CN1513879A - 富锗金针菇多糖及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

一种富锗金针菇多糖粗品，它是由富锗金针菇菌丝体用水提取，将提取液浓缩，加入氯仿和正丁醇，剧烈振荡，静置分层，水层对流水透析，浓缩透析液，加入乙醇，4℃放置，收集沉淀得到的富锗金针菇多糖的粗品，该富锗金针菇多糖粗品主要含有富锗金针菇单一多糖FVP1，和富锗金针菇单一多糖FVP2。FVP1或FVP2是由富锗金针菇多糖粗品经纯化、分离得到的由葡萄糖组成、端基碳为α－构型的、以1→4糖苷键为主要连接方式、其中每七个葡萄糖主链通过1→6连接带有1个葡萄糖侧链、平均分子量为2.58×10⁶或1.98×10⁴、比旋光度[α]_D ^t为+83.60°、+160.19°、含锗量为482.19ng/g或722.83ng/g的富锗金针菇单一多糖。它们有保肝、治疗肝炎和抗癌作用。本发明公开了其制备方法和用途。

Description

富锗金针菇多糖及其制法和用途

一、技术领域

本发明涉及从富锗金针菇(Flammulina velutipes)菌丝体提取的多糖，具体地说是一种从富锗金针菇菌丝体中提取的富锗金针菇多糖，其结构和生物活性及其制备方法。

二、背景技术

糖类是自然界最多的有机化合物，也是重要的生物高分子化合物和重要的信息分子，它们参与了细胞各种生命活动的调节。活性多糖专指具有某种特殊生理活性的多糖化合物，因其具有较强的免疫调节作用和抗肿瘤活性而备受重视。其中的多糖(Polysacharides)，对促进和恢复机体免疫机能作用极为明显。真菌多糖是从真菌中提取的多糖组分，它作为一种广谱免疫调节剂，主要是通过宿主中介，刺激机体的各种免疫活性细胞成熟，分化，使机体免疫系统恢复平衡，由机体本身的抵抗力驱逐和吞噬肿瘤细胞。从真菌中提取的多糖，优于从动物体内血液中提取的免疫球蛋白，具有更大的提高人体免疫力和抗癌的作用。

金针菇(Flammulina velutipes)属于伞菌目口磨科金钱菌属。它是一种传统的著名食用真菌。国外学者已从金针菇子实体和菌丝体中提取分离纯化了许多蛋白，多具有较强的抗肿瘤活性。金针菇多糖(Flammulina velutipes Polysaccharide简称FVP)则是从金针菇中提取的另一种活性物质，是一种多糖复合物。1968年，日本Kamasuka等人最先报道了其多糖成分对小鼠肉瘤S180有明显的抑制作用，之后又有一些人对此作了较为深入的研究。本发明涉及的富锗金针菇多糖尚未见报导。

锗是周期表第IV主族的半金属元素，在地壳中的分布属于典型的稀散元素。虽未被列入人体必需的微量元素行列，但有机锗具有生物活性、药理作用及保健效能，其应用范围已超越了微量元素及人体必需元素的概念。生物活性物质中含有的有机锗即天然有机锗比较安全，无副作用且具疗效，因此，人们把越来越多的目光投向天然有机锗，食药用真菌也越来越受到重视。

据报道锗具有免疫，抗癌，抗高血压，抗衰老等活性，因此近二十年来锗化合物的生物活性日益受到人们的重视，从而推动了微量元素锗生物化学的研究。如今锗是人们注意的抗癌新星，对血管硬化及断发的心、脑血管疾病，胃炎，消化道溃疡，糖尿病，关节炎等都有一定的疗效。

金属离子与生物大分子结合后，常常会发生明显的生物化学效应。本发明的富锗金针菇多糖就是锗与多糖的复合物。集多糖和锗的优点和生物活性于一身，前景广阔。因此我们对其理化性质、化学结构、生物学活性进行了比较广泛的深入研究。

三、发明内容

本发明的目的在于：

提供一种富锗金针菇多糖粗品及两种单一的富锗金针菇多糖FVP1和FVP2，以及它们的提取、纯化方法和它们的用途。

本发明的具体的技术方案如下：

一种富锗金针菇多糖粗品，它是由富锗金针菇菌丝体用水提取，将提取液浓缩，加入氯仿和正丁醇，剧烈振荡，静置分层，水层对流水透析，浓缩透析液，加入乙醇，4℃放置，收集沉淀得到的富锗金针菇多糖的粗品，该富锗金针菇多糖粗品主要含有由葡萄糖组成的、平均分子量为2.58×10⁶的富锗金针菇多糖FVP1，和由葡萄糖组成的、平均分子量为1.89×10⁴的富锗金针菇多糖FVP2。

一种制备上述的富锗金针菇多糖粗品的方法，它是由下列步骤组成：

步骤一.取富锗金针菇菌丝体，以菌丝体50g加水至800---1200ml的比例加水，在70-80℃水浴上提取6---10小时，间歇搅拌，3000r.p.m.离心去沉淀，

步骤二.将提取液浓缩至原体积的1/4～1/5，加入浓缩液1/5体积的氯仿及1/25体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，除去下层有机溶剂层及中间层，保留水层，重复5～6次，所得水溶液对自来水透析72小时，透析液浓缩至浓缩液体积的1/2，逐步加入3倍体积的乙醇，4℃放置4小时，离心得到沉淀，

步骤三.沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得本发明的富锗金针菇多糖粗品。

一种富锗金针菇单一多糖，它是由上述的富锗金针菇多糖粗品经纯化、分离得到的由葡萄糖组成、端基碳为α-构型、以1→4糖苷键为主要连接方式、其中每七个葡萄糖主链通过1→6连接带有1个葡萄糖侧链、平均分子量为2.58×10⁶、比旋光度[α]_D ^t为+83.60°、含锗量为482.19ng/g的富锗金针菇单一多糖FVP1。它不含核酸和蛋白。

一种富锗金针菇单一多糖，它是由上述的富锗金针菇多糖粗品经纯化、分离得到的由葡萄糖组成、端基碳为α-构型、以1→4糖苷键为主要连接方式、其中每七个葡萄糖主链通过1→6连接带有1个葡萄糖侧链、平均分子量为1.98×10⁴、比旋光度[α]_D ^t为+160.19°、含锗量为722.83ng/g的富锗金针菇单一多糖FVP2。它不含核酸和蛋白。

一种由富锗金针菇多糖粗品纯化分离得到富锗金针菇单一多糖FVP1和FVP2的方法，它由下列步骤组成：

步骤一.将上述的富锗金针菇多糖粗品溶解于水，上用蒸馏水平衡好的DEAE-Sephadex A-50离子交换柱，以蒸馏水为洗脱液，分部收集，合并相同组分，冷冻干燥得半精品多糖，

步骤二.将步骤一离子交换柱分离所得的金针菇半精品多糖溶于蒸馏水中，上Sephacryl S-400分子筛柱进行柱层析，以蒸馏水为洗脱液，分部收集，合并相同组分，分别冷冻干燥，得富锗金针菇单一多糖FVP1和FVP2。

上述从富锗金针菇菌丝体提取的、经分离纯化获得高效纯的FVP1多糖和FVP2多糖经本发明人采用凝胶柱层析方法和聚丙烯凝胶电泳方法测定其纯度证明它们是单一的多糖；采用硫酸蒽酮法测定其中总糖的含量，测得粗品总糖含量为925.1μg/mg，半精品多糖总糖含量为982.3μg/mg，FVP1总糖含量为993.3μg/mg，FVP2总糖含量为991.5μg/mg；采用石墨炉原子吸收法测定锗的含量，测得半精品多糖含锗为801.30ng/g、FVP1含锗量为482.19ng/g、FVP2含锗量为722.83ng/g；采用染料结合比色法和紫外扫描测定蛋白含量证明它们不含蛋白。富锗金针菇单一多糖FVP1和FVP2经水解，采用薄层层析和气相色谱分析FVP1和FVP2的单糖组分证明它们由葡萄糖组成。通过过碘酸氧化反应、Smith降解、甲基化反应和NMR分析相邻单糖基间的连接方式，重复结构中单糖的数目，推断FVP1，FVP2均以1→4糖苷键为主要连接方式，其中每七个葡萄糖主链通过1→6连接带有1个葡萄糖侧链。通过比旋测定，测得FVP1具有较高的正性比旋(+83.60°)，表明FVP1的端基碳为α-构型；FVP2具有较高的正性比旋(+160.19°)，表明FVP2的端基碳为。红外光谱、¹H-NMR和¹³C-NMR分析端基碳的构型也为α-构型。

采用MTT法检测FVP对原代小鼠肝细胞活力的影响，表明FVP1，FVP2能显著增加小鼠原代肝细胞的活力。两者中剂量组和低剂量组效果明显，与对照组成极显著性差异(P＜0.01)。FVP1高剂量组与对照组成显著性差异。对SMMC7721的抑制作用试验结果表明，FVP1的半数抑制浓度TC₅₀＝180ug/ml，FVP2的半数抑制浓度TC₅₀＝67ug/ml。用赖氏法检测FVP对四氯化碳损伤的原代小鼠肝细胞ALT活力的影响，实验结果表明FVP1中剂量组和低剂量组和FVP2中剂量组可使培养液中的ALT活性明显低于模型组，具有极显著性差异(p＜0.01)。即ALT明显减少，说明对CCL₄损伤的原代小鼠肝细胞具有保护作用。

因此，上述的富锗金针菇多糖粗品或富锗金针菇单一多糖FVP1或FVP2可以应用于制备保肝、治疗肝炎或抗癌药物。

四、附图说明

图1.FVP多糖的DEAE-SephadexA-50洗脱曲线；

图2.FVP多糖的Sephacryl S-400洗脱曲线；

图3 FVP1的Sephacryl S-400柱层析纯度峰；

图4 FVP2的Sephacryl S-400柱层析纯度峰；

图5 FVP的聚丙稀酰胺凝胶电泳；

图6 糖标准曲线(硫酸蒽酮法)；

图7.FVP1的紫外图谱；

图8.FVP2的紫外图谱；

图9分子量标准曲线；

图10 FVP的薄层层析，其中：F为D-岩藻糖，F1为FVP1，G为D-葡萄糖，F2为FVP2，M为D-甘露糖，L为D-半乳糖，A为D-阿拉伯糖，R为D-鼠李糖；

图11NaIO₄标准曲线；

图12 FVP1的红外光谱；

图13 FVP2的红外光谱；

图14 FVP对SMMC7721生长抑制曲线；

五、具体实施方式

实施例1富锗金针菇多糖粗品的制备

1.称取富锗金针菇菌丝体(由江苏神华药业有限公司购得，下同)50g，补足水至1000ml，70～80℃水浴提取8小时。间歇搅拌，3000r.p.m.离心去沉淀。提取液浓缩至200ml，加入浓缩液1/5体积的氯仿及1/25体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，除去下层有机溶剂层及中间层，保留水层。反复萃取6次。所得水溶液对自来水透析72小时。透析液浓缩至100ml，逐步加入3倍量乙醇，4℃放置4小时。离心，沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得多糖粗品。

2.称取富锗金针菇菌丝体50g，补足水至800ml，70～80℃水浴提取10小时。间歇搅拌，3000r.p.m.离心去沉淀。提取液浓缩至200ml，加入浓缩液1/5体积的氯仿及1/25体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，除去下层有机溶剂层及中间层，保留水层。反复萃取6次。所得水溶液对自来水透析72小时。透析液浓缩至100ml，逐步加入3倍量乙醇，4℃放置4小时。离心，沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得多糖粗品。

3.称取富锗金针菇菌丝体50g，补足水至1200ml，70～80℃水浴提取6小时。间歇搅拌，3000r.p.m.离心去沉淀。提取液浓缩至200ml，加入浓缩液1/5体积的氯仿及1/25体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，除去下层有机溶剂层及中间层，保留水层。反复萃取6次。所得水溶液对自来水透析72小时。透析液浓缩至100ml，逐步加入3倍量乙醇，4℃放置4小时。离心，沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得多糖粗品。

实施例2富锗金针菇多糖精品FVP1，FVP2分离纯化的方法

步骤一.取粗品300mg，充分溶解于9ml蒸馏水中，上用蒸馏水平衡好的DEAE-Sephadex A-50离子交换柱，柱规格为2×44cm，以蒸馏水为洗脱液。分部收集，用硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分，冷冻干燥得半精品多糖。洗脱曲线如图1。

步骤二.将离子交换柱分离所得金针菇半精品多糖组分50mg溶于3ml蒸馏水中，上Sephacryl S-400分子筛柱层析，柱规格为1.5×65cm，以蒸馏水为洗脱液，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分。冷冻干燥得精品多糖FVP1、FVP2。洗脱曲线如图2。

实施例3 FVP多糖纯度的鉴定

1.凝胶柱层析纯度鉴定：分别取分离纯化所得的FVP1、FVP2溶液1.5ml，样品浓度为2mg/ml，分别上Sephacryl S-400层析柱，规格为1.0cm×100cm，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分，计算洗脱体积。FVP洗脱曲线为单一对称峰，证明为单一组分，洗脱体积为35.4ml。洗脱曲线如图3

FVP2洗脱曲线为单一对称峰，证明为单一组分，洗脱体积为71.9ml。洗脱曲线如图4

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯度鉴定：凝胶浓度为6％，缓冲液为0.025MpH9.0的硼砂液，样品为2mg/ml，每管进样20μl，电压为110V，每管电流量约2mA，电泳5小时，电泳结束后进行染色。先将凝胶置于基础液中固定2小时，然后放入氧化液中氧化1小时，再置于还原液中还原1小时，最后用阿利新蓝染色液浸泡2小时以上，染色完毕放入基础液中至背景退清。

基础液：20mg麝香草酚溶于75ml3％醋酸和25ml无水乙醇中

氧化液：0.5g高碘酸溶于100ml3％醋酸中(使用前配制)

还原液：0.5g偏重亚硫酸钠溶于100ml3％醋酸中(使用前配制)

阿利新蓝染色液：0.5g阿利新蓝溶于100ml基础液中

加样缓冲液配制：0.1％溴酚蓝  10％甘油  0.2M硼砂

结果如图5：电泳显示单一斑点，故可初步判定FVP1，FVP2均为单一组分。

实施例4 FVP多糖中总糖含量的测定

总糖含量的测定：精确配置100μg/mL的标准葡萄糖溶液，分别吸取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL标准溶液置带塞试管中，补足蒸馏水至1mL，加入2mg/mL蒽酮试剂4ml，混匀，沸水浴煮10min。冷却后测定波长为620nm处的吸光度。以“0”管作空白对照，以吸光度对葡萄糖浓度作图得标准曲线(见图6)。取粗品多糖，半精品多糖，FVP1，FVP2多糖分别配成1mg/mL的溶液，吸取0.1mL，补足蒸馏水至1mL，其余操作同标准曲线的制备，再由回归方程算出相应浓度。

由实验可得粗品总糖含量为925.1μg/mL，半精品多糖总糖含量为982.3μg/mL，FVP1总糖含量为993.3μg/mL，FVP2总糖含量为991.5μg/mL。

实施例5 FVP多糖蛋白含量的测定

1.染料结合比色法测定蛋白含量—考马斯亮蓝G250

称取金针菇多糖FVP1，FVP2各2mg溶解于1ml蒸馏水中，准确吸取溶液各0.5ml于干燥烧杯中，溶液浓度为2mg/ml，加入CBG试剂50ml摇匀，室温静置3分钟，以蒸馏水作平行实验调零点，在波长595nm处比色。

CBG试剂的配制：称CBG100mg溶于50ml95％的乙醇，加蒸馏水约800ml，再加85％磷酸100ml，最后补足水至1000ml。

经实验测的分离纯化所得精品多糖FVP1、FVP2均不含蛋白质。

2.FVP多糖紫外光谱分析

由紫外图谱(图7，图8)可知，FVP1，FVP2在波长260、280nm处无明显吸收峰，说明几乎不含核酸和蛋白。

实施例6石墨炉原子吸收法测定富锗金针菇多糖中的痕量锗

1.仪器和试剂：岛津AA6800原子吸收分光光度计，锗空心阴极灯，热解石墨管，MARS5微波消解仪，Ni(NO₃)₂(国产)

2.锗的标准液的配置：纯水三次重蒸，准确称取GeO₂ 69.8mg，溶于1000ml水中，加入适量的KOH促溶，相当于Ge 48.4mg/L，备用。Ni(NO₃)₂溶液：用1％HNO₃配制，浓度10mg/ml

3.锗标准曲线：

锗标准使用液：取锗标准液1ml，稀释至100ml，进行倍比稀释，配置成484μg/L、242μg/L、121μg/L、60.5μg/L标准液。分别取上述溶液1ml，加入1ml的Ni(NO₃)₂，并用无离子水稀释至10ml，配置成48.4ng/ml、24.2ng/ml、12.1ng/ml、6.05ng/ml的标准液，待测。

4.样品的预处理

样品的处理：称取粗品50.0mg，为UNK1-AV。

            称取FVP1 44.6mg，为UNK2-AV。

称取FVP2 60.0mg，为UNK3-AV。

将样品1、2、3置于高压罐中，加5毫升HNO₃，再加入1毫升过氧化氢，于150度的微波消解仪中消解0.5小时，冷却后用水反复冲洗样品液于烧杯中，微热蒸干，最后加入0.5ml的Ni(NO₃)₂溶液，定容至5ml。

5.测定

仪器工作条件：锗：灯电流10Ma，下缝0.2，波长265.2nm，进样10微升

石墨炉的升温程序

步骤	温度(℃)	时间  (s)
			干燥	80～120	27
灰化	1100	27
			原子化	2900	10
清洗	3000	3

结果见表1，经测定样品含锗分别为半精品多糖8.0130ng/ml，FVP1为4.3011ng/ml，FVP2为8.6740ng/ml。相当于半精品多糖含锗为801.30ng/g、FVP1含锗为482.19ng/g、FVP2含锗为722.83ng/g。

实施例7 FVP多糖分子量的测定

采用凝胶过滤法，依次从蓝色葡聚糖及标准分子量多糖Dextran T-10，T-40，T-70，T-500相继上Sephacryl S-400层析柱，规格为1.0cm×100cm。测外水体积Ve及标准分子量多糖洗脱体积Vt，按Vt/Ve与分子量对数关系作图，绘制标准曲线(见图9)。样品洗脱体积与标准曲线对照，确定分子量。

FVP1的洗脱体积为35.4ml，Ve/Vo＝0.95418，由标准曲线得，平均分子量为2.58×10⁶道尔顿。FVP2的洗脱体积为71.9ml，Ve/Vo＝1.938，由标准曲线得，平均分子量为1.89×10⁴道尔顿。

实施例8 FVP多糖薄层层析(TLC)分析单糖组分

称取FVP1，FVP2各5mg，置于干净的安瓿中，加入2mol/l三氟乙酸2ml，封管。100℃水解8小时后，将三氟乙酸蒸干，用甲醇洗4-5次后，用蒸馏水溶解，备用。精密称取D-葡萄糖，D-甘露糖，D-鼠李糖，D-阿拉伯糖，D-半乳糖，D-岩藻糖各20mg，分别溶于1ml蒸馏水中。量取0.75％CMC-Na溶液(配好放置一周后用)16ml于研钵中，分次加入6g硅胶G，研磨均匀后均匀涂铺在干净的玻璃板上(10×20cm)。静置晾干，使用前在105℃活化1小时。将酸水解多糖样品和标准单糖样品用毛细管点样。按正丁醇∶乙酸乙酯∶异丙醇∶水＝7∶4∶7∶2配成展开剂置于层析缸中，放入已活化、点好样的板，饱和10分钟后，上行展开。展开完毕后，取出，以苯胺-邻苯二甲酸溶液为显色剂显色后，于110℃加热10min。

FVP1，FVP2完全酸水解后进行薄层层析，结果显示清晰的葡萄糖斑点(见图10)。

实施例9 FVP多糖的糖醇乙酰化衍生物的气相分析

称取金针菇多糖FVP1，FVP2各10mg加2mol/L的三氟乙酸，于安瓿中封口，于100℃水解8h，水解产物于蒸发皿中蒸干后加入甲醇5-6次反复蒸干后溶于2ml水中，加入5mg硼氢化钠还原，3mg内标物肌醇，充分溶解后，65℃放置30min，水解液减压蒸干。然后加少量强酸型离子交换树脂732H⁺搅拌数分钟后，检查溶液呈酸性时过滤，树脂用少量水反复洗3次，合并滤液在水浴上蒸干，所得残余物加3ml甲醇溶解并蒸干，反复4次以上以除去硼化物，最后使还原产物于小安瓿管中彻底干燥。在上述还原产物中加入醋酐和无水吡啶各0.3ml，封口，于100℃水浴乙酰化20min，冷却，转移至蒸发皿中，加入0.5ml水，浓缩后反复加水2-3次直至蒸干，残渣用1ml三氯甲烷提取，提取液用1ml水洗，三氯甲烷溶液减压蒸干后，再用0.2ml三氯甲烷重溶。标准单糖(D-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖)按相同方法处理。

气相条件为：惠普6890气相色谱仪，HP-55％苯甲基硅烷毛细管柱(30.0cm×0.25mm×0.25μm)。分流-不分流进样口，进样口温度260℃。程序升温110℃至190℃，3℃/min；190℃至206℃，2℃/min；206℃至280℃，20℃/min，保留2min。FID检测器，载气为N₂，流速25.0ml/min，检测器温度300℃。

FVP1，FVP2酸水解产物的还原乙酰化产物进行气相色谱分析，都仅出现一个单峰，与标准单糖的保留时间对比，可认为FVP1，FVP2均由葡萄糖组成(见表2)。

实施例10过碘酸氧化与Smith降解

将NaIO₄配成15mmol/L溶液，稀释250倍，再稀释成10个不同浓度，于波长223nm处测吸收值，作标准曲线(见图11)。

精确称取多糖FVP1，FVP2各10mg，加10ml NaIO₄置4℃暗处，间或振摇，间隔时间取样，稀释250倍，在波长223nm处测吸收值，直至数值不再下降为止。由标准曲线查出NaIO₄消耗量。反应终止后，以标定的0.01mol/L NaOH测定甲酸释放量。

FVP1，FVP2经15mM高碘酸完全氧化后，加入适量乙二醇搅拌30min以还原剩余的高碘酸。装入透析袋，对流水透析48h，蒸馏水透析12h，于70-80℃减压浓缩至最小体积，用NaBH₄于室温暗处还原12h，用0.1mol/L乙酸调节至pH5.5，以分解剩余的硼氢化物，对蒸馏水透析24h后冷冻干燥。

将所得的多糖醇用2mol/L的三氟乙酸于100℃水解8h，水解液减压蒸干，乙酰化后进行气相分析。

根据实验结果，FVP1，FVP2经高碘酸氧化，经132h均可反应完全，高碘酸的消耗达到稳定。测得每mol FVP1消耗1.102mol高碘酸量并有0.154mol甲酸生成；每mol FVP2消耗1.132mol高碘酸量并有0.11mol甲酸生成。结合Smith降解产物经气相色谱分析，主要产物为赤藓醇，有少量甘油。推断FVP1，FVP2均以1→4糖苷键为主要连接方式，其中每七个葡萄糖主链通过1→6连接带有1个葡萄糖侧链。

实施例11甲基化分析

分别称取20mg彻底干燥的FVP1，FVP2，溶于10ml无水二甲亚砜(DMSO)充氮气封管，超声波振荡10分钟，加入200mg精细研磨的NaOH，充氮气密封，超声波振荡90min，放置90min，逐滴加入CH₃I 6ml，超声波振荡30min，放置30min。减压蒸馏除去剩余的CH₃I，加1ml H₂O和1ml CHCl₃，振荡，静置使分层，弃去水层，取有机层，用水(3×3ml)洗涤至中性，弃水层，CHCl₃层加无水Na₂SO₄干燥过夜，过滤，减压蒸干。全甲基样品加2ml 90％(v/v)的甲酸，于安瓿中封口，于100℃水解6h，减压蒸干后，再加入3ml浓度为2mol/ml的三氟乙酸，安瓿中封口，于100℃水解6h，产物于蒸发皿中蒸干后加入甲醇5-6次反复蒸干后溶于2ml水中，加入5mg硼氢化钠还原，3mg内标物肌醇，充分溶解后，65℃放置30min，水解液减压蒸干。然后加少量强酸型离子交换树脂732H⁺搅拌数分钟后，检查溶液呈酸性时过滤，树脂用少量水反复洗3次，合并滤液在水浴上蒸干，所得残余物加3ml甲醇溶解并蒸干，反复4次以上以除去硼化物，最后使还原产物于小安瓿管中彻底干燥。在上述产物中加入醋酐和无水吡啶各0.3ml，封口，于100℃水浴乙酰化20min，冷却，转移至蒸发皿中，加入0.5ml水，浓缩后反复加水2-3次直至蒸干，残渣用1ml三氯甲烷提取，提取液用1ml水洗，三氯甲烷溶液减压蒸干后，再用0.2ml三氯甲烷重溶，进行GC和GC-MS分析。

根据GC保留时间(t_R)及MS主要碎片(m/z)，显示反应产物中有1，4，5-三乙酰基-2，3，6-三甲基葡萄糖，1，5-二乙酰基-2，3，4，6-四甲基葡萄糖及1，4，5，6-四乙酰基-2，3-二甲基葡萄糖，其摩尔比为6∶1∶1。表明1→4连接葡萄糖构成了多糖的基本骨架，7个葡萄糖残基有一个6-0位上分支(见表3)。

实施例12比旋测定

将FVP1，FVP2干燥失重后，精密称取25mg，定容至25ml，用旋光仪测定旋光度，由公式[α]_D ^t＝α/1c计算比旋。[α：旋光度；L：玻管长度(dm)；c：溶液浓度(g/ml)]

经测定和计算，FVP1具有较高的正性比旋(+83.60°)，表明FVP1和端基碳为α-构型。FVP2具有较高的正性比旋(+160.19°)，表明FVP2的端基碳为α-构型。

实施例13红外光谱分析

FVP1，FVP2经干燥后称取1mg样，用溴化钾压片法在Nicolet-170X型红外光谱仪上于4000-400cm区间扫描。

FVP1的红外光谱图如图12所示。在3600-3200cm^-1出现一种宽峰，是O-H的伸缩振动。在3000-2800cm^-1的一组峰是糖类C-H伸缩振动，1400-1200cm^-1的一些峰是C-H的变角振动。这两组峰是糖类化合物的特征吸收。1000-1200cm^-1间的吸收峰是由C-O的伸缩振动所引起。935cm^-1的吸收是由D-葡萄吡喃环的非对称环伸缩振动所引起。854cm^-1的吸收是α-端基差向异构的的C-H变角振动的特征吸收，表明FVP1的端基碳为α-构型。773cm^-1的吸收是由D-葡萄吡喃环的对称环伸缩振动所引起。

FVP2的红外光谱图如图13所示。在3600-3200cm^-1出现一种宽峰，是O-H的伸缩振动。在3000-2800cm^-1的一组峰是糖类C-H伸缩振动，1400-1200cm^-1的一些峰是C-H的变角振动。这两组峰是糖类化合物的特征吸收。1000-1200cm^-1间的吸收峰是由C-O的伸缩振动所引起。929cm^-1的吸收是由D-葡萄吡喃环的非对称环伸缩振动所引起。853cm^-1的吸收是α-端基差向异构的的C-H变角振动的特征吸收，表明FVP2的端基碳为α-构型。764cm^-1的吸收是由D-葡萄吡喃环的对称环伸缩振动所引起。

实施例14 ¹H-NMR，¹³C-NMR分析

取纯化的FVP1，FVP2各15mg，溶于氘代水(D₂O)，60℃于Varian 500兆核磁共振仪上进行分析。

从¹H-NMR图谱可以看出FVP1 C-1上的质子信号在δ 5.3756ppm，FVP2 C-1上的质子信号在δ5.4035ppm，¹³C-NMR中FVP1在δ102.4230ppm，FVP2在δ102.3985ppm的共振信号可进一步说明FVP1，FVP2的糖苷键构型为α-构型。另外在¹³C-NMR中FVP1δ74.1950，76.1877，79.7941，74.0116，63.3390ppm和FVP2δ74.3172，75.5031，79.7452，74.0116，63.3146ppm与文献对比应分别是C-2，C-3，C-4，C-5及C-6的信号(见表4)。通过以上数据可验证FVP1，FVP2的结构均是α-构型，以1→4糖苷键为主要连接方式。

实施例15多糖活性的研究

1.原代小鼠肝细胞的制备

用二步灌流法分离小鼠肝细胞。将小鼠用20mg/ml乌拉坦(2mg/10g)ip麻醉。用酒精棉球消毒小鼠表面后，用针头将其固定在手术台上，再次用酒精棉球消毒其腹部。打开腹腔，门静脉插管并固定。剪断下腔静脉，用37℃水浴预热的D-Hanks液以6ml/min的速度预灌流肝脏。10min后换37℃水浴预热的0.05％胶原酶溶液以3ml/min的速度灌流肝脏。10min后，取下肝脏置培养皿中，冲洗2～3次，然后轻轻撕开肝包膜。将肝细胞散落于1640培养基中，用200目不锈钢滤网过滤，500rpm，离心1min，弃上清，重复2次，以进行纯化。纯化后肝细胞用1640完全培养液重悬，即为肝细胞悬液。然后以台盼蓝排除实验检测肝细胞的存活率，存活率大于80％即可用于以下实验。

2.MTT法检测FVP对原代小鼠肝细胞活力的影响

将分离得到的原代小鼠肝细胞以1.5×10⁵个/ml的密度接种于96孔板，每孔200ul。置于37℃5％CO₂和饱和水蒸气的CO₂培养箱内预培养，2h后药物孔加入不同浓度的FVP1，FVP2保护，使其终浓度为25、50、100、200、400ug/ml；同时设空白对照组和HGF(促肝细胞生成素)阳性对照组，HGF终浓度为200ug/ml。每组均设5个复孔。CO₂培养箱内培养2h后，吸去100ul上清，加入5mg/ml的MTT 20ul。CO₂培养箱内培养6h后吸走上清，加入DMSO 100ul。10min后，以调零孔调零，在酶标仪上测定各孔OD₅₇₀值。结果如表5所示。

由表5可得FVP1，FVP2能显著增加小鼠原代肝细胞的活力。两者中剂量组和低剂量组效果明显，与对照组成极显著性差异(P＜0.01)。FVP1高剂量组与对照组成显著性差异，FVP2高剂量组效果不明显。阳性对照HGF提高原代大鼠肝细胞活力的作用也极显著(P＜0.01)。

3.FVP对四氯化碳损伤的原代小鼠肝细胞ALT活力的影响

用二步灌流法制备小鼠原代肝细胞，以5×10⁴个/ml的密度接种于96孔板，置于37℃，5％CO₂和饱和水蒸气的CO₂培养箱内培养内预培养2h。然后加入不同浓度的FVP1，FVP2，使其终浓度为25、50、100、200、400ug/ml同时设空白对照组和HGF对照组(200ug/ml)。1h后加入CCl₄，使其终浓度为10mmol/L，继续培养2h后，测定培养液中ALT活性。结果如表6所示。

实验结果表明FVP1中剂量组和低剂量组和FVP2中剂量组可使培养液中的ALT活性明显低于模型组，具有极显著性差异(p＜0.01)。即ALT明显减少，说明对CCL₄损伤的原代小鼠肝细胞具有保护作用。阳性对照HGF对CCL₄损伤的原代小鼠肝细胞的保护作用也极显著(p＜0.01)。

 4.FVP对SMMC7721的抑制作用

将SMMC7721细胞株以2.5×10⁵个/ml的密度接种于96孔板，加入不同浓度的FVP1，FVP2，使其终浓度为25、50、100、200、400ug/ml，同时设空白对照组和HGF对照组(200ug/ml)，每组均设5个复孔，置于37℃5％CO₂和饱和水蒸气的CO₂培养箱内培养25h，。然后吸去100ul上清，加入5mg/ml的MTT20ul。CO₂培养箱内培养6h后吸走上清，加入DMSO 100ul。10min后，以调零孔调零，在酶标仪上测定各孔OD₅₇₀值。并按下式计算细胞生长抑制率(IR)和半数抑制浓度TC₅₀。(见表7，图14)

 IR(％)＝(1-A实验组/A对照组)×100％

由图可得：FVP1的半数抑制浓度TC₅₀＝180ug/ml

          FVP2的半数抑制浓度TC₅₀＝67ug/ml

                              表1 石墨炉原子吸收法测定锗

Action	Sample ID	True Value(ng/mL)	Conc.(ng/mL)	Abs	Pos	VOL	％RSD
								BLK-AV				0.0099	R1	10	1.4285
STD-AV	STD1	6.0500		0.0280	1	10	9.4589
								STD-AV	STD2	12.1000		0.1538	2	10	14.1118
STD-AV	STD3	24.2000		0.5078	3	10	13.5135
								STD-AV	STD4	48.4000		0.8029	4	10	18.1881
UNK1-AV	001		8.0130	0.1211	5	10	20.6829
								UNK2-AV	002		4.3011	0.0554	6	10	19.3578
UNK3-AV	003		8.6740	0.1328	7	10	18.3659

标准曲线是：y＝-0.02073+0.01770x  r＝0.98191704  s＝0.07537717

    表2 FVP1，FVP2气相分析

Retention time(min)Sugar26.722  27.133 37.614  38.180  38.384D-rhamnose    +D-fucose             +D-mannose                    +D-glucose                           +D-galactose                                 +FVP1                              +FVP2                              +

                            表3 FVP GC和GC-MS甲基化数据

MolarMethylated sugar                   MS main fragments(m/z)                       Linkagesratios2，3，4，6-Tetra-O-Me-Glc   1    43，45，71，87，101，117，129，145，161，205     G1c-(1→2，3，6-Tri-O-Me-Glc        6    43，45，87，99，101，113，117，233            →4)-Glc-(1→2，3-Di-O-Me-Glc            1    43，101，117，261                          →4，6)-Glc-(1→

                        表4 FVP1，FVP2 ¹³C-NMR数据

糖                         化学位移(ppm)C-1      C-2        C-3        C-4        C-5        C-6FVP1    102.4230  74.1950    76.1877    79.7941    74.0116    63.3390FVP2    102.3985  74.3172    75.5031    79.7452    74.0116    63.3146

表5 MTT法检测FVP对原代小鼠肝细胞活力的影响(n＝5 x±s)

    Group              Dosage(ug/ml)     OD₅₇₀

    Control                              0.068±0.008

    FVP1                   400           0.082±0.013^△

                           200           0.182±0.022^▲

                           100           0.176±0.011^▲

                           50            0.154±0.018^▲

                           25            0.108±0.013^▲

    FVP2                   400           0.086±0.015

                           200           0.158±0.013^▲

                           100           0.146±0.011^▲

                           50            0.120±0.016^▲

                           25            0.100±0.016^▲

    HGF                    200           0.306±0.033^▲

^△P＜0.05vs control  ^▲P＜0.01vs control

表6 FVP对四氯化碳损伤的原代小鼠肝细胞ALT活力的影响.(n＝5 x±s)

     Group      Dosage(ug/ml)    OD₅₀₅           ALT_{(caL’s unit)}

     Control                     0.044±0.002      12.18±0.78

     Model                       0.083±0.003      25.86±1.00^▲▲

     FVP1           400          0.079±0.002      24.32±0.67

                    200          0.052±0.003      15.04±1.14^▲

                    100          0.061±0.005      17.97±1.59^▲

                    50           0.069±0.004      20.83±1.29^▲

                    25           0.073±0.004      22.16±1.27^▲

     FVP2           400          0.082±0.004      25.58±1.34

                    200          0.059±0.004      17.55±1.53^▲

                    100          0.063±0.002      18.67±0.84^▲

                    50           0.074±0.002      22.51±0.80^△

                    25           0.080±0.003      24.60±1.12

      HGF           200          0.062±0.002      18.46±0.78^▲

^△P＜0.05vs model  ^▲P＜0.01vs model  ^▲▲P＜0.01vs control

表7 FVP对SMMC7721的抑制作用  n＝5 x±s

     Group           Dosage(ug/ml)      OD₅₇₀          IR(％)

     Control                            0.880±0.012

     FVP1                400            0.320±0.019    63.60

                         200            0.400±0.022    54.50

                         100            0.560±0.029    36.40

                         50             0.620±0.019    29.50

                         25             0.740±0.024    16.00

     FVP2                400            0.170±0.016    80.70

                         200            0.230±0.022    73.90

                         100            0.310±0.016    64.80

                         50             0.510±0.012    42.00

                         25             0.670±0.019    23.90

     HGF                 200            0.120±0.016    86.40

Claims (6)

1.一种富锗金针菇多糖粗品，其特征是：它是由富锗金针菇菌丝体用水提取，将提取液浓缩，加入氯仿和正丁醇，剧烈振荡，静置分层，水层对流水透析，浓缩透析液，加入乙醇，4℃放置，收集沉淀得到的富锗金针菇多糖的粗品，该富锗金针菇多糖粗品主要含有由葡萄糖组成的、平均分子量为2.58×10⁶的富锗金针菇多糖FVP1，和由葡萄糖组成的、平均分子量为1.89×10⁴的富锗金针菇多糖FVP2。

2.一种制备权利要求1所述的富锗金针菇多糖粗品的方法，其特征是由下列步骤组成：

步骤一.取富锗金针菇菌丝体，以菌丝体50g加水至800---1200ml，的比例加水，在70-80℃水浴上提取6--10小时，间歇搅拌，3000r.p.m.离心去沉淀，

步骤二.将提取液浓缩至原体积的1/4～1/5，加入浓缩液1/5体积的氯仿及1/25体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，除去下层有机溶剂层及中间层，保留水层，重复5～6次，所得水溶液对自来水透析72小时，透析液浓缩至浓缩液体积的1/2，逐步加入3倍体积的乙醇，4℃放置4小时，离心得到沉淀，

步骤三.沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得本发明的富锗金针菇多糖粗品。

3.一种富锗金针菇单一多糖FVP1，其特征是：它是由权利要求1所述的富锗金针菇多糖粗品经纯化、分离得到的由葡萄糖组成、端基碳为α-构型、以1→4糖苷键为主要连接方式、其中每七个葡萄糖主链通过1→6连接带有1个葡萄糖侧链、平均分子量为2.58×10⁶、比旋光度[α]_D ^t为+83.60°、含锗量为482.19ng/g的富锗金针菇单一多糖FVP1。

4.一种富锗金针菇单一多糖FVP2，其特征是：它是由权利要求1所述的富锗金针菇多糖粗品经纯化、分离得到的由葡萄糖组成、端基碳为α-构型、以1→4糖苷键为主要连接方式、其中每七个葡萄糖主链通过1→6连接带有1个葡萄糖侧链、平均分子量为1.98×10⁴、比旋光度[α]_D ^t为+160.19°、含锗量为722.83ng/g的富锗金针菇单一多糖FVP2。

5.一种权利要求3或4所述的富锗金针菇单一多糖FVP1和FVP2的制备方法，其特征是它由下列步骤组成：

步骤一.将上述的富锗金针菇多糖粗品溶解于水，上用蒸馏水平衡好的DEAE-Sephadex A-50离子交换柱，以蒸馏水为洗脱液，分部收集，合并相同组分，冷冻干燥得半精品多糖，

步骤二.将步骤一离子交换柱分离所得的金针菇半精品多糖溶于蒸馏水中，上Sephacryl S-400分子筛柱进行柱层析，以蒸馏水为洗脱液，分部收集，合并相同组分，分别冷冻干燥，得富锗金针菇单一多糖FVP1和FVP2。

6.富锗金针菇多糖粗品或富锗金针菇单一多糖FVP1或FVP2在制备保肝、治疗肝炎或抗癌药物中的应用。

Images