CN108752497A - 巴戟天水提物、寡糖和多糖制备，及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种巴戟天水提物、粗多糖、寡糖和多糖组分，及其制备方法、用途。其优点在于：从巴戟天根中通过水浸提的方式提取得到巴戟天水提物和粗多糖，进而将粗多糖分离得到其中的寡糖和多糖组分，并进行了性质测定。实验表明本发明的巴戟天水提物和粗多糖均能促进小鼠脾脏细胞增殖和细胞因子分泌，促进人肝细胞的增殖和降低毒剂对细胞的损伤，能抑制乙肝表面抗原和核心抗原的表达，抑制肝癌细胞的增殖以及抑制ConA对小鼠肝脏和肾脏的造成的损伤，生物活性显著优于其他方法制得的巴戟天寡糖、多糖或巴戟天多糖组分，具备开发成免疫调节剂、抗肝损伤和抗肿瘤药物或保健食品的前景。制备步骤简单，制备过程对环境污染小，适于工业生产。

Description

巴戟天水提物、寡糖和多糖制备，及其应用
技术领域
本发明属于中药学、肝病学和免疫学技术领域，涉及巴戟天寡糖、粗多糖和多糖组分， 其制备方法及用途。具体地，本发明还涉及一种药物组合物以及所述巴戟天水提物、寡糖 和多糖用于制备保肝和免疫调节之用途。
背景技术
巴戟天是我国著名的四大南药之一，来源于茜草科巴戟天属(Morindaofficinalis How)的 干燥根，分布于广东、福建、广西、海南等省区的热带和亚热带地区。巴戟天具有补肾阳、 强筋骨、祛风湿之功效，被誉为“补肾阳之要药”。巴戟天主要有环烯醚萜类、蒽醌化合物、 糖类、有机酸类以及微量元素等。药理实验证明，巴戟天除具有补肾壮阳、祛风湿等作用 外，还具有抗抑郁、抗炎、镇痛、抗氧化、抗衰老和免疫调节等多种生理作用【王欣，等.中 国食品添加剂，2007,(6)：92-95.】。
一、寡糖和多糖的化学研究
巴戟天药材中含有较多的寡糖和多糖。崔承彬等从生巴戟天药材中分离得到4个寡糖 成分，分别是耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、菊淀粉(2→1)-果呋喃糖基蔗糖的六聚糖和 七聚糖【崔承彬，等.中国药物化学杂志，1995，5(1)：32-39】。杨振民等将巴戟天根粉碎后在70℃条件下加入20倍水浸提1.5小时，然后过滤、浓缩，在加入4倍体积乙醇醇沉 过夜。沉淀部分水溶解后，采用Sevag试剂脱蛋白和双氧水脱色后，再加入4倍乙醇醇沉 过夜。沉淀用无水乙醇洗涤，获得粗多糖(MOHP)。MOHP采用DEAE-Sepharose FF柱层 析获得MOHP-1，MOHP-2和MOHP-3多糖组分。MOHP-1采用Sephadex G-10进一步纯化， 获得分子量均一多糖MOHP-1。MOHP-1分子量为2536Da，是由果糖以(2→1)糖苷键连接 的菊淀粉性多糖，其结构为α-D-葡萄糖(1→2)-[β-D-果糖-(2→1)-β-D-果糖]n-(2→1)-β-D- 果糖【杨振民，等.天然产物研究与开发，2011，23：1-5,24.】。冯峰等采用60％乙醇回流提 取巴戟天，提取液经过HP-20大孔树脂分离，得到水洗脱部位。水洗部位在经过1号微晶 纤维素和薄层层析硅胶柱(H)柱层析，分离出6个寡糖，分别为蔗糖(I)、耐斯糖(II)、 菊粉六糖(III)、β-D-果吡喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖(IV)、β-D-果吡 喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖(V)、β-D-果吡喃糖 -(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖 (VI)【中药材，2012，35(8)：1259-1262】。
何传波等将巴戟天粉碎，经乙醚回流脱酯后，采用60℃热水浸提获得浸提液，在减压 浓缩后加入5倍体积的95％醇沉过夜。沉淀加蒸馏水溶解，加入Sevage试剂脱蛋白、浓缩、冷冻干燥获得巴戟天粗多糖样品(MOHP)。MOHP经过DEAE-Sepharose CL-6B柱将 离子交换柱和SephadexG100凝胶柱层析，得到了MOHP-I,MOHP-II,MOHP-III和MOHP-IV 四个多糖组分。MOHP-I由葡萄糖和果糖组成，分子质量约为2ku，呋喃糖环结构；MOHP-III 是一种糖蛋白，糖部分阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖以及半乳糖组成，分子质量约为35ku。 【何传波，等.华南理工大学学报(自然科学版)，2005，33(12)：29-33.】Zhang HL等将 巴戟天先用95％乙醇回流后，残渣煎煮3次。煎煮液浓缩，加入乙醇醇沉，再Sevag法脱 蛋白和活性炭脱色，继而冷冻干燥获得粗多糖MP。MP经DEAE-Sepharose CL-6B柱层析， 水、0.1和0.3mol/LNaCl洗脱，获得MPA,MPB和MPC三个组分。MPA经Sephadex G-75 柱层析纯化，获得均一多糖MP-1。MP-1是一种果聚糖，2→1连接方式，葡萄糖和果糖的 摩尔比为1:21。MPB和MPC经Sephadex G-100柱层析得到二个酸性多糖MP-2和MP-3。 【Zhang HL,et al.Inter JBiolMacromol,2009,44:257-261】。何传波等将巴戟天经热水浸提、 Sevag法除蛋白、乙醇沉淀和DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱层析，得到一种水溶性的 巴戟天多糖MOPI-3.MOPI-3分子量为36061，是一种由阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖组成的 杂多糖，以α-1,3-吡喃葡萄糖和α-1,4-吡喃半乳糖为主链，平均每5个葡萄糖连接一个半 乳糖，每个重复单元具有一个支链，支链由3个呋喃阿拉伯糖以α-1,3-键型组成，连接在 主链葡萄糖的6位碳上，MOPI-3含有乙酰基，连接在主链半乳糖的2位碳原子。该多糖的 主要重复结构【何传波，等.高等学校化学学报，2009，30(12)：2391-2395】。
二、寡糖和多糖生物活性研究
1.抗抑郁
刘建金在75℃条件下加入水提取巴戟天(W药材∶W水＝1：25)，再加热浓缩后，加入95％ 乙醇(W∶W＝1∶4)，静置于冰箱中12h，离心得巴戟天多聚糖，经膜过滤、去蛋白、冰 冻干燥，得巴戟天多糖。采用T迷宫法研究巴戟天多聚糖抗抑郁作用。结果表明巴戟天多 糖干预组T迷宫错误次数、海马区神经元数目和血清MDA水平均低于模型组和高于对照 组，血清SOD水平高于模型组及对照组。提示巴戟天多糖能够减轻抑郁症大鼠体内氧化 应激反应，减轻海马区神经元损伤，改善实验性抑郁症大鼠认知行为障碍【刘建金.中国现 代医生，2011，49(16)：1-3】。张中启等采用小鼠强迫性游泳和获得性无助抑郁模型研究 巴戟天寡糖(MOs)的抗抑郁作用。MOs含4聚糖8.27％,5聚糖6.10％,6聚糖13.09％和7 聚糖45.38％；第2批(9905)含4聚糖13.60％,5聚糖7.74％,6聚糖12.87％和7聚糖30.96％；第 3批(9906)含4聚糖12.17％,5聚糖7.68％,6聚糖11.74％和7聚糖31.57％(未提及制备方法 和寡糖理化性质)。在大鼠获得性无助抑郁模型，MOs 60～100mg/kg-1(ip,每天2次，连续8 次)显著减少大鼠的逃避失败次数，60mg/kg-1还明显减少逃避失败动物数【张中启，等.中 国药理与毒理学杂志，2001,15(4)：262-265】。邹连勇等研究巴戟天寡糖(北京同仁堂股 份有限公司提供，寡糖含量占55.9％，未提及具体制备方法和性质)对海马神经细胞再生及 神经元生长的影响。结果表明巴戟天寡糖50mg/kg能显著促进成年小鼠海马神经细胞的再 生，10mg/mL能增加原代培养的海马神经元树突及分支数目(P＜0.05)【邹连勇，等.中国 新药杂志，2012，21(22)：2623-2626】。
2.抗骨质疏松
刘亦恒等将巴戟天水煎煮、3倍乙醇醇沉、水复溶、Sevga法脱蛋白、活性炭脱色，再经无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤，滤过。用蒸馏水溶解沉淀物，用无水乙醇加至其浓度为85％，得巴戟天多糖。研究该多糖对去卵巢大鼠骨质疏松症的影响。结果表明巴戟天多糖(100mg/kg)给予模型大鼠3个月，能显著提高去卵巢大鼠的骨密度、骨矿物质、1,25一 二羟基维生素D及骨钙素的含量【刘亦恒，等.海南医学，2014，25(20)：2973-2975】。 Zhu MY等在75℃条件下水提取巴戟天得到水提液，再加入4倍乙醇醇沉，分离沉淀和冷 冻干燥获得粗多糖MOP(未提及该粗多糖理化性质)。该MOP按100和300mg/kg剂量灌 胃卵巢切除大鼠30天，能明显增加骨矿物质密度和浓度，降低血浆细胞因子水平【Zhu MY, et al.Inter JBiolMacromol,2008,43:276-278】。
3.抗氧化
许美玉等将烘干的巴戟天粉碎，先加入乙醚脱色，再加入水浸泡，取滤液，滤液加5倍体积的80％乙醇沉淀，低温静置过夜。沉淀用少量水溶解，所得溶液蒸发除去乙醇，冷 冻干燥所得粗多糖。研究该粗多糖的抗氧化活性。结果表明，巴戟天粗多糖对羟基自由基 和H2O2的清除能力的IC50是1.40mg/mL和2.81mg/mL【许美玉，等.粮食科技与经济， 2016，41(2)：66-69】。刘霄将巴戟天加入10倍量的水煮沸1h，滤过，滤液加3倍体积的 乙醇，静置过夜，收集沉淀，复溶于蒸馏水中，采用Sevag法除蛋白，在加乙醇至体积分 数为80％静置过夜，收集沉淀，用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,干燥，得巴戟天粗多糖(未 提及理化性质)。该多糖10、20、40mg/mL的溶液按20mL/kg灌胃四氧嘧啶所致高血糖小 鼠，连续8d。结果表明巴戟天多糖能降低肾上腺素和四氧嘧啶所致高血糖小鼠的血糖，能 提高D-半乳糖衰老型小鼠血浆、肝、心和脑中SOD的活性并降低MDA的含量【刘霄.中 药材，2009，32(6)：949-951】。Zhang HL等采用碱水溶液提取巴戟天，获得一种酸性粗 多糖APMO。APMO由半乳糖醛酸、阿拉伯糖和半乳糖组成(未提及具体制备方法)。研究 发现APMO能清除DPPH自由基、螯合铁离子、抑制H2O2引起的红细胞裂解，抗氧化作 用优于Vc【Zhang HL,等.Inter JBiolMacromol,2013,58:7-12】。
4.抗疲劳
Zhang HL等采用热水提取巴戟天，再加入乙醇沉淀多糖(未提及具体制备方法)。该 粗提物对负重游泳小鼠具有良好的抗疲劳作用【Zhang HL,et al.Inter JBiolMacromol,2009, 44:257-261】。
5.免疫调节
何传波等将巴戟天粉碎，热水浸提、减压浓缩、乙醇沉淀、脱蛋白、脱色和冷冻干燥， 得到巴戟天粗多糖MOP。MOP经DEAE-Sep-harose CL-6B和Sephadex G-100柱层析，获得巴戟天多糖成分MOPI-3。结果表明粗多糖MOP及MOPI-3对环磷酰胺诱导的免疫功能 低下小鼠具有明显的免疫促进作用，30mg/kg·d剂量效果最为明显。在相同剂量下，MOPI-3 的免疫增强活性大于MOP【何传波，等.食品科技，2009，34(8)：167-171】。何传波等又 将MOP经离子交换和亲和柱层析得到的纯化多糖MOPI-3a和MOPA-2a，研究对环磷酰胺 诱导免疫功能低下小鼠的影响。结果显示30和50mg/kg·d剂量组免疫增强效果最为明显。 在相同剂量下，三种多糖的免疫增强活性次序是MOPA-2a>MOPI-3a>MOP【何传波，等.中 国食品学报，2010，10(5)：68-72】。刘琛等从北京生物制品检定所购买巴戟天多糖标准品 (未提及其理化性质)，研究其对梗阻性黄疸大鼠T细胞免疫平衡影响。结果表明该标准品 给予胆总管结扎大鼠10天，能抑制大鼠血胆红素升高，减轻血浆CD4+减少和CD4+/CD8+比值下降【刘琛，等.细胞与分子免疫学杂志，2011，27(6)：678-679】。徐超斗等研究巴 戟天寡糖(MOO，未提及具体制备方法和理化性质)对小鼠免疫功能的影响。结果表明 MOO 25和50mg/kg可使小鼠脾细胞增殖反应明显增强，使小鼠脾细胞抗体形成细胞数目 明显增加。体外在25～200μg/ml对脾细胞增殖反应和PP结细胞增殖反应无明显促进作用【徐 超斗，等.解放军药学学报，2003，19(6)：466-468】。
6.促新生血管生成
杨景柯等将巴戟天用70％乙醇在90℃水浴中煮60分钟，减压浓缩蒸回收乙醇，得浓 缩液。用适量的蒸馏水稀释后，分别用乙醚、醋酸乙脂、正丁醇依次萃取，得到醇提物的水溶部分(MOO)。MOO用蒸馏水配成0.28、0.14和0.07g/mL三种质量浓度药液，制备MOO以0.7、1.4和2.8g/kg含药血清，建立鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型，研究对大鼠急 性心肌梗死(AMI)模型血管生成的作用。结果表明巴戟天寡糖可明显促进鸡胚绒毛尿囊 膜的血管生成，明显促进AMI后大鼠缺血心肌的血管生成，改善缺血心肌局部的侧支循环 还能促进AMI后大鼠缺血心肌VEGF、bFGT蛋白的表达【杨景柯，等.中国药理通讯，2009， 26(2)：43-44】。杨景柯等又研究发现，与空白对照组和阳性对照组相比，MOO小、大剂 量组单核成肌细胞及多核初生肌管内的胞浆中免疫细胞化学反应TGF-β1呈阳性反应，中剂 量组呈强阳性反应；MOO小、中剂量组多数单核成肌细胞核免疫细胞化学反应呈PCNA阳 性，大剂量组呈强阳性反应【杨景柯，等.中国中药杂志，2010，35(3)：360-363】。
7.抗缺血
汪宝军等将巴戟天用70％乙醇在90℃水浴中煎煮，获得70％乙醇提取浓缩液，再用蒸 馏水稀释后分别用乙醚、乙酸乙酯及正丁醇依次萃取，得到醇提物的水溶部分即MOO(这 种提取方法是无法获得寡糖)。MOO以0.7、1.4和2.8g/kg·d剂量灌胃给予缺血再灌注模型 大鼠，巴戟天寡糖给药组大鼠心律失常评分降低，心肌损伤及梗死面积缩小,心肌组织中 SOD、CAT和GSH-Px酶活性升高，MDA含量降低(P<0.05)【汪宝军，等.郑州大学学报，2010，45(5)：794-796.】。汪宝军等继而又研究了MOO对心肌缺血再灌注损伤(IRI)大 鼠心功能的影响。结果显示与模型组相比，MOO各剂量组大鼠心功能均明显改善，心肌组 织中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性升高，CK含量则降低(P＜0.001)。 提示巴戟天寡糖有预防心肌IRI作用【汪宝军，郑州大学学报(医学版)，2010，45(4)： 612-615】。
8.促生殖发育
采用环磷酰胺(CTX)引起的精子减少雄性小鼠模型。小鼠随机分为对照组、CTX模型 组、巴戟天水提液组、巴戟天体积分数80％乙醇提取液组、巴戟天寡糖结晶组、甲睾酮组。 建模后连续给药4周，观察给药组、模型组与对照组小鼠性器官以及精子数的差异。结果 表明与模型组比较，巴戟天水提液组、巴戟天80％乙醇提取液、巴戟天总寡糖结晶组均具 有明显的促进精子生成作用，其中以总寡糖结晶组作用最明显【丁平，等.中国药学杂志， 2008，43(19)：1467-1470】。
9.抗乙肝
巴菟补肾益肝颗粒(上海中医药大学附属曙光医院院内复方制剂，含有巴戟天药材) 给予乙肝患者，每次1袋，每天3次，疗程均为12周。结果显示患者服用巴菟补肾益肝颗粒能明显改善腰膝酸软、耳鸣等症状，肝功能指标改善，T细胞、IL-2和IFN-γ水平比例升高，IL-6和IL-8水平降低【聂红明，等.上海中医药杂志，2013，47(11)：41-44.】。
综合上述研究结果，可以看出巴戟天乙醇提取物和寡糖具有明显抗抑郁、抗骨质疏松、 抗缺血和促进血管生成等药用活性。巴戟天药材中寡糖化学有研究，而对多糖类成分理化 性质及结构特征研究较少。另外，巴戟天作为中药复方组成之一，也仅有1篇文献报道用 于乙肝的治疗。因此本专利意在对巴戟天提取物、寡糖和多糖进行深入的抗肝损伤和保肝 作用进行深入研究，阐明其中活性多糖及组分，以推动巴戟天在保肝药品和功能食品上的 应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种巴戟天水提物、寡糖和多糖、其制 备方法和保肝及免疫调节之用途。
第一方面，本发明提供了一种巴戟天水提物，所述的巴戟天水提物是按照以下方法制 备得到的：
取巴戟天根药材，加水浸提，料液比为1:(1-20)kg/L，浸提温度为0-100℃，浸提或煎煮，提取时间为1-48小时，提取液过滤，滤渣在同样条件下再进行1-2次提取；合并各 次提取的水提液，离心，获得的上清液在50℃-60℃下减压浓缩，得到浓缩的水提液，然 后喷雾干燥或冷冻干燥，获得巴戟天水提物。
第二方面，本发明提供了一种巴戟天粗多糖，所述的巴戟天粗多糖是按照以下方法制 备得到的：
步骤1：水提
取巴戟天根药材粉碎，过10-30目筛，称取巴戟天根粉末，加水浸提，料液比为1:(1-20) kg/L，浸提温度为0-100℃，浸提或搅拌，提取时间为1-48小时，提取液过滤，滤渣在同样 条件下再进行1-2次提取；合并各次提取的水提液，离心，获得的上清液在50℃-60℃下减 压浓缩，得到浓缩的水提液；
步骤2：醇沉
向浓缩液中加入1-4倍体积的乙醇，使乙醇最终质量浓度为40％-80％，静置沉淀48-72 小时后，离心，分离沉淀，沉淀部分加入水中搅拌溶解，离心，沉淀再加水进行1-2次如上 的乙醇沉淀操作后，再用水反复溶解1-3次，离心，合并上清液；
步骤3：除杂和回收
将醇沉的沉淀再加水溶解，上清液装入截留分子量>1000Da的透析袋，用水透析24-72 小时，进行1-3次透析；将透析袋内所截留的溶液在50℃-60℃下减压浓缩后，浓缩液进行 冷冻干燥24-72小时，获得巴戟天粗多糖。
作为一个优选例，所述的巴戟天药材为未经提取的根块或粉末，或者经过有机溶剂萃 取后得到的残渣根块或粉末。
作为一个优选例，步骤2中乙醇最终质量浓度为70％-80％。
作为一个优选例，步骤1中所用的水为蒸馏水或去离子水。
作为一个优选例，步骤3中使用自来水和/或蒸馏水进行透析。
作为一个优选例，步骤1中，浸提温度为0-20℃时，浸提时间为24-48小时；浸提温度为20-80℃时，浸提时间为2-12小时；浸提温度为80-100℃时，浸提时间为0.5-2小时。 更优选地，浸提温度为20℃时，浸提时间为24小时；浸提温度为60℃时，浸提时间为5 小时；浸提温度为100℃时，浸提时间为1.5小时。
作为一个优选例，所述的巴戟天粗多糖含糖量为40％-85％(以葡萄糖计算)，糖醛酸含 量为5-30％(以半乳糖醛酸计算)。
第三方面，本发明提供了一种巴戟天寡糖和多糖，所述的巴戟天寡糖和多糖组分选自 下列中的一种：
将所述的巴戟天粗多糖加入一定体积水溶解，再加入2倍体积的乙醇(乙醇终浓度50-70％)进行醇沉24-72小时。离心分离沉淀。上清部分再加入1-2倍体积乙醇(乙醇终浓度65-85％)，进行醇沉24-72小时。离心，沉淀部分加水溶解后冷冻干燥，即获得巴戟天寡糖部分。
2倍体积乙醇醇沉的沉淀部分加入水中搅拌溶解，离心，沉淀再加水进行1-2次如上的 乙醇沉淀操作后，再用水反复溶解1-3次，离心，合并上清液。上清液装入截留分子量>1000Da 的透析袋，用水透析24-72小时，可进行1-3次透析；将透析袋内所截留的溶液在50℃-60℃ 下减压浓缩后，浓缩液进行冷冻干燥24-72小时，获得所述的巴戟天多糖部分。
第四方面，本发明提供了一种巴戟天中性多糖和酸性多糖组分，所述的巴戟天中性多 糖和酸性多糖组分选自下列中的一种：
巴戟天中性多糖组分：将所述的巴戟天粗多糖经DEAE-纤维素柱层析，水洗脱得到。 其主要为中性寡糖和低聚多糖，含糖量为70％～100％，主要由果糖组成，还含有少量葡萄 糖。
巴戟天酸性多糖组分：将所述的巴戟天粗多糖经DEAE-纤维素柱层析，0.25和0.5mol/L NaHCO3依次洗脱，分别得到酸性多糖组分1和酸性多糖组分2。其为酸性多糖，含糖量为 40％～80％，糖醛酸含量为10％～40％。
第五方面，本发明提供了如上任一所述的巴戟天水提物、巴戟天粗多糖、巴戟天寡糖、 巴戟天多糖、中性多糖组分和/或酸性多糖组分在制备免疫调节、促进肝细胞增殖、抗肝损 伤或抗肿瘤药物中的用途。
作为一个优选例，所述的肝损伤是由肝脏脂肪变性、人类免疫性肝病或病毒性肝炎导 致的肝损伤。
作为另一个优选例，所述的肝损伤是由酒精、药物或其它毒物导致的肝损伤。
第六方面，本发明提供了一种药物或保健食品组合物，其包含如上任一所述的巴戟天 水提物、巴戟天粗多糖、巴戟天寡糖、巴戟天多糖、中性多糖组分和/或酸性多糖组分，以 及药学或食品上可接受的载体。
所述的“药学上可接受的载体”是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂 和水等，填充剂如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、 明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲 基纤维素、琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇、 十二烷基硫酸钠；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅 胶和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明的优点在于：从巴戟天根中通过水浸提的方式提取得到巴戟天水提物和粗多糖， 进而将粗多糖分离得到其中的寡糖和多糖组分，并对其进行了性质测定。
1、实验表明本发明的巴戟天水提物和粗多糖均能促进小鼠脾脏细胞增殖和细胞因子分 泌；促进人肝细胞的增殖和降低毒剂对细胞的损伤；能抑制乙肝表面抗原和核心抗原的表 达；抑制肝癌细胞的增殖以及抑制ConA对小鼠肝脏和肾脏的造成的损伤，具备开发成免 疫调节剂、抗肝损伤和抗肿瘤药物或保健食品的前景。
2、本发明的巴戟天水提物、粗多糖及其多糖组分采用特定步骤和参数制备得到，生物 活性显著优于现有技术中其他方法制备得到的巴戟天多糖或巴戟天多糖组分。
3、本发明的巴戟天多糖的制备方法采用了特定步骤和参数，制备得到的巴戟天粗多糖 及其多糖组分效果突出，制备步骤简单，不使用有机溶剂或有机溶剂用量很少，产物中没 有或很少有有机溶剂的残留，且制备过程对环境污染小，更适于工业生产，因此推进了巴 戟天的药物开发利用。
附图说明
附图1：MOP-60在DEAE-纤维素柱层析的洗脱曲线。
附图2：MOP-60-100在DEAE-纤维素柱层析的洗脱曲线。
附图3：MOP-20的分子量分布图谱(TSK2000色谱柱)。
附图4：MOP-20的分子量分布图谱(TSK3000色谱柱)。
附图5：MOP-60的分子量分布图谱(TSK3000色谱柱)。
附图6：MOP-100的分子量分布图谱(TSK2000色谱柱)。
附图7：MOP-100的分子量分布图谱(TSK3000色谱柱)。
附图8：MOP-60-100的分子量分布图谱(TSK2000色谱柱)。
附图9：MOP-60-100的分子量分布图谱(TSK3000色谱柱)。
附图10：MOP-60-A的分子量分布图谱。
附图11：MOP-60-B的分子量分布图谱。
附图12：MOP-60-100-A的分子量分布图谱。
附图13：MOP-60-100-B的分子量分布图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：巴戟天水提物的制备
称取巴戟天药材饮片1公斤，加入20L水，浸泡1小时后煎煮1.5小时。过滤，药渣再加入20L水，再煎煮1小时，过滤。合并滤液，离心(3000r/分钟×20分钟)。上清液在55-60℃减压浓缩，浓缩浸膏再烘干和真空干燥，获得水提干浸膏。
实施例2：巴戟天水提液中小分子部位和粗多糖的制备(一)
巴戟天根原药材粉碎，过20目筛。称取巴戟天根粉末3份，每份1kg。分别在室温(20℃)、 60℃和100℃温度下加15L蒸馏水浸提。其中，室温条件下浸提24小时，60℃条件下浸提4小时，100℃条件下煎煮1.5小时，浸提期间进行搅拌。浸提液过滤，滤渣各自在同样 条件下再进行一次提取。各自合并两次提取的水提液，离心(3000r/min×20min)，不同温度下获得的上清液分别在50-55℃下减压浓缩至1.5L，得到水提浓缩液。
分别向不同温度下提取的巴戟天浓缩液中加入4倍体积的95％乙醇，使乙醇终浓度为 75％(乙醇的质量浓度)，静置沉淀48小时后，离心(3000r/min×20min)，分离沉淀，沉淀 部分加入1.0L水中搅拌溶解，离心(3000r/min×20min)，再进行2次如上的乙醇沉淀操作 后，再将沉淀用1.0L水反复溶解2次，离心，合并水溶上清液。将醇沉后再水溶解的上清液分别装入透析袋(截留分子量为1000Da)，用蒸馏水透析48小时。将透析袋内所截留的 透析液在55℃下减压浓缩后，浓缩液装入小瓶，进行冷冻干燥，获得不同温度下制备的巴 戟天粗多糖，分别命名为MOP-20、MOP-60和MOP-100。
20℃、60℃和100℃分别制备的水提浓缩液的醇沉上清部分，分别在40-50℃条件下 减压浓缩和真空干燥后，获得巴戟天醇沉上清干浸膏。分别命名MO-20-WR、MO-60-WR 和MO-100-WR。
实施例3：巴戟天粗多糖的制备(二)
巴戟天根原药材粉碎，过20目筛。称取巴戟天根粉末1kg，加入15L蒸馏水，60℃温度下搅拌浸提5小时后，过滤。滤渣再加入15L水，相同条件下重复浸提1次。合并滤液， 离心(3000r/min×20min)，上清液在50-55℃下减压浓缩至1.5L，得到60℃水提浓缩液。 药材残渣加入15L水，100℃煎煮1.5小时后，过滤，滤液离心，上清液50-55℃下减压浓 缩至1.5L，得到100℃水提浓缩液。
分别向60℃水提浓缩液和100℃水提浓缩液各加入4倍体积乙醇，使乙醇终浓度为75％(乙醇的质量浓度)，分别静置沉淀72小时。离心(3000r/min×20min)，分离沉淀，60℃和100℃沉淀部分分别加入1.0L水中搅拌溶解，离心(3000r/min×20min)，再进行2次反 复水溶解2次和离心，分别合并水溶上清液。将60℃醇沉后再水溶解的上清液，在55-60℃ 条件下减压浓缩，浓缩液再加入4倍体积95％乙醇醇沉48小时。沉淀部分再连续用乙醇、 丙酮洗涤，去除小分子，获得巴戟天粗多糖，命名MOP-60。100℃醇沉后再水溶解的上清 液装入透析袋(截留分子量为1000Da)，用蒸馏水透析48小时。将透析袋内所截留的透析 液在55℃下减压浓缩后，浓缩液装入小瓶，进行冷冻干燥，获得巴戟天粗多糖，命名 MOP-60-100。
60℃和100℃连续制备的水提浓缩液的醇沉上清部分，分别在40-50℃条件下减压浓 缩和真空干燥后，获得巴戟天醇沉上清干浸膏。分别命名MO-60-WR和MO-60-100-WR。
实施例4：巴戟天粗多糖的制备(三)
巴戟天药材饮片1kg，加入20L水，煎煮1小时，过滤，药材残渣再加入15L水和煎 煮1小时后，过滤。合并二次滤液，离心，上清液减压浓缩至1.5L。该浓缩液先加入3L 95％ 乙醇(2倍)进行静置沉淀48小时，然后离心，分离沉淀(多糖)；醇沉上清液中再加入 3L 95％乙醇(2倍)，静置48小时，离心，分离沉淀(含低分子量多糖和寡糖)。第一次醇 沉的沉淀部分多次加水溶解，收集水溶解上清液，水透析48小时(截留分子量>1000Da)， 再减压浓缩和冷冻干燥，获得粗多糖MOP。第二次醇沉的沉淀部分，经多次加水溶解后， 离心，上清液减压浓缩冷冻干燥，获得寡糖MOO。
实施例5：巴戟天多糖组分的制备(一)
称取60℃制备的巴戟天粗多糖MOP-60(按照实施例2或实施例3的方法制备)1g，加入蒸馏水50mL溶解，溶解液上样DEAE-纤维素柱(Φ7cm×35cm)，分别采用水、0.25mol/LNaHCO3和0.5mol/L NaHCO3进行连续洗脱，流速1mL/min，10mL/管。苯酚-硫酸法(λ490nm 吸收)检测含糖组分，分别获得多糖组分MOP-60-A(H2O洗脱)、MOP-60-B(0.25mol/L NaHCO3洗脱)，0.5mol/L NaHCO3洗脱未检测到含糖组分(洗脱曲线见图1)。MOP-60-B 装入透析膜，蒸馏水透析除盐后，再冷冻干燥。
实施例6：巴戟天多糖组分的制备(二)
称取巴戟天粗多糖MOP-60-100(实施例3方法制备)1g，加入蒸馏水50mL溶解，溶解液上样DEAE-纤维素柱(Φ7cm×35cm)，分别采用水、0.25mol/L NaHCO3和0.5mol/LNaHCO3进行连续洗脱，流速1mL/min，10mL/管。苯酚-硫酸法(λ490nm吸收)检测含糖 组分(洗脱曲线见图2)，分别获得多糖组分MOP-60-100-A(H2O洗脱)、MOP-60-100-B (0.25mol/LNaHCO3洗脱)和MOP-60-100-C(0.5mol/L NaHCO3)。收集的三个多糖组分分 别装入透析膜，蒸馏水透析除盐后，再分别冷冻干燥获得干燥粉末。
实施例7：不同温度制备的巴戟天粗多糖的理化性质测定
1.实验样品
根据实施例2和实施例3制备的巴戟天粗多糖。
2.糖含量测定(苯酚-硫酸法)
(1)标准曲线制作
葡萄糖标准品置于55℃真空干燥箱中干燥，至恒重。准确称取葡萄糖标准品5mg，转 移至50mL容量瓶中，加蒸馏水定容。移取葡萄糖标准溶液0.0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL至于具塞试管中，再分别补水至2.0ml。各 试管中加入8％苯酚溶液1.0mL，摇匀，然后沿管壁缓慢加入浓硫酸5.0mL，摇匀。室温放 置30分钟后于490nm波长处测定吸光度值。以葡萄糖溶液浓度(C)为横坐标，吸光度值 (A)为纵坐标，绘制标准曲线。
(2)样品糖含量测定
待测样品置于55℃真空干燥箱干燥至恒重。精确称量10mg样品，转移至25mL容量瓶中，加水定容。移取待测样品溶液0.5mL至于具塞试管中，补加蒸馏水至2.0mL。按标 准曲线相同方法操作，测定其吸光度值，代入标准曲线方程中，计算样品中糖含量。
糖含量＝糖重量(mg)/巴戟天多糖重量(mg)×100％。
3.糖醛酸含量测定(间羟联苯法)
(1)标准曲线制作
标准半乳糖醛酸样品于60℃真空干燥2h，精确称取4.2mg配制成25ml的标准半乳糖 醛酸水溶液，依次取0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7ml半乳糖醛酸标准溶液，再各加入0.7，0.6，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0.0ml水补至0.7ml，各试管中加入3ml 0.0125mol/L四硼酸钠溶液，沸水浴加热5min，冰浴中冷却后各加入50μl 0.15％间羟联苯溶液，摇匀，放置20min，在520nm处测定其吸光度。以半乳糖醛酸溶液浓度(C)为横坐标，吸光度 值(A)为纵坐标，绘制标准曲线。
(2)样品测定
多糖样品于60℃真空干燥2h后迅速取出，密封。精确称取5mg配制成10ml的水溶液，取0.7ml水溶液，3ml 0.0125mol/L四硼酸钠溶液，沸水浴加热5min，冰浴中冷却后各 加入50μl 0.15％间羟联苯溶液，摇匀，放置20min，在520nm处测定其吸光度A，另取0.7 ml水溶液，加入3ml水，沸水浴加热5min，冰浴中冷却后各加入50μl 0.15％间羟联苯溶液， 摇匀，放置20min，同样在520nm处测定其本底吸光度A0，以A-A0得出A样品，将该数值 代入标准曲线计算得出糖醛酸含量。
4.分子量分布测定(凝胶渗透色谱法，HPGPC)
(1)色谱条件：
标准品：一系列不同分子量的葡聚糖。
色谱柱：TSKgel-G 2000 SWXL(7.8×300mm)
TSKgel-G 3000 SWXL(7.8×300mm)
流动相：0.1mol/L的Na2SO4溶液。
进样：20μL。
检测器：2414示差检测器。
(2)标准曲线制作：
分别称取5mg不同分子量葡聚糖标准品，加入0.5mL超纯水溶解，0.45μm膜过滤。在流速0.5mL/min条件下分别进样20μL。采用Waters Empower 2.0GPC软件处理实验数据， 绘制分子量标准曲线。
(3)样品分子量测定
分别称取5mg待测样品，加入0.5mL超纯水溶解，0.45μm膜过滤，进样20μL。根据 样品的保留时间，计算多糖样品的峰高分子量(Mp)。
5.单糖组成测定(毛细管电泳法，CE)
(1)标准品混合物的PMP衍生物的制备
称取氨基葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、岩藻糖、半乳糖、甘露糖、葡 萄糖醛酸和半乳糖醛酸各10mg，加入5ml超纯水溶解，混合。移取40μL标准单糖混合溶 液于试管中，然后加入600μl 0.3mol/L NaOH溶液和600μl 0.5mol/L PMP溶液(甲醇配制)， 充分混合，置于70℃水浴中反应30min。取出自然冷却至室温，慢慢加入600μl 0.3mol/L 盐酸溶液至中性。加入1ml氯仿进行萃取，水层再加入氯仿重复萃取2次。水层溶液经0.22μm 过滤，滤液待进样。
(2)样品的PMP衍生物制备
称取5mg待测样品置于水解管中，加入3ml 2mol/L三氟乙酸溶解，密封，置于120℃烘箱中加热水解2h。取出放置冷至室温后，转移至25ml圆底烧瓶中。45℃减压条件下反 复加入少量甲醇，去除残余的三氟乙酸。然后加入600μl 0.3mol/L NaOH溶液和600μl0.5mol/L PMP溶液(甲醇配制)，充分混合，置于70℃水浴中反应30min。取出自然冷却 至室温，慢慢加入600μL 0.3mol/L盐酸溶液至中性。加入1ml氯仿进行萃取，水层再加入 氯仿重复萃取2次。水层溶液经0.22μm过滤，滤液待进样。
(3)毛细管电泳条件
缓冲盐溶液：50mmol/L硼砂溶液(pH＝10.57)；毛细管柱：Φ50μm×60cm；分离电压： 15kV；检测波长：245nm；进样压力：0.5psi；进样时间：10s；柱温：25℃。依据每种单 糖质量和相应峰面积，计算每种单糖校正因子fi，再与待测样品所含单糖的峰面积相乘，然后计算不同单糖之间的摩尔比。
6.实验结果
6.1糖含量
不同温度制备的巴戟天多糖的糖含量结果见表1。
表1.不同温度制备巴戟天粗多糖的糖含量结果
6.2多糖分子量分布
20℃条件下制备的巴戟天粗多糖MOP-20的分子量分布图谱见图3和图4。60℃条件下制备的巴戟天粗多糖MOP-60的分子量分布图谱见图5。100℃条件下制备的巴戟天粗多糖MOP-100的分子量分布图谱见图6和图7。巴戟天在60℃提取后残渣再经100℃提取 获得的粗多糖MOP-60-100的分子量分布图谱见图8和图9。
6.3单糖组成测定
不同温度制备的巴戟天多糖的单糖组成结果见表2。
表2.不同温度制备巴戟天粗多糖的单糖组成结果
实施例8：巴戟天多糖组分的理化性质测定
1.实验样品
MOP-60-A、MOP-60-B、MOP-60-100-A和MOP-60-100-B四种多糖组分(来自实施例 4和实施例5)。
2.实验方法
样品中糖含量、糖醛酸含量、多糖分子量分布以及单糖组成的测定方法同实施例7。
3.实验结果
3.1糖含量
不同巴戟天多糖组分的糖含量和糖醛酸含量测定结果见表3。
表3.不同多糖组分的糖含量和糖醛酸含量测定结果
3.2分子量分布
MOP-60-A、MOP-60-B、MOP-60-100-A和MOP-60-100-B四种多糖组分的分子量分布结果见图10～图13。
3.3单糖组成测定
不同巴戟天多糖组分的单糖组成结果见表4。
表4.不同多糖组分的单糖组成测定结果
实施例9：巴戟天水煎液小分子部位和粗多糖的免疫活性测定
1.促进小鼠脾细胞的增殖活性
Balc/C小鼠眼球取血，颈椎脱臼处死。无菌条件下取出脾，制备脾细胞悬液，用台盼 蓝染色法检测细胞存活率＞95％，进行细胞计数，调整细胞密度为5×109·L-1。将计数后的 脾细胞悬液按每孔100μL加入到96孔细胞培养板，溶剂对照孔只加等体积的RPMI1640 培养液作为本底。各孔再加入100μL巴戟天待测样品(终浓度分别为10、50和250μg/mL)、 ConA(终浓度2μg/mL)和LPS(终浓度15μg/mL，每组设3复孔。将培养板置于含5％CO2培养箱中，37℃孵育72h。加入20μL MTT 5μg/mL，继续孵育4h。弃上清液后，每孔中加 入150μLDMSO，酶标仪检测A570nm，计算细胞增殖百分率。结果见表5和表6。
结果表明：巴戟天水煎煮液中小分子部位(MO-100-WR)和粗多糖(MOP-100-WP) 本身在250μg/mL浓度下对小鼠淋巴细胞增殖有促进作用(P<0.05)，而且二者对ConA刺 激的T细胞增殖有一定协同作用。
表5.巴戟天水煎液小分子部位对小鼠原代脾淋巴细胞增殖的影响
注：与溶剂对照组相比，*P<0.05，***P<0.001；与ConA组相比，#P<0.05，n＝3.
表6.巴戟天水煎液中粗多糖对小鼠原代脾细胞增殖的影响
注：与溶剂对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与ConA组相比，#P<0.05， ##P<0.01，n＝3.
2.促进细胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌
Balb/C小鼠处死后无菌取脾脏，制备脾细胞悬液(5×106/mL)。将脾细胞悬液加入24 孔细胞培养板中，每孔各加入500μL。再加入500μL待测样品，使其终浓度分别为50μg/mL， 另设ConA(4μg/mL)和溶剂对照孔，每组设3复孔。然后置于37℃、5％CO2培养箱中培 养72h，然后取出细胞培养液，离心10min(600×g)，收集上清，按照ELISA试剂盒说明 书测定脾细胞培养上清IFN-γ含量，实验结果见表7和表8。
Balb/C小鼠处死后无菌抽取腹腔巨噬细胞，制备细胞悬液，并用含FBS的DMEM培养液调整细胞浓度为2.5×105/mL。向24孔培养板中加入巨噬细胞悬液500μL，再加入500μL不同浓度多糖样品(终浓度为50μg/mL)，设3复孔，然后置于5％CO2、37℃饱和湿度的 培养箱中培养48h。收集巨噬细胞培养上清液，采用ELISA试剂盒测定细胞上清液中TNF-α 的含量，实验结果见表7和表8。
结果表明：巴戟天水煎剂中小分子部位(MO-100-WR)对小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ 和腹腔巨噬细胞分泌TNF-α无明显影响，而粗多糖(MOP-100-WP)对IFN-γ和TNF-α的 分泌有促进作用(P<0.05)。
表7.巴戟天MO-100-WR对小鼠分泌IFN-γ和TNF-α的影响
注：与溶剂对照相比，*P<0.05，n＝3.
表8.巴戟天MOP-100-WP对小鼠分泌IFN-γ和TNF-α的影响
注：与溶剂对照相比，*P<0.05，***P<0.001，n＝3.
实施例10：巴戟天寡糖MOO和多糖MOP的免疫活性测定
1.促进小鼠脾细胞的增殖活性
Balc/C小鼠眼球取血，颈椎脱臼处死。无菌条件下取出脾，制备脾细胞悬液，用台盼 蓝染色法检测细胞存活率＞95％，进行细胞计数，调整细胞密度为5×109·L-1。将计数后的 脾细胞悬液按每孔100μL加入到96孔细胞培养板，溶剂对照孔只加等体积的RPMI1640 培养液作为本底。各孔再加入100μL巴戟天待测样品(终浓度分别为10、50和250μg/mL)、 ConA(终浓度2μg/mL)和LPS(终浓度15μg/mL，每组设3复孔。将培养板置于含5％CO2培养箱中，37℃孵育72h。加入20μL MTT 5μg/mL，继续孵育4h。弃上清液后，每孔中加 入150μLDMSO，酶标仪检测A570nm，计算细胞增殖百分率。结果见表9和表10。
结果表明：巴戟天水煎煮液中小分子部位(MO-100-WR)和粗多糖(MOP-100-WP) 本身在250μg/mL浓度下对小鼠淋巴细胞增殖有促进作用(P<0.05)，而且二者对ConA刺 激的T细胞增殖有一定协同作用。
表9.巴戟天寡糖和多糖对小鼠原代脾淋巴细胞增殖的影响
注：与溶剂对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与ConA组相比，#P<0.05， ##P<0.01，n＝3.
实施例11：巴戟天提取物对人肝细胞的促增殖和抗损伤活性
1.促增殖实验方法
取对数生长期人L-O2肝细胞，经消化处理后，以1％FBS的RPMI-1640液制成单细胞悬液，用台酚蓝液染色，计数活细胞总数，接种入96孔细胞培养板，细胞密度为1×104/孔。待测样品采用培养液配制，加入培养板中，使其终浓度为0、10、50和250μg·mL-1，每个 浓度平行设3个孔，置于培养箱中孵育72h。向含有培养物的96孔板中每孔加入0.5％MTT 液20μL，继续培养4h，然后每孔加入100μL 10％SDS，继续37℃孵育过夜，最后采用酶 标仪检测570nm波长处的OD值，计算细胞增殖率。
2.抗损伤实验方法
取对数生长期人L-O2肝细胞，经消化处理后，以1％FBS的RPMI-1640液制成单细胞悬液，用台酚蓝液染色，计数活细胞总数，接种入96孔细胞培养板，细胞密度为1×104/孔。待测样品采用培养液配制，加入培养板中，使其终浓度为0、10、50和250μg·mL-1，每孔 再加入ConA，终浓度为500μg·mL-1，同时设溶剂对照组。每个浓度平行设3个孔，置于培 养箱中孵育72h。向含有培养物的96孔板中每孔加入0.5％MTT液20μL，继续培养4h，然 后每孔加入100μL 10％SDS，继续37℃孵育过夜，最后采用酶标仪检测570nm波长处的 OD值，计算细胞抑制率。
抑制率(％)＝(1-实验组OD/溶剂对照组平均OD)×100％
3.实验结果
从表10中可以看出，巴戟天水煎液中小分子部位MO-100-WR对人L-O2肝细胞有明显促增殖活性，对ConA诱发的肝细胞损或死亡有明显抑制作用，均呈剂量-效应关系。表11的实验结果显示不同温度提取的巴戟天粗多糖均能呈剂量效应关系促进肝细胞增殖和抑制肝细胞的损伤。表12中数据显示巴戟天寡糖和巴戟天多糖对人肝细胞有明显促进增殖活性，对ConA引起的肝细胞损伤有抑制作用，且呈良好量效关系。
表10.巴戟天水煎液小分子部位对人肝细胞增殖和ConA损伤的影响
注：与溶剂对照组相比，***P<0.001；与ConA组相比，#P<0.05，###P<0.001，n＝3.
表11.巴戟天粗多糖对人肝细胞增殖和ConA损伤的影响
注：与溶剂对照组相比，***P<0.001；与ConA组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，n＝3.
表12.巴戟天寡糖和多糖对人肝细胞增殖和ConA损伤的影响
注：与溶剂对照组相比，***P<0.001；与ConA组相比，#P<0.05，###P<0.001，n＝3.
实施例12：巴戟天提取物对人肝细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响
将处于对数生长期的HepG2.2.15细胞用胰酶消化后，加入DMEM培养液(含10％FBS) 终止消化，转至15ml离心管中1000rpm离心5min，去液体后加1ml DMEM培养液(含10％FBS)重悬后，计数。按照5.0×103细胞/孔分别种于96孔板，每孔100μl DMEM培养 液(含10％FBS)，置37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱培养24小时。待细胞贴壁后，弃原 培养液，分别加入100μl/孔的含药培养液(待测样品来源于实施例2和实施例3，按50、100、 250和500μg/mL设4个复孔)，分别在药物干预后24和48小时分别收集细胞培养上清， 采用乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)诊断试剂盒(酶联免疫法)和乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)诊断试剂盒(酶联免疫法)检测细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的水平，计 算抑制率。实验结果见表13和表14。
结果表明：巴戟天水煎液中小分子部位(MO-100-WR)对肝细胞分泌HBsAg无明显抑制活性，但对分泌HBeAg有一定抑制作用(P<0.05)；粗多糖则对肝细胞分泌HBsAg和HBeAg均有明显抑制活性，且呈一定剂量-效应关系。
表13.巴戟天水煎液小分子部位和粗多糖对Hep2.5.5细胞分泌HBsAg的影响
注：与溶剂对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n＝3.
表14.巴戟天水煎液小分子部位和粗多糖对Hep2.5.5细胞分泌HBeAg的影响
注：与溶剂对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n＝3.
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员， 在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本 发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种巴戟天水提物，其特征在于，所述的巴戟天水提物是按照以下方法制备得到的：取巴戟天根药材，加水浸提，料液比为1:(1-20)kg/L，浸提温度为0-100℃，浸提或煎煮，提取时间为1-48小时，提取液过滤，滤渣在同样条件下再进行1-2次提取；合并各次提取的水提液，离心，获得的上清液在50℃-60℃下减压浓缩，得到浓缩的水提液，然后喷雾干燥或冷冻干燥，获得巴戟天水提物。
2.一种巴戟天粗多糖，其特征在于，所述的巴戟天粗多糖的制备方法包括以下步骤：
步骤1：水提
取巴戟天根药材粉碎，过10-30目筛，称取巴戟天根粉末，加水浸提，料液比为1:(1-20)kg/L，浸提温度为0-100℃，浸提或搅拌，提取时间为1-48小时，提取液过滤，滤渣在同样条件下再进行1-2次提取；合并各次提取的水提液，离心，获得的上清液在50℃-60℃下减压浓缩，得到浓缩的水提液；
步骤2：醇沉
向浓缩液中加入1-4倍体积的乙醇，使乙醇最终质量浓度为40％-80％，静置沉淀48-72小时后，离心，分离沉淀，沉淀部分加入水中搅拌溶解，离心，沉淀再加水进行1-2次如上的乙醇沉淀操作后，再用水反复溶解1-3次，离心，合并上清液；
步骤3：除杂和回收
将醇沉的沉淀再加水溶解，上清液装入截留分子量>1000Da的透析袋，用水透析24-72小时，进行1-3次透析；将透析袋内所截留的溶液在50℃-60℃下减压浓缩后，浓缩液进行冷冻干燥24-72小时，获得巴戟天粗多糖。
3.根据权利要求2所述的巴戟天粗多糖，其特征在于，所述的巴戟天药材为未经提取的根块或粉末，或者经过有机溶剂萃取后得到的残渣根块或粉末。
4.根据权利要求2所述的巴戟天粗多糖，其特征在于，所述的巴戟天粗多糖中以葡萄糖计算含糖量为40％-85％，以半乳糖醛酸计算糖醛酸含量为5-30％。
5.一种巴戟天寡糖，其特征在于，所述的巴戟天寡糖是按照以下方法制备得到的：
将权利要求2所述的巴戟天粗多糖加入一定体积水溶解，再加入2倍体积的乙醇，使乙醇终浓度50-70％，进行醇沉24-72小时，离心分离沉淀，上清部分再加入1-2倍体积乙醇，使乙醇终浓度65-85％，进行醇沉24-72小时，离心，沉淀部分加水溶解后冷冻干燥，即获得巴戟天寡糖。
6.一种巴戟天多糖，其特征在于，所述的巴戟天多糖是按照以下方法制备得到的：
将权利要求2所述的巴戟天粗多糖加入一定体积水溶解，再加入2倍体积的乙醇，使乙醇终浓度50-70％，进行醇沉24-72小时，离心分离沉淀，沉淀部分加入水中搅拌溶解，离心，沉淀再加水进行1-2次如上的乙醇沉淀操作后，再用水反复溶解1-3次，离心，合并上清液，上清液装入截留分子量>1000Da的透析袋，用水透析24-72小时，进行1-3次透析；将透析袋内所截留的溶液在50℃-60℃下减压浓缩后，浓缩液进行冷冻干燥24-72小时，获得所述的巴戟天多糖。
7.一种巴戟天中性多糖组分或巴戟天酸性多糖组分，其特征在于，所述的巴戟天中性多糖组分是按照以下方法制备得到的：将权利要求2所述的巴戟天粗多糖经DEAE-纤维素柱层析，水洗脱得到；所述的巴戟天酸性多糖组分是按照以下方法制备得到的：将权利要求2所述的巴戟天粗多糖经DEAE-纤维素柱层析，0.25和0.5mol/L NaHCO3依次洗脱，分别得到酸性多糖组分1和酸性多糖组分2。
8.根据权利要求1所述的巴戟天水提物、权利要求2、3或4所述的巴戟天粗多糖、权利要求5所述的巴戟天寡糖、权利要求6所述的巴戟天多糖、权利要求7所述的巴戟天中性多糖组分或巴戟天酸性多糖组分在制备免疫调节、促进肝细胞增殖、抗肝损伤或抗肿瘤药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的肝损伤是由肝脏脂肪变性、人类免疫性肝病或病毒性肝炎导致的肝损伤。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的肝损伤是由酒精、药物或其它毒物导致的肝损伤。
11.一种药物或保健食品组合物，其特征在于，所述的药物或保健食品组合物包含权利要求1所述的巴戟天水提物、权利要求2、3或4所述的巴戟天粗多糖、权利要求5所述的巴戟天寡糖、权利要求6所述的巴戟天多糖、权利要求7所述的巴戟天中性多糖组分或巴戟天酸性多糖组分，以及药学或食品上可接受的载体。
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