CN116589603A - 巴戟天多糖纳米硒及其制备方法和抗肿瘤的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种巴戟天多糖纳米硒及其制备方法和抗肿瘤的应用。制备方法包括以下步骤：将巴戟天粉末和纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶混合酶解，然后浓缩、醇沉、过滤、纯化干燥得到巴戟天多糖；再将巴戟天多糖与亚硒酸钠溶液预热混合，然后向巴戟天多糖混合溶液中加入抗坏血酸溶液进行还原反应，透析，冷冻干燥得到巴戟天多糖纳米硒。本发明采用天然产物巴戟天多糖为分散剂，避免纳米硒的聚集，对人体和生物的亲和性高，产品含硒量高，形貌特征稳定，制备工艺可靠，并且合成的巴戟天多糖纳米硒具有抑制多种肿瘤细胞的活性，对正常细胞的毒副作用较低，能够进一步用于制备抑制肿瘤细胞增殖的抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明属于生物纳米材料技术领域，具体涉及巴戟天多糖纳米硒及其制备方法和抗肿瘤的应用。
背景技术
癌症一直是威胁人类健康的重大疾病之一。世界卫生组织指出，癌症是全世界的一个主要死因，2020年近1000万例（或近六分之一）死亡由癌症导致。2020年癌症死亡的最常见原因是：肺癌（180万例死亡），结肠和直肠癌（91.6万例死亡），肝癌（83万例死亡），胃癌（76.9万例死亡），乳腺癌（68.5万例死亡）。硒是人体必须的微量元素之一，既往研究表明其具有抗癌，抗病毒，抗氧化和免疫调节等多种作用。世卫组织建议每天补充200微克硒以有效预防癌症等多种疾病。
据报道，目前临床常见的补硒药品有无机的亚硒酸钠片，具有较大的毒性，需在医生的监督下严格按照处方服用；而一般的无机单质硒不能溶于水，也没有生物活性。作为无机硒的一种，纳米硒展现出了完全不同的物理性质和生物活性，其颜色由灰白色转变为红色，由不溶于水转变为可溶于水，有更高的生物利用度和生物学特性，而且细胞毒性显著降低。纳米硒的制备主要是采用还原剂还原无机硒化合物制得，以不同聚合材料为分散剂，但分散剂类型较为局限，往往没有药理作用，一些分散剂甚至对人体有害。
目前，常用的制备纳米硒的方法有三种：物理法、生物法和化学法。物理法是指利用超声波、电磁波等的能量，帮助硒实现原子化，常用方法包括激光灼烧、γ射线辐射或微波辐射等，得到的纳米硒粒子形貌均匀可控，但需要特殊的仪器设备和实验条件，成本较高，有一定危险性；生物法是指利用植物提取物或微生物自身的还原作用，以及某些微生物本身的生物合成或转化作用，与硒进行反应，其具体方法包括植物提取物还原高价硒或微生物与硒前体物共同培养法等，该方法操作难度低，但难以控制所得纳米硒粒子的形貌；化学法是指采用合适的还原剂与高价硒反应的方法，该方法操作简单，但得到的纳米硒粒子表面无配位的原子，常温下不稳定，易聚集形成毒性大，难吸收的单质硒，因此，在制备过程中，需使用合适的分散剂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供巴戟天多糖纳米硒及其制备方法和抗肿瘤的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种巴戟天多糖纳米硒，其制备方法包含以下步骤：
1)将巴戟天粉末和纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶混合酶解，然后过滤浓缩醇沉，收集沉淀后去除蛋白，纯化干燥得到巴戟天多糖；
2)取巴戟天多糖与亚硒酸钠溶液预热混合，然后向巴戟天多糖混合溶液中加入抗坏血酸溶液进行还原反应，反应液浓缩，蒸馏水透析，冷冻干燥得到巴戟天多糖纳米硒。
在一些实例中，所述纤维素酶的用量为巴戟天粉末质量的0.5 %～2 %，所述果胶酶的用量为巴戟天粉末质量的0.5 %～2 %，所述木瓜蛋白酶的用量为巴戟天粉末质量的0.5 %～2 %。
在一些实例中，所述酶解反应的条件为：反应温度为30～70 ℃，反应时间为1～4h，反应pH为3～6。
在一些实例中，所述巴戟天多糖混合溶液中的巴戟天多糖的浓度为1～10 g/L，亚硒酸钠的浓度为0.1～1mol/L。
在一些实例中，所述巴戟天多糖混合溶液中，巴戟天多糖和亚硒酸钠的混合比为：(5～10 g)巴戟天多糖：1 mol 亚硒酸钠。
在一些实例中，所述巴戟天多糖与亚硒酸钠溶液的预热温度为30～60 ℃，预热时间为10～40 min。
在一些实例中，所述亚硒酸钠与抗坏血酸的摩尔比为1：（1～10）。
在一些实例中，所述还原反应的温度为20～80 ℃，反应时间为1～8 h。
在一些实例中，透析截留分子量1kDa。
第二个方面，本发明提供的巴戟天多糖纳米硒在抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。
在一些实例中，所述肿瘤细胞为人肝癌细胞、人肺癌细胞、人乳腺癌细胞、人回盲肠癌细胞以及人胃癌细胞。
本发明的有益效果是：
本发明的一些实例中，采用天然产物巴戟天多糖为分散剂，由于巴戟天多糖无毒，水溶性好，可以与硒之间形成分子间氢键，避免纳米硒的聚集，提高纳米硒的稳定性，其本身具有抗氧化、增强免疫、生殖系统保护和骨保护作用，是优良的纳米硒分散剂。而且巴戟天多糖对人体无害，生物亲和性高，生物利用度好，产品含硒量高，形貌特征稳定，生产成本较低，合成工艺简单，并且合成的巴戟天多糖纳米硒具有抑制多种肿瘤细胞的活性，且对正常细胞的毒副作用较低，进而能够进一步用于制备抑制肿瘤细胞增殖的抗肿瘤药物。
本发明的一些实例中，通过采用多种酶复配，以酶促反应为主，反应条件温和，对多糖的结构破坏较少甚至没有破坏，可以显著提高巴戟天多糖的产率和质量。
附图说明
图1为实施例2合成的巴戟天多糖纳米硒实物图。
图2为巴戟天多糖纳米硒颗粒表征分析实验中巴戟天多糖纳米硒紫外光谱图。
图3为巴戟天多糖纳米硒颗粒表征分析实验中巴戟天多糖纳米硒的透射电镜图。
图4为巴戟天多糖纳米硒颗粒表征分析实验中巴戟天多糖纳米硒的红外光谱图。
图5为巴戟天多糖纳米硒颗粒表征分析实验中巴戟天多糖的红外光谱图。
图6为巴戟天多糖纳米硒颗粒的抗癌应用实验中巴戟天多糖纳米硒的抑制癌细胞生长结果图。
具体实施方式
下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方案。
实施例1
1） 取巴戟天粉末100 g，纤维素酶0.5 g，果胶酶0.6 g，木瓜蛋白酶0.6 g，上述四者与500 mL蒸馏水混合，设定反应温度为35℃，反应体系pH为4，超声酶解1 h；
2） 过滤固液混合物，收集滤液，旋转蒸发至约50~60 mL，向浓缩液中加入2倍量无水乙醇，静置，收集沉淀，沉淀用水复溶，向溶液中加入1/2Sevage试剂（氯仿-正丁醇=4:1），充分摇匀混合后收集水层，重复2次，合并水层；再加入固液比为0.3 g：100 ml的活性炭粉末，在80 ℃下水浴15 min，连续搅拌再离心得到除蛋白、脱色巴戟天多糖溶液，冷冻干燥16h，得到巴戟天多糖；
3） 取巴戟天多糖，亚硒酸钠固体和蒸馏水，配制50 mg/mL巴戟天多糖溶液和2mol/L亚硒酸钠溶液；
4） 取50 mL比色管，向比色管中加入2 mL巴戟天多糖溶液和5 mL亚硒酸钠溶液，振荡混合均匀，在60 ℃下预热10 min，随后趁热加入5 mol/L抗坏血酸溶液10 mL，使反应体系中亚硒酸钠和抗坏血酸的摩尔比为1:5，振荡混合均匀，加水至50 mL刻度；
5） 设定反应时水浴温度为65 ℃，反应时间为2.5 h，反应结束后将反应液旋转蒸发浓缩，浓缩液用流动蒸馏水透析72 h（透析袋：1kDa），收集未透过液，冷冻干燥14 h，得到巴戟天多糖纳米硒固体。
实施例2
1） 取巴戟天粉末100 g，纤维素酶0.9 g，果胶酶1.6 g，木瓜蛋白酶1.2 g，上述四者与600 mL蒸馏水混合，设定反应温度为40 ℃，反应体系pH为4，超声酶解1.5 h；
2） 过滤固液混合物，收集滤液，旋转蒸发至约60~70 mL，向浓缩液中加入2倍量无水乙醇，静置，收集沉淀，沉淀用水复溶，向溶液中加入1/3Sevage试剂（氯仿-正丁醇=4:1），充分摇匀混合后收集水层，重复3次，合并水层；再加入固液比为0.2 g：100 ml的活性炭粉末，在50 ℃下水浴40 min，连续搅拌再离心得到除蛋白、脱色巴戟天多糖溶液，冷冻干燥18h，得到巴戟天多糖；
3） 取巴戟天多糖，亚硒酸钠固体和蒸馏水，配制50 mg/mL巴戟天多糖溶液和2mol/L亚硒酸钠溶液；
4） 取50 mL比色管，向比色管中加入2.5 mL巴戟天多糖溶液和10 mL亚硒酸钠溶液，振荡混合均匀，在50 ℃下预热15 min，随后趁热加入5 mol/L抗坏血酸溶液8 mL，使反应体系中亚硒酸钠和抗坏血酸的摩尔比为1:2，振荡混合均匀，加水至50 mL刻度；
5） 设定反应时水浴温度为45 ℃，反应时间为7 h，反应结束后将反应液旋转蒸发浓缩，浓缩液用流动蒸馏水透析72 h（透析袋：1kDa），收集未透过液，冷冻干燥18 h，得到巴戟天多糖纳米硒固体。
实施例3
1） 取巴戟天粉末100 g，纤维素酶1.9 g，果胶酶1.8 g，木瓜蛋白酶1.5 g，上述四者与500 mL蒸馏水混合，设定反应温度为65 ℃，反应体系pH为6，超声酶解3 h；
2） 过滤固液混合物，收集滤液，旋转蒸发至约50~60 mL，向浓缩液中加入2倍量无水乙醇，静置，收集沉淀，沉淀用水复溶，向溶液中加入1/3Sevage试剂（氯仿-正丁醇=4:1），充分摇匀混合后收集水层，重复3次，合并水层；再加入固液比为0.2 g：100 ml的活性炭粉末，在50 ℃下水浴40 min，连续搅拌再离心得到除蛋白、脱色巴戟天多糖溶液，冷冻干燥18h，得到巴戟天多糖；
3） 取巴戟天多糖，亚硒酸钠固体和蒸馏水，配制50 mg/mL巴戟天多糖溶液和2mol/L亚硒酸钠溶液；
4） 取50 mL比色管，向比色管中加入1 mL巴戟天多糖溶液和5 mL亚硒酸钠溶液，振荡混合均匀，在50℃下预热15 min，随后趁热加入5 mol/L抗坏血酸溶液14 mL，使反应体系中亚硒酸钠和抗坏血酸的摩尔比为1:7，振荡混合均匀，加水至50 mL刻度；
5） 设定反应时水浴温度为55 ℃，反应时间为6 h，反应结束后将反应液旋转蒸发浓缩，浓缩液用流动蒸馏水透析72 h（透析袋截留分子量1kDa），收集未透过液，冷冻干燥24h，得到巴戟天多糖纳米硒固体。
对比例1
1） 取巴戟天粉末100 g，纤维素酶0.5 g，上述两者与150 mL蒸馏水混合，设定反应温度为40 ℃，反应体系pH为4.5，超声酶解1 h；
2） 过滤固液混合物，收集滤液，旋转蒸发至约5~10 mL，向浓缩液中加入2倍量无水乙醇，静置，收集沉淀，沉淀用水复溶，向溶液中加入1/2Sevage试剂（氯仿-正丁醇=4:1），充分摇匀混合后收集水层，重复2次，合并水层；再加入固液比为0.3 g：100 mL的活性炭粉末，在80 ℃下水浴15 min，连续搅拌再离心得到除蛋白、脱色巴戟天多糖溶液，冷冻干燥16h；
3）使用纤维素酶单一酶解，巴戟天多糖得率比三种复合酶共同提取低10 %。
对比例2
1） 取巴戟天粉末100 g，纤维素酶0.9 g，木瓜蛋白酶0.6 g，上述三者与150 mL蒸馏水混合，设定反应温度为40 ℃，反应体系pH为4.5，超声酶解1 h；
2） 过滤固液混合物，收集滤液，旋转蒸发至约5~10 mL，向浓缩液中加入2倍量无水乙醇，静置，收集沉淀，沉淀用水复溶，向溶液中加入1/2Sevage试剂（氯仿-正丁醇=4:1），充分摇匀混合后收集水层，重复2次，合并水层；再加入固液比为0.3 g：100 ml的活性炭粉末，在80 ℃下水浴15 min，连续搅拌再离心得到除蛋白、脱色巴戟天多糖溶液，冷冻干燥16h；
3）使用纤维素酶和木瓜蛋白酶进行酶解，巴戟天多糖得率比三种复合酶共同提取低7 %。
巴戟天多糖纳米硒颗粒表征分析
使用实施例2步骤5）中的粉末状的样品，进行红外光谱扫描；
将实施例2步骤5）中的粉末状样品重新加蒸馏水溶解，配制成2 mg/mL巴戟天多糖纳米硒溶液，进行Zeta电位分析、紫外光谱扫描、扫描电镜形貌观察；
结果如图所示。纳米粒子溶液稳定性要求通常为20 mV左右，巴戟天多糖纳米Zeta电位结果为-21.17±0.47 mV；研究发现，纳米硒粒子平均直径在100 nm以下，紫外吸收峰在300 nm之内，通过紫外光谱（图2）可以发现，巴戟天多糖纳米硒在266 nm处有最大吸收峰，明显区别于巴戟天多糖和亚硒酸钠；通过透射电镜观察不同视野中的巴戟天多糖纳米硒（图3），确定其形状为圆形、直径约40~80 nm。
通过红外光谱（图4、图5）可发现，纳米硒和巴戟天多糖共有特征峰如下：在3238.79 cm-1和3257.26 cm-1有O-H伸缩振动吸收峰，在1591.96 cm-1和1594.16 cm-1的特征峰与结合水有关，在1405.70 cm-1和1404.00 cm-1有吡喃糖环的CH2剪切振动峰，在1400 cm-1~1200 cm-1都有吡喃环C-H变角振动峰，在1026.27 cm-1和1022.54 cm-1有吡喃环C-O-C伸缩振动峰，在929.01 cm-1和934.58 cm-1有D-吡喃葡萄糖的不对称环伸缩振动峰，在871.16cm-1和876.54 cm-1有次甲基的横向振动峰，在829.19 cm-1和818.71 cm-1有呋喃环C-H变角振动峰，从以上共有峰可以看出纳米硒粒子和巴戟天多糖紧密结合在一起，其中，形成巴戟天多糖纳米硒后，O-H振动吸收峰由3257.26 cm-1向低波数处移动至3238.79 cm-1，且峰宽度增加，证明有氢键缔合物形成，纳米硒在668.94 cm-1处有一弱尖峰，为Se-H吸收峰，进一步证明纳米硒粒子与多糖之间形成了硒氢键缔合物。
综上所述，巴戟天多糖纳米硒的形状为立体圆形，直径约40~80 nm，其形貌稳定，可以在溶液中稳定分散，巴戟天多糖与纳米粒子之间通过氢键稳定缔合，说明巴戟天多糖是一种良好的纳米粒子生物分散剂。
巴戟天多糖纳米硒颗粒的抗癌应用
本实施例所用的巴戟天多糖和巴戟天多糖纳米硒颗粒均由实施例2获得。
1） 在96孔板中配制100 μL的癌细胞（HepG2/PC9/MCF-7/HCT-8/AGS）悬液。将培养板放在培养箱预培养24 h（培养条件37 ℃，5％CO2）。
2）向培养板加入含不同浓度巴戟天多糖或巴戟天多糖纳米硒溶液的100μL培养基，将培养板在培养箱孵育72 h。
3）吸去之前的含药培养基，向每孔加入100 μL新配制的含10％CCK-8的培养基，将培养板在培养箱内孵育1 h。
4）用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，然后根据下式计算细胞毒性活力。
细胞毒性活力（％）=[A(加药)-A（空白）]/ [A（0加药）-A（空白）]×100
A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度。
A（空白）：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度。
A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。
结果如表2和图6所示，巴戟天多糖纳米硒对人肝癌细胞（HepG2）的抑制作用最明显，在给药浓度为3.125 μg/mL时，对HepG2细胞的抑制率为74.79±4.49％；在给药浓度为100 μg/mL时，对HepG2细胞的抑制率为91.07±1.44％；在给药浓度为400 μg/mL时，对HepG2细胞的抑制率为97.48±0.22％。
巴戟天多糖纳米硒对人胃癌细胞（AGS）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人肺癌细胞（PC9）的抑制作用较明显，在给药浓度为25 μg/mL时，对AGS细胞的抑制率为50.81±2.89％，对MCF-7细胞的抑制率为52.91±1.64％；在给药浓度为50 μg/mL时，对PC9细胞的抑制率为54.47±3.27％；在给药浓度为400 μg/mL时，对AGS细胞的抑制率为94.74±1.04％，对MCF-7细胞的抑制率为95.24±0.90％，对PC9的抑制率为82.45±4.15％。此外，巴戟天多糖纳米硒对人回盲肠癌细胞（HCT-8）有一定的抑制作用，在给药浓度为400 μg/mL时，对HCT-8细胞的抑制率为62.41±1.38％。
表 1 巴戟天多糖纳米硒对不同种类癌细胞的抑制作用结果（％）
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种巴戟天多糖纳米硒，其特征在于，其制备方法包含以下步骤：
将巴戟天粉末和纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶混合酶解，然后过滤浓缩醇沉，收集沉淀后去除蛋白，纯化干燥得到巴戟天多糖；
取巴戟天多糖与亚硒酸钠溶液预热混合，然后向巴戟天多糖混合溶液中加入抗坏血酸溶液进行还原反应，反应液浓缩，蒸馏水透析，冷冻干燥得到巴戟天多糖纳米硒。
2.根据权利要求1所述的巴戟天多糖纳米硒，其特征在于，所述纤维素酶的用量为巴戟天粉末质量的0.5 %～2 %，所述果胶酶的用量为巴戟天粉末质量的0.5 %～2 %，所述木瓜蛋白酶的用量为巴戟天粉末质量的0.5 %～2 %。
3.根据权利要求1所述的巴戟天多糖纳米硒，其特征在于，所述酶解反应的条件为：反应温度为30～70 ℃，反应时间为1～4 h，反应pH为3～6。
4.根据权利要求1所述的巴戟天多糖纳米硒，其特征在于，所述巴戟天多糖混合溶液中的巴戟天多糖的浓度为1～10 g/L，亚硒酸钠的浓度为0.1～1 mol/L。
5.根据权利要求4所述的巴戟天多糖纳米硒，其特征在于，所述巴戟天多糖混合溶液中，巴戟天多糖和亚硒酸钠的混合比为：(5～10 g)巴戟天多糖：1 mol 亚硒酸钠。
6.根据权利要求1所述的巴戟天多糖纳米硒，其特征在于，所述巴戟天多糖与亚硒酸钠溶液的预热温度为30～60 ℃，预热时间为10～40 min。
7.根据权利要求1～6任一项所述的巴戟天多糖纳米硒，其特征在于，所述亚硒酸钠与抗坏血酸的摩尔比为1：（1～10）。
8.根据权利要求1～6任一项所述的巴戟天多糖纳米硒，其特征在于，所述还原反应的温度为20～80 ℃，反应时间为1～8 h。
9.权利要求1～8任一项所述巴戟天多糖纳米硒在抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为人肝癌细胞、人肺癌细胞、人乳腺癌细胞、人回盲肠癌细胞以及人胃癌细胞。
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