CN105287704A - 一种抗癌药物组合物及其在制备抗癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗癌药物组合物及其在制备抗癌药物中的应用，本发明药物组合物包括有以下重量份比的原料：槐角总黄酮提取物10~50份，5-氟尿嘧啶0.01~0.05份，其中槐角总黄酮提取物是以秋季采摘的槐角为原料，先后以80%、60%和40%体积分数的乙醇为溶剂进行梯度萃取，经超声提取、纯化而得。本发明药物组合物具有良好的协同作用，其在抑制癌细胞活性方面的效果明显优于单一药物对癌细胞活性的抑制效果，且其毒副作用小。以本发明药物组合物为活性成分制备成各种药物制剂，可为临床治疗各种癌症提供新的用药选择，尤其是为人食道癌的治疗提供新的选择。

Description

一种抗癌药物组合物及其在制备抗癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种含天然植物提取物的药物组合物及其在制备抗癌药物中的应用。

背景技术

5-氟尿嘧啶是目前公认的疗效确切的抗癌药物，其在临床上也早已广泛应用于治疗消化系癌(胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、食管癌等)、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、膀胱癌、肺癌、皮肤癌、头颈部癌等各种癌症，在肿瘤内科治疗中占有重要地位。5-氟尿嘧啶为抗代谢药，其在细胞内转化为氟尿嘧啶脱氧核苷酸后，通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成，其对RNA的合成也有一定抑制作用。此外，5-氟尿嘧啶的代谢物也可以伪代谢物形式掺入到RNA和DNA中，影响细胞功能，产生细胞毒性。但是，5-氟尿嘧啶的毒性较大，使用者常伴随有食欲不振、呕吐、脱发、白细胞减少、血小板下降等不良反应，有时会发生严重的毒副作用，甚至死亡。

槐角(FructusSophorae)是《中华人民共和国药典》(以下简称药典)收载的常用中药材，为豆科植物槐(SophorajaponicaL.)的干燥成熟果实。按照药典规定，药用槐角通常应采用冬季采收的成熟荚果。中医理论认为，槐角性寒、味苦，归肝、大肠经，有清热泻火、凉血止血的功能，适用于肠热便血，痔肿出血，肝热头痛，眩晕目赤。关于槐角的化学研究早有报道，应用LC/MS方法研究发现槐角中的黄酮化合物有27种，而这些黄酮类化合物水解后的苷元主要有4种，分别是槲皮素(quercetin)、染料木素(genistein)、山奈酚(kaempferol)和异鼠李素(isorhamnetin)。现代医学研究表明，槐角黄酮类成分除用于预防或治疗骨质疏松症、女性更年期综合症、老年痴呆症、高血脂症、高血压症、冠心病、脑血栓等病症以及用于抗衰老和防止皮肤老化、面部色斑或雀斑等方面外，还具有抗增殖、抗肿瘤活性的特性。近年来，人们对槐角中的黄酮类化合物做了大量的研究，但在抗肿瘤方面的研究却相对较少，且其药理活性相对较弱，不能满足临床需要。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种具有良好协同作用的抗癌药物组合物。

本发明的目的之二是提供一种该药物组合物在制备抗癌药物中的应用。

本发明的目的是这样实现的：

一种抗癌药物组合物，它由以下重量份比的原料药组成：

槐角总黄酮提取物10～50份，5-氟尿嘧啶0.01～0.05份。

优选地，本抗癌药物组合物由以下重量份比的原料药组成：

槐角总黄酮提取物50份，5-氟尿嘧啶0.01份。

其中所述的槐角总黄酮提取物按照以下步骤制备：

a、取秋季槐角果夹，洗净，吸干水分，50～60℃烘干，备用；

b、干燥后的槐角果夹加入80％乙醇，浸渍2～3天，过滤，得乙醇浸渍液；将滤出的槐角果夹，除去其中的种子，留取槐角皮，然后将槐角皮和乙醇浸渍液置于匀浆机中，加入5～8倍体积的80％乙醇，高速匀浆，得槐角皮匀浆液；

c、将槐角皮匀浆液置于超声波提取器中超声提取1次，离心留上清液，所得残渣用6倍体积量的60％乙醇超声提取1次，离心留上清液；所剩残渣再加入6倍体积量的40％乙醇超声提取1次，离心留上清液，合并上述各上清液；

d、将合并后的上清液进行真空抽滤，得到总黄酮粗提物；

e、将总黄酮粗提物溶于水中，离心过滤，去除不溶物，滤液上大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗去除多糖，再用65％～70％乙醇洗脱，收集洗脱液；将洗脱液加温真空旋转蒸发去除乙醇溶液，干燥即得到槐角总黄酮提取物。

槐角总黄酮提取物的定性定量方法可采用以下方法进行：

定性分析

对所得槐角总黄酮提取物进行紫外光谱分析，取槐角总黄酮提取物，配制成0.01mg/mL溶液，应用紫外-可见分光光度计，在200～500nm波长范围进行扫描，所得槐角总黄酮提取物具有两个主峰，其中之一出现在240～280nm处，为由A-环苯酰系统引起的吸收峰，另一个在330～400nm处，为由B-环肉桂酰系统引起的吸收峰。

定量分析采用RP-HPLC法

黄酮标准品溶液制备：应用甲醇(色谱纯)配制浓度分别为30μg/mL，30μg/mL，30μg/mL，20μg/mL的槲皮素、染料木素、山奈酚和异鼠李素4种标准黄酮化合物溶液(槲皮素、山柰酚、染料木素与异鼠李素标准品为中国药品生物制品检定所产品，批号分别为100081-200406、110861-200606、111704-200501、110860-201109)。

样品处理：取100mg槐角总黄酮提取物，溶解在50mL甲醇-25％HCl(4:1)中，回流30min，加甲醇定容至100mL，样品用0.22μm滤膜过滤备用，用前适当稀释。

色谱条件：应用高效液相色谱仪(美国Waters1525，配置高压双泵、2487型双波长紫外检测器和Breeze色谱数据系统)，选用DiamonsilC18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为50％甲醇-0.2％磷酸-(v/v)，流速为1.0mL·min^-1，检测波长为360nm，仪器灵敏度：0.00001AUFS，柱温：室温(20℃)，进样量10μL。

根据黄酮标准品和水解的槐角总黄酮提取物HPLC色谱图计算各峰面积积分值，并将积分值代入对照品回归方程分别计算槲皮素、染料木素、山柰酚与异鼠李素的含量。计算公式为：黄酮化合物(mg)/每克(g)槐角总黄酮提取物＝槐角总黄酮提取物中某黄酮化合物的峰面积积分值/某标准黄酮化合物的峰面积积分值×某标准黄酮化合物的含量×稀释倍数。所述槐角总黄酮提取物中槲皮素、染料木素、山奈酚、异鼠李素四种组分的质量比为2～3∶14～16∶15～17∶0.5～1。

本发明所提供的抗癌药物组合物，对人体癌细胞具有非常显著的协同抑制作用。据此可有效降低5-氟尿嘧啶的使用剂量，从而有效降低5-氟尿嘧啶的毒副作用。由此可为临床提供一种疗效更优的抗癌药物选择。

本发明所述抗癌药物组合物在人食道癌细胞Eca-109具有更好的活性，因此本发明所述组合物可在制备人食道癌药物中得到应用。

本发明药物组合物在制剂应用中，可以本发明所述槐角总黄酮提取物以及5-氟尿嘧啶为活性成分，按照常规的制剂技术添加常规的药用辅料，由此制备成各种临床用药物制剂。

本发明药物组合物具有良好的协同作用，其在抑制癌细胞活性方面的效果明显优于单一药物(即单独使用槐角总黄酮提取物或单独使用5-氟尿嘧啶)对癌细胞活性的抑制效果，且本药物组合物中5-氟尿嘧啶的占比非常小，故本药物组合物毒副作用小，而槐角本身就是药食同源的植物，故在制备抗肿瘤药物中的应用具有显著的有益效果。

本发明药物组合物可经口服或不经口服给药，给药量因给药途径不同而各有不同，临床医师可根据病人的具体情况决定药物的用法用量。

本发明药物组合物经口服给药时，首先使用药物组合物与常规的药用辅料如赋形剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂等混合，将其制成颗粒剂、胶囊剂、片剂等形式给药。

附图说明

图1是实施例1中槐角总黄酮提取物紫外光谱图。

图2是实施例1中黄酮标准品HPLC色谱图。

图3是实施例1中盐酸水解的槐角总黄酮提取物HPLC色谱图。

具体实施方式

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂未标明来源、规格的均为市售分析纯或化学纯。

实施例1

槐角总黄酮提取物的制备

采摘及处理：将秋季采摘的槐角(9月15日～10月15日之间采自石家庄地区的国槐)用自来水洗净，吸干水分，60℃烘干备用。秋季槐角呈扁圆柱形，长约1～6cm，直径约0.6～1cm，有的略微弯曲，种子间缢缩成连珠状，颜色呈绿或黄绿色。果肉肉质柔软多汁而粘。内有个数不等种子，约1～6枚，种子长约8～10mm，宽约5～8mm，厚约5mm，饱满光滑呈淡黄色，肾形，一侧有椭圆形的种脐，旁有圆形珠孔，另一旁有略显凸起的种脊。与冬季槐角比较单个槐角平均湿重和干重，考察其成熟度，确定秋季槐角已成熟，只是含水量高于冬季槐角，约是冬季槐角的3倍。

原料预处理：取干燥的槐角250g，按1:2料液比加入80％乙醇，浸渍2天，手工分离槐角皮与种子或将其置于匀浆机中低速旋转，使槐角皮与种子分离，将槐角皮与浸渍后的乙醇液置于匀浆机中，加入8倍体积的80％乙醇高速匀浆，得槐角皮匀浆液。

超声提取：将槐角皮匀浆液置于超声波提取器中，超声提取1h(超声功率：300W，超声频率：40KHz)，将超声后的匀浆液高速离心(离心条件：转速：10000r/min，离心时间：10分钟，离心力：11179牛顿)，收集上清液；残渣用6倍量的60％乙醇按前述条件继续超声提取1小时，离心取上清液；剩余残渣再用6倍量的40％乙醇按前述条件继续超声提取1小时，离心取上清液，残渣干燥后称重；合并所有上清液，置于旋转蒸发器中，加温减压去除水醇，温度分两级控制，首先为55～60℃，真空度控制为-0.04～-0.05MPa，去除其中大部分醇，再将温度控制为85～90℃，真空度控制为-0.08～-0.09MPa，去除水分至干燥，得总黄酮粗提物。

粗提物纯化：取AB-8大孔吸附树脂(净品级)1000g，用蒸馏水反复漂洗，动态装柱(柱径4cm，柱长150cm，柱床高度120cm)，并用10倍柱体积水快速冲洗后备用；将干燥的槐角总黄酮粗提物用3L蒸馏水溶解，高速离心(离心条件：转速：10000r/min，离心时间：10分钟，离心力：11179牛顿)去除不溶物，上清液以10～15mL/min流速上样，上样完毕后用蒸馏水冲洗，洗至流出液无颜色；用70％乙醇洗脱，流速控制在10～15mL/min，收集洗脱液，洗至大孔树脂无色；将洗脱液置于旋转蒸发器中，减压回收乙醇，干燥后即得到槐角总黄酮提取物，称重计算得率为23.47％。

槐角总黄酮提取物光谱分析

应用紫外-可见分光光度计对所得槐角总黄酮提取物进行紫外光谱分析，结果如图1所示，所得槐角总黄酮提取物具有两个主峰，其中之一出现在261.21nm处，另一个在342.14nm处，因此制备的槐角总黄酮提取物符合典型黄酮类化合物的紫外光谱特征。

采用RP-HPLC法对制备的槐角总黄酮提取物进行含量测定及成分分析

黄酮标准品和水解的槐角总黄酮提取物HPLC色谱图分别为图2、图3所示，将各峰面积积分值代入对照品回归方程分别计算槲皮素、染料木素、山柰酚与异鼠李素的含量，含量分析结果见表1。

表1槐角总黄酮提取物中主要黄酮苷元含量分析

结论：以本法测得每克按照上述提取方法制备的槐角总黄酮提取物含有槲皮素22.8mg，染料木素151.6mg，山奈酚165.6mg，和异鼠李素7.72mg，四者的重量比符合要求。

实施例2～实施例4为本发明药物组合物的配比实施例

槐角总黄酮提取物为实施例1所制备，5-氟尿嘧啶购自天津金耀氨基酸有限公司，生产批号：200801，各实施例的重量份比(克)如下表所示：

组分	实施例2	实施例3	实施例4
				槐角总黄酮提取物	625	400	500
5-氟尿嘧啶	0.13	0.25	0.5

实施例5

体外抗肿瘤试验

1)试验材料

受试药物：实施例1中制备的槐角总黄酮提取物与5-氟尿嘧啶不同比例的组合物。

受试药物的配制：取5-氟尿嘧啶0.25g用10mL含有10％FBS的DMEM培养基稀释成1.9×10^-1mol/L，再用相同培养基稀释成2.5×10^-5mol/L～2.5×10^-7mol/L，用于实验。

细胞株：人食道癌细胞(Eca-109)和肝癌细胞(SMMC-7721)株购自河北医科大学肿瘤研究所；乳腺癌细胞(MDA-MB-231)细胞株购自中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心；乳腺癌细胞(MCF-7)细胞株为白求恩国际和平医院检验科赠送；

试剂和仪器：10％胎牛血清(FBS，Hyclone公司产品)；青霉素(Sigma，USA)；MTT(中杉金桥生物公司产品，北京)；酶联仪、恒温CO₂培养箱。

2)细胞培养：细胞株Eca-109、SMMC-7721和MCF-7细胞分别生长在DMEM培养基中(GibcoGlasgow，UK产品)，添加10％胎牛血清和100mg/mL链霉素和100IU/mL青霉素；MDA-MB-231细胞生长在RPMI-1640培养基中(GibcoGlasgow，UK产品)，添加10％胎牛血清和100mg/mL链霉素和100IU/mL青霉素；BL2细胞生长在RPMI1640培养基中，加10％胎牛血清和100mg/mL链霉素和100IU/mL青霉素。培养条件均为37℃，5％CO₂和100％相对湿度，每周更换培养液2次。

3)细胞活性测定

将肿瘤细胞按5×10³/孔密度接种于96孔板，培养24h。用受试药物处理细胞，使槐角提取物终浓度分别为0.625mg/mL，1.25mg/mL，和2.50mg/mL，对照组加等量的20％乙醇溶液，5-FU终浓度分别为1×10^-5mol/L，1×10^-6mol/L，和1×10^-7mol/L，对照组加等量的培养液，空白孔无细胞加等量培养液，处理时间72h；加入MTT溶液20μL/孔，37℃保温4h；弃去培养液，加入150μLDMSO，用酶联仪492nm波长测定吸光度值。

按公式计算细胞活性：细胞活性(％)＝(处理组吸光度值-空白吸光度值)/(对照组吸光度值-空白吸光度值)×100％。

将试验结果与单独使用实施例1的提取物和单独使用5-氟尿嘧啶的结果对比，如下表所示。

实施例6

按照本领域已知的方法制备片剂，每片(500mg)含有下述成分：

Claims (4)

1.一种抗癌药物组合物，其特征在于，它由以下重量份比的原料药组成：

槐角总黄酮提取物10~50份，5-氟尿嘧啶0.01~0.05份；

其中所述的槐角总黄酮提取物按照以下步骤制备：

a、取秋季槐角果夹，洗净，吸干水分，50~60℃烘干，备用；

b、干燥后的槐角果夹加入80%乙醇，浸渍2~3天，过滤，得乙醇浸渍液；将滤出的槐角果夹，除去其中的种子，留取槐角皮，然后将槐角皮和乙醇浸渍液置于匀浆机中，加入5~8倍体积的80%乙醇，高速匀浆，得槐角皮匀浆液；

c、将槐角皮匀浆液置于超声波提取器中超声提取1次，离心留上清液，所得残渣用6倍体积量的60%乙醇超声提取1次，离心留上清液；所剩残渣再加入6倍体积量的40%乙醇超声提取1次，离心留上清液，合并上述各上清液；

d、将合并后的上清液进行真空抽滤，得到总黄酮粗提物；

e、将总黄酮粗提物溶于水中，离心过滤，去除不溶物，滤液上大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗去除多糖，再用65~70%乙醇洗脱，收集洗脱液；将洗脱液中的乙醇去除，干燥即得到槐角总黄酮提取物。

2.根据权利要求1所述的抗癌药物组合物，其特征在于，它由以下重量份比的原料药组成：

槐角总黄酮提取物50份，5-氟尿嘧啶0.01份。

3.权利要求1或2所述的抗癌药物组合物在制备抗癌药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，所述癌为人食道癌。