CN104116026A - 盐制巴戟天多糖在制备具有辅助抑制前列腺癌功效的功能食品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了盐制巴戟天多糖在制备具有辅助抑制前列腺癌功效的功能食品中的应用，其中盐制巴戟天多糖优选通过以下方法制备获得：以巴戟天为原料，经含盐制、沸水提取、去蛋白、透析和乙醇处理工序制备获得，所述的巴戟天多糖具有调节肿瘤微环境的作用，本发明中的盐制巴戟天多糖可以通过抑制肿瘤新生血管生成、免疫抑制及抑制前列腺癌成纤维细胞生长等多途径调节肿瘤微环境，表明其具有良好的辅助抑制前列腺癌肿瘤作用。
Description
技术领域
本发明属于多糖技术领域，具体涉及一种盐制巴戟天多糖在制备具有辅助抑制前列腺癌功效的功能食品中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是当前危害人类健康的严重疾病，化学治疗是应用于恶性肿瘤全身治疗的主要方法之一，但大部分抗肿瘤化学药物在杀死肿瘤细胞的同时，也严重损伤了正常细胞，因此寻找高效低毒的抗肿瘤药物具有重要意义。而近年来的研究发现，多糖就具有显著地抗肿瘤活性并且对人体的毒副作用相对较小，对多糖的生物活性研究在医学领域已经成为国内外专家学者研究的热点。近年发现一些多糖及其复合物对多种疾病，如免疫紊乱、癌症、糖尿病、高血压、肝炎、血栓、肺炎、病毒等都具有显著疗效，并且参与细胞各种生命现象的调节。大量药理和临床试验表明多糖类化合物是优良的免疫调节剂，能增加巨噬细胞和白细胞的吞噬功能、诱导产生细胞坏死因子（TNF）和白细胞素，从而提高人体的免疫功能，并且对正常细胞几乎无毒副作用。
巴戟天出自《神农本草经》，别名鸡肠风、鸡眼藤、三角藤。为茜草科巴戟天属的植物。生长于山谷林下，分布于中国南方等地，主要功能为补肾助阳；强筋壮骨；祛风除湿。目前尚未有人以巴戟天为原料获得多糖，并用于辅助抑制前列腺癌的开发。
发明内容
本发明的目的在于提供盐制巴戟天多糖在制备具有辅助抑制前列腺癌功效的功能食品中的应用。
其中所述的辅助抑制前列腺癌功效是指通过抑制前列腺癌肿瘤新生血管生成、免疫抑制及抑制前列腺癌成纤维细胞生长功效，调节前列腺癌肿瘤微环境，从而起到辅助抑制前列腺癌功效。
作为本发明的一种实施方式，本发明中的巴戟天多糖优选通过以下方法制备获得：所述的盐制巴戟天多糖通过以下方法制备获得：以巴戟天为原料，经含盐制、沸水提取、去蛋白、透析和乙醇处理工序制备获得，所述的巴戟天多糖具有调节肿瘤微环境的作用。
作为本发明的一种优选的实施方式，本发明所述的巴戟天多糖具体通过以下方法制备获得：所述的巴戟天多糖具体通过以下方法制备获得：以巴戟天为原料，盐制后，用沸水多次提取，合并提取液，将提取液浓缩得浓缩液，在浓缩液中加入三氯乙酸水溶液进行去蛋白处理，去蛋白后将反应液进行中和、扎袋透析处理，将透析袋内反应液进行浓缩、离心处理，取上清液加入乙醇进行醇沉、干燥处理，即得巴戟天多糖。
本发明在巴戟天多糖的制备过程中，各工序的具体参数优选如下：
盐制时，在巴戟天原料中加入质量百分含量为20%的盐水浸泡40~60分钟后，再调节压力为0.10~0.12 MPa蒸制1~2 h，对巴戟天原料进行盐制。
盐制巴戟天可以增加有效成分多糖含量。
沸水提取时，提取次数为1 ~5 次，每次提取时沸水的用量为巴戟天总质量的5~20 倍，每次提取时间为1.5~5 h。
沸水提取时，沸水的用量优选为巴戟天总质量的5~20 倍，提取次数较佳为3 次，其中第一次提取时，沸水的用量优选为原料巴戟天总质量的10~20 倍，提取2~5 h；第二次提取时，沸水的用量优选为原料巴戟天总质量的10~20 倍，提取1.5~ 5h；第三次提取时，沸水的用量优选为原料巴戟天总质量的10~20倍，提取1.5~ 5 h。
将提取液优选浓缩至原提取液总体积的约1/10得浓缩液。
本发明所述的三氯乙酸水溶液的质量百分含量优选为35%，去蛋白处理时间优选为3~6 h，三氯乙酸水溶液的体积优选与浓缩液的体积相同。
中和处理时可以采用质量百分含量为10%的氢氧化钠水溶液。
扎袋透析处理时优选采用截留分子量3500Da的透析袋进行透析处理。
乙醇进行醇沉处理时优选采用体积百分含量优选为70~ 95%的乙醇水溶液。
浓缩可以采用多种现有技术中的浓缩方式，其中以真空浓缩最佳。真空浓缩时温度优选为40℃。
本发明中的巴戟天多糖，可以直接口服，也可以制成药剂学上所说的多种剂型，如胶囊型、片剂、粉剂、颗粒剂或口服液等，食用后具有辅助抑制前列腺癌肿瘤的功效。
因此，本发明所述功能食品的剂型优选为胶囊型、片剂、粉剂、颗粒剂或口服液等。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）本发明中的巴戟天多糖，其纯度和活性高，可以通过抑制肿瘤新生血管生成、免疫抑制及抑制前列腺癌成纤维细胞生长等多途径调节肿瘤微环境，其具有良好的辅助抑制前列腺癌肿瘤作用；
（2）本发明中的巴戟天多糖的制备方法，工艺简单稳定高效，适合工业化生产，成本低；
（3）本发明中的巴戟天多糖，可以用于制备具有辅助抑制前列腺癌肿瘤功效的功能食品。
附图说明
图1是本发明实施例4中巴戟天多糖可抑制BMP2诱导的带有BRE报告基因的荧光素酶的活性；
图2是本发明实施例5中巴戟天多糖可抑制TGFβ诱导的带有SMAD2/3/4报告基因活性；
图3是本发明实施例6中巴戟天多糖可抑制带有NF-кB报告基因的荧光素酶的活性；
图 4是本发明实施例7中巴戟天多糖可抑制前列腺癌成纤维细胞的生长。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。
以下实施例中采用的各原料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1
本实施例中的巴戟天多糖，通过以下方法制备获得：取巴戟天原料，在质量百分含量为20. 0 %的 盐水浓度中浸泡45 min后，在0. 10 MPa 压力下，蒸制1. 5 h，进行盐制，盐制后巴戟天多糖，采用沸水提取，第一次提取时，水的用量为原料总质量的20倍，煮沸5 h ；第二次提取时，水的用量为原料总质量的20倍，煮沸3 h；第三次提取时，水的用量为原料总质量的10倍，煮沸2 h过滤，合并滤液，真空浓缩至原来体积的大约1/10。将浓缩液进行三氯乙酸除蛋白处理，加入同体积（下同）的30%三氯乙酸(质量百分比)，处理时间为4 h后，用 10% NaOH（质量百分比）中和，下同，中和后将反应液置于透析袋中扎袋透析，透析时透析袋的截留分子量通常约为3500Da，下同，然后将透析袋内液浓缩，离心，取上清液加入3~4倍体积的85%乙醇水溶液（体积百分含量）进行醇沉淀处理，取沉淀物经含真空干燥（约40℃，下同）处理得巴戟天多糖组分。
实施例2
本实施例中的巴戟天多糖，通过以下方法制备获得：取巴戟天原料，采用质量百分含量为20. 0 % 的盐水浓度浸泡60 min后，0. 11 MPa 压力下，蒸制1. 5 h，进行盐制，盐制后巴戟天多糖，采用沸水提取，第一次提取时，水的用量为巴戟天原料总质量的15倍，煮沸5 h ；第二次提取时，水的用量为巴戟天原料总质量的15倍，煮沸3 h；第三次提取时，水的用量为巴戟天原料总质量的10倍，煮沸3 h过滤，合并滤液，真空浓缩。将浓缩液进行三氯乙酸除蛋白处理，加入同体积的25%三氯乙酸(质量百分比)，处理时间为3 h后，用 10% NaOH（质量百分比）中和，中和后将反应液置于透析袋中扎袋透析，然后将透析袋内液浓缩，离心，取上清液加入3~4倍体积的70%乙醇水溶液（体积百分含量）进行醇沉淀处理，取沉淀物经含真空干燥处理得巴戟天多糖组分。
实施例3
本实施例中的巴戟天多糖，通过以下方法制备获得：取巴戟天原料，采用质量百分含量为20. 0 % 的盐水浓度中浸泡50 min后，在0. 12 MPa 压力下，蒸制1. 5 h，进行盐制。盐制后巴戟天多糖，第一次提取时，水的用量为巴戟天原料总质量的10倍，煮沸3 h ；第二次提取时，水的用量为巴戟天原料总质量的20 倍，煮沸3 h；第三次提取时，水的用量为巴戟天原料总质量的10倍，煮沸5 h过滤，合并滤液，真空浓缩，将浓缩液进行三氯乙酸除蛋白处理，加入同体积的15%三氯乙酸(质量百分比)，处理时间为5 h后，用 10% NaOH（质量百分比）中和，中和后将反应液置于透析袋中扎袋透析，然后将透析袋内液浓缩，离心，取上清液加入3~4倍体积的95%乙醇水溶液（体积百分含量）进行醇沉淀处理，取沉淀物经含真空干燥处理得巴戟天多糖组分。
实施例4 巴戟天多糖可抑制BMP2诱导的带有BRE报告基因的荧光素酶的活性
C2C12细胞株购自中科院细胞库，C2C12- pGF1-BRE细胞株由中国科学院上海药物研究所丁侃实验室构建，保存于液氮中。C2C12- pGF1-BRE细胞用含10 % Gibco胎牛血清DMEM 培养基培养，置于37℃饱和湿度、含5% CO2的恒温箱中培养，以1×104细胞/孔的密度接种于96孔板内，每孔100 μL 。贴壁24 h后吸去60 μL培养基，加配置好相应浓度的样品50 mL(实施例1中制备的巴戟天多糖)，终浓度分别为0.5 mg/mL、0.1 mg/mL、0.02 mg/mL，10 μLBMP2调整至终浓度200 ng/mL。同时设空白组和BMP2组对照。给药16 h后吸去培养基，加20 μL Reporter Lysis 1X Buffer，将溶解的细胞裂解液20 μL转移至白板，加入40 μL luciferase底物，于3分钟内读板，读取RLU值。采用SPSS 统计软件进行统计学处理。数据均以均数±标准差(.x ±s) 表示，两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。
实验结果如图1所示，巴戟天多糖在0.5 mg/mL低浓度下具有抑制BMP2诱导的带有BRE报告基因的荧光素酶的活性，且该活性具有剂量依赖性。已知肿瘤新生血管生成在肿瘤的发生发展过程中起着关键作用，而BMP2信号通路在肿瘤新生血管生成过程中起关键作用。该多糖可显著抑制BMP2信号通路，表明该多糖具有潜在的可调节肿瘤微环境的功效。
实施例5 巴戟天多糖可抑制TGFβ诱导的带有SMAD2/3/4报告基因活性
HEK293T细胞株购自中科院细胞库，HEK293T-pGF1-SMAD2/3/4细胞株由中国科学院上海药物研究所丁侃实验室构建，保存于液氮中。HEK293T-pGF1-SMAD2/3/4细胞用含10% Gibco胎牛血清DMEM 培养基培养，置于37℃饱和湿度、含5% CO2的恒温箱中培养，以2×104细胞/孔的密度接种于96孔板内，每孔100 μL。贴壁24 h后吸去60 μL培养基，加配置好相应浓度的样品50 mL(来自实施例1中的样品)，终浓度分别为0.5 mg/mL、0.1 mg/mL、0.02 mg/mL，10 μLTGFβ1调整至终浓度50 ng/mL。同时设空白组和TGFβ1组对照。给药16hr后吸去培养基，加20 μLReporter Lysis 1X Buffer，将溶解的细胞裂解液20 μL转移至白板，加入40 μL luciferase底物，于3分钟内读板，读取RLU值。采用SPSS 统计软件进行统计学处理。数据均以均数±标准差(.x ±s) 表示，两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。
实验结果如图2所示，巴戟天多糖在0.5mg/mL低浓度下具有抑制TGFβ诱导的带有SMAD2/3/4信号通路，且具有剂量依赖性。已知肿瘤新生血管生成在肿瘤的发生发展过程中起着关键作用，而TGFβ诱导的SMAD2/3/4信号通路在肿瘤新生血管生成过程中起关键作用。该多糖可显著抑制该信号通路，表明该多糖具有潜在的可调节肿瘤微环境的功效。
实施例6 巴戟天多糖能抑制带有NF-кB报告基因的荧光素酶的活性
THP-1细胞株购自中科院细胞库，THP-1/pGF1-NF-кB细胞株由中国科学院上海药物研究所丁侃实验室构建，保存于液氮中。THP-1/pGF1-NF-кB细胞用含10%胎牛血清RPMI-1640培养基培养。置于37 ℃饱和湿度、含5% CO2的恒温箱中培养，以5×104细胞/孔的密度接种于96孔板内，每孔50 μL容积。加入受试样品50 μL（实施例1中的样品），终浓度分别为0.5 mg/mL、0. L mg/mL、0.02 mg/mL，同时设立空白组和LPS对照组。加入LPS溶液10 μL，终浓度为1 μg/mL，置于37℃饱和湿度、含5% CO2的恒温箱中培养过夜。培养过夜后，每空加入100 μL Bright-GloTM Luciferase Assay System底物，于酶标仪读板，读取RLU值。
采用SPSS 统计软件进行统计学处理。数据均以均数±标准差(.x ±s) 表示,两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。
实验结果如图3所示，该多糖在0.5 mg/mL低浓度下具有较好的抑制NF-кB信号通路的活性。已知NF-кB是参与一系列基因表达调控的关键性核转录因子，其在癌症的起源、发展、血管新生及转移中具有重要作用，并与癌症耐药性的产生密切相关。NF-кB激活后通过不同的途径参与这些过程，而阻断NF-кB的作用可抑制癌症的发生。因此，该多糖可通过抑制NF-кB信号通路，从而发挥潜在的可调节肿瘤微环境的功效。
实施例7 巴戟天多糖可抑制前列腺癌成纤维细胞的生长
前列腺癌相关成纤维细胞（CAF）由南开大学生命科学院惠赠。细胞接种于96孔板，细胞密度为1×104/孔。将实施例1中的巴戟天多糖溶于DMEM+/+培养基中，使其浓度为1.0 mg/mL。培养8天，采用CCK检测试剂盒（北京庄盟生物公司）测定细胞生长状态。每种多糖样本量为3。
统计学分析：计量数据多组间比较采用方差分析，首先对数据进行方差齐性检验，计算Levene统计值，若方差齐，则进行组间多重比较，方法为LSD和Dunnett，若方差不齐，则采用校正方法Dennett。统计软件为SPSS17.0，显著性水平为α=0.05。
巴戟天多糖活性测定结果如图4所示，巴戟天多糖在0.5 mg/mL的浓度下可显著抑制前列腺癌CAF的生长。
综上实验证明本发明中的巴戟天多糖可通过抑制肿瘤新生血管生成、免疫抑制及抑制前列腺癌成纤维细胞生长等多途径调节肿瘤微环境，并进一步发挥潜在的抗前列腺癌肿瘤活性，从而可以将巴戟天多糖通过常规工艺，制成药剂学上所说的多种剂型，用于制备具有辅助抑制前列腺癌功效的功能食品，功能食品的剂型可以为胶囊型、片剂、粉剂、颗粒剂或口服液等。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
Claims (10)
1.盐制巴戟天多糖在制备具有辅助抑制前列腺癌功效的功能食品中的应用。
2.根据权利要求1所述的盐制巴戟天多糖在制备具有辅助抑制前列腺癌功效的功能食品中的应用，其特征是：所述的辅助抑制前列腺癌功效是指通过抑制前列腺癌肿瘤新生血管生成、免疫抑制及抑制前列腺癌成纤维细胞生长功效，调节前列腺癌肿瘤微环境，从而起到辅助抑制前列腺癌功效。
3.根据权利要求1所述的盐制巴戟天多糖在制备具有辅助抑制前列腺癌功效的功能食品中的应用，其特征是：所述的盐制巴戟天多糖通过以下方法制备获得：以巴戟天为原料，经含盐制、沸水提取、去蛋白、透析和乙醇处理工序制备获得，所述的巴戟天多糖具有调节肿瘤微环境的作用。
4.根据权利要求3所述的盐制巴戟天多糖在制备具有辅助抑制前列腺癌功效的功能食品中的应用，其特征是：所述的巴戟天多糖具体通过以下方法制备获得：以巴戟天为原料，盐制后，用沸水多次提取，合并提取液，将提取液浓缩得浓缩液，在浓缩液中加入三氯乙酸水溶液进行去蛋白处理，去蛋白后将反应液进行中和、扎袋透析处理，将透析袋内反应液进行浓缩、离心处理，取上清液加入乙醇进行醇沉、干燥处理，即得巴戟天多糖。
5.根据权利要求4所述的盐制巴戟天多糖在制备具有辅助抑制前列腺癌功效的功能食品中的应用，其特征是：盐制时，在巴戟天原料中加入质量百分含量为20%的盐水浸泡40~60分钟后，再调节压力为0.10~0.12 MPa蒸制1~2 h，对巴戟天原料进行盐制。
6.根据权利要求4所述的盐制巴戟天多糖在制备具有辅助抑制前列腺癌功效的功能食品中的应用，其特征是：沸水提取时，提取次数为1 ~5 次，每次提取时沸水的用量为巴戟天总质量的5~20 倍，每次提取时间为1.5~5 h。
7.根据权利要求4所述的盐制巴戟天多糖在制备具有辅助抑制前列腺癌功效的功能食品中的应用，其特征是：去蛋白时采用三氯乙酸水溶液，所述三氯乙酸水溶液的质量百分含量为35%，处理时间为3~6 h。
8.根据权利要求4所述的盐制巴戟天多糖在制备具有辅助抑制前列腺癌功效的功能食品中的应用，其特征是：乙醇处理时采用体积百分含量为70~95% 的乙醇水溶液。
9.根据权利要求4所述的盐制巴戟天多糖在制备具有辅助抑制前列腺癌功效的功能食品中的应用，其特征是：透析时透析袋的截留分子量为3500Da。
10.根据权利要求1所述的盐制巴戟天多糖在制备具有辅助抑制前列腺癌功效的功能食品中的应用，其特征是：所述功能食品的剂型为胶囊型、片剂、粉剂、颗粒剂或口服液。
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