CN106236796A - 一种小驳骨有效部位的制备方法及其应用 - Google Patents

一种小驳骨有效部位的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种小驳骨有效部位的制备方法及其应用，有效解决小驳骨抗乳腺癌作用的有效部位的制备，实现小驳骨应用在制备抗癌药物中的问题，将小驳骨药材用乙醇回流提取3次，加蒸馏水混悬，然后依次加入混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯分别各萃取3次，合并乙酸乙酯萃取部位，减压回收溶剂后，加蒸馏水混悬，过大孔吸附树脂AB‑8柱色谱，用乙醇洗脱，回收溶剂后得到稠膏，即为小驳骨的有效部位，本发明制备工艺简单，易操作，所制备得到的小驳骨有效部位对乳腺癌细胞具有较强的生长抑制作用，且能够显著增加乳腺癌细胞MCF‑7中caspase3 mRNA的表达水平，是小驳骨有效部位制备和应用上的创新。

Description

一种小驳骨有效部位的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及中药制药领域，特别是一种小驳骨有效部位的制备方法及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康和生命的常见病、多发病。现今，癌症已成为全世界首要的致死病因。乳腺癌通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤，已经成为严重威胁中青年妇女健康和生命的主要疾病之一，发病率较高，多见于40-60岁之间绝经期前后的妇女，全国每年新发乳腺癌的人数约100万以上。目前治疗乳腺癌的药物虽很多，均具有较强的毒副作用，其中以减退消化功能和抑制骨髓造血功能最为明显，往往使乳腺癌患者难以坚持完成整个化疗过程，难以彻底治愈。同时长期用药以后，出现多药耐药现象，这也是制约乳腺癌成功治疗的主要障碍。中草药在抗肿瘤方面的应用历史悠久，从中草药中寻找选择性强、毒副作用低的新型抗乳腺癌药物是药学科研工作者迫切解决的首要问题。
小驳骨为爵床科植物小驳骨(Gendarussa vulgaris Nees)的干燥地上部分。广泛分布于我国广西、广东、海南等省。具有祛瘀镇痛、续筋接骨之功效，主要用于跌打损伤、筋伤骨折、风湿骨痛、血瘀经闭及产后腹痛。在我国已有较长的应用历史，在《本草纲目拾遗》、《生草药性备要》、《岭南采药录》、《陆川本草》等医药古籍中均有记载。2010年作为新增药材，收载于《中华人民共和国药典》。近年来关于小驳骨化学成分及生物活性的研究受到国内外学者的广泛关注，化学成分主要包括生物碱、黄酮、香豆素、三萜等类型。生物活性研究表明，具有抗炎止痛、保肝、免疫抑制、抗血管生成、抗人获得性免疫缺陷病毒、驱虫、抗焦虑、抗氧化等作用。但至今尚未见到有关小驳骨药材在抗癌方面的公开报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种小驳骨有效部位的制备方法及其应用，可有效解决小驳骨抗乳腺癌作用的有效部位的制备，实现小驳骨应用在制备抗癌药物中的问题。
解决的技术方案是：一种小驳骨有效部位的制备方法，包括以下步骤：将小驳骨药材每次用5-10倍药材重量的体积浓度90-98%的乙醇回流提取3次，提取温度为90-95℃，每次提取时间为为1-2h，合并滤液，将滤液在45-55℃下减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水混悬至相对密度为1.1-1.2的混悬液，然后依次加入混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯分别各萃取3次，合并乙酸乙酯萃取部位，减压回收溶剂后，加蒸馏水混悬至相对密度为1.1-1.5的混悬液，将上述混悬液，过大孔吸附树脂AB-8柱色谱，依次用4倍量色谱柱体积的体积浓度10%的乙醇和2倍量色谱柱体积的体积浓度95%的乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱部分，回收溶剂后得到稠膏，即为小驳骨的有效部位。小驳骨有效部位作为唯一活性部位在制备抗乳腺癌药物中的应用。
本发明制备工艺简单，易操作，所制备得到的小驳骨有效部位对乳腺癌细胞具有较强的生长抑制作用，且能够显著增加乳腺癌细胞MCF-7中caspase3 mRNA的表达水平，必要时按照常规方法可将其制备成常规的中药片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂等制剂，是小驳骨有效部位制备和应用上的创新。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一种小驳骨有效部位的制备方法，包括以下步骤：
将小驳骨药材2.5Kg每次用8倍药材重量的体积浓度95%的乙醇回流提取3次，提取温度为95℃，3次提取时间分别为2h、1.5h、1h，分别过滤后，合并滤液，将滤液在45℃下减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水混悬至相对密度为1.1的混悬液，然后依次加入混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取部位，减压回收溶剂后，加蒸馏水混悬至相对密度为1.2的混悬液，将上述混悬液，过大孔吸附树脂AB-8柱色谱，依次用4倍量色谱柱体积的体积浓度10%的乙醇和2倍量色谱柱体积的体积浓度95%的乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱部分，回收溶剂后得到稠膏，即为小驳骨有效部位。
实施例2
一种小驳骨有效部位的制备方法，包括以下步骤：
将小驳骨药材3.5Kg每次用7倍药材重量的体积浓度90%的乙醇回流提取3次，提取温度为90℃，3次提取时间分别为2h、1.5h、1h，分别过滤后，合并滤液，将滤液在55℃下减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水混悬至相对密度为1.2的混悬液，然后依次加入混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取部位，减压回收溶剂后，加蒸馏水混悬至相对密度为1.2的混悬液，将上述混悬液，过大孔吸附树脂AB-8柱色谱，依次用4倍量色谱柱体积的体积浓度10%的乙醇和2倍量色谱柱体积的体积浓度95%的乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱部分，回收溶剂后得到稠膏，即为小驳骨有效部位。
实施例3
一种小驳骨有效部位的制备方法，包括以下步骤：
将小驳骨药材1.5Kg每次用6倍药材重量的体积浓度92%的乙醇回流提取3次，提取温度为93℃，3次提取时间分别为2h、1.5h、1h，分别过滤后，合并滤液，将滤液在50℃下减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水混悬至相对密度为1.1的混悬液，然后依次加入混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取部位，减压回收溶剂后，加蒸馏水混悬至相对密度为1.3的混悬液，将上述混悬液，过大孔吸附树脂AB-8柱色谱，依次用4倍量色谱柱体积的体积浓度10%的乙醇和2倍量色谱柱体积的体积浓度95%的乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱部分，回收溶剂后得到稠膏，即为小驳骨有效部位。
实施例4
一种小驳骨有效部位的制备方法，包括以下步骤：
将小驳骨药材2.0Kg每次用7倍药材重量的体积浓度94%的乙醇回流提取3次，提取温度为94℃，3次提取时间分别为2h、1.5h、1h，分别过滤后，合并滤液，将滤液在50℃下减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水混悬至相对密度为1.2的混悬液，然后依次加入混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取部位，减压回收溶剂后，加蒸馏水混悬至相对密度为1.4的混悬液，将上述混悬液，过大孔吸附树脂AB-8柱色谱，依次用4倍量色谱柱体积的体积浓度10%的乙醇和2倍量色谱柱体积的体积浓度95%的乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱部分，回收溶剂后得到稠膏，即为小驳骨有效部位。
实施例5
一种小驳骨有效部位的制备方法，包括以下步骤：
将小驳骨药材1.8Kg每次用5倍药材重量的体积浓度98%的乙醇回流提取3次，提取温度为90℃，3次提取时间分别为2h、1.5h、1h，分别过滤后，合并滤液，将滤液在48℃下减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水混悬至相对密度为1.1的混悬液，然后依次加入混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取部位，减压回收溶剂后，加蒸馏水混悬至相对密度为1.5的混悬液，将上述混悬液，过大孔吸附树脂AB-8柱色谱，依次用4倍量色谱柱体积的体积浓度10%的乙醇和2倍量色谱柱体积的体积浓度95%的乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱部分，回收溶剂后得到稠膏，即为小驳骨有效部位。
上述方法制备的小驳骨有效部位可用常规方法制备成抗乳腺癌的片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂粉等剂型。
本发明方法稳定可靠，其制备得到的小驳骨有效部位经多次反复试验，对人乳腺癌细胞MCF-7具有较强的生长抑制作用，作为唯一活性部位有效，用于制备抗乳腺癌药物中的应用，并经实验得到证明，有关实验资料如下：
1. 实验材料
人乳腺癌细胞株MCF-7由中国医学科学院药物研究所提供，胎牛血清购自Gibco公司。
2. 细胞培养
MCF-7细胞培养于含有10% 经加热灭活的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，将培养瓶置于37 °C，5% CO2饱和湿度培养箱培养，每1~2天换培养液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代。
3.MTT法
对数生长期细胞培养于96孔培养板内，每孔100 μL(含4000个肿瘤细胞)，置37 °C、5%CO2温箱中培养。次日，给药组加入含有不同浓度的测试化合物的稀释液，设4-5个剂量组，每组至少设五个平行孔。对照组加入与给药组等体积的溶剂。置37 °C、5% CO2温箱中培养。2天后弃培养液，每孔加50 μL (1 mg/mL) MTT溶液(培养基配置)。37 °C孵育4小时，弃去上清液，每孔加入DMSO 200 μL溶解甲簪颗粒，轻度振荡溶解。用酶标仪，在检测波长490 nm条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的细胞为对照组，用下面公式计算药物对细胞的抑制率，根据计算得到的各浓度的抑制率通过SPSS 13.0软件处理得到半数抑制浓度(IC50)，重复测试3次，取平均值为最终结果。
4.实验结果
通过MTT法采用人乳腺癌细胞株MCF-7对小驳骨有效部位进行细胞生长抑制测试，结果表明100ug/ml的小驳骨有效部位对乳腺癌细胞MCF-7细胞的生长抑制率分别为84.95%。
小驳骨的有效部位经试验，能够显著增加MCF-7中caspase3的mRNA的表达水平，有关实验资料如下：
1.总RNA的提取
取小驳骨有效部位处理24h后的乳腺癌细胞MCF-7，加入PBS吹悬清洗2次，转移至1.5mL离心管中，弃去上清，加入1ml Trizol液后反复均匀吹打细胞，室温放置5min，使其充分裂解。按200µl氯仿/ml Trizol比例加入氯仿，振荡混匀后室温放置2min。4℃、12000r/min，离心15min。小心取上层水相，至另一离心管中。按0.5ml异丙醇/ml Trizol 比例加入异丙醇，手动震荡，室温放置10min。4℃、12000r/min，离心10min，弃上清。加入1ml 75%乙醇混匀，4℃、7500r/min离心5min，小心弃上清液。在室温下干燥5～8min。最后加40µl灭菌DEPC水溶解。
2.反转录(RT)反应
表1. 反转录反应体系如下
反转录反应条件
3. PCR
表2. PCR反应体系
caspase3条件选择为：
4.PCR产物的分析
取PCR产物5µl，进行2%琼脂糖凝胶电泳。电泳展开后，置紫外灯下观察、用凝胶自动成像系统扫描。得到待测的RNA扩增产物与内参照β-actin RNA扩增产物的光密度值，计算二者的比值，以此作为目的RNA的相对表达量。
本研究表明，经50μg/ml的小驳骨有效部位对MCF-7细胞作用24小时后，发现小驳骨有效部位可以增加乳腺癌细胞MCF-7中caspase3 mRNA的表达水平，说明小驳骨有效部位能够通过促进caspase3基因表达，诱导细胞凋亡而发挥抗乳腺癌作用。结果见表3。
表3. 小驳骨有效部位对MCF-7中caspase3 mRNA表达的影响
*与空白组对照，p＜0.05
本发明制备工艺简单，易操作，制备出的小驳骨有效部位经过多次反复实验证实，对人乳腺癌细胞MCF-7具具有较强的生长抑制作用，且能够显著增加乳腺癌细胞MCF-7中caspase3 mRNA的表达水平，具有制备临床上抗乳腺癌药物的应用价值，并经过临床对38例乳腺癌患者试用，均有不同程度的症状改善，效果之好，未曾料到。实现在小驳骨有效部位作为唯一活性部位制备抗乳腺癌药物中的应用，是治疗乳腺癌药物上的一大创新，经济和社会效益显著。

Claims (7)

1.一种小驳骨有效部位的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将小驳骨药材每次用5-10倍药材重量的体积浓度90-98%的乙醇回流提取3次，提取温度为90-95℃，每次提取时间为为1-2h，合并滤液，将滤液在45-55℃下减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水混悬至相对密度为1.1-1.2的混悬液，然后依次加入混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯分别各萃取3次，合并乙酸乙酯萃取部位，减压回收溶剂后，加蒸馏水混悬至相对密度为1.1-1.5的混悬液，将上述混悬液，过大孔吸附树脂AB-8柱色谱，依次用4倍量色谱柱体积的体积浓度10%的乙醇和2倍量色谱柱体积的体积浓度95%的乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱部分，回收溶剂后得到稠膏，即为小驳骨的有效部位。
2.根据权利要求1所述的一种小驳骨有效部位的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将小驳骨药材2.5Kg每次用8倍药材重量的体积浓度95%的乙醇回流提取3次，提取温度为95℃，3次提取时间分别为2h、1.5h、1h，分别过滤后，合并滤液，将滤液在45℃下减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水混悬至相对密度为1.1的混悬液，然后依次加入混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取部位，减压回收溶剂后，加蒸馏水混悬至相对密度为1.2的混悬液，将上述混悬液，过大孔吸附树脂AB-8柱色谱，依次用4倍量色谱柱体积的体积浓度10%的乙醇和2倍量色谱柱体积的体积浓度95%的乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱部分，回收溶剂后得到稠膏，即为小驳骨有效部位。
3.根据权利要求1所述的一种小驳骨有效部位的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将小驳骨药材3.5Kg每次用7倍药材重量的体积浓度90%的乙醇回流提取3次，提取温度为90℃，3次提取时间分别为2h、1.5h、1h，分别过滤后，合并滤液，将滤液在55℃下减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水混悬至相对密度为1.2的混悬液，然后依次加入混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取部位，减压回收溶剂后，加蒸馏水混悬至相对密度为1.2的混悬液，将上述混悬液，过大孔吸附树脂AB-8柱色谱，依次用4倍量色谱柱体积的体积浓度10%的乙醇和2倍量色谱柱体积的体积浓度95%的乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱部分，回收溶剂后得到稠膏，即为小驳骨有效部位。
4.根据权利要求1所述的一种小驳骨有效部位的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将小驳骨药材1.5Kg每次用6倍药材重量的体积浓度92%的乙醇回流提取3次，提取温度为93℃，3次提取时间分别为2h、1.5h、1h，分别过滤后，合并滤液，将滤液在50℃下减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水混悬至相对密度为1.1的混悬液，然后依次加入混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取部位，减压回收溶剂后，加蒸馏水混悬至相对密度为1.3的混悬液，将上述混悬液，过大孔吸附树脂AB-8柱色谱，依次用4倍量色谱柱体积的体积浓度10%的乙醇和2倍量色谱柱体积的体积浓度95%的乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱部分，回收溶剂后得到稠膏，即为小驳骨有效部位。
5.根据权利要求1所述的一种小驳骨有效部位的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将小驳骨药材2.0Kg每次用7倍药材重量的体积浓度94%的乙醇回流提取3次，提取温度为94℃，3次提取时间分别为2h、1.5h、1h，分别过滤后，合并滤液，将滤液在50℃下减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水混悬至相对密度为1.2的混悬液，然后依次加入混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取部位，减压回收溶剂后，加蒸馏水混悬至相对密度为1.4的混悬液，将上述混悬液，过大孔吸附树脂AB-8柱色谱，依次用4倍量色谱柱体积的体积浓度10%的乙醇和2倍量色谱柱体积的体积浓度95%的乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱部分，回收溶剂后得到稠膏，即为小驳骨有效部位。
6.根据权利要求1所述的一种小驳骨有效部位的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将小驳骨药材1.8Kg每次用5倍药材重量的体积浓度98%的乙醇回流提取3次，提取温度为90℃，3次提取时间分别为2h、1.5h、1h，分别过滤后，合并滤液，将滤液在48℃下减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水混悬至相对密度为1.1的混悬液，然后依次加入混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取部位，减压回收溶剂后，加蒸馏水混悬至相对密度为1.5的混悬液，将上述混悬液，过大孔吸附树脂AB-8柱色谱，依次用4倍量色谱柱体积的体积浓度10%的乙醇和2倍量色谱柱体积的体积浓度95%的乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱部分，回收溶剂后得到稠膏，即为小驳骨有效部位。
7.权利要求1或2-6任一项所述方法制备的小驳骨有效部位作为唯一活性部位在制备抗乳腺癌药物中的应用。
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