柠檬苦素的制备方法及组合物和其应用
技术领域
本发明属于植物药(中草药)领域,具体而言,本发明涉及一种高纯度的柠檬苦素的制备方法,以及以其制备出的高安全性的含高纯度柠檬苦素的药物组合物。另外,本发明还涉及上述药物组合物在制备用于预防和/或治疗结肠癌或直肠癌的药物中的应用。
背景技术
柠檬苦素(limomin),又称吴萸苦素、白藓内酯、黄柏内酯,主要存在于芸香科(Rutaceae)和楝科(Meliaceae)植物中,如枳实(脐橙、柑桔、香橙)柚等中,以果核(种子)中含量较高,果皮中含量较少(约万分之一至十万分之五)。柠檬苦素的化学结构如下所示:
柠檬苦素具有抗癌、镇痛、抗炎、降低胆固醇、抑制HIV-1病毒、催眠、抗焦虑、镇静和增加食欲改善消化功能等作用,还有杀虫作用,有明显抗疟(原虫)作用。
当前,柠檬苦素的制备方法已经有现有文献报道了,但是要么制备中浪费溶剂、提取率低,造成生产成本高;要么制备出的组合物(产物)纯度低,带有较多杂质,直接使用为用药安全带来极大隐患,而且也难以通过审批从而用于实际产业化,而进一步提纯则相当于增加制备成本。
具体而言,中国专利申请第00106285号公开了从芸香科果实中提取柠檬苦素的方法,然而该方法制备的柠檬苦素的纯度很低(达不到90%);
中国专利申请第00130622号公开了一种从柑桔类种子中提取药物活性物质的工艺,然而该工艺制备的柠檬苦素的纯度很低,我们研究发现,要得到高纯度产物需要在过硅胶色谱柱 后频繁采用重结晶步骤(远大于2次)才行,提取率低而且成本很高;
中国专利申请第02145371号公开了柠檬苦素制备治疗痔疮药物的用途,其安全性是口服标准,比本发明的产物能用于安全注射的标准低得多;
中国专利申请第03118175号公开了一种从柚子中同时提取果胶、柚皮甙等八种产物的方法,然而该方法在通过吸附树脂脱苦的时候将损失大量柠檬苦素,造成柠檬苦素的提取率低,另外三次用柱分离,造成工艺复杂,不适合工业化;
中国专利申请第03140079号公开了一种柠檬苦素化合物-木果楝内酯及其用途,其涉及新的化合物;
中国专利申请第200780038818号公开了用于激活PLTP基因表达的方法和组合物,其包括施用有效量的柠檬苦素类化合物,该方法和组合物用于治疗肥胖;
中国专利申请第200810037312号公开了一种工业层析法制备柠檬苦素单体的工艺,该文献将工业层析柱用在结晶后与重结晶前,柠檬苦素损失较大,而且我们研究发现,虽然该文献声称(而且没有提供依据证明)产物中的柠檬苦素纯度大于98%、99%,但是我们重复了其实施例,发现纯度最好也不超过93%,达不到注射用的安全纯度,如要提高纯度,需要再增加多次重结晶过程;
中国专利申请第200810046164号公开了从吴茱萸中分离柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法,然而其中需要用到高效制备液相分离,不适用工业生产(或者工业生产成本极高),只适合实验室制备;
中国专利申请第200810204440号公开了一种从柚核中提取柠檬苦素的工艺,然而该工艺所得的产物纯度不超过92%;
赵雪梅等在“柑橘属中柠檬素类化合物研究进展”一文中提到柠檬苦素的提取制备,采用己烷脱脂、二氯甲烷提取,最后采用二氯甲烷多次重结晶得到柠檬苦素。该方法采用昂贵的己烷进行脱脂,成本高,而且提取率也低。
为了克服现有技术的不足,本发明人经过长期艰苦研究,发现采用有机酸提取的效率比传统的乙醇提取效率更高,而且采用有机酸提取-大孔树脂纯化-活性炭纯化这三个步骤的依次组合就能够在只需要两次重结晶纯化的情况下得到纯度大于98%的柠檬苦素,生产成本低且产率高,而且最后的结晶纯化无需氯仿等有毒物质。
另外,当前中药提取物的安全性问题,尤其是注射液安全性问题日益为广大群众和政府管理部门所重视,例如双黄莲注射液、清开灵注射液都由于制备残留的杂质而发生了严重的不良反应,为此本发明人特别研究了本发明制备方法所得产物并进行了艰苦的动物实验,令 人意外的是,其中的这些杂质即使在注射给药时也没有引起不良反应,而且也没有干扰柠檬苦素药效的发挥,能够有效地预防和治疗直、结肠癌,也可以用于直、结肠癌的辅助用药。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术中存在的生产成本以及安全性等方面的缺陷,提供一种高纯度的柠檬苦素的制备方法,以及以其制备出的含高纯度柠檬苦素的药物组合物。另外,本发明还涉及上述药物组合物在制备用于预防和/或治疗结肠癌或直肠癌的药物中的应用。
本发明所取得的有益效果主要包括:
1,使用有机酸提取,提取效率高,加之其他优选的制备步骤细节,成本的降低和安全性的提高更令人意想不到;
2,采用一步大孔树脂工业柱层析和一步活性炭纯化,成本低,而且操作方便;
3,有效配置制备步骤,使得为了获得高纯度产物而使用的结晶(重结晶)步骤大大减少,节约了生产时间并降低了损失,而且结晶和重结晶都无需氯仿等有毒物质,避免了有毒物质的残留;
4,所得产物安全性高,可以用于直接配制成注射剂型;
5,对直、结肠癌预防和/或治疗的有效率高,即使在口服给药的情况下也较高。
具体而言,在第一方面,本发明提供了一种含高纯度柠檬苦素的组合物的制备方法,其包括如下步骤:
(1)将芸香科和/或楝科植物的种子粉碎;
(2)用有机酸水溶液提取上述粉碎的种子,收集提取液;
(3)将步骤(2)所得的提取液上样于大孔树脂柱,依次用水、20~40%(v/v)乙醇和91~98%(v/v)乙醇洗脱,收集用91~98%(v/v)乙醇洗脱的洗脱液,然后干燥该洗脱液并用氯仿溶解,过滤后收集滤液;
(4)向步骤(3)所得的滤液中加入活性炭,干燥并粉碎,然后装柱并依次用水、15~40%(v/v)乙醇和75~85%(v/v)乙醇洗脱,收集75~85%(v/v)乙醇洗脱的洗脱液,浓缩该洗脱液,过滤,收集柠檬苦素粗品;
(5)将步骤(4)所得的柠檬苦素粗品重结晶两次。
在第一方面中,芸香科(Rutaceae)植物的例子有枳实、广柑、柑橘属、柚、柠檬、吴茱萸等,而楝科(Meliaceae)植物的例子有木果楝等。在本发明的具体实施方式中,优选芸 香科和/或楝科植物是胡柚。为了避免杂质的污染以及提高提取效率,种子优选是洗净的,也优选是干燥的。
优选在第一方面中,所述高纯度为纯度大于95%,优选大于96%,更优选大于97%,更优选大于98%,更优选大于98.5%。这样的高纯度在适合产业化的生产中未见有实质依据地被报道过。其中,“纯度”对于本领域技术人员是完全可以理解的,例如可以根据高效液相色谱(HPLC)的测定图谱,通过面积归一法来计算纯度。
优选在第一方面中,所述含高纯度柠檬苦素的组合物是注射安全的。由于本发明人研究发现,根据本发明的方法制备的含高纯度柠檬苦素的组合物中柠檬苦素纯度高,而且其中各杂质即使在注射使用时,对于哺乳动物也是安全的。因此,该含高纯度柠檬苦素的组合物可直接配制成注射剂使用,无需在进一步提纯去除对安全性有影响的杂质,方便了使用。另外,其安全性程度更是给安全性要求较低的口服制剂和粘膜给药制剂等再加了一道保险,提供了进一步的安全保障。
优选在第一方面的步骤(2)中,所述有机酸水溶液的pH值为3.0~4.0,更优选为3.1~3.5,如3.2。在本发明的具体实施方式中,所述有机酸是醋酸。本发明人研究发现,采用醋酸等有机酸进行提取,替代传统的用醇提取,不但没有降低提取效率,而且提取后的脂溶性杂质大为减少,可以省却脱脂的步骤,方便了产业化的生产。通常,所述有机酸水溶液提取的用量为粉碎的种子重量的3~6倍,优选为4~5倍。为了进一步提高提取效率,可以在有机酸水溶液提取的同时,采用超声波处理和/或加热。其中,超声波处理的频率优选为18~25KHZ;加热温度通常为40~60℃,优选为50℃。所述提取的时间为40~60min,如50min。综合提取率以及提取时间和试剂成本,本发明人发现提取两次最优,其提取率甚至可以超过用醇提取。提取后,收集提取液,最优选通过过滤来收集提取液。
优选在第一方面的步骤(3)中,为了避免上样量过大,可以先将步骤(2)所得的提取液浓缩,如浓缩至潜在干燥后的固形物/料液的浓度为0.5~1.2g/ml,优选浓缩至1g/ml。上样后可依次使用水和乙醇(即,乙醇的水溶液)洗脱。其中乙醇的浓度可以是23%、27%、32%、35%、92%、94%、96%(v/v)等。最优选其中,将步骤(2)所得的提取液上样于大孔树脂柱,依次用水、30%(v/v)乙醇和95%(v/v)乙醇洗脱,收集用95%(v/v)乙醇洗脱的洗脱液,然后干燥该洗脱液并用氯仿溶解,过滤后收集滤液。以水、30%乙醇洗脱,除去多糖和极性大的杂质,然后用95%乙醇充分洗脱包含柠檬苦素的洗脱液。判断洗脱充分性可以采用对二甲氨基苯甲醛试剂(DMAB试剂)进行显色跟踪,当洗脱液不显色时,收集停止。
优选在第一方面的步骤(3)中,为了避免洗脱液急速干燥的不均匀,该洗脱液的干燥 可以先减压浓缩洗脱液,然后再干燥。干燥后的产物用氯仿溶解。
优选在第一方面的步骤(3)中,所述大孔树脂为非极性吸附剂型大孔树脂,优选是D101型、AB-8型、XDA-1型或H-20型。有大量不同类型的大孔树脂可以市售获得,从中可以优选出这些特定类型。
优选在第一方面的步骤(4)中,柱并不限于特定形状,只要能使洗脱液流经全部柱即可,通常柱是圆柱形的。装柱后可依次使用水和乙醇(即,乙醇的水溶液)洗脱。其中乙醇的浓度可以是17%、22%、29%、36%、77%、79%、83%(v/v)等。最优选其中,向步骤(3)所得的滤液中加入活性炭,干燥并粉碎,然后装柱并依次用水、25%(v/v)乙醇和80%(v/v)乙醇洗脱,收集80%(v/v)乙醇洗脱的洗脱液,浓缩该洗脱液,过滤,收集柠檬苦素粗品。通常浓缩该洗脱液后,放置即可有柠檬苦素粗品结晶析出。
优选在第一方面的步骤(4)中,可以采用粉状活性炭,但是优选采用颗粒活性炭,如40目的活性炭。除了脱色之外,本发明人发现,采用活性炭可以将柠檬苦素与其他大多数的柠檬苦素类化合物进行分离。
优选在第一方面的步骤(5)中,将步骤(4)所得的柠檬苦素粗品用冰醋酸重结晶,然后将重结晶出的晶体用正己烷和丙酮的混合液重结晶。优选其中正己烷和丙酮的体积比为3∶1。本发明只需要两次重结晶纯化即可得到高纯度的柠檬苦素。
在第二方面,本发明提供了本发明第一方面所述的制备方法制备的含高纯度柠檬苦素的组合物。其中,柠檬苦素纯度大于95%,优选大于96%,更优选大于97%,更优选大于98%,更优选大于98.5%。
优选在第二方面中,所述含高纯度柠檬苦素的组合物是注射安全的,可直接配制注射剂而不会带来对哺乳动物在大剂量注射时的安全性隐患。这样的组合物包含除柠檬苦素以外的杂质,所述杂质包括具有在选自以下相对保留时间处的HPLC峰的杂质:约0.36,约0.43,约0.59,约0.61,约0.67,约0.93和约1.49。在本文中,“相对保留时间”指的是杂质的HPLC峰的保留时间相对于柠檬苦素的HPLC峰的保留时间的数值,对于本领域技术人员来说是常用的物质指标。相对保留时间能够容易地换算成保留时间,如根据本发明实施例中的柠檬苦素在约13.0分处的HPLC峰,所述杂质包括具有在选自以下保留时间处的HPLC峰的杂质:约4.7分,约5.6分,约7.2分,约7.9分,约8.7分,约12.1分和约19.5分。这些峰确认了在所述含高纯度柠檬苦素的组合物中的杂质,而且经过本发明人的研究,这些杂质即使在大剂量注射时也不会对构成安全性威胁。由于本领域技术人员能够理解检测仪器可能存在的误差, 因此在本文中,“约”指相应限定的数值+3%。
在第三方面,本发明提供了药物组合物,其包括本发明第二方面所述的组合物以及药学上可接受的辅料。药学上可接受的辅剂包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等,它们与活性成分相容。运用药学上可接受的辅剂制备药物组合物对本领域普通技术人员来说是公知的。本发明的药物组合物将活性成分和药学上可接受的辅剂(如本领域普通技术人员所熟知的载体、赋形剂、稀释剂等)组合在一起,配制成各种制剂,优选为固体制剂和液体制剂。本发明的制剂可以为单位剂量形式,如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释释放形式)、粉剂、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液、针剂、等剂型以及各种缓释剂型,从而适合各种给药方式,例如口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等的给药形式。优选本发明的药物制剂为口服制剂或注射制剂或粘膜给药制剂或粘膜给药制剂。例如,对于注射制剂,优选其中药学上可接受的辅料选自水、生理盐水;特别对于冻干粉针剂,优选其中药学上可接受的辅料还包括甘露醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明胶、聚维酮和氯化钠中的一种或几种。又如,对于口服制剂,优选其中药学上可接受的辅料选自淀粉、乳糖、微晶纤维素、交联PVP和羧甲基淀粉钠中的一种或几种。本发明的药物组合物中活性成分的含量可以根据具体剂型、给药方式以及给药对象的情况而定,也可以根据动物实验来推定人的剂量并确定所需的含量。
在第四方面,本发明提供了本发明第二方面所述的组合物或本发明第三方面所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗结肠癌或直肠癌的药物中的应用。优选该药物是安全的,尤其是注射级别的安全的。该药物还可以与手术、放疗和化疗联合使用。给药的剂量和形式一般由医师根据患者的具体情况(如年龄、体重、性别、患病时间、身体状况等)确定,还可以参考药物组合物的剂型及其生物利用度来确定。本发明的适合的给药形式有口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等给药形式。
为了便于理解,以下将通过具体实施例对本发明进行描述。需要特别指出的是,这些描述仅仅是示例性的描述,并不构成对本发明范围的限制。另外,本发明引用了现有文献,它们全部纳入本文参考,就好像它们在本文中全部重复叙述过一样。
附图说明
图1为采用本发明制备方法制备的产物的柠檬苦素纯度的HPLC纯度色谱图。
具体实施方式
实施例1高纯度的柠檬苦素的制备方法及安全性检测
取10kg的胡柚核50℃干燥后,粉碎,过12目筛。置超声罐中,调节频率在20KHZ,加入50L的pH值3.2的浓度为3%(v/v)的醋酸溶液,启动超声波,加热至50℃,超声提取50min;过滤,滤渣再加40L的pH值3.2的浓度为3%(v/v)的醋酸溶液50℃超声提取50min,冷至室温,过滤。合并两部分滤液,得到提取液。
然后,提取液减压浓缩至1.0g/ml(生药/料液)。过D101大孔树脂的层析柱中(?150×1500)(江阴金确层析设备有限公司),采用40L的水进行洗脱,流速100ml/min,洗脱液弃去;再以25L的30%(v/v)乙醇进行洗脱,流速100ml/min,洗脱液弃去;再以95%(v/v)乙醇进行洗脱,收集洗脱液,以对-二甲氨基苯甲醛(DMAB)试剂(125mg对-二甲氨基苯甲醛溶于100ml硫酸和无水乙醇(硫酸∶无水乙醇=35∶65(v/v))混合溶液中,然后加入至0.5ml0.9%FeCl3水溶液中)进行显色,洗脱液与显色试剂混合后不变色,停止收集。将该洗脱液减压浓缩,得到黄色残留物230g,加入氯仿500ml搅拌溶解,过滤,滤饼再以50ml氯仿洗涤,洗涤两次,抽干,弃去滤饼,保留滤液。
然后,向滤液中加入100g活性炭(40目),减压浓缩至干,研细,装入活性炭层析柱中,以10L水进行洗脱,洗脱液弃去;再以5L的25%(v/v)乙醇洗脱,洗脱液弃去;最后以80%(v/v)乙醇洗脱,收集洗脱液,TLC检测(展开剂为石油醚-乙酸乙酯(3∶2(v/v)),用DMAB试剂显色检测)至洗脱液里没有柠檬苦素,停止收集。洗脱液减压浓缩约400ml,室温放置,过滤得淡黄色柠檬苦素粗品。
然后,向粗品加入500ml的冰醋酸,搅拌加热至90℃,完全溶解后,加入药用活性炭(zz-702型,溧阳市江南活性炭厂)3g,搅拌20min,趁热过滤;冷至室温析晶,过滤,直接(滤饼不用烘干)加入400ml正己烷丙酮(3∶1(v/v))混合液进行于回流重结晶,冷却至室温析晶,得到168g的无色针状晶体柠檬苦素产物。
对所得的无色针状晶体柠檬苦素产物进行HPLC分析,其中,
仪器:LC-10ATvp型高效液相色谱仪(双泵,SPD-M10Avp二极管阵列检测器,Class-vp色谱工作站)日本岛津
色谱条件:流动相:甲醇-0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(63∶37)
检测波长:210nm,流速1.0ml/min,柱温30℃,进样体积:20μl
色谱柱:hypersil C18柱4.6mm×250mm,5μm填料。
将所得的无色针状晶体柠檬苦素产物以流动相配制成1mg/ml的溶液,吸取20μl注入以上高效液相色谱仪,记录色谱图。输出的结果如图1所示,该产物中柠檬苦素的纯度为 98.67%(HPLC面积归一化法)。
所得的无色针状晶体柠檬苦素产物按照国家食品药品监督管理局颁布的中药、天然药物研究技术指导原则进行柠檬苦素注射剂的急性毒性试验、长期毒性试验、过敏性试验、血管刺激性试验和溶血性试验。结果如下:
1)毒性试验
给大鼠口服和静脉注射该无色针状晶体柠檬苦素产物1g/kg均未见急性中毒现象。
2)长毒试验
以大鼠作为试验动物模型,进行周期三个月(大剂量组:80mg/kg/日、中剂量组:40mg/kg/日、小剂量组:20mg/kg/日)的长期毒性试验。试验结果,发现给大鼠连续静脉注射3个月,即使该药大剂量组(80mg/kg/日)在副性器官及其他项目无明显的变化;主要脏器系数、组织病理检查未发现给药有关的组织病理改变,未发现明显的毒副作用;恢复期各项血液和生活指标均恢复正常,未见延迟性毒性反应。
3)过敏试验、血管刺激试验和溶血试验
将该无色针状晶体柠檬苦素产物配成0.5%(w/w)的浓度,豚鼠以lml/只腹腔注射给药,隔日一次,连续3次,给药后第14天及21天以2ml/只静脉注射给药进行攻击性试验,结果未见豚鼠有明显的全身过敏反应。溶血试验结果表明该药无溶血现象发生。血管刺激性试验以0.5%该无色针状晶体柠檬苦素产物1ml/kg向兔耳缘静脉滴注给药每天一次,连续7天,给药后对注射部位进行肉眼观察及病理学切片检查,检查结果表明柠檬苦素对血管无明显的刺激作用。
由此可见,所得的无色针状晶体柠檬苦素产物即使注射,其杂质也不会影响其临床安全用药。
实施例2柠檬苦素抑制由氧化偶氮甲烷(AOM)诱导致大鼠结肠癌的实验
2.1材料与方法
2.1.1材料
实验动物雄性断乳Wistar大鼠60-85g(合格证号:医动字第2009028号)由西安交通大学医学院实验动物中心提供。质量合格证号:陕医动字:09-125号。
2.1.2主要试剂柠檬苦素(即实施例1所得的无色针状晶体柠檬苦素产物),氧化偶氮甲烷(AOM)(Sigma公司)。
2.2方法
2.2.1动物分组及处理140只雄性W istar大鼠(5周龄),体重在60~80g。在动物 房温度为(23±2)℃,相对湿度为(50±10)%,正常的光照(12小时白天/黑夜循环)的条件下饲养,以常规饲料喂养。大鼠在动物房适应1周后,随机分为5组(AOM组、AOM+0.02%柠檬苦素组、AOM+0.05%柠檬苦素组、0.05%柠檬苦素组、阴性对照组)每组28只。除0.05%柠檬苦素组、阴性对照组外,其余各组从实验第2周开始颈部皮下注射氧化偶氮甲烷(AOM)20mg/kg,每周1次,连续10周。准确称取AOM,溶于0.9%生理盐水中,现用现配。AOM+柠檬苦素组分别从试验第二周开始分别以200ppm与500pp柠檬苦素粉末与饲料混合饮食,直至实验结束。阴性对照组颈部皮下注射相同剂量的生理盐水。阳性对照组(AOM组)和阴性对照组以常规饲料喂养。整个实验期间,每天观察动物一般情况,记录各组大鼠食进食。注射AOM期间每周称一次体重以调整AOM用量。以后每4周称一次体重。分别于实验第16周和32周断头处死大鼠,取出结肠组织以测定指标。
2.2.2变性隐窝病灶(ACF)观察于实验第16周,每组处死8只大鼠,参照B ird的方法固定标本和染色:动物处死后立即分离结肠,用生理盐水冲洗肠内容物,将整根结肠铺平夹于两层滤纸之间,固定于100ml/L中性缓冲福尔马林溶液中,至少24h。固定好的标本用2g/L美蓝染色3~5分钟,立即在×40或×100光学显微镜下观察并计数ACF数目。除了计数整根结肠ACF总数外,还根据每个ACF含有的变性隐窝(AC)数目分为以下三类:小ACF:含有1~3个AC;中ACF:含有4~6个AC;大ACF:含有7个以上AC。
2.2.3结肠肿瘤发生情况于实验第32周,每组断头处死20只大鼠,迅速打开腹腔,分离出整根结肠,纵向剖开,用生理盐水冲洗肠内容物,展开铺于玻璃板上,除计算每只大鼠结肠瘤数目外,还用游标卡尺测量每个瘤的长(L)、宽(W)、高(H),计算瘤体积(V=L×W×H×π/6),单位mm3。
2.3结果
2.3.1动物体重
分别于实验时0周、16周、32周,称量动物体重,具体结果见表1
表1各组动物体重的变化
组别 |
0周(kg) |
16周(kg) |
32周(kg) |
AOM |
70.3±3.5 |
426.1±43.8 |
459.8±93.5 |
AOM+0.02%柠檬苦素 |
70.6±6.7 |
427.3±39.4 |
460.2±95.4 |
AOM+0.05%柠檬苦素 |
69.5±6.1 |
428.6±41.9 |
462.8±99.2 |
0.05%柠檬苦素 |
70.2±4.9 |
426.8±44.8 |
470.1±96.7 |
阴性对照组 |
69.8±6.4 |
429.4±45.2 |
485.4±96.3 |
[0080] 阳性对照组(AOM)及各试验组动物体重在第16周、32周均不同程度低于阴性对照组),但均无显著性差异。在整个试验期间,各组动物一般状况良好,无一动物死亡。
2.3.2结肠癌前病变
于实验第16周末,检查从肛门至回盲部整根结肠的ACF数(见表2)。
表2柠檬苦素对氧化偶氮甲烷(AOM)诱发结肠癌前病变ACF的影响
组别 |
ACF总数 |
抑制率( %) |
小ACF |
由ACF |
大ACF |
AOM |
252.1±10.2 |
|
159.0±7.1 |
58.3±9.2 |
34.4 ±3.3
|
AOM+0.02%柠檬苦素 |
156.5±12.5** |
37.9% |
96.8±6.4** |
39.2±1.5** |
20.7 ±2.9* * |
AOM+0.05%柠檬苦素 |
120.7±6.3** |
52.1% |
73.6±5.988 |
28.8±3.2** |
17.8 ±2.1* * |
0.05%柠檬苦素 |
0 |
|
0 |
0 |
0 |
阴性对照组 |
0 |
|
0 |
0 |
0 |
注:与阳性组(AOM)比较,经t检验,**P<0.01
阳性对照组(AOM)及2个柠檬苦素组都出现ACF,而阴性对照组则未发现ACF。与阳性对照组相比,柠檬苦素组的ACF数均显著减少(P<0.01),与200ppm相比,500ppm对ACF的抑制效果较好,达到抑制率52.1%;小ACF、中ACF和大ACF数目在2个柠檬苦素组中也显著减少(P<0.01)。
2.3.2结肠肿瘤发生率
至第32周实验结束时,观察柠檬苦素对AOM诱发结肠肿瘤发生的影响,结果见表3
表3柠檬苦素对AOM诱发大鼠结肠肿瘤发生的影响(n=20)
组别 |
发生肿瘤的个 数 |
平均肿瘤个数( 个/只) |
平均瘤体积(mm3/瘤) |
平均 瘤体 积抑 制率 (%) |
AOM |
20 |
3.5±1.2 |
303.1±525.4 |
|
AOM+0.02%柠檬苦素 |
14 |
1.3±1.1** |
121.4±126.8△△ |
60. 0% |
AOM+0.05%柠檬苦素 |
11 |
0.8±0.9** |
59.5±32.1△△ |
80. 4% |
0.05%柠檬苦素 |
0 |
0 |
0 |
0 |
阴性对照组 |
0 |
0 |
0 |
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注:与阳性组(AOM)相比**P<0.01,△△P<0.01,△△△P<0.001
从表3可以看出,至实验结束时,阳性对照组(AOM)大鼠全部发生结肠肿瘤;而阴性对照组无一只动物发生肿瘤,注射AOM并饮食柠檬苦素的动物,平均瘤数及平均瘤体积与阳性组相比,均具有显著性的差异,平均瘤体积的抑制率达到60.0%、80.4%。
2.3.4组织病理学变化
组织病理学观察上述大鼠结肠组织取材将结肠纵向剖开,生理盐水冲洗肠内容物。取靠近直肠端4cm和盲肠端4cm两段组织,经福尔马林固定后,梯度酒精脱水,石蜡包埋,常规石蜡切片(5μm)。2张切片经二甲苯脱蜡,梯度酒精水化后,进行常规HE染色。病理改变分异型增生和癌,出现明显肿瘤细胞病理改变者记录为癌。异型增生分级标准参考Mo rson等的方法。光学显微镜下盲法观察其病理改变。具体的结果见表4
表4柠檬苦素对AOM诱发大鼠结肠粘膜组织病理变化的影响(n=8)
注:与阳性组(AOM)相比,**P<0.01
由表4可以看出,阳性对照组(AOM)随着时间增加,病变程度加重,在第32周时,100%大鼠均发生结肠癌。在(AOM)致癌的不同时期,柠檬苦素组的组织异常增生程度及癌发生率均有显著的降低(P<0.01)。