CN103601771A

CN103601771A - 一种从白刺果实中分离制备花色苷单体的方法

Info

Publication number: CN103601771A
Application number: CN201310658346.6A
Authority: CN
Inventors: 索有瑞; 胡娜; 丁晨旭; 张秋龙
Original assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Current assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Priority date: 2013-12-09
Filing date: 2013-12-09
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2033-12-09
Also published as: CN103601771B

Abstract

本发明涉及一种从白刺果实中分离制备花色苷单体的方法，该方法包括以下步骤：⑴原料预处理：将唐古特白刺的干燥果实去杂、水洗，得到处理后的白刺果实；⑵配制体积浓度为2%甲酸甲醇溶液；⑶将甲酸甲醇溶液加入到白刺果实中进行常温浸提，得到提取液；⑷提取液经过滤、蒸发浓缩，得到白刺花色苷浸膏；⑸大孔吸附树脂的处理；⑹将白刺花色苷浸膏复溶后上处理后的大孔吸附树脂，收集流出液；⑺流出液经减压浓缩后得到花色苷粗品；⑻将花色苷粗品注入高效半制备色谱柱中进行分离，即得纯度≥90%的花色苷单体；最后，花色苷单体经减压浓缩、干燥至恒重，即得花色苷单体成品。本发明分离效果好、耗时短、成本低。

Description

一种从白刺果实中分离制备花色苷单体的方法

技术领域

本发明涉及一种分离制备花色苷单体的方法，尤其涉及一种从白刺果实中分离制备花色苷单体的方法。

背景技术

唐古特白刺(Nitraria Tangutorum Bobr)为蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺属植物，是一种药食两用的植物，主要生长在荒漠或半荒漠地区。白刺果实中含花色苷、总多酚、多糖、氨基酸、维生素、黄酮、生物碱、矿物质元素等成分，具有显著的降血糖、降血脂、调节免疫、抗疲劳、耐寒冷、抗氧化、延缓衰老、保肝作用、抗肿瘤抗癌等生物活性。白刺果实成熟后呈现不同的颜色，其果色有黄、浅红、鲜红、玫瑰色、紫色、黑紫色等多种颜色。

研究表明花色苷(Anthocyanidin)为一类自然界中广泛分布的酚类化合物中的类黄酮类天然水溶性色素，其主要存在于花卉，果实及有色叶片中。大量研究表明花色苷类化合物具有显著的生理活性：抗自由基、改善视力、预防心血管疾病、提高认知能力、抗肿瘤、抗突变等。在食品安全问题日益受到人们重视的情况下。花色苷作为一种天然染料，其低毒性、色彩自然艳丽及资源可再生等特点使其在食品、化妆品及药品行业得到逐步应用。

目前关于花色苷的分离，主要采用高速逆流色谱（HSCCC），其局限性是可看到的色谱峰较少，分离效果差，分离时间长；而高速逆流色谱在分离花青素类物质时，由于花青素的极性较大故分离体系中需要添加甲基叔丁基醚和正丁醇，这两种高极性的试剂在后续浓缩过程中很难除去，即使能够除去也需要高温，这将使花青素受到损失。再则高速逆流色谱为一个开放的分离系统，其中的化学试剂尤其是甲基叔丁基醚很容易挥发出来对操作人员造成危害，并易污染环境。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种分离效果好、耗时短、成本低的从白刺果实中分离制备花色苷单体的方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种从白刺果实中分离制备花色苷单体的方法，包括以下步骤：

⑴原料预处理：将唐古特白刺的干燥果实挑选去杂，用水冲洗，洗去表面浮土，得到处理后的白刺果实；

⑵配制体积浓度为2%甲酸甲醇溶液：将200 mL甲酸与9800 mL甲醇混合均匀即得；

⑶将所述步骤⑵所得的甲酸甲醇溶液加入到所述白刺果实中，在室温避光状态下按1 g：1 ~5mL的比例进行常温浸提，提取次数为1~3次，每次12~24 h，合并得到提取液；

⑷所述提取液用滤纸除去不溶物、蛋白质、多糖后，得到滤液，该滤液于旋转蒸发仪上在40~50℃进行真空蒸发浓缩至膏状，得到白刺花色苷浸膏，并回收甲醇；

⑸大孔吸附树脂的处理：将D-101大孔吸附树脂用体积浓度为95% 的甲醇浸泡 24 小时，然后用体积浓度为95% 的甲醇进行洗涤，再用去离子水清洗；将该大孔吸附树脂缓慢装入树脂柱中，再用去离子水冲洗至柱中颗粒干净，不再沉降为止，即得处理后的大孔吸附树脂；

⑹将所述白刺花色苷浸膏用体积浓度为2 %的甲酸复溶后上所述处理后的大孔吸附树脂；上样后先以4~6倍柱体积的蒸馏水冲柱，然后再以3~6倍柱体积的甲醇冲柱，将花色苷类化合物解吸附，收集流出液；

⑺所述流出液经减压浓缩后得到花色苷粗品，同时回收甲醇；

⑻将所述花色苷粗品注入高效半制备色谱柱中，在柱温为25~40℃、流速为15~25 mL/min、进样量为200~600 mg、检测波长为525nm的条件下进行半制备色谱分离，根据出峰时间依次收集单体矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷；然后采用高效液相色谱系统在柱温为25~40℃、流速为0.6~1.0 mL/min、进样量为10 ul、检测波长为525nm的条件下进行检测，当样品纯度低于90%时，再次采用高效半制备色谱柱进行二次分离，即得纯度≥90%的花色苷单体；最后，所述花色苷单体于旋转蒸发仪上依次经减压浓缩、真空冷冻干燥至恒重，即得花色苷单体成品。

所述步骤⑺和步骤⑻中减压浓缩的条件均是指40~50℃水浴，转速45~55 r.p.m，真空泵压力为0.06~0.08MPa。

所述步骤⑻中真空冷冻干燥的条件是指冷肼温度为-45~-55 ℃，真空度为10~15 Pa。

所述步骤⑻中高效液相色谱分离的条件是指流动相分别为A相：A：体积浓度为10%的甲酸溶液中含有体积浓度为0.1%的三氟乙酸，B相：含有体积浓度为15%的甲醇的乙腈溶液；梯度洗脱程序为：0~20 min，3 % ~ 5 % B相，线性梯度；20~40 min，5 % B相，等度洗脱；40~55 min，5 % ~ 12 % B相，线性梯度；55~70 min，12 % ~ 22 % B相，线性梯度；70~100 min，22 % ~ 3 % B相，线性梯度。

所述步骤⑻中半制备色谱分离的条件是指流动相分别为A相：含有体积浓度为50 %的乙腈的甲醇，B相：体积浓度为5 %甲酸的水溶液；一次纯化程序为：0~30 min，25%~40%A相，线性梯度；30~35 min，40%A相，等度洗脱；35~50 min，40%~43%A相，线性洗脱；50~70 min，43%~25%A相，线性洗脱；二次纯化程序为：流动相分别为A相：50 %甲醇水溶液，B相：5 %甲酸溶液，进行等度洗脱。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明采用高效半制备色谱来分离制备花色苷单体。由于高速逆流色谱的检测器为UV检测器，而高效半制备色谱的检测器为UV-Vis检测器，花青素的最大吸收波长在可见光区(525 nm左右)，因此，一些含量相对较少的花青素的色谱峰在高速逆流上没有被检测到，但在高效半制备色谱上却可以检测到，有效提高了分离效果，所得到的花色苷单体纯度达到了98%以上（参见图2、图3），并且可大量制备。

2、由于高速逆流色谱制备一次样品，从泵入固定相到分离结束，耗时往往较长，有时长达数小时，而本发明采用高效半制备色谱则只需要几十分钟，大大缩短了分析时间，一次分离得到的样品含量高。由图1可知，高效半制备色谱在60min内即实现了对唐古特白刺两种花色苷单体的分离制备，分离时间短且分离效果好。

3、本发明在甲醇中加入甲酸，目的是维持一个酸性环境，使花青素处于烊盐离子状态以维持花色苷的结构，防止花色苷降解。

4、本发明所用试剂无毒，成本低、安全且操作简便，所得产品可在食品、化妆品及药品行业得到逐步应用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明高效半制备色谱分离制备唐古特白刺花色苷图。其中N1为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，N2为芍药素-3-O-葡萄糖苷。

图2为本发明矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的液相图谱。

图3为本发明芍药素-3-O-葡萄糖苷的液相图谱。

具体实施方式

实施例1 一种从白刺果实中分离制备花色苷单体的方法，包括以下步骤：

⑴原料预处理：将唐古特白刺的干燥果实挑选去杂，用水冲洗，洗去表面浮土，得到处理后的白刺果实。

⑵配制体积浓度为2%甲酸甲醇溶液：将200 mL甲酸与9800 mL甲醇混合均匀即得。

⑶将步骤⑵所得的甲酸甲醇溶液加入到白刺果实中，在室温避光状态下按1 g：1 mL的比例进行常温浸提，提取次数为1次，每次12 h，合并得到提取液。

⑷提取液用滤纸除去不溶物、蛋白质、多糖后，得到滤液，该滤液于旋转蒸发仪上在40℃进行真空蒸发浓缩至膏状，得到白刺花色苷浸膏，并回收甲醇。

⑸大孔吸附树脂的处理：将D-101大孔吸附树脂用体积浓度为95% 的甲醇浸泡 24 小时，然后用体积浓度为95% 的甲醇进行洗涤，再用去离子水清洗；将该大孔吸附树脂缓慢装入树脂柱中，再用去离子水冲洗至柱中颗粒干净，不再沉降为止，即得处理后的大孔吸附树脂。

⑹将白刺花色苷浸膏用体积浓度为2 %的甲酸复溶后上处理后的大孔吸附树脂；上样后先以4倍柱体积的蒸馏水冲柱，然后再以3倍柱体积的甲醇冲柱，将花色苷类化合物解吸附，收集流出液。

⑺流出液在40℃水浴、转速45 r.p.m、真空泵压力为0.06MPa的条件下经减压浓缩后得到花色苷粗品，同时回收甲醇。

⑻将花色苷粗品注入高效半制备色谱柱中，在柱温为25℃、流速为15 mL/min、进样量为200mg、检测波长为525nm的条件下进行半制备色谱分离，根据出峰时间依次收集单体矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷；然后采用高效液相色谱系统在柱温为25℃、流速为0.6 mL/min、进样量为10 ul、检测波长为525nm的条件下进行检测，当样品纯度低于90%时，再次采用高效半制备色谱柱进行二次分离，即得纯度≥90%的花色苷单体；最后，花色苷单体于旋转蒸发仪上依次经减压浓缩、真空冷冻干燥至恒重，即得花色苷单体成品。

其中：减压浓缩的条件是指40℃水浴，转速45 r.p.m，真空泵压力为0.06MPa。

真空冷冻干燥的条件是指冷肼温度为-45 ℃，真空度为10 Pa。

高效液相色谱分离的条件是指流动相分别为A相：A：体积浓度为10%的甲酸溶液中含有体积浓度为0.1%的三氟乙酸，B相：含有体积浓度为15%的甲醇的乙腈溶液；梯度洗脱程序为：0~20 min，3 % ~ 5 % B相，线性梯度；20~40 min，5 % B相，等度洗脱；40~55 min，5 % ~ 12 % B相，线性梯度；55~70 min，12 % ~ 22 % B相，线性梯度；70~100 min，22 % ~ 3 % B相，线性梯度。

半制备色谱分离的条件是指流动相分别为A相：含有体积浓度为50 %的乙腈的甲醇，B相：体积浓度为5 %甲酸的水溶液；一次纯化程序为：0~30 min，25%~40%A相，线性梯度；30~35 min，40%A相，等度洗脱；35~50 min，40%~43%A相，线性洗脱；50~70 min，43%~25%A相，线性洗脱；二次纯化程序为：流动相分别为A相：50 %甲醇水溶液，B相：5 %甲酸溶液，进行等度洗脱。

实施例2 一种从白刺果实中分离制备花色苷单体的方法，包括以下步骤：

⑴原料预处理同实施例1。

⑵配制体积浓度为2%甲酸甲醇溶液同实施例1。

⑶将步骤⑵所得的甲酸甲醇溶液加入到白刺果实中，在室温避光状态下按1 g：5mL的比例进行常温浸提，提取次数为3次，每次24 h，合并得到提取液。

⑷提取液用滤纸除去不溶物、蛋白质、多糖后，得到滤液，该滤液于旋转蒸发仪上在50℃进行真空蒸发浓缩至膏状，得到白刺花色苷浸膏，并回收甲醇。

⑸大孔吸附树脂的处理同实施例1。

⑹将白刺花色苷浸膏用体积浓度为2 %的甲酸复溶后上处理后的大孔吸附树脂；上样后先以6倍柱体积的蒸馏水冲柱，然后再以6倍柱体积的甲醇冲柱，将花色苷类化合物解吸附，收集流出液。

⑺流出液在50℃水浴、转速55 r.p.m、真空泵压力为0.08MPa的条件下经减压浓缩后得到花色苷粗品，同时回收甲醇。

⑻将花色苷粗品注入高效半制备色谱柱中，在柱温为40℃、流速为25 mL/min、进样量为400 mg、检测波长为525nm的条件下进行半制备色谱分离，根据出峰时间依次收集单体矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷；然后采用高效液相色谱系统在柱温为40℃、流速为1.0 mL/min、进样量为10 ul、检测波长为525nm的条件下进行检测，当样品纯度低于90%时，再次采用高效半制备色谱柱进行二次分离，即得纯度≥90%的花色苷单体；最后，花色苷单体于旋转蒸发仪上依次经减压浓缩、真空冷冻干燥至恒重，即得花色苷单体成品。

其中：减压浓缩的条件是指50℃水浴，转速55 r.p.m，真空泵压力为0.08MPa。

真空冷冻干燥的条件是指冷肼温度为-55 ℃，真空度为15 Pa。

高效液相色谱分离的条件同实施例1。

半制备色谱分离的条件同实施例1。

实施例3 一种从白刺果实中分离制备花色苷单体的方法，包括以下步骤：

⑴原料预处理同实施例1。

⑵配制体积浓度为2%甲酸甲醇溶液同实施例1。

⑶将步骤⑵所得的甲酸甲醇溶液加入到白刺果实中，在室温避光状态下按1 g：3mL的比例进行常温浸提，提取次数为2次，每次18 h，合并得到提取液。

⑷提取液用滤纸除去不溶物、蛋白质、多糖后，得到滤液，该滤液于旋转蒸发仪上在45℃进行真空蒸发浓缩至膏状，得到白刺花色苷浸膏，并回收甲醇。

⑸大孔吸附树脂的处理同实施例1。

⑹将白刺花色苷浸膏用体积浓度为2 %的甲酸复溶后上处理后的大孔吸附树脂；上样后先以5倍柱体积的蒸馏水冲柱，然后再以5倍柱体积的甲醇冲柱，将花色苷类化合物解吸附，收集流出液。

⑺流出液在45℃水浴、转速50 r.p.m、真空泵压力为0.07MPa的条件下经减压浓缩后得到花色苷粗品，同时回收甲醇。

⑻将花色苷粗品注入高效半制备色谱柱中，在柱温为35℃、流速为20 mL/min、进样量为600 mg、检测波长为525nm的条件下进行半制备色谱分离，根据出峰时间依次收集单体矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷；然后采用高效液相色谱系统在柱温为35℃、流速为0.8 mL/min、进样量为10 ul、检测波长为525nm的条件下进行检测，当样品纯度低于90%时，再次采用高效半制备色谱柱进行二次分离，即得纯度≥90%的花色苷单体；最后，花色苷单体于旋转蒸发仪上依次经减压浓缩、真空冷冻干燥至恒重，即得花色苷单体成品。

其中：减压浓缩的条件是指45℃水浴，转速50 r.p.m，真空泵压力为0.07MPa。

真空冷冻干燥的条件是指冷肼温度为-50 ℃，真空度为12Pa。

高效液相色谱分离的条件同实施例1。

半制备色谱分离的条件同实施例1。

上述实施例1~3中，冷冻干燥设备为LGJ-10B冷冻干燥机；大孔树脂为D-101来自于南开大学化工厂；甲醇、甲酸和乙腈溶液均为色谱纯，均来自于山东济宁化工厂。

高效液相色谱系统：HPLC/DAD系统为Dionex系统(Sunnyvale，CA，USA)，配有P680 HPLC泵；UltiMate 3000自动进样器；TCC-100柱温箱；Dionex PDA 100检测器。色谱柱为C18 ODS 80 Ts QA (150×4.6 mm，5 um i.d，Tosoh，Tokyo，Japan)，保护柱为C18柱(10×4.6 mm，5 um Kromasil C18)。

高效半制备色谱系统：半制备色谱系统为SHIMADZU LC-8A系统，色谱柱为shim-pack PRC-ODS (L) 制备色谱柱，检测器为UV-Vis检测器。

Claims

1. 一种从白刺果实中分离制备花色苷单体的方法，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种从白刺果实中分离制备花色苷单体的方法，其特征在于：所述步骤⑺和步骤⑻中减压浓缩的条件均是指40~50℃水浴，转速45~55 r.p.m，真空泵压力为0.06~0.08MPa。

3.如权利要求1所述的一种从白刺果实中分离制备花色苷单体的方法，其特征在于：所述步骤⑻中真空冷冻干燥的条件是指冷肼温度为-45~-55 ℃，真空度为10~15 Pa。

4.如权利要求1所述的一种从白刺果实中分离制备花色苷单体的方法，其特征在于：所述步骤⑻中高效液相色谱分离的条件是指流动相分别为A相：A：体积浓度为10%的甲酸溶液中含有体积浓度为0.1%的三氟乙酸，B相：含有体积浓度为15%的甲醇的乙腈溶液；梯度洗脱程序为：0~20 min，3 % ~ 5 % B相，线性梯度；20~40 min，5 % B相，等度洗脱；40~55 min，5 % ~ 12 % B相，线性梯度；55~70 min，12 % ~ 22 % B相，线性梯度；70~100 min，22 % ~ 3 % B相，线性梯度。

5.如权利要求1所述的一种从白刺果实中分离制备花色苷单体的方法，其特征在于：所述步骤⑻中半制备色谱分离的条件是指流动相分别为A相：含有体积浓度为50 %的乙腈的甲醇，B相：体积浓度为5 %甲酸的水溶液；一次纯化程序为：0~30 min，25%~40%A相，线性梯度；30~35 min，40%A相，等度洗脱；35~50 min，40%~43%A相，线性洗脱；50~70 min，43%~25%A相，线性洗脱；二次纯化程序为：流动相分别为A相：50 %甲醇水溶液，B相：5 %甲酸溶液，进行等度洗脱。