JP4607484B2

JP4607484B2 - ガン転移抑制剤

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Publication number: JP4607484B2
Application number: JP2004115615A
Authority: JP
Inventors: 勉坂井田; 潔松村; 和寿大隅; 正孝岸
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2004-04-09
Filing date: 2004-04-09
Publication date: 2011-01-05
Anticipated expiration: 2024-04-09
Also published as: JP2005298391A

Description

本発明は、ガンの転移抑制剤に関する。

ガンは、ほとんどの先進諸国における主要死亡原因の１つであり、我が国では、およそ３割の人がガンで亡くなっている状況である。近年の外科療法、放射線療法の発達により、ガンの原発巣自体はほぼ取り除けるようになったが、それでも尚死亡率が高いのは、ガンが転移を起こす性質を有しているためと考えられており、転移が多発するようになったガンを治療することは現状では非常に困難であると言わざるをえない。従って、従来の原発巣の治療法に加えて、転移を抑制する方法を確立することが、ガン治療の大きな目的の１つであると考えられる。このような現況の中、徐々にではあるが転移のメカニズムが分子レベルで明らかになりつつあり、最近では、その転移プロセスの１つとして細胞外基質の分解系が注目されている。

ガンの転移とは、原発部位から離脱したガン細胞が血流に乗って全身に散布され、他の臓器に生着し、その組織で再び増殖をはじめることである。一般に、腫瘍組織は、密な細胞外基質に囲まれているため、ガン細胞が原発部位からの移動を行うためには細胞外基質の酵素分解を必要とする。細胞外基質はコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン等の多様な高分子によって構成されており、これら細胞外基質の分解に関わる主要な酵素群が、ＭＭＰである。ＭＭＰは、ガン組織中で血管が新生される際あるいはガンが転移する際に、発現量が上昇したり酵素の活性化が起こることが、例えば下記の非特許文献１に記載されている。従って、これらの酵素の発現量の低下や活性を阻害することにより、ガン細胞の浸潤を抑制し、転移を抑えることが可能になると期待できる。

「腫よう湿潤およびマトリックスメタロプロティナーゼ合成のレチノイド仲介阻害」（ＳｃｈｏｅｎｅｒｍａｒｋＭＰ等、『ＡｎｎａｌｓＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ』、Ｖｏｌ．８７８、第４６６−４８６頁、１９９９年）

ガンの転移を抑制する従来技術としては、マンネンタケ（赤霊芝や黒霊芝）のＭＭＰ阻害剤が特許文献１に記載されている。

特願２００２−２８０６３２号

この文献には赤霊芝や黒霊芝の溶媒抽出物のＭＭＰ阻害効果が記載されているが、これらの活性成分については一切記載されていない。

本発明は、ガンの転移抑制剤を得ることを目的とする。

この様な事情により、本発明者らは鋭意研究検討した結果、主として黒霊芝に含有する特定の成分に極めて高いガン転移抑制効果を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明のガン転移抑制成分は、次の事項によって特徴付けられるものである。
１．
下記に示される、（１）〜（５）のすべての条件を満たす成分を含有することを特徴とする、ガン転移抑制剤。
（１）黒霊芝のエタノール抽出物に含有する成分である。
（２）赤外吸収スペクトルを測定すると（ＫＢｒ法）、２９２５、１７００、１６００、１４５５、１１７０、８３５ｃｍ ^−１に吸収の極大を示す。
（３）本成分をエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定すると、２８０〜３３０ｎｍに吸収の極大を示す。
（４）分子内に芳香環を含有する。
（５）本成分に酢酸エチルを加えたとき、酢酸エチル可溶分の溶液は着色性であり、茶色〜赤褐色を示す。
２．
下記（Ａ）〜（Ｆ）の条件にてＨＰＬＣ分析を行い、図１に示される、保持時間が１０〜２５分のブロードなピークを有する成分を含有することを特徴とする、上記１．に記載のガン転移抑制剤。
分析条件
（Ａ）ＨＰＬＣカラム：ＯＤＳ（オクタデシル化シリカゲル）
（Ｂ）ＨＰＬＣカラム温度：４０℃
（Ｃ）展開溶媒
０．２％リン酸／０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを用い、０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを２０％から１００％に２０分かけて直線的に溶媒を変化させ、１００％で２５分保持する（４５分分析）。
（Ｄ）流速：１ｍＬ／分
（Ｅ）検出：３１３ｎｍ
（Ｆ）試料：１０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液を２０マイクロＬ導入

上記のうち、（４）は^１Ｈ、^１３Ｃ−ＮＭＲ分析により判別可能である。すなわち、溶媒として重メタノール（ＣＤ_３ＯＤ）を用いて測定した場合、６〜８ｐｐｍ（^１Ｈ−ＮＭＲ）、１００〜１５０ｐｐｍ（^１３Ｃ−ＮＭＲ）に芳香族に置換した水素原子のスペクトル吸収が認められる。上記のスペクトル分析値は分析機器、手法、ピークの幅広さなどにより、若干数値の誤差がある場合がある。（５）については、本成分約１〜１０ｍｇに酢酸エチル１ｍＬを加えることで着色性を判別できる。

また、本発明のガン転移抑制成分は、定法により加水分解を行うと、ヒドロキシケイヒ酸を遊離する性質がある。例えば、水酸化ナトリウム水溶液などを用いた定法により加水分解でき、ＨＰＬＣなどで分析することで確認できる。

本発明のガン転移抑制成分は、以下に示した高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により確認できる（図１参照）。本分析によれば、保持時間が約１０〜２５分の幅広のピーク群が本発明のガン転移抑制成分である（分析条件により、保持時間、パターンは若干変化することがある）。
（Ａ）カラム：オクタデシル化シリカゲル（ＯＤＳ、内径４．５ｍｍ×２５０ｍｍ）
（Ｂ）カラム温度：４０℃
（Ｃ）展開溶媒：０．２％リン酸／０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを用い、０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを２０％から１００％に２０分かけて直線的に溶媒を変化させ、１００％で２５分保持する（計４５分分析）。
（Ｄ）流速：１ｍＬ／分
（Ｅ）検出：３１３ｎｍ
（Ｆ）試料：１０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液を２０マイクロＬ導入

本発明に用いられる黒霊芝は、マンネンタケ科（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｔａｃｅａｅ）、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）に属し、学名は、Ｇ．ａｔｒｕｍ、Ｇ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｇ．ｓｉｎｅｎｓｅなどといわれている。また、マンネンタケ属のキノコについては、中国の薬学古書である「本草綱目」や「神農本草経」には、黒霊芝（黒芝）のほか、赤霊芝（霊芝）、紫霊芝（紫芝）、青霊芝（青芝）、黄霊芝（黄芝）及び白霊芝（白芝）が存在すると記載されている。黒霊芝は広く中国や日本市場などで流通しているものを用いることができるし、自生品や栽培品を用いても良い。

なお、黒霊芝は紫霊芝と外観が似ているために紫霊芝として市場に流通していることもある。この場合、例えば、上記の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析することにより、本発明のガン転移抑制成分の検出が可能である。また、まれに赤霊芝にも微量含有している場合もあり、何れも本発明の範囲に属するものとする。

本発明に用いられる黒霊芝などは、子実体、菌糸体、天産物、栽培物、及び培養物などを問わず使用することができる。また、必要に応じてそのままの状態、破砕物、或いは乾燥物などを適宜選択して抽出操作に付することができる。

本発明のガン転移抑制成分の抽出方法の一例として、好ましくは黒霊芝の子実体を溶媒抽出することにより得ることができる。

抽出する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノールなど）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなど）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトンなど）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチルなど）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、石油エーテルなど）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテルなど）が挙げられる。好ましくは、低級アルコール、ケトン類、アセトニトリル、エステル類などや、これらの含水溶媒が良く、特に好ましくは、安全性の面からエタノール又は含水エタノールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。また、塩基性にして抽出することも好ましい。

本発明のガン転移抑制成分をさらに精製する方法として、互いに混合しない溶媒で液・液分配抽出により溶媒分画精製することもできる。

液・液分配抽出に用いる溶媒としては、上記の溶媒を用いることが可能である。例えば、（水又は含水アルコール）・炭化水素系、（水又は含水アルコール）・エーテル系、（水又は含水アルコール）・エステル系、水・ブタノール系などを採用できる。上記にとらわれず、互いに混合しない溶媒系であれば採用できる。好ましくは、溶媒抽出物（固形物）に含水低級アルコールと炭化水素溶媒を加えて抽出し、炭化水素溶媒可溶分を除去した残液にエステル溶媒を加えて抽出することにより本発明のガン転移抑制成分を精製することができる。また、酸や塩基による分別抽出を行うこともできる。

本発明のガン転移抑制成分をさらに精製する方法として、黒霊芝の溶媒抽出物又は上記の溶媒分画物を吸着剤に吸着させ、溶媒により溶出させることにより、ガン転移抑制成分を精製することができる。

吸着剤としては、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂、イオン交換樹脂、オクタデシル化シリカゲル（ＯＤＳ）、シリカゲル、セルロース、デキストラン、修飾デキストランなどの吸着剤が挙げられる。中でも、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂やＯＤＳが好ましい。

吸着方法としては、吸着剤をカラムに充填し、これに抽出物の溶液を通す方法や、抽出物の溶液に吸着剤をそのまま混合する方法などがあるが、特に限定されない。

吸着剤の溶出溶媒としては、各吸着剤の特性により選択できるが、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノールなど）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなど）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトンなど）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチルなど）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、石油エーテルなど）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテルなど）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコールなどの溶媒が良く、特に好ましくは、水やエタノールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。更に、上記溶出溶媒に酸やアルカリを添加してｐＨ調整して用いても良い。

上記抽出物や精製物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、希釈、ろ過、活性炭などによる脱色、脱臭、エタノール沈殿などの処理をして用いても良い。更には、抽出や精製した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥などの処理を行い、乾燥物として用いても良い。

特に好ましい例を挙げると、溶媒抽出を行った後、上記の液・液分配抽出（上記の好ましいとされる溶媒系で抽出）で精製する方法や、溶媒抽出を行った後、合成吸着樹脂（スチレン−ジビニルベンゼン系、上記の好ましいとされる溶媒で溶出）で精製する方法や、溶媒抽出を行った後、ＯＤＳ系の吸着剤で精製する方法が良い。

本発明のガン転移抑制成分は、使用目的に応じ、液・液分配抽出や吸着剤による精製を単独又は組み合わせて製造することができる。

本発明のガン転移抑制成分は、医薬品として用いることができ、その剤型としては、例えば、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、座剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤等を含む）、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス等が挙げられる。また、本発明の効果を損なわない範囲内で、賦形剤、安定剤、保存剤、結合剤、崩壊剤、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、油脂類、ロウ類等の成分を配合することもできる。

本発明に用いるガン転移抑制成分の摂取量は、投与形態、使用目的、年齢、体重などによって異なるが、０．１〜５，０００ｍｇ／日、好ましくは１〜５００ｍｇ／日の範囲で１日１回から数回経口投与できる。もちろん前記したように、投与方法や投与量は種々の条件で変動するので、上記投与範囲より少ない量で十分な場合もあるし、また、範囲を超えて投与する必要がある場合もある。また、添加の方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。

本発明の新規なガン転移抑制成分は、ガンの転移抑制効果が非常に高かった。

本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、本発明の処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量の部とは重量部を示し、％は重量％を示す。

製造例１黒霊芝のガン転移抑制成分の製造
黒霊芝子実体の乾燥物１Ｋｇにエタノール１５Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、黒霊芝のエタノール抽出物を２０ｇ得た。このうち、黒霊芝のエタノール抽出物０．５０ｇを分取ＨＰＬＣにより精製し、黒霊芝のガン転移抑制成分を０．２１ｇ得た。なお、ＨＰＬＣの分画範囲は、００１３段落に記載の範囲とした。
＜ＨＰＬＣ分画条件＞
（Ａ）充填剤：ＯＤＳ（内径２０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）
（Ｂ）展開溶媒
０．２％リン酸／０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを用い、０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを２０％から１００％に２０分かけて直線的に溶媒を変化させ、１００％で２５分保持する。
（Ｃ）流速：１０ｍＬ／分
（Ｄ）検出：３５０ｎｍ

＜製造例１のスペクトル解析＞
赤外吸収スペクトル分析
製造例１の黒霊芝の溶媒分画物をＫＢｒ法で赤外吸収スペクトルを測定した。その結果、約３２９４、２９２６、１６９８、１６０４、１４５６、１１６９、８２３ｃｍ^−１に吸収の極大を示した。
紫外吸収スペクトル分析
製造例１の黒霊芝の溶媒分画物５ｍｇを１００ｍＬのエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定した。その結果、２９５、３１３ｎｍに吸収の極大を示した。
ＮＭＲスペクトル分析
製造例１の黒霊芝の溶媒分画物を用い、定法により^１Ｈ、^１３Ｃ−ＮＭＲ分析した結果、６．６〜７．６ｐｐｍ（^１Ｈ−ＮＭＲ）、１００〜１５０ｐｐｍ（^１３Ｃ−ＮＭＲ）にスペクトル吸収を認め、芳香環の存在が確認された。なお、溶媒は重メタノール（ＣＤ_３ＯＤ）を用いた。

比較製造例１黒霊芝のエタノール抽出物
製造例１で製造した抽出物を用いた。

本発明のガン転移抑制成分は、処方例として下記の製剤化を行うことができる。

処方例１散剤
処方配合量
１．黒霊芝のガン転移抑制成分（製造例１）２０部
２．乾燥コーンスターチ３０
３．微結晶セルロース５０
［製法］成分１〜３を混合し、散剤とする。

処方例２軟膏
処方配合量
１．黒霊芝のガン転移抑制成分（製造例１）０．５部
２．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．）２．０
３．モノステアリン酸グリセリン１０．０
４．流動パラフィン５．０
５．セタノール６．０
６．パラオキシ安息香酸メチル０．１
７．プロピレングリコール１０．０
８．精製水６６．４
［製造方法］成分２〜５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１および６〜８を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。

実験例１ガン転移抑制試験
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対し、黒霊芝のガン転移抑制成分（製造例１）を１日１回、１００ｍｇ／ｋｇとなるように腹腔経路にて１週間連続投与を行った。対照群には生理食塩水を腹腔内投与した。動物の例数は一群８匹とした。次いで、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞をマウス１匹あたり１×１０^５個となるように尾静脈より注入した。その後も試料の投与は継続し、ガン細胞の接種から３週間後に肺を摘出し、１０％ホルマリン溶液中で固定した。ホルマリン固定した肺を５葉に分割し、表面に形成された転移巣の数をカウントした。その結果、表１に示すように、黒霊芝のガン転移抑制成分の投与により転移巣の形成は対照群と比較して有意に抑制され、極めて高い転移抑制効果を有することがわかった。

以上より、黒霊芝のガン転移抑制成分は、ガン転移抑制効果に優れていた。

本発明の黒霊芝に含有するガン転移抑制成分は、ガンの転移抑制効果に優れ、ガンの転移に対する予防、抑制または症状の改善を目的とする医薬品に配合することが可能である。

黒霊芝のガン転移抑制成分のＨＰＬＣチャートを示す。横軸は保持時間（分）、縦軸は強度を示す。

Claims

下記に示される、（１）〜（５）のすべての条件を満たす成分を含有することを特徴とする、ガン転移抑制剤。
（１）黒霊芝のエタノール抽出物に含有する成分である。
（２）赤外吸収スペクトルを測定すると（ＫＢｒ法）、２９２５、１７００、１６００、１４５５、１１７０、８３５ｃｍ ^−１に吸収の極大を示す。
（３）本成分をエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定すると、２８０〜３３０ｎｍに吸収の極大を示す。
（４）分子内に芳香環を含有する。
（５）本成分に酢酸エチルを加えたとき、酢酸エチル可溶分の溶液は着色性であり、茶色〜赤褐色を示す。
下記（Ａ）〜（Ｆ）の条件にてＨＰＬＣ分析を行い、図１に示される、保持時間が１０〜２５分のブロードなピークを有する成分を含有することを特徴とする、請求項１に記載のガン転移抑制剤。
分析条件
（Ａ）ＨＰＬＣカラム：ＯＤＳ（オクタデシル化シリカゲル）
（Ｂ）ＨＰＬＣカラム温度：４０℃
（Ｃ）展開溶媒
０．２％リン酸／０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを用い、０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを２０％から１００％に２０分かけて直線的に溶媒を変化させ、１００％で２５分保持する（４５分分析）。
（Ｄ）流速：１ｍＬ／分
（Ｅ）検出：３１３ｎｍ
（Ｆ）試料：１０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液を２０マイクロＬ導入