CN107556401A - 一种苦参多糖、其制备方法及保肝和免疫调节用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种苦参多糖、其制备方法及保肝和免疫调节用途。所述的苦参多糖是从苦参根中通过水浸提的方式提取得到的，本发明还进一步分离得到所述苦参多糖中的多糖组分。实验证实所述的苦参多糖及其多糖组分均能促进小鼠脾脏细胞增殖和细胞因子分泌，促进人肝细胞的增殖和降低化学毒剂对细胞的损伤，能抑制乙肝表面抗原和核心抗原的表达，抑制肝癌细胞的增殖以及抑制ConA对小鼠肝脏和肾脏造成的损伤，因此能用于制备免疫调节、抗肿瘤和抗肝损伤的药物。
Description
技术领域
本发明涉及中药学、肝病学和免疫学领域，具体涉及一种苦参多糖、其制备方法及保肝和免疫调节用途。
背景技术
苦参为豆科植物苦参(Sophora flavescens Ait.)的干燥根，为多年生草本或灌木，性寒味苦，具有小毒，具有清热利湿、利尿、杀虫等功效，用于热痢、便血、黄疸尿闭、赤白带下、阴肿阴痒、湿疹、湿疮、皮肤瘙痒、疥癣麻风等，外治滴虫性阴道炎【2015版中华人民共和国药典，一部，P202】。
现代药理学研究发现苦参具有抗肿瘤、抗病毒、抗肝损伤和纤维化、抗心律失常、抗寄生虫和免疫调节等药用活性。目前苦参的化学研究主要集中在根部，包括生物碱、黄酮、三萜皂苷、木脂素、酚酸和少量的苯丙素类成分，其中已分离得到了41个生物碱和108个黄酮类化合物【张翅，等.中国实验方剂学杂志，2014，20(4)：205-214】。苦参抗肿瘤活性成分有苦参碱、去甲苦参酮、戊二烯查耳酮、苦豆碱、苦参啶、氧化苦参碱、三叶豆紫檀苷、槐果碱、槐胺碱、槐定碱等【闫德祺，等.现代生物医学进展，2014，14(24)：4776-4779】。大量研究表明苦参中生物碱类成分在肝脏方面具有肝保护、免疫调节、抗纤维化、抑制癌细胞、抗病毒等作用【阳巧凤，等.中南药学，2010，8(4)：296-298】，其中主要活性成分有苦参素和氧化苦参碱。苦参素(也称苦参碱，matrine)是从苦参根中分离出来的一种单体生物碱，被广泛应用于慢性乙型肝炎治疗中【王旭，等.菏泽医学专科学校学报，2009，21(2)：64-66】。氧化苦参碱(oxymatrine)治疗乙型肝炎病毒情况与干扰素疗效近似，能有效地减轻肝内胶原纤维组织增生和降低肝脏组织内炎症活动度【石磊，等.山西医药杂志，2015，44(2)：123-126】。
目前对苦参中多糖成分化学和生物活性的研究报道较少，主要有：
Olennikiov等从苦参中分离了一个α-葡聚糖，其主链是α-(1→4)连接的吡喃葡萄糖，在C-6上部分地被吡喃葡萄糖取代【Olennikov DN，et al.Chem Nat Comp，2011，47(1)：1-4】。
Bai等将苦参先用甲醇-氯仿(8:1，v/v)提取，残渣在室温下用水提取3次。合并水提液，浓缩，Sevage方法脱蛋白。之后在4℃条件下加入4倍体积的95％乙醇沉淀多糖。沉淀物依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，获得苦参粗多糖(命名CSFP)。CSFP采用DEAE-Sepharose FF和Sephadex G-100凝胶柱层析分离获得1个多糖成分(命名SFPW1，其理化性质不清楚)。SFPW1能够有效抑制癌细胞H22在小鼠体内的增长，促进脾淋巴细胞增殖反应【Bai L，Inter J Biol Macromol，2012，51：705-709】。
Zhang等将苦参药材粉末在室温下用水提取2次，每次15min。合并二次提取液，用柠檬酸调至pH＝7，然后浓缩、脱盐，在4℃条件下加入4倍体积乙醇过夜。收集沉淀，乙醇洗涤，然后用水溶解、离心，上清液采用Sevage方法脱蛋白后，冷冻干燥获得粗多糖。该粗多糖经DEAE-Sepharose FF凝胶柱层析，依次用水、0.1、0.2和0.4mol/L NaCl洗脱，获得四个多糖部位。这四个组分经DEAE-纤维素柱层析，水、0.075、0.16共和0.36mol/L NaCl依次洗脱，最终获得SF1、SF2、SF3和SF4多糖组分。SF1、SF2、SF3和SF4均由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖组成，平均分子量分别为400.9kDa、98.6kDa、99.3kDa和42.7kDa。体外实验发现SF4捕获O2·、ABTS和DPPH作用最强，SF3捕获OH·作用最强。SF1、SF2、SF3和SF4均能刺激巨噬细胞分泌NO和促进脾细胞的增殖【Zhang QH，et al.Inter J Biol Macromol，2016，93：459-467】。
王迎进等采用水提醇沉法获得苦参粗多糖，Sevage法脱蛋白、DEAE-52纤维素柱色谱法分离，获得四个苦参多糖组分SFP-1、SFP-2、SFP-3和SFP-4。SFP-1组分中不含蛋白质及核酸，主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖，半乳糖、阿拉伯糖组成，其摩尔比为0.34:1.00:0.12:1.19:0.62:0.19。体外抗氧化性研究表明SFP-1对DPPH自由基清除能力为56.40％，金属螯合率为18.31％【王迎进，等.药物分析杂志，2014，34(7)：1187-1191】。
黄少愉等以乙醇/硫酸铵双水相为萃取溶剂，利用单因素试验和正交试验考察了双水相体系的组成、萃取温度、萃取时间、液料比等因素对苦参多糖萃取的影响。结果表明：微波萃取苦参多糖的最佳萃取条件为：双水相体系组成为19％硫酸铵(w/w)和25％乙醇(w/w)，萃取温度为80℃，萃取时间25min，液料比70:1，苦参多糖的萃取率为13.97％。但对获得的多糖未进行理化性质的研究。【黄少愉，等.今日药学，2015，25(9)：626-630】。
归纳以上研究结果，可以看出目前国内外对苦参多糖的化学和生物活性研究较少，特别是生物活性方面仅仅体外评价了对自由基的捕获、抑制H22肿瘤细胞生长和对小鼠巨噬细胞分泌NO的促进作用。此外，还可以看出不同方法获得的苦参多糖的生物活性存在较大差距。
综上，有必要进一步深入研究苦参多糖的生物学作用，并探索更恰当的苦参多糖制备方法，以推动苦参多糖在制药上的应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种苦参多糖、苦参多糖组分、其制备方法和用途。
第一方面，本发明提供了一种苦参多糖，所述的苦参多糖是按照以下方法制备得到的：
步骤1：水浸提
取苦参根药材粉碎，过10-30目筛，称取苦参根粉末，加水浸提，料液比为1:(2-20)kg/L，浸提温度为0-100℃，浸提时间为1-48小时，浸提液过滤，滤渣在同样条件下再进行1-2次提取；合并各次提取的水提液，离心，获得的上清液在50℃-55℃下减压浓缩，得到浓缩的水提液；
步骤2：醇沉
向浓缩液中加入2-4倍体积的乙醇，使乙醇最终质量浓度为40％-80％，静置沉淀48-72小时后，离心，分离沉淀，沉淀部分加入水中搅拌溶解，离心，再进行1-2次如上的乙醇沉淀操作后，再用水反复溶解1-3次，离心，合并上清液；
步骤3：除杂和回收
将醇沉后的上清液装入截留分子量>1000Da的透析袋，用水透析24-72小时，总的进行1-3次透析；将所截留的透析液在50℃-55℃下减压浓缩后，浓缩液在-20～-30℃下冷冻干燥10-20小时，获得所述的苦参多糖。
作为一个优选例，所述的苦参根药材为未经提取的根，或者经过有机溶剂萃取后得到的残渣根。
作为一个优选例，步骤2中乙醇最终质量浓度为60％-70％。
作为一个优选例，步骤1中所用的水为蒸馏水或去离子水。
作为一个优选例，步骤3中使用自来水和/或蒸馏水进行透析。
作为一个优选例，步骤1中，浸提温度为0-20℃时，浸提时间为24-48小时；浸提温度为20-80℃时，浸提时间为2-12小时；浸提温度为80-100℃时，浸提时间为0.5-2小时。更优选地，浸提温度为20℃时，浸提时间为24小时；浸提温度为60℃时，浸提时间为5小时；浸提温度为100℃时，浸提时间为1.5小时。
作为一个优选例，所述的苦参多糖含糖量为30％-80％(以葡萄糖计算)。
作为一个优选例，所述的苦参多糖的DEAE-纤维素柱层析图谱如图1所示。
第二方面，本发明提供了所述的苦参多糖的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：水浸提
取苦参根药材粉碎，过10-30目筛，称取苦参根粉末，加水浸提，料液比为1:(2-20)kg/L，浸提温度为0-100℃，浸提时间为1-48小时，浸提液过滤，滤渣在同样条件下再进行1-2次提取；合并各次提取的水提液，离心，获得的上清液在50℃-55℃下减压浓缩，得到浓缩的水提液；
步骤2：醇沉
向浓缩液中加入2-4倍体积的乙醇，使乙醇最终质量浓度为40％-80％，静置沉淀48-72小时后，离心，分离沉淀，沉淀部分加入水中搅拌溶解，离心，再进行1-2次如上的乙醇沉淀操作后，再用水反复溶解1-3次，离心，合并上清液；
步骤3：除杂和回收
将醇沉后的上清液装入截留分子量>1000Da的透析袋，用水透析24-72小时，总的进行1-3次透析；将所截留的透析液在50℃-55℃下减压浓缩后，浓缩液在-20～-30℃下冷冻干燥10-20小时，获得所述的苦参多糖。
第三方面，本发明提供了一种苦参多糖组分，所述的苦参多糖组分选自下列中的一种：
苦参多糖组分1：将权利要求1所述的苦参多糖经DEAE-纤维素柱层析，水洗脱得到，其为中性多糖，含糖量为60％～100％，由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖构成；
苦参多糖组分2：将权利要求1所述的苦参多糖经DEAE-纤维素柱层析，0.25mol/LNaHCO3洗脱得到，其为酸性多糖，含糖量为50％～90％，糖醛酸含量为10％～30％，由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成；
苦参多糖组分3：将权利要求1所述的苦参多糖经DEAE-纤维素柱层析，0.5mol/LNaHCO3洗脱得到，其为酸性多糖，含糖量为15％～40％，糖醛酸含量为5％～25％，由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸组成。
第四方面，本发明提供了所述的苦参多糖组分的制备方法，所述的苦参多糖组分的制备方法分别为：
苦参多糖组分1：将权利要求1所述的苦参多糖经DEAE-纤维素柱层析，水洗脱得到；
苦参多糖组分2：将权利要求1所述的苦参多糖经DEAE-纤维素柱层析，0.25mol/LNaHCO3洗脱得到；
苦参多糖组分3：将权利要求1所述的苦参多糖经DEAE-纤维素柱层析，0.5mol/LNaHCO3洗脱得到。
第五方面，本发明提供了如上任一所述的苦参多糖以及所述的苦参多糖组分在制备免疫调节、抗肿瘤或抗肝损伤的药物中的用途。
作为一个优选例，所述的肝损伤是由人类自身免疫性肝病或病毒性肝炎导致的肝损伤。
第六方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如上任一所述的苦参多糖和/或苦参多糖组分，以及药学上可接受的载体。
所述的“药学上可接受的载体”是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂和水等，填充剂如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇、十二烷基硫酸钠；吸附载体如高龄土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明的优点在于：从苦参根中通过水浸提的方式提取得到苦参多糖，进而分离得到其中的多糖组分，并对其进行了性质测定。
1、实验表明本发明的苦参多糖及其多糖组分均能促进小鼠脾脏细胞增殖和细胞因子分泌；促进人肝细胞的增殖和降低化学毒剂对细胞的损伤；能抑制乙肝表面抗原和核心抗原的表达；抑制肝癌细胞的增殖以及抑制ConA对小鼠肝脏和肾脏的造成的损伤。该项发明将为苦参多糖开发免疫调节剂、抗肿瘤和抗肝损伤药物或保健食品等提供了坚实的实验基础。
2、本发明的苦参多糖及其多糖组分采用特定步骤和参数制备得到，生物活性显著优于现有技术中其他方法制备得到的苦参多糖或苦参多糖组分。
3、需特别说明的是，本发明基于ConA诱导的肝损伤模型证实了苦参多糖对动物肝脏和肾脏具有保护作用，能够显著减轻炎症反应，ConA诱发的小鼠肝损伤模型是人类自身免疫性肝病或病毒性肝炎导致的肝损伤的具有代表性的动物模型，因此本发明证明了苦参多糖对人类自身免疫性肝病或病毒性肝炎导致的肝损伤具有确切的治疗效果。
4、本发明的苦参多糖的制备方法采用了特定步骤和参数，制备得到的苦参多糖及其多糖组分效果突出，制备步骤简单，不使用有机溶剂或有机溶剂用量很少，产物中没有或很少有有机溶剂的残留，且制备过程对环境污染小，更适于工业生产，因此推进了苦参的药物开发利用。
附图说明
图1是苦参多糖(SFP-100)的DEAE-纤维素柱层析图谱。
图2是SFP-20的分子量分布图谱。
图3是SFP-60的分子量分布图谱。
图4是SFP-100的分子量分布图谱。
图5是SFP-100-A的分子量分布图谱。
图6是SFP-100-B的分子量分布图谱。
图7是SFP-100-C的分子量分布图谱。
图8是小鼠肝脏病理切片的照片。其中，A：正常对照小鼠1肝脏；B：正常对照小鼠2肝脏；C：模型对照小鼠1肝脏；D：模型对照小鼠2肝脏；E：SFP-100小鼠1肝脏；F：SFP-100小鼠2肝脏。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购而获得的常规产品。
实施例1 本发明苦参多糖的制备(一)
步骤1：水浸提
取未经提取的苦参根原药材粉碎，过20目筛。称取苦参根粉末3份，每份1kg。分别在20℃、60℃和100℃温度下加15L蒸馏水浸提。其中，25℃条件下浸提24小时，60℃条件下浸提5小时，100℃条件下煎煮1.5小时，浸提期间进行搅拌。浸提液过滤，滤渣各自在同样条件下再进行一次提取。各自合并两次提取的水提液，离心(3000r/min×20min)，不同温度下获得的上清液分别在55℃下减压浓缩至1.5L，得到浓缩的水提液。
步骤2：醇沉
分别向不同温度下提取的浓缩液中加入3倍体积的乙醇，使乙醇终浓度为70％(乙醇的质量浓度)，静置沉淀48小时后，离心(3000r/min×20min)，分离沉淀，沉淀部分加入1.0L水中搅拌溶解，离心(3000r/min×20min)，再进行2次如上的乙醇沉淀操作后，再将沉淀用1.0L水反复溶解2次，离心，各自合并上清液。
步骤3：除杂和回收
将醇沉后的上清液分别装入透析袋(截留分子量为1200Da)，用蒸馏水透析48小时。将所截留的透析液在55℃下减压浓缩后，浓缩液装入小瓶，进行冷冻干燥(-25度，15小时)，获得不同温度下制备的苦参多糖，分别命名为SFP-20、SFP-60和SFP-100。
实施例2 本发明苦参多糖的制备(二)
步骤1：水浸提
取未经提取的苦参根原药材粉碎，过10目筛。称取苦参根粉末，加蒸馏水浸提，料液比为1:20kg/L，浸提温度为0℃，浸提时间为48小时，浸提液过滤，滤渣在同样条件下再进行2次提取。浸提期间进行搅拌。合并各次提取的水提液，离心(3000r/min×20min)，获得的上清液在50℃下减压浓缩至1.0L，得到浓缩的水提液。
步骤2：醇沉
向提取的浓缩液中加入2倍体积的乙醇，使乙醇终浓度为80％(乙醇的质量浓度)，静置沉淀60小时后，离心(3000r/min×20min)，分离沉淀，沉淀部分加入1.0L水中搅拌溶解，离心(3000r/min×20min)，再进行1次如上的乙醇沉淀操作后，再将沉淀用1.0L水反复溶解3次，离心，合并上清液。
步骤3：除杂和回收
将醇沉后的上清液装入透析袋(截留分子量为2000Da)，用蒸馏水透析24小时，透析总的进行2次。将所截留的透析液在50℃下减压浓缩后，浓缩液装入小瓶，进行冷冻干燥(-20度，20小时)，获得苦参多糖。
实施例3 本发明苦参多糖的制备(三)
步骤1：水浸提
取经过乙酸乙酯萃取后的苦参根粉碎，过30目筛。称取苦参根粉末，加去离子水浸提，料液比为1:2kg/L，浸提温度为90℃，浸提时间为1小时，浸提液过滤，滤渣在同样条件下再进行2次提取。浸提期间进行搅拌。合并各次提取的水提液，离心(3000r/min×20min)，获得的上清液在55℃下减压浓缩至1.5L，得到浓缩的水提液。
步骤2：醇沉
向提取的浓缩液中加入4倍体积的乙醇，使乙醇终浓度为40％(乙醇的质量浓度)，静置沉淀72小时后，离心(3000r/min×20min)，分离沉淀，沉淀部分加入1.0L水中搅拌溶解，离心(3000r/min×20min)，再进行2次如上的乙醇沉淀操作后，再将沉淀用1.0L水溶解1次，离心，得到上清液。
步骤3：除杂和回收
将醇沉后的上清液装入透析袋(截留分子量为3500Da)，用蒸馏水透析72小时，透析总的进行3次。将所截留的透析液在55℃下减压浓缩后，浓缩液装入小瓶，进行冷冻干燥(-30度，10小时)，获得苦参多糖。
实施例4 本发明苦参多糖的制备(四)
步骤1：水浸提
取未经提取的苦参根原药材粉碎，过20目筛。称取苦参根粉末，加去离子水浸提，料液比为1:10kg/L，浸提温度为50℃，浸提时间为24小时，浸提液过滤，滤渣在同样条件下再进行1次提取。浸提期间进行搅拌。合并两次提取的水提液，离心(3000r/min×20min)，获得的上清液在50℃下减压浓缩至1.0L，得到浓缩的水提液。
步骤2：醇沉
向提取的浓缩液中加入4倍体积的乙醇，使乙醇终浓度为60％(乙醇的质量浓度)，静置沉淀48小时后，离心(3000r/min×20min)，分离沉淀，沉淀部分加入1.0L水中搅拌溶解，离心(3000r/min×20min)，再进行2次如上的乙醇沉淀操作后，再将沉淀用1.0L水反复溶解3次，离心，合并上清液。
步骤3：除杂和回收
将醇沉后的上清液装入透析袋(截留分子量为3500Da)，用自来水透析48小时，透析总的进行2次。将所截留的透析液在50℃下减压浓缩后，浓缩液装入小瓶，进行冷冻干燥(-20度，20小时)，获得苦参多糖。
实施例5 本发明苦参多糖的制备(五)
步骤1：水浸提
取经石油醚萃取的苦参根粉碎，过10目筛。称取苦参根粉末，加去离子水浸提，料液比为1:15kg/L，浸提温度为70℃，浸提时间为48小时，浸提液过滤，滤渣在同样条件下再进行2次提取。浸提期间进行搅拌。合并各次提取的水提液，离心(3000r/min×20min)，获得的上清液在50℃下减压浓缩至1.0L，得到浓缩的水提液。
步骤2：醇沉
向提取的浓缩液中加入2倍体积的乙醇，使乙醇终浓度为70％(乙醇的质量浓度)，静置沉淀48小时后，离心(3000r/min×20min)，分离沉淀，沉淀部分加入1.0L水中搅拌溶解，离心(3000r/min×20min)，再进行2次如上的乙醇沉淀操作后，再将沉淀用1.0L水反复溶解3次，离心，合并上清液。
步骤3：除杂和回收
将醇沉后的上清液装入透析袋(截留分子量为2000Da)，用自来水和蒸馏水(1:1)透析48小时，透析总的进行2次。将所截留的透析液在50℃下减压浓缩后，浓缩液装入小瓶，进行冷冻干燥(-20度，20小时)，获得苦参多糖。
实施例6 本发明苦参多糖的制备(六)
步骤1：水浸提
取未经提取的苦参根原药材粉碎，过30目筛。称取苦参根粉末，加去离子水浸提，料液比为1:15kg/L，浸提温度为70℃，浸提时间为48小时，浸提液过滤，滤渣在同样条件下再进行2次提取。浸提期间进行搅拌。合并各次提取的水提液，离心(3000r/min×20min)，获得的上清液在50℃下减压浓缩至1.0L，得到浓缩的水提液。
步骤2：醇沉
向提取的浓缩液中加入2倍体积的乙醇，使乙醇终浓度为70％(乙醇的质量浓度)，静置沉淀48小时后，离心(3000r/min×20min)，分离沉淀，沉淀部分加入1.0L水中搅拌溶解，离心(3000r/min×20min)，再进行2次如上的乙醇沉淀操作后，再将沉淀用1.0L水反复溶解3次，离心，合并上清液。
步骤3：除杂和回收
将醇沉后的上清液装入透析袋(截留分子量为2000Da)，用自来水和蒸馏水(1:1)透析48小时，透析总的进行2次。将所截留的透析液在50℃下减压浓缩后，浓缩液装入小瓶，进行冷冻干燥(-20度，20小时)，获得苦参多糖。
实施例7 本发明苦参多糖组分的制备
称取100℃制备的苦参总多糖SFP-100(按照实施例1的方法制备)1g，加入蒸馏水50ml溶解，溶解液上样DEAE-纤维素柱(Φ8cm×35cm)，分别采用水、0.25mol/L NaHCO3和0.5mol/L NaHCO3进行连续洗脱，流速1mL/min，10mL/管，分别相应获得多糖组分SFP-100-A(H2O洗脱，λ490nm吸收)、SFP-100-B(0.25mol/L NaHCO3洗脱，λ490nm吸收)和SFP-100-C(0.5mol/LNaHCO3洗脱，λ490nm吸收)。SFP-100在DEAE-纤维素柱层析的色谱图如图1所示。
实施例8 不同温度制备的苦参多糖的理化性质测定
1.实验样品
根据实施例1制备的苦参多糖。
2.苦参多糖得率和糖含量测定(苯酚-硫酸法)
(1)标准曲线制作
葡萄糖标准品置于55℃真空干燥箱中干燥，至恒重。准确称取葡萄糖标准品5mg，转移至50mL容量瓶中，加蒸馏水定容。移取葡萄糖标准溶液0.0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL至于具塞试管中，再分别补水至2.0ml。各试管中加入8％苯酚溶液1.0mL，摇匀，然后沿管壁缓慢加入浓硫酸5.0mL，摇匀。室温放置30分钟后于490nm波长处测定吸光度值。以葡萄糖溶液浓度(C)为横坐标，吸光度值(A)为纵坐标，绘制标准曲线。
(2)样品糖含量测定
待测样品置于55℃真空干燥箱干燥至恒重。精确称量10mg样品，转移至25mL容量瓶中，加水定容。移取待测样品溶液0.5mL至于具塞试管中，补加蒸馏水至2.0mL。按标准曲线相同方法操作，测定其吸光度值，代入标准曲线方程中，计算样品中糖含量。
苦参多糖得率＝苦参多糖重量(g)/药材重量(g)×100％。
糖含量＝糖重量(mg)/苦参多糖重量(mg)×100％。
不同温度制备的苦参多糖的得率和糖含量统计结果见表1。
表1.不同温度制备的苦参多糖的得率和糖含量
3.苦参多糖分子量分布(凝胶渗透色谱法，HPGPC)
(1)色谱条件：
标准品：一系列不同分子量的葡聚糖。
色谱柱：TSKgel-G 3000SWXL(7.8×300mm)。
流动相：0.1mol/L的Na2SO4溶液。
进样：20μL。
检测器：2414示差检测器。
(2)标准曲线制作：
分别称取5mg不同分子量葡聚糖标准品，加入0.5mL超纯水溶解，0.45μm膜过滤。在流速0.5mL/min条件下分别进样20μL。采用Waters Empower 2.0 GPC软件处理实验数据，绘制分子量标准曲线。
(3)样品分子量测定：
分别称取5mg待测样品，加入0.5mL超纯水溶解，0.45μm膜过滤，进样20μL。根据样品的保留时间，计算多糖样品的峰高分子量(Mp)。
(4)测定结果：
按照实施例1制备的苦参多糖，其分子量分布结果见图2、图3和图4。
4.单糖组成测定
分别称取实施例1的苦参多糖各5mg，分别置于水解管中，加入3mL2mol/L三氟乙酸溶解，密封，置于120℃烘箱中加热水解2小时。取出放置冷至室温后，转移至25mL圆底烧瓶中。45℃减压条件下反复加入少量甲醇，去除残余的三氟乙酸。反应瓶中各加入2mL水溶解，再加入80mg硼氢化钠，室温搅拌反应4小时。反应结束后滴加25％醋酸除去过量的硼氢化钠。然后45℃减压条件下多次加入甲醇，去除残留的硼酸。待测样品70℃真空干燥2小时，再各加入2mL无水吡啶和2mL无水醋酸酐，密封，90℃加热1小时进行乙酰化衍生反应。反应结束后，60℃减压条件下多次加入少量甲苯，去除反应瓶中残余的吡啶及醋酸酐。样品加入少量氯仿溶解、过滤，滤液进行气相色谱分析，根据不同单糖的峰面积计算单糖之间的摩尔比。
单糖组成测定结果见表2。
表2.苦参多糖的单糖组成
实施例9苦参多糖组分的理化性质测定
1.实验样品
SFP-100-A、SFP-100-B和SFP-100-C
2.实验方法
(1)糖含量测定：同实施例8(略)。
(2)多糖分子量分布：同实施例8(略)。
(3)单糖组成：同实施例8(略)。
3.实验结果
(1)糖含量(见表3)
表3.三个多糖组分糖含量
(2)分子量分布(见图5、图6和图7)
(3)单糖组成
表4.苦参多糖组分的单糖组成
实施例10 苦参多糖及其多糖组分的免疫调节活性
1.促进小鼠脾细胞的增殖活性
Balc/C小鼠眼球取血，颈椎脱臼处死。无菌条件下取出脾，制备脾细胞悬液，用台盼蓝染色法检测细胞存活率＞95％，进行细胞计数，调整细胞密度为5×109·L-1。将计数后的脾细胞悬液按每孔100μL加入到96孔细胞培养板，溶剂对照孔只加等体积的RPMI 1640培养液作为本底。各孔再加入100μL苦参多糖或多糖组分(终浓度为50μg/mL)、ConA(终浓度4μg/mL)和LPS(终浓度30μg/mL，每组设3复孔。将培养板置于含5％CO2培养箱中，37℃孵育48h。加入20μL MTT 5μg/mL，继续孵育4h。弃上清液后，每孔中加入150μL DMSO，酶标仪检测A570nm，计算细胞增殖百分率。结果见表5。
结果表明：20℃、60℃和100℃条件下分别制备的苦参多糖对ConA刺激的T细胞增殖和LPS刺激的B细胞增殖均有显著的协同作用，60℃和100℃制备的苦参多糖本身对脾细胞有促进增殖的效果(P<0.05)。苦参多糖SFP-100的三个多糖组分中SFP-100-B和SFP-100-C有促进脾细胞增殖活性(P<0.05)。
表5.苦参多糖对小鼠脾细胞增殖的影响
注：与生理盐水组相比，**P<0.01；与Con A或LPS组相比，#P<0.05，##P<0.01.n＝3.
表6.苦参多糖组分对小鼠脾细胞增殖的影响
注：与生理盐水组相比，**P<0.01；与Con A或LPS组相比，#P<0.05，##P<0.01.n＝3.
2.促进细胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌
Balb/C小鼠处死后无菌取脾脏，制备脾细胞悬液(5×106/mL)。将脾细胞悬液加入24孔细胞培养板中，每孔各加入500μL。再加入500μL多糖样品(培养液配制)，使其终浓度分别为50μg/mL，另设ConA(2μg/mL)和溶剂对照孔，每组设3复孔。然后置于37℃、5％CO2培养箱中培养72h，然后取出细胞培养液，离心10min(600×g)，收集上清，按照ELISA试剂盒说明书测定脾细胞培养上清IFN-γ含量，实验结果见表7。
Balb/C小鼠处死后无菌抽取腹腔巨噬细胞，制备细胞悬液，并用含FBS的DMEM培养液调整细胞浓度为2.5×105/mL。向24孔培养板中加入巨噬细胞悬液500μL，再加入500μL不同浓度多糖样品(终浓度为50μg/mL)，设3复孔，然后置于5％CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养48h。收集巨噬细胞培养上清液，采用ELISA试剂盒测定细胞上清液中TNF-α的含量，实验结果见表6。
结果表明：60℃和100℃条件下制备的苦参多糖SFP-60和SFP-100能明显促进小鼠脾细胞分泌IFN-γ和腹腔巨噬细胞分泌TNF-α(P<0.01)，20℃条件下制备的苦参多糖SFP-20对TNF-α的分泌有促进活性(P<0.05)。
表7.苦参多糖对小鼠分泌IFN-γ和TNF-α的影响
注：与生理盐水组相比，**P<0.01，n＝3.
实施例11 苦参多糖组分对人肝癌细胞的抑制活性
取对数生长期人肝癌SMMC7721细胞，经消化处理后，以1％FBS的RPMI-1640液制成单细胞悬液，用台酚蓝液染色，WBC计数法计数活细胞总数。然后接种于96孔细胞培养板，密度为1×104/孔，再加入不同浓度苦参多糖组分(终浓度为10、50和250μg/mL)，并设溶剂対照组，每个浓度组设3复孔。按常规静置培养48小时。96孔板每孔加入0.5％MTT液20μL，继续孵育箱培养4小时，加入10％SDS 100μL/孔，37℃温箱过夜后，酶标仪570nm波长处检测OD值，计算抑制率。
结果表明：苦参多糖中组分SFP-100-B对人肝癌细胞生长有明显抑制活性(P<0.05)，组分SFP-100-C也有一定抑制作用。
表8.苦参多糖组分对人肝癌细胞的抑制作用
注：与生理盐水组相比，*P<0.05，n＝3.
实施例12 苦参多糖及组分对人L-O2肝细胞的促增殖活性
取对数生长期L-O2肝细胞，经消化处理后，以1％FBS的RPMI-1640液制成单细胞悬液，用台酚蓝液染色，计数活细胞总数，接种入96孔细胞培养板，密度为1×104/孔。多糖样品采用培养液配制，加入培养板中，使其终浓度为0、10、50和250mg·L-1，每个浓度平行设3个孔，置于培养箱中孵育48h。向含有培养物的96孔板中每孔加入0.5％MTT液20μL，继续培养4h，然后每孔加入100μL 10％SDS，继续37℃孵育过夜，最后采用酶标仪检测570nm波长处的OD值，计算细胞增殖率，实验数据见表9和表10。
结果表明：苦参多糖SFP-100及组分SFP-100-A在250μg/mL浓度下对人肝细胞有明显促增殖活性(P<0.05)。多糖组分SFP-100-B和SFP-100-C具有显著促增殖活性，并呈剂量-效应关系(P<0.01)。
表9.苦参多糖对人L-O2肝细胞增殖的影响
注：与生理盐水组相比，*P<0.05，n＝3.
表10.苦参多糖组分对人L-O2肝细胞的促增殖作用
注：与生理盐水组相比，*P<0.05，**P<0.01，n＝3.
实施例13 苦参多糖及组分对人肝细胞株分泌HBsAg和HBeAg的影响
将处于对数生长期的HepG2.2.15细胞用胰酶消化后，加入DMEM培养液(含10％FBS)终止消化，转至15ml离心管中1000rpm离心5min，去液体后加1ml DMEM培养液(含10％FBS)重悬后，计数。按照5.0×103细胞/孔分别种于96孔板，每孔100μl DMEM培养液(含10％FBS)，置37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱培养24小时。待细胞贴壁后，弃原培养液，分别加入100μl/孔的含药培养液(每种药物按100、250和500μg/mL设3个复孔)，分别在药物干预后48小时收集细胞培养上清，采用乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)诊断试剂盒(酶联免疫法)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)诊断试剂盒(酶联免疫法)检测细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的水平，计算抑制率。实验结果见表11。
结果表明：苦参多糖组分SFP-100-A能显著抑制HepG2.2.15肝细胞表达HBsAg和HBeAg(P<0.01)，SFP-100-C对HBsAg有抑制作用(P<0.05)。
表11.苦参多糖组分对HepG2.2.15肝细胞HBsAg和HBeAg的抑制率
注：与溶剂组相比，**P<0.01，n＝3.
实施例14 苦参多糖对ConA诱导小鼠肝损伤的保护作用
雌性Balb/C小鼠40只，随机分为四组，每组10只。(1)正常对照组；(2)肝损伤模型组；(3)肝损伤模型+苦参多糖组(500mg/kg)；(4)肝损伤模型+复方甘草酸片(50mg/kg)。模型组小鼠每周尾静脉注射ConA二次，剂量均为10mg/kg，连续注射4周。苦参多糖和复方甘草酸片每天灌胃1次，连续4周。末次注射ConA和给药后，禁食过夜。处死小鼠。无菌取小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，测定培养液上清中IFN-γ含量。摘取小鼠肝脏、肾脏和胸腺，称重，计算重量指数，肝脏和肾脏制备病理切片。
实验结果见表12。数据表明：与对照组相比，肝损伤模型组小鼠肝脏和肾脏肿大，重量指数明显增加(P<0.01)，胸腺萎缩，重量指数降低。给予苦参多糖和复方甘草酸苷对肝脏和肾脏肿大有一定抑制作用，苦参多糖作用明显(P<0.05)。苦参多糖和复方甘草酸均能显著促进小鼠脾脏细胞分泌IFN-γ(P<0.01)。病理分析显示：与正常对照组相比(图8中A和B)，ConA模型组小鼠肝脏出现多处肝细胞坏死区域，区域周边大量炎症细胞聚集(图8中C和D)和纤维细胞的增生；与模型组相比，小鼠给予苦参多糖(SFP-100)，肝脏出现肝细胞坏死区域明显减少或不出现，炎症细胞明显减少，同时还会出现双核肝细胞，增加细胞的分裂和增生(图8中E和F)。
表12.苦参多糖对小鼠脏器重量和脾脏分泌IFN-γ的影响
注：与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，n＝10.
实施例15 不同苦参多糖对ConA诱导小鼠肝损伤保护作用的比较
同期研究了不同提取方法制备的苦参多糖对ConA诱导小鼠肝损伤的保护作用是否有明显差异。发明人设置了大量的实验组，其中包含以下实验组：
实验组一：按照Bai等的方法制备苦参多糖，具体为：利用干燥气体粉碎苦参根用甲醇-氯仿(8:1v/v)提取，残留物用蒸馏水在室温条件下提取三次，每次三个小时，提取溶液合并、浓缩、提取物中的相关蛋白使用Sevag方法移除，然后多糖的溶液再浓缩，用四管95％的乙醇在4℃整夜沉淀多糖。最后，沉淀物用无水乙醇、丙酮和乙醚冲洗，获得原始多糖，即一种苦参粗多糖。
实验组二：按照王迎进等的方法制备苦参粗多糖，具体为：苦参70℃干燥3h，粉碎，过60目筛，取苦参粉末50g，用石油醚(沸程60～90℃)500mL回流2h，抽滤，挥干。用95％乙醇500mL回流2h，干燥得苦参药渣。以20倍量的蒸馏水100℃下提取3h，过滤，滤渣重提2次，合并滤液，减压浓缩。Sevag法除蛋白，醇沉，抽滤，冷冻干燥得苦参粗多糖。
实验组三：按照王迎进等的方法制备苦参多糖组分SFP-1，具体为：苦参70℃干燥3h，粉碎，过60目筛，取苦参粉末50g，用石油醚(沸程60～90℃)500mL回流2h，抽滤，挥干。用95％乙醇500mL回流2h，干燥得苦参药渣。以20倍量的蒸馏水100℃下提取3h，过滤，滤渣重提2次，合并滤液，减压浓缩。Sevag法除蛋白，醇沉，抽滤，冷冻干燥得苦参粗多糖。DEAE-52纤维素柱(2.5cm×60cm)经蒸馏水平衡后，取苦参粗多糖0.50g溶解于10mL蒸馏水中上样，分别以蒸馏水及0.1、0.2、0.3、0.4mol·L-1的氯化钠溶液各250mL梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1，分管收集，每管10mL，苯酚-硫酸法检测。SFP-1峰为蒸馏水洗脱得到。收集SFP-1峰组分，经透析、醇沉、冷冻干燥得苦参多糖SFP-1。
实验组四：
步骤1：水浸提
取未经提取的苦参根原药材粉碎，过20目筛。称取苦参根粉末1kg，在100℃温度下加15L蒸馏水煎煮浸提1.5小时，浸提期间进行搅拌。浸提液过滤，滤渣在同样条件下再进行一次提取。合并两次提取的水提液，离心(3000r/min×20min)，获得的上清液在55℃下减压浓缩至1.5L，得到浓缩的水提液。
步骤2：醇沉
向提取的浓缩液中加入3倍体积的乙醇，使乙醇终浓度为85％(乙醇的质量浓度)，静置沉淀48小时后，离心(3000r/min×20min)，分离沉淀，沉淀部分加入1.0L水中搅拌溶解，离心(3000r/min×20min)，再进行2次如上的乙醇沉淀操作后，再将沉淀用1.0L水反复溶解2次，离心，合并上清液。
步骤3：除杂和回收
将醇沉后的上清液装入透析袋(截留分子量为1200Da)，用蒸馏水透析48小时。将所截留的透析液在55℃下减压浓缩后，浓缩液装入小瓶，进行冷冻干燥(-25度，15小时)，获得苦参多糖。
实验组五：
步骤1：水浸提
取未经提取的苦参根原药材粉碎，过20目筛。称取苦参根粉末1kg，在100℃温度下加15L蒸馏水煎煮浸提1.5小时，浸提期间进行搅拌。浸提液过滤，滤渣在同样条件下再进行一次提取。合并两次提取的水提液，离心(3000r/min×20min)，获得的上清液在55℃下减压浓缩至1.5L，得到浓缩的水提液。
步骤2：使用Sevag方法移除蛋白。
步骤3：醇沉
向移除蛋白后的浓缩液中加入3倍体积的乙醇，使乙醇终浓度为70％(乙醇的质量浓度)，静置沉淀48小时后，离心(3000r/min×20min)，分离沉淀，沉淀部分加入1.0L水中搅拌溶解，离心(3000r/min×20min)，再进行2次如上的乙醇沉淀操作后，再将沉淀用1.0L水反复溶解2次，离心，合并上清液。
步骤4：除杂和回收
将醇沉后的上清液装入透析袋(截留分子量为1200Da)，用蒸馏水透析48小时。将所截留的透析液在55℃下减压浓缩后，浓缩液装入小瓶，进行冷冻干燥(-25度，15小时)，获得苦参多糖。
实验组六：
步骤1：水浸提
取未经提取的苦参根原药材粉碎，过20目筛。称取苦参根粉末1kg，在100℃温度下加15L蒸馏水煎煮浸提1.5小时，浸提期间进行搅拌。浸提液过滤，滤渣在同样条件下再进行一次提取。合并两次提取的水提液，离心(3000r/min×20min)，获得的上清液在55℃下减压浓缩至1.5L，得到浓缩的水提液。
步骤2：醇沉
向提取的浓缩液中加入3倍体积的乙醇，使乙醇终浓度为70％(乙醇的质量浓度)，静置沉淀48小时后，离心(3000r/min×20min)，分离沉淀，沉淀部分加入1.0L水中搅拌溶解，离心(3000r/min×20min)，再进行2次如上的乙醇沉淀操作后，再将沉淀用1.0L水反复溶解2次，离心，合并上清液。
步骤3：除杂和回收
将醇沉后的上清液装入透析袋(截留分子量为800Da)，用蒸馏水透析48小时。将所截留的透析液在55℃下减压浓缩后，浓缩液装入小瓶，进行冷冻干燥(-25度，15小时)，获得苦参多糖。
按照实施例9的方法检测各实验组的苦参多糖对ConA诱导小鼠肝损伤的影响，尤其是对肝脏重量和脾脏细胞分泌IFN-γ能力的影响。此外，对小鼠肝脏病理切片的肝细胞坏死区域大小和炎症细胞数量进行评分，总分数为10分，分数越高代表肝细胞坏死区域越大和炎症细胞数量越多。
实验结果见表13和表14。数据表明，各苦参多糖治疗组肝损伤模型组小鼠肾脏肿大受到一定抑制，苦参多糖SFP-100组的作用最显著，并与其他苦参多糖治疗组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。各苦参多糖治疗组鼠脾脏细胞分泌IFN-γ均增加，苦参多糖SFP-100组的作用最显著，与其他苦参多糖治疗组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。病理分析显示：苦参多糖SFP-100组肝细胞坏死区域大小和炎症细胞数量评分最低，并显著低于其他各组(P<0.05)。
表13.各组苦参多糖对小鼠脏器重量和脾脏分泌IFN-γ的影响
注：与苦参多糖组相比，#P<0.05，##P<0.01，n＝10.
表14.各组苦参多糖对小鼠肝细胞坏死和肝脏炎症的影响
注：与苦参多糖组相比，#P<0.05，##P<0.01，n＝10.
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种苦参多糖，其特征在于，所述的苦参多糖是按照以下方法制备得到的：
步骤1：水浸提
取苦参根药材粉碎，过10-30目筛，称取苦参根粉末，加水浸提，料液比为1:(2-20)kg/L，浸提温度为0-100℃，浸提时间为1-48小时，浸提液过滤，滤渣在同样条件下再进行1-2次提取；合并各次提取的水提液，离心，获得的上清液在50℃-55℃下减压浓缩，得到浓缩的水提液；
步骤2：醇沉
向浓缩液中加入2-4倍体积的乙醇，使乙醇最终质量浓度为40％-80％，静置沉淀48-72小时后，离心，分离沉淀，沉淀部分加入水中搅拌溶解，离心，再进行1-2次如上的乙醇沉淀操作后，再用水反复溶解1-3次，离心，合并上清液；
步骤3：除杂和回收
将醇沉后的上清液装入截留分子量>1000Da的透析袋，用水透析24-72小时，总的进行1-3次透析；将所截留的透析液在50℃-55℃下减压浓缩后，浓缩液在-20～-30℃下冷冻干燥10-20小时，获得所述的苦参多糖。
2.根据权利要求1所述的苦参多糖，其特征在于，所述的苦参根药材为未经提取的根，或者经过有机溶剂萃取后得到的残渣根。
3.根据权利要求1所述的苦参多糖，其特征在于，步骤2中乙醇最终质量浓度为60％-70％。
4.根据权利要求1所述的苦参多糖，其特征在于，步骤1中所用的水为蒸馏水或去离子水。
5.根据权利要求1所述的苦参多糖，其特征在于，步骤3中使用自来水和/或蒸馏水进行透析。
6.权利要求1所述的苦参多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：水浸提
取苦参根药材粉碎，过10-30目筛，称取苦参根粉末，加水浸提，料液比为1:(2-20)kg/L，浸提温度为0-100℃，浸提时间为1-48小时，浸提液过滤，滤渣在同样条件下再进行1-2次提取；合并各次提取的水提液，离心，获得的上清液在50℃-55℃下减压浓缩，得到浓缩的水提液；
步骤2：醇沉
向浓缩液中加入2-4倍体积的乙醇，使乙醇最终质量浓度为40％-80％，静置沉淀48-72小时后，离心，分离沉淀，沉淀部分加入水中搅拌溶解，离心，再进行1-2次如上的乙醇沉淀操作后，再用水反复溶解1-3次，离心，合并上清液；
步骤3：除杂和回收
将醇沉后的上清液装入截留分子量>1000Da的透析袋，用水透析24-72小时，总的进行1-3次透析；将所截留的透析液在50℃-55℃下减压浓缩后，浓缩液在-20～-30℃下冷冻干燥10-20小时，获得所述的苦参多糖。
7.一种苦参多糖组分，其特征在于，所述的苦参多糖组分选自下列中的一种：
苦参多糖组分1：将权利要求1所述的苦参多糖经DEAE-纤维素柱层析，水洗脱得到，其为中性多糖，含糖量为60％～100％，由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖构成；
苦参多糖组分2：将权利要求1所述的苦参多糖经DEAE-纤维素柱层析，0.25mol/LNaHCO3洗脱得到，其为酸性多糖，含糖量为50％～90％，糖醛酸含量为10％～30％，由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成；
苦参多糖组分3：将权利要求1所述的苦参多糖经DEAE-纤维素柱层析，0.5mol/L NaHCO3洗脱得到，其为酸性多糖，含糖量为15％～40％，糖醛酸含量为5％～25％，由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸组成。
8.权利要求7所述的苦参多糖组分的制备方法，其特征在于，所述的苦参多糖组分的制备方法分别为：
苦参多糖组分1：将权利要求1所述的苦参多糖经DEAE-纤维素柱层析，水洗脱得到；
苦参多糖组分2：将权利要求1所述的苦参多糖经DEAE-纤维素柱层析，0.25mol/LNaHCO3洗脱得到；
苦参多糖组分3：将权利要求1所述的苦参多糖经DEAE-纤维素柱层析，0.5mol/L NaHCO3洗脱得到。
9.权利要求1-5任一所述的苦参多糖以及权利要求7所述的苦参多糖组分在制备免疫调节、抗肿瘤或抗肝损伤的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的肝损伤是由人类自身免疫性肝病或病毒性肝炎导致的肝损伤。
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2017
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