JP2016056140A - 概日リズム調整剤 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、安全性に優れ、時計遺伝子Ｂｍａｌ１発現調節効果に優れた新規な概日リズム調整剤を提供することを課題とする。
【解決手段】霊芝抽出物を含有することを特徴とする概日リズム調整剤である。霊芝抽出物は時計遺伝子Ｂｍａｌ１発現調節効果を有していた。霊芝抽出物は概日リズムを調整することで、近年問題となっている時差ぼけや交代勤務等による体調の変調等、概日リズムの乱れが引き起こす様々な問題の改善に効果的であると考えられ、医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品等への応用が期待される。
【選択図】 なし

Description

本発明は、概日リズム（サーカディアンリズム）調整剤に関するものであり、詳しくは時計遺伝子Ｂｍａｌ１の発現調節剤及び時差ぼけ等を改善する概日リズム調整剤に関する。

概日リズムとは、約２４時間を周期とする生物リズムであり、ヒトを含むほとんどの生物に存在している。生物の睡眠、覚醒の他、体温、ホルモン分泌、代謝、血圧等のさまざまな生理現象が概日リズムを示す。近年、時差ぼけ、交代勤務等による体調の変調等、概日リズムの乱れが引き起こす様々な問題が指摘されている。

哺乳類における概日リズムの中枢は、視交叉上核に存在することが明らかになっており、末梢組織のリズムを同調させている。さらに、概日リズムは中枢のみでなく、心臓、肝臓、皮膚などの末梢組織においても独自の概日リズムが存在することが明らかにされている。そして近年、線維芽細胞をはじめとした培養細胞において、各種遺伝子発現の概日リズムをｉｎ ｖｉｔｒｏで同調させ、時計遺伝子発現を指標として概日リズムを評価する方法が用いられている（非特許文献１−３）。

概日リズムは、数種類の時計遺伝子と遺伝子産物によるネガティブフィードバックによって調節されており、中枢である視交叉上核においても末梢組織においても同様である。主要な時計遺伝子としては、Ｂｍａｌ１、Ｃｌｏｃｋ、Ｐｅｒｉｏｄ、Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅの４つのタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。Ｂｍａｌ１／Ｃｌｏｃｋヘテロダイマーが転写促進因子として働き、Ｐｅｒｉｏｄなどの発現を促進する。生じたＰｅｒｉｏｄ、Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅの複合体が抑制因子として働き、Ｂｍａｌ１／Ｃｌｏｃｋヘテロダイマーを抑制する。このフィードバックループが時計分子機構の中核（コア）をなし、約２４時間のリズムを刻むことにより、概日リズムが形成される。

時計遺伝子は多くの遺伝子の日周発現を制御しているが、その方法は二種類存在する。一つは転写因子として他の遺伝子の発現リズムを制御する直接的な方法である。もう一つはホルモン分泌の調節等を介して間接的に制御する方法であり、間接的に、より多くの遺伝子の発現を調節している。そのため、時計遺伝子の発現リズムが乱れると、広い範囲で生体器官の働きや内分泌系に異常をきたし、様々な症状を引き起こすことが明らかとなっている（非特許文献４）。

時差ぼけ（時差症候群）とは、数時間以上の時差がある地域間を飛行機などによって短時間で移動した際、外因性リズム（光の明暗等）と内因性リズム（概日リズム）にずれが生じることに起因する、心身の不調状態（睡眠・覚醒リズムの乱れ、注意力、集中力の低下等）のことである。

交代勤務等による体調の変調とは、勤務時間帯が朝から夕、夕から夜中及び真夜中から早朝まで等の間を循環する交代勤務者における、一時的な概日リズムの乱れ及びそれに起因する全身倦怠、疲労感の促進をはじめとする体調不全のことである。交代勤務者では、血漿中のトリグリセライド及びコレステロールが増加していること（非特許文献５）や、日中勤務者と比較して、交代勤務者では睡眠時と覚醒時で血圧の差異が小さいこと（非特許文献６）などが報告されている。これらの理由から、労働生産性の低下といった問題だけでなく、労働者の疾病管理といった労働衛生上の観点からも、これらの体調の変調を改善できる製剤の開発が産業上強く求められている。

これらの時差ぼけ、交代勤務等による体調の変調等の症状は、概日リズムの乱れが原因であると考えられる。

従って、時計遺伝子の発現を調節することにより、それにより制御されている生体の様々な行動リズムや生理機能の概日リズムを調整することが可能であると考えられ、概日リズムの変調を調整するために、十分な明るさの光を一定時間照射する方法（特許文献１、２）や、概日リズム調整にかかわるホルモンであるメラトニンやメラトニン誘導体及び新規化合物を用いた方法の探索が行われている（特許文献３、４）。

しかし、メラトニンは、催眠作用、内分泌系作用などの概日リズム調整以外の作用も有している（非特許文献７、８）ため、それらが副作用となってしまう可能性がある。メラトニン誘導体やメラトニン前駆物質についても同様の副作用の問題が残る。特に、メラトニン前駆物質であるセロトニンを経口摂取すると、消化器系・循環器系への悪影響が報告されている（非特許文献９、１０）。また、新規化合物の安全性は証明されていない段階にあるため、副作用が無く、安全で、安心して摂取できる素材によるリズム調整方法の発見は、未だ見出されておらず、強く求められているのが現状である。

霊芝は、生薬として流通している担子菌であり、マンネンタケ科（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｔａｃｅａｅ）、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）に属するキノコである。霊芝が時計遺伝子の発現を調節できることは、今まで全く知られていなかった。

ＷＯ９６１６６９７ ＷＯ９７１９７２０ 特開２００１−３１６２８１ 特開２００３−３３５６６９

Ｏｋａｍｕｒａ Ｈ．， （２００４） Ｃｌｏｃｋ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｌｏｃｋｓ： Ｒｏｌｅｓ， Ａｃｔｉｏｎｓ， ａｎｄ Ｍｙｓｔｅｒｉｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｈｙｔｈｍｓ， １９ （５）； ３８８−３９９ Ｂａｌｓａｌｏｂｒｅ Ａ．， Ｄａｍｉｏｌａ Ｆ．， Ｓｃｈｉｂｌｅｒ Ｕ．， （１９９８） Ａ ｓｅｒｕｍ ｓｈｏｃｋ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ， ９３； ９２９−９３７ Ｙａｇｉｔａ Ｋ．， Ｔａｍａｎｉｎｉ Ｆ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｒｓｔ Ｇ．， Ｏｋａｍｕｒａ Ｈ．， （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｌｏｃｋ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９２； ２７８−２８１ Ｈａｓｔｉｎｇｓ Ｍ．， Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ＪＳ．， Ｍａｙｗｏｏｄ ＥＳ．， （２００７） Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋｓ： ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｈｙｔｈｍｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １９５； １８７−１９８ Ｌｕｎｄ Ｊ．， Ａｒｅｎｄｔ Ｊ．， Ｈａｍｐｔｏｎ ＳＭ．， Ｅｎｇｌｉｓｈ Ｊ．， Ｍｏｒｇａｎ ＬＭ．， （２００１） Ｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｍｏｎｇ ｓｈｉｆｔ ｗｏｒｋｅｒｓ ｉｎ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ， １７１； ５５７−５６４ Ｙａｍａｓａｋｉ Ｆ．， Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＪＥ．， Ｇｅｒｂｅｒ ＬＭ．， Ｗａｒｒｅｎ Ｋ．， Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ ＴＧ．， （１９９８） Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｓｈｉｆｔ ｗｏｒｋ ａｎｄ ｒａｃｅ／ｅｔｈｎｉｃｉｔｙ ｏｎ ｔｈｅ ｄｉｕｒｎａｌ ｒｈｙｔｈｍ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ａｎｄ ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ． Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ， ３２； ４１７−４２３ Ｍｏｎｔｉ ＪＭ， Ｃａｒｄｉｎａｌｉ ＤＰ．， （２０００） Ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｌａｔｏｎｉｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｓｌｅｅｐ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｂｉｏｌ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｒｅｃｅｐｔ ９； ３２８−３９ Ｒｅｉｔｅｒ ＲＪ．， （１９９８） Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｎｎ Ｍｅｄ， ３０； １０３−１０８ Ｈａｓｌｅｒ ＷＬ．， （１９９９） Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｍｅｓｉｓ．Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｃｉ， ４４（８ Ｓｕｐｐｌ）：１０８Ｓ−１１３Ｓ ｖａｎ Ｚｗｉｅｔｅｎ ＰＡ， Ｂｌａｕｗ ＧＪ， ｖａｎ Ｂｒｕｍｍｅｌｅｎ Ｐ．， （１９９０）Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｒｕｇｓ Ｔｈｅｒ， ４（６）； １４４３−１４４７

本発明は、概日リズムのコア遺伝子であるＢｍａｌ１発現調節効果に優れた新規な剤を提供することを課題とする。

本発明者らは、この課題を解決すべく、鋭意検討した結果、霊芝抽出物が優れた時計遺伝子Ｂｍａｌ１発現調節効果を持つことを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の（１）〜（４）からなる。

（１）霊芝抽出物を含有することを特徴とする概日リズム調整剤。
（２）霊芝抽出物を含有することを特徴とする時計遺伝子発現調節剤。
（３）時計遺伝子がＢｍａｌ１である（２）記載の時計遺伝子発現調節剤。
（４）霊芝抽出物を含有することを特徴とする時差ぼけ及び交代勤務による体調の変調改善剤。
（５）霊芝抽出物が黒霊芝抽出物であることを特徴とする（１）〜（４）いずれか一項記載の剤。

本発明の概日リズム調整剤は、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現を調節して、概日リズムの不調に起因する様々な心身の症状を改善する効果を有しており、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品の分野において貢献できるものである。

培養ヒト皮膚線維芽細胞における、５０％ＦＢＳにより誘導された時計遺伝子発現の概日リズムを示すグラフ

本発明の概日リズム調整剤は、霊芝抽出物を有効成分とする。

本発明において遺伝子発現調節とは、遺伝子発現を促進及び抑制することに加え、それにより遺伝子発現リズムを調節することを含む。

本発明の概日リズム調整剤は、上記のＢｍａｌ１遺伝子発現調節剤を含む。時計遺伝子は、生物の睡眠や覚醒、体温、ホルモン分泌、代謝、血圧等に関するさまざまな遺伝子発現の概日リズムを制御しており、時計遺伝子であるＢｍａｌ１遺伝子発現を調節することにより、生体の様々な概日リズムを調整することができる。

Ｂｍａｌ１（Ｂｒａｉｎ−Ｍｕｓｃｌｅ Ａｒｎｔ Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）とは概日リズムの機能を決定する時計遺伝子の一つであり、ＡＲＮＴＬ（ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ−ｌｉｋｅ）とも呼ばれる。

本発明で使用する霊芝には赤霊芝及び黒霊芝などが含まれ、生薬「霊芝」に用いられる担子菌であり、マンネンタケ科（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｔａｃｅａｅ）、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）に属し、学名は、赤霊芝（赤芝、学名：Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）、黒霊芝（黒芝、学名：Ｇ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｇ．ｓｉｎｅｎｓｅ、Ｇ．ａｔｒｕｍ）といわれている。また、マンネンタケ属のキノコについては、中国の薬学古書である「本草綱目」や「神農本草経」には、黒霊芝（黒芝）のほか、赤霊芝（赤芝）、紫霊芝（紫芝）、青霊芝（青芝）、黄霊芝（黄芝）及び白霊芝（白芝）が存在すると記載されている。赤霊芝や黒霊芝は広く中国や日本市場などで流通しているものを用いることができるし、自生品や栽培品を用いても良い。

本発明に用いられる赤霊芝及び黒霊芝は、子実体、菌糸体、天産物、栽培物及び培養物などを問わず使用することができる。また、必要に応じてそのままの状態、破砕物、或いは乾燥物などを適宜選択して抽出操作に付することができる。

抽出する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノールなど）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなど）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトンなど）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチルなど）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、石油エーテルなど）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテルなど）が挙げられる。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。好ましくは、低級アルコール、ケトン類、エステル類などや、これらの含水溶媒が良い。特に好ましくは、熱水抽出が良い。

本発明の抽出物をさらに精製する方法として、互いに混合しない溶媒で液・液分配抽出により溶媒分画精製することもできる。

液・液分配抽出に用いる溶媒としては、上記の溶媒を用いることが可能である。例えば、（水又は含水アルコール）・炭化水素系、（水又は含水アルコール）・エーテル系、（水又は含水アルコール）・エステル系、水・ブタノール系などを採用できる。上記にとらわれず、互いに混合しない溶媒系であれば採用できる。好ましくは、溶媒抽出物（固形物）に含水低級アルコールと炭化水素溶媒とを加えて抽出し、炭化水素溶媒可溶分を除去した残液にエステル溶媒を加えて抽出することにより本発明の抽出物を精製することができる。また、酸や塩基による分別抽出を行うこともできる。

本発明の抽出物をさらに精製する方法として、霊芝抽出物又は上記の溶媒分画物を吸着剤に吸着させ、溶媒により溶出させることにより、抽出物を精製することができる。

上記抽出物や精製物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、希釈、ろ過、活性炭などによる脱色、脱臭、エタノール沈殿などの処理をして用いても良い。更には、抽出や精製した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥などの処理を行い、乾燥物として用いても良い。

本発明の概日リズム調整剤には、上記抽出物や吸着剤などによる精製物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲内で、希釈剤を用いることができ、希釈剤としては固体、液体、半固体でもよく、例えば次のものがあげられる。すなわち、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、香料、保存料、溶解補助剤、溶剤などである。具体的には、乳糖、ショ糖、ソルビット、マンニット、澱粉、沈降性炭酸カルシウム、重質酸化マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、セルロース又はその誘導体、アミロペクチン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、界面活性剤、水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、カカオ脂、ラウリン脂、ワセリン、パラフィン、高級アルコールなどである。

本発明の概日リズム調整剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品のいずれにも用いることができ、その剤型は、例えば、経口用として散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤、飲料、錠菓、米飯添加物などである。非経口用として注射液にすることが出来る。また、座薬とすることも出来る。外用剤としては、化粧水、クリーム、マッサージクリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏などが挙げられる。

本発明に用いる抽出物の摂取量は、投与形態、使用目的、年齢、体重などによって異なるが、赤霊芝と黒霊芝固形分の合計として、０．１〜５，０００ｍｇ／日、好ましくは１〜５００ｍｇ／日の範囲で１日１回から数回経口投与できる。もちろん前記したように、投与方法や投与量は種々の条件で変動するので、上記投与範囲より少ない量で十分な場合もあるし、また、範囲を超えて投与する必要がある場合もある。外用剤の場合は、本発明の概日リズム調整剤の全量に対し、固形物に換算して０．００１重量％以上、好ましくは０．００５〜１０重量％が良い。０．００１重量％未満では十分な効果は発揮されにくい。１０重量％を越えて配合した場合、効果の増強はみられにくく不経済である。また、添加の方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。

本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、本発明の処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す％は重量％を示す。

尚、本発明の概日リズム調整剤の具体的な適用は、概日リズムの調整に関連するものであれば特に限定されない。

製造例１ 赤霊芝の熱水抽出物
赤霊芝子実体の乾燥物１００ｇに精製水２Ｌを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して赤霊芝の熱水抽出物を６．０ｇ得た。

製造例２ 黒霊芝の熱水抽出物
黒霊芝子実体の乾燥物２０ｇに精製水４００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して黒霊芝の熱水抽出物を１．４ｇ得た。

製造例３ 赤霊芝のエタノール抽出物
製造例１で使用したものと同じ赤霊芝子実体の乾燥物５００ｇにエタノール５Ｌを加えて、５時間還流抽出した。抽出終了後、濾過し、その濾液を濃縮して赤霊芝のエタノール抽出物を８．３ｇ得た。

製造例４ 黒霊芝のエタノール抽出物
製造例２で使用したものと同じ黒霊芝子実体の乾燥物５００ｇにエタノール５Ｌを加えて、５時間還流抽出した。抽出終了後、濾過し、その濾液を濃縮して黒霊芝のエタノール抽出物を６．５ｇ得た。

以下、実験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実験例に限定されるものではない。尚、培養細胞として、各種細胞を用いることができるが、本実験例ではヒト皮膚線維芽細胞を用いて評価を行なった。いずれの生物種及び細胞種においても時計遺伝子のコアシステムは共通であるため、ヒト皮膚線維芽細胞での評価結果は、他の生物種及び細胞種にも反映できると考えられる。

実験例１ 培養ヒト皮膚線維芽細胞における時計遺伝子発現リズムの確認
培養ヒト皮膚線維芽細胞を用いて、時計遺伝子発現の概日リズムを評価できることを
確認した。

培養細胞では通常、細胞一つ一つがそれぞれのタイミングでリズムを刻んでいるが、５０％ＦＢＳで刺激することによって時計遺伝子発現リズムを同調させることができる。

ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０^５個播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地にて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで、５０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地にて、インキュベートした。２時間後にＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地に置換した時点を０時間とし、３時間ごとに３０時間後までの細胞を回収し、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法には、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ）及びＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。すなわち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、ＢＭＡＬ１及びＰＥＲ２ ｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。ＢＭＡＬ１及びＰＥＲ２の発現率は、同調０時間後のＢＭＡＬ１及びＰＥＲ２ ｍＲＮＡの発現量に対する同調各時間後のＢＭＡＬ１及びＰＥＲ２ ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。

ＢＭＡＬ１用のプライマーセット
ＧＴＧＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＡＴＡＣＡＣＡ（配列番号１）
ＴＧＣＣＣＴＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＴＧＴＴ（配列番号２）
ＰＥＲ２用のプライマーセット
ＣＧＣＣＡＧＡＧＴＣＣＡＧＡＴＡＣＣＴＴＴ（配列番号３）
ＴＴＣＧＡＡＧＡＣＴＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＧ（配列番号４）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号５）
ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号６）

実験結果を図１に示した。５０％ＦＢＳで刺激することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現は刺激約６時間後に最も高く、約２１時間後に最も低くなり、また、Ｐｅｒｉｏｄ２遺伝子の発現は刺激約１２時間後に最も低く、約２４時間後に最も高くなり、いずれも約２４時間周期の概日リズムを刻むことが確認できた。

実験例２ 同調６時間後における霊芝抽出物の時計遺伝子Ｂｍａｌ１発現促進効果
実験例１の結果から、培養ヒト皮膚線維芽細胞において、Ｂｍａｌ１発現は５０％ＦＢＳによる刺激の約６時間後に最も高い発現を迎える概日リズムを刻むことが認められた。そこで、５０％ＦＢＳ刺激６時間後の遺伝子発現量を指標として、霊芝抽出物のＢｍａｌ１遺伝子発現調節効果について評価した。

実験例１と同様の方法により、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を播種、培養し、同調させた。同調後、最終濃度１、１０、１００μｇ／ｍＬの試料を添加したＤＭＥＭ培地にてさらに６時間培養した後、細胞を回収し、総ＲＮＡの抽出を行った。その後、実験例１と同様の方法により、ＢＭＡＬ１ ｍＲＮＡの発現量を求めた。ＢＭＡＬ１の発現率は、コントロールのＢＭＡＬ１ ｍＲＮＡの発現量に対する霊芝抽出物を添加した時のＢＭＡＬ１ ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。

実験結果を表１に示した。本発明の霊芝抽出物は、同調６時間後においてＢｍａｌ１遺伝子発現促進効果を示した。中でも特に、黒霊芝では赤霊芝と比較してより高い効果を示した。Ｂｍａｌ１遺伝子発現が最も高い同調６時間後において、Ｂｍａｌ１遺伝子発現を促進することで、Ｂｍａｌ１遺伝子発現の日内変動リズムを明確にし、概日リズムを調整することができると考えられる。

実験例３ 同調２１時間後における霊芝抽出物の時計遺伝子Ｂｍａｌ１発現抑制効果
実験例１の結果から、培養ヒト皮膚線維芽細胞において、Ｂｍａｌ１遺伝子発現は５０％ＦＢＳによる刺激の約２１時間後に最も低い発現を迎える概日リズムを刻むことが認められた。そこで、５０％ＦＢＳ刺激２１時間後の遺伝子発現量を指標として、霊芝抽出物のＢｍａｌ１遺伝子発現調節効果について評価した。

実験例１と同様の方法により、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を播種、培養し、同調させた。同調後、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地にて培養した。１９時間後、最終濃度１、１０、１００μｇ／ｍＬの試料を添加したＤＭＥＭ培地にてさらに２時間培養後、細胞を回収し、総ＲＮＡの抽出を行った。その後、実験例１と同様の方法により、ＢＭＡＬ１ ｍＲＮＡの発現量を求めた。ＢＭＡＬ１の発現率は、コントロールのＢＭＡＬ１ ｍＲＮＡの発現量に対する霊芝抽出物を添加した時のＢＭＡＬ１ ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。

実験結果を表２に示した。本発明の霊芝抽出物は、同調２１時間後においてＢｍａｌ１遺伝子発現抑制効果を示した。中でも特に、黒霊芝では赤霊芝と比較してより高い効果を示した。Ｂｍａｌ１遺伝子発現が最も低い同調２１時間後において、Ｂｍａｌ１遺伝子発現を抑制することで、Ｂｍａｌ１遺伝子発現の日内変動リズムを明確にし、概日リズムを調整することができると考えられる。

本発明の概日リズム調整剤は、処方例として下記の製剤化を行うことができる。これらの製剤は概日リズムの調整に有効である。

処方例１ 散剤
処方 配合量（％）
１．赤霊芝の熱水抽出物（製造例１） ２０．０
２．乾燥コーンスターチ ２０．０
３．微結晶セルロース ６０．０
［製法］成分１〜３を混合し、散剤とする。

処方例２ 錠剤
処方 配合量（％）
１．黒霊芝の熱水抽出物（製造例２） １２．０
２．乾燥コーンスターチ ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム ２０．０
４．微結晶セルロース ３３．０
５．ポリビニルピロリドン ７．０
６．タルク ３．０
［製法］成分１〜４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成形する。成形した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。

処方例３ 飲料
処方 配合量（％）
１．赤霊芝のエタノール抽出物 （製造例３） ０．２
２．エタノール ２．０
３．ステビア ０．０５
４．リンゴ酸 ５．０
５．香料 ０．１
６．精製水 ９２．６５
［製法］成分１及び２を混合する。次いで、成分３、４、５及び６を加えて混合する。

処方例４ 錠菓
処方 配合量（％）
１．黒霊芝のエタノール抽出物（製造例４） １．５
２．乾燥コーンスターチ ５０．０
３．エリスリトール ４０．０
４．クエン酸 ５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル ３．４
６．香料 ０．１
［製法］成分１〜４を混合し、１０％の水を結合剤として加え流動層造粒する。成形した顆粒に成分５及び６を加えて混合し打錠する。１粒１．０ｇとする。

処方例５ 米飯添加物
処方 配合量（％）
１．赤霊芝の熱水抽出物（製造例１） １０．０
２．デキストリン ８９．０
３．微粒子二酸化ケイ素 １．０
［製法］成分１〜３を混合して米飯添加物を得る。使用に当たっては、加水時に米１合に対して該添加物を２．０ｇ加えて炊飯する。

処方例６ クリーム
処方 配合量（％）
１．黒霊芝の熱水抽出物（製造例２） １．０
２．酵母セラミド １．０
３．スクワラン ５．５
４．オリーブ油 ３．０
５．ステアリン酸 ２．０
６．ミツロウ ２．０
７．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
８．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
９．ベヘニルアルコール １．５
１０．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１１．香料 ０．１
１２．１，３−ブチレングリコール ８．５
１３．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１４．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１５．精製水 ６６．１５
［製法］成分２〜１０を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１２〜１５を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１１を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

処方例７ 乳液
処方 配合量（％）
１．黒霊芝のエタノール抽出物（製造例４） ０．５
２．コンニャクセラミド ０．５
３．スクワラン ５．０
４．オリーブ油 ５．０
５．ホホバ油 ５．０
６．セタノール １．５
７．モノステアリン酸グリセリン ２．０
８．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
９．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
１０．香料 ０．１
１１．プロピレングリコール １．０
１２．グリセリン ２．０
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．精製水 ７２．２
［製法］成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

処方例８ パック
処方 配合量（％）
１．赤霊芝のエタノール抽出物（製造例３） ０．１
２．酵母セラミド ０．１
３．ポリビニルアルコール １２．０
４．エタノール ５．０
５．１，３−ブチレングリコール ８．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
７．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．） ０．５
８．クエン酸 ０．１
９．クエン酸ナトリウム ０．３
１０．香料 ０．１
１１．精製水 ７３．６
［製法］成分１〜１１を均一に溶解し製品とする。

処方例９ 軟膏
処方 配合量（％）
１．黒霊芝のエタノール抽出物（製造例４） １．０
２．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
３．モノステアリン酸グリセリン １０．０
４．流動パラフィン ５．０
５．セタノール ６．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
７．プロピレングリコール １０．０
８．精製水 ６５．９
［製法］成分２〜５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び６〜８を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

本発明の概日リズム調整剤は、優れたＢｍａｌ１遺伝子発現調節効果を示し、時差ぼけ、交代勤務等による体調の変調等、概日リズムの乱れが引き起こす様々な問題の改善に特に有効である。

Claims (5)

1. 霊芝抽出物を含有することを特徴とする概日リズム調整剤。
2. 霊芝抽出物を含有することを特徴とする時計遺伝子発現調節剤。
3. 時計遺伝子がＢｍａｌ１である請求項２記載の時計遺伝子発現調節剤。
4. 霊芝抽出物を含有することを特徴とする時差ぼけ及び交代勤務による体調の変調改善剤。
5. 霊芝抽出物が黒霊芝抽出物であることを特徴とする請求項１〜４いずれか一項記載の剤。