收集60％乙醇洗脱部分并减压蒸干，温度不高于60℃，真空干燥后即得裸花紫珠叶苯乙醇苷类提取物。紫外分光光度法检测提取物中总苯乙醇苷类成分含量为75％，高效液相色谱法测定连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷含量之和为60％。

实施例3

提取：取裸花紫珠叶500g，加7500mL蒸馏水，浸泡2小时，加热提取2小时，过滤，滤渣加6000mL蒸馏水加热提取1小时，合并2次提取液,提取液经300目纱布滤过。

除杂：滤液加热浓缩至500mL(1.0g/mL)，按药液和澄清剂体积比比例1:0.12加入ZTC1+1Ⅱ型澄清剂，温度为80℃，搅拌10min，搅拌速度100r/min，搅拌后静置4小时，离心(3000r/min，10min)。

精制：取离心后上清液，按树脂量与药材量1:1.2上D-101大孔树脂，按照1BV/h的吸附流速进行动态吸附，其中径高比为1:12，分别用4BV蒸馏水、5BV 30％乙醇、8BV 70％乙醇以1BV/h的流速进行洗脱，收集70％乙醇洗脱部分并减压蒸干，温度不高于60℃，真空干燥后即得裸花紫珠叶苯乙醇苷类提取物。紫外分光光度法检测提取物中总苯乙醇苷类成分含量为65％，高效液相色谱法测定连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷含量之和为52％。

实施例4

提取：取裸花紫珠叶600g，加6000mL蒸馏水，浸泡2小时，加热提取1小时，过滤，滤渣加6000mL蒸馏水加热提取2次，每次1小时，合并2次提取液,提取液经300目纱布滤过。

除杂：滤液加热浓缩至600mL(1.0g/mL)，按药液和澄清剂体积比比例1:0.12加入YC-I澄清剂，温度为50℃，搅拌10min，搅拌速度150r/min，搅拌后静置2小时，离心(3000r/min，10min)。

精制：取离心后上清液，按树脂量与药材量1:1.0上AB-8大孔树脂，按照2BV/h的吸附流速进行动态吸附，其中径高比为1:10，分别用3BV蒸馏水、4BV 25％乙醇、6BV 55％乙醇以2BV/h的流速进行洗脱，收集55％乙醇洗脱部分并减压蒸干，温度不高于60℃，真空干燥后即得裸花紫珠叶苯乙醇苷类提取物。紫外分光光度法检测提取物中总苯乙醇苷类成分含量为72％，高效液相色谱法测定连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷含量之和为56％。

Claims (10)

1.一种裸花紫珠提取物，其中总苯乙醇苷含量为60-80％，为重量百分比。

2.权利要求1的裸花紫珠提取物，其中连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷三个组分的总含量为50％-70％。

3.权利要求1或2的裸花紫珠提取物的制备方法，包括：裸花紫珠叶用水加热回流提取，提取液过滤后浓缩，浓缩液加入澄清剂澄清，澄清溶液通过大孔树脂柱，先用纯水进行洗脱，再以低浓度乙醇洗脱，最后以高浓度乙醇洗脱，收集高浓度乙醇洗脱液，干燥，即得。

4.权利要求3的制备方法，其中裸花紫珠叶药材量与提取用水的重量比为1:10-1:25。

5.权利要求3的制备方法，其中澄清剂为壳聚糖、101果汁澄清剂、YC-1澄清剂或ZTC 1+1Ⅱ型天然澄清剂。

6.权利要求3的制备方法，其中提取后浓缩液与澄清剂体积比为1:0.06-1:0.15，澄清温度50-80℃。

7.权利要求3的制备方法，其中大孔树脂为SP-207、AB-8、X-5、D-101或SP-825。

8.权利要求3的制备方法，其中所述低浓度乙醇浓度为10％-40％；所述高浓度乙醇浓度为45％-85％。

9.权利要求3的制备方法，其中水洗脱体积为1-5倍树脂体积，低浓度乙醇洗脱体积为3-7倍树脂体积，高浓度乙醇洗脱体积为5-15倍树脂体积。

10.权利要求3的制备方法，其中低浓度乙醇浓度为15％-35％；所述高浓度乙醇浓度为50％-70％。