CN106198172B

CN106198172B - 一种黑果枸杞中花色苷类化合物的选择性富集方法

Info

Publication number: CN106198172B
Application number: CN201510214091.3A
Authority: CN
Inventors: 梁鑫淼; 金红利; 刘艳芳; 郭志谋; 张秀莉; 薛兴亚
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Taizhou Medical City Guoke Huawu Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2019-02-15
Anticipated expiration: 2035-04-30
Also published as: CN106198172A

Abstract

本发明公开了一种黑果枸杞中花色苷类化合物的选择性富集方法，具体为将所述的花色苷类化合物在低pH条件下洗脱，以保证该类化合物的稳定性，黑果枸杞的酸化乙醇提取物经弱极性大孔树脂进行分离得到黑果枸杞样品，之后，将得到的黑果枸杞样品过强阳离子交换固相萃取柱，富集样品中的花色苷类化合物粗组分，再次，将得到的花色苷类化合物粗组分经弱极性大孔树脂脱盐制备得到精组分；该方法可以实现复杂体系中花色苷类化合物的选择性富集，解决了该类化合物与杂质在反相材料上“共流出”的问题，实现了该类化合物的类分离。因此，本发明建立了一种花色苷类化合物选择性富集的新方法，为该类化合物生物活性的深入研究提供技术支撑。

Description

一种黑果枸杞中花色苷类化合物的选择性富集方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种黑果枸杞中花色苷类化合物的选择性富集方法，具体地说是一种采用强阳离子交换固相萃取柱在低pH条件下选择性地富集花色苷类化合物的新方法，该方法对复杂体系中花色苷类化合物的富集表现出较优的分离效果。

背景技术

花色苷是一种广泛存在于自然界植物中的天然水溶性色素。花色苷属于黄酮类化合物。它由于其独特的功能性，而被应用于清除体内自由基、增殖叶黄素、抗肿瘤、抗癌、抗炎、抑制脂质过氧化和血小板凝集、预防糖尿病、减肥、保护视力等。(Hou,D.X.(2003).Potential mechanisms of cancer chemoprevention by anthocyanins.CurrentMolecular Medicine,3(2),149-159；Olsson,M.E.,Gustavsson,K.E.,Andersson,S.,Nilsson,A.,&Duan,R.D.(2004).Inhibition of cancer cell proliferation in vitroby fruit and berry extracts and correlations with antioxidant levels.Journalof Agricultural and Food Chemistry,52(24),7264-7271)。然而，多数活性实验采用的是花色苷粗提物，由于大量非花色苷类化合物的存在，严重影响了花色苷类化合物生物活性的研究。

黑果枸杞中含有丰富的花色苷类化合物。由于花色苷类化合物与样品中非花色苷类杂质疏水性相似，常规反相方法制备花色苷组分较为低效、耗时，且选择性较差。因此，采用高效的类分离方法从黑果枸杞中制备花色苷类组分，对于开展相关生物活性研究具有重要意义。

发明内容

针对上述问题，本发明的技术目的是提供一种利用强阳离子交换固相萃取柱选择性富集黑果枸杞中花色苷类化合物的方法。

本发明的具体技术方案为：

本发明提供一种黑果枸杞中花色苷类化合物的选择性富集方法：

1)黑果枸杞样品的制备：黑果枸杞的酸化乙醇提取物经弱极性大孔树脂进行分离得到黑果枸杞样品，其中黑果枸杞酸化乙醇提取物的pH为1-4；

2)花色苷类化合物粗组分的制备：将得到的黑果枸杞样品过强阳离子交换固相萃取柱，富集样品中的花色苷类化合物粗组分；

3)花色苷类化合物精组分的制备：将得到的花色苷类化合物粗组分经弱极性大孔树脂脱盐制备得到精组分。

所述的弱极性大孔树脂为AB-8大孔树脂、D101或HPD100。

步骤1)所述的黑果枸杞提取物的制备方法为：称取一定量的黑果枸杞果实，用5-30倍量的50％-95％乙醇溶液浸泡提取1-5次，每次浸泡时间为1-3小时，其中，乙醇溶液中加入盐酸、甲酸、三氟乙酸中的一种或两种以上，调节乙醇溶液pH值至1-3，合并提取液抽滤，用旋转蒸发仪60℃条件下减压回收乙醇，得到浓缩液，将浓缩液上AB-8大孔树脂、D101或HPD100大孔吸附树脂柱，先用3-5倍柱体积的蒸馏水或10％-30％乙醇溶液淋洗，然后用3-5倍柱体积50％-95％的乙醇洗脱花色苷，收集洗脱液，减压浓缩，最后真空冷冻干燥，即黑果枸杞样品，干燥过程中物料温度不得超过70℃，真空度为20-50Pa。

固相萃取柱为强阳离子交换固相萃取柱(XCharge SCX)，固相萃取柱参数为0.5-20g，1-60mL，dp＝10μm-100μm。

步骤2)中所述的花色苷类化合物粗组分的制备方法为：称取一定量黑果枸杞样品溶解于甲酸水溶液中，其中甲酸体积浓度为0.1％-0.5％，样品浓度为10mg/mL-200mg/mL，用3-10倍柱体积量的甲醇溶液活化及平衡SCX SPE柱，抽干SPE柱，上样，上样量为1mg-500mg，采用线性梯度、台阶梯度或等度洗脱方式，黑果枸杞样品经过两次淋洗，淋洗1：10-100mL 5％-50％(v/v)乙腈-甲酸水溶液，酸水溶液体积浓度为0.1％-0.5％，流速为1mL/min-30mL/min；淋洗2：10～100mL 10％～60％(v/v)乙腈水溶液，溶液中加入0.1M～2M磷酸二氢钠，使淋洗2的pH值保持在1-3，流速为1mL/min-30mL/min，收集洗脱液，减压浓缩，至有机溶剂完全除去，即得花色苷粗组分，干燥过程中物料温度不得超过70℃，真空度为20-50Pa。

步骤3)中所述的花色苷类化合物精组分的制备过程为，花色苷粗组分上AB-8大孔树脂、D101或HPD100大孔吸附树脂柱，先用3-5倍柱体积的蒸馏水或10％-30％乙醇溶液淋洗，然后用3-5倍柱体积50％-95％的乙醇洗脱花色苷，收集洗脱液，减压浓缩，最后真空冷冻干燥，即黑果枸杞精组分，干燥过程中物料温度不得超过70℃，真空度为20-50Pa。

本发明的有益效果

该方法可以实现复杂体系中花色苷类化合物的选择性富集，解决了该类化合物与杂质在反相材料上“共流出”的问题，实现了该类化合物的类分离。因此，本发明建立了一种花色苷类化合物选择性富集的新方法，为该类化合物生物活性的深入研究提供技术支撑。

附图说明

图1中(A)、(B)分别为黑果枸杞提取物和花色苷精组分液相分析结果。

图2为黑果枸杞提取物和花色苷精组分的总花色苷含量测定结果。

具体实施方式

现结合实例，对本发明做进一步说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

本发明使用的强阳离子固相萃取柱XCharge SCX为北京华谱新创科技有限公司生产。

实施例1

1)黑果枸杞70％(v/v)乙醇-甲酸水(pH 2)提取物先经弱极性大孔树脂分离，淋洗条件：分离材料：AB-B大孔树脂；淋洗1：分离条件：树脂为AB-8大孔树脂(50×520mm)；淋洗条件为：淋洗1：纯水；淋洗2：50％(v/v)乙醇-水，回收溶剂得黑果枸杞样品，针对上述样品，采用XCharge SCX强阳离子交换固相萃取柱选择性富集其中花色苷类化合物，再经AB-8大孔树脂脱盐，制备花色苷精组分。

2)针对黑果枸杞样品，采用XCharge SCX强阳离子交换固相萃取柱选择性富集花色苷类化合物，固相萃取条件：固相萃取柱为强阳离子固相萃取柱(XCharge SCX,20g/60mL)；淋洗条件为：淋洗1：5％(v/v)乙腈-甲酸水60mL(酸水体积浓度为0.1％)；淋洗2：30％(v/v)乙腈-水60mL(1.5M磷酸二氢钠，pH 2.5)，回收溶剂，减压浓缩，至有机溶剂完全去除，即得花色苷粗组分。

3)针对花色苷粗组分，利用弱极性大孔树脂进行脱盐。分离条件：分离材料为AB-8大孔树脂(50×520mm)；淋洗条件为：淋洗1：甲酸/水(酸水体积浓度为1％)；淋洗2：95％(v/v)乙醇-甲酸水(酸水体积浓度为1％)，回收溶剂，减压浓缩，最后真空冷冻干燥，即得花色苷精组分，总花色苷含量见图2。

该方法可以实现花色苷类化合物的选择性富集，提供了一种高效分离花色苷类化合物的新方法，为该类化合物生物活性的深入研究提供技术支撑。

Claims

1.一种黑果枸杞中花色苷类化合物的选择性富集方法，其特征在于：

1）黑果枸杞样品的制备：黑果枸杞的酸化乙醇提取物经弱极性大孔树脂进行分离得到黑果枸杞样品，其中黑果枸杞酸化乙醇提取物的pH为1-4；

2）花色苷类化合物粗组分的制备：将得到的黑果枸杞样品过强阳离子交换固相萃取柱，富集样品中的花色苷类化合物粗组分；步骤2）中所述的花色苷类化合物粗组分的制备方法为：称取一定量黑果枸杞样品溶解于甲酸水溶液中，其中甲酸体积浓度为0.1%-0.5%，样品浓度为10 mg/mL-200 mg/mL，用3-10倍柱体积量的甲醇溶液活化及平衡SCX SPE柱，抽干SPE柱，上样，上样量为1 mg-500 mg，采用线性梯度、台阶梯度或等度洗脱方式，黑果枸杞样品经过两次淋洗，淋洗1：10-100 mL 5%-50%v/v乙腈-甲酸水溶液，甲酸水溶液体积浓度为0.1%-0.5%，流速为1 mL/min-30 mL/min；淋洗2：10~100 mL 10%~60% v/v乙腈水溶液，在淋洗2的淋洗溶液中加入0.1 M~2M 磷酸二氢钠，使淋洗2的pH值保持在1-3，流速为1 mL/min-30 mL/min，收集洗脱液，减压浓缩至有机溶剂完全除去，即得花色苷粗组分，干燥过程中物料温度不得超过70℃，真空度为20-50Pa；

3）花色苷类化合物精组分的制备：将得到的花色苷类化合物粗组分经弱极性大孔树脂脱盐制备得到精组分。

2.按照权利要求1所述的选择性富集方法，其特征在于：所述的弱极性大孔树脂为AB-8大孔树脂、D101或HPD100。

3.按照权利要求1所述的选择性富集方法，其特征在于：步骤1）所述的黑果枸杞样品的制备方法为：称取一定量的黑果枸杞果实，用5-30倍量的50%-95%乙醇溶液浸泡提取1-5次，每次浸泡时间为1-3小时，其中，乙醇溶液中加入盐酸、甲酸、三氟乙酸中的一种或两种以上，调节乙醇溶液pH值至1-3，合并提取液抽滤，用旋转蒸发仪60℃条件下减压回收乙醇，得到浓缩液，将浓缩液上AB-8大孔树脂、D101或HPD100大孔吸附树脂柱，先用3-5倍柱体积的蒸馏水或10%-30%乙醇溶液淋洗，然后用3-5倍柱体积50%-95%的乙醇洗脱花色苷，收集洗脱液，减压浓缩，最后真空冷冻干燥，即黑果枸杞样品，干燥过程中物料温度不得超过70℃，真空度为20-50Pa。

4.按照权利要求1所述的选择性富集方法，其特征在于：固相萃取柱为强阳离子交换固相萃取柱XCharge SCX，固相萃取柱参数为0.5-20 g，1-60 mL，dp=10 μm-100 μm。

5.按照权利要求1所述的选择性富集方法，其特征在于：步骤3）中所述的花色苷类化合物精组分的制备过程为，花色苷粗组分上AB-8大孔树脂、D101或HPD100大孔吸附树脂柱，先用3-5倍柱体积的蒸馏水或10%-30%乙醇溶液淋洗，然后用3-5倍柱体积50%-95%的乙醇洗脱花色苷，收集洗脱液，减压浓缩，最后真空冷冻干燥，即黑果枸杞精组分，干燥过程中物料温度不得超过70℃，真空度为20-50Pa。