CN102229633B

CN102229633B - 一种从葡萄皮中分离制备五种高纯度花色苷单体的方法

Info

Publication number: CN102229633B
Application number: CN201110143962.9A
Authority: CN
Inventors: 韩富亮; 徐岩
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2011-05-31
Filing date: 2011-05-31
Publication date: 2014-01-08
Anticipated expiration: 2031-05-31
Also published as: CN102229633A

Abstract

一种从葡萄皮中分离制备五种高纯度花色苷单体的方法，涉及天然色素的制备，属于食品安全和食品分析化学领域。本发明为先对赤霞珠葡萄皮进行花色苷浸提，得到花色苷的粗提取物。再用XAD-7HP大孔树脂对粗提取物进行纯化，除去其中大部分的糖类、无机盐、粘液质等吸潮成分。将初步纯化后的花色苷提取物进行制备液相分离，得到花色苷的高纯单体。在花色苷制备的提取、纯化、分离阶段溶剂仅使用乙醇和酸，环境友好，方法简便易行。纯化后得到的五种花色苷单体分别为花翠素葡萄糖苷、3’甲基花翠素葡萄糖苷、二甲花翠素葡萄糖苷、二甲花翠素乙酰化葡萄糖苷、二甲花翠素反式香豆酰化葡萄糖苷，纯度依次为：99.9%、99.9%、99.9%、91.7%、95.5%。

Description

一种从葡萄皮中分离制备五种高纯度花色苷单体的方法

技术领域

一种从葡萄皮中分离制备五种高纯度花色苷单体的方法，涉及天然色素的制备，属于食品安全和食品分析化学领域。

背景技术

花色苷是一种对人体有益的天然色素，可做为食用色素使用，在食品中的应用广泛。花色苷有助于人体抵御炎症，抑制脂质过氧化作用，同时还能促进血液循环。在葡萄中天然花色苷主要存在于果皮上，经酿造过程赋予了葡萄酒亮丽的红色。葡萄是世界年产量最大的水果之一，大部分用于了葡萄酒的酿造。在欧亚种葡萄中，花翠素葡萄糖苷（Delphinidin-3-glucoside, Dp3-glu）、3’甲基花翠素葡萄糖苷（Petunidin-3-glucoside, Pt3-glu）、二甲花翠素葡萄糖苷（Malvidin-3-glucoside, Mv3-glu）及其乙酰化（Malvidin-3-acetylglucoside, Mv3-acet-glu）和香豆酰化的花色苷（Malvidin-3coumarylglucoside, Mv3-coum-glu）是五种含量较多的花色苷，五种花色苷结构如下所示。

溶剂法是从水果中提取酚类物质最常用的方法，甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯是常用的提取溶剂。纯化花色苷类物质最常用的方法是大孔树脂吸附法，具有效率高、成本低、操作简单的特点。天然花色苷的纯化分离一般以植物为原料，常见的有葡萄皮、杨梅、越橘、火龙果、红心萝卜等。花色苷在pH 2.0到3.0之间时稳定性较好，此时花色苷主要以2-苯基苯并吡喃的阳离子形式存在。有研究表明极性较弱的大孔树脂对花色苷的纯化效果较为理想，应用效果较好的大孔树脂有XAD-7HP、X-5、AB-8、NKA-9等。

根据研究报道，目前已发现500多种花色苷，但现在市场上能购买到的花色苷标样很少，并且价格昂贵。在葡萄酒花色苷研究中，定量大都是采用Mv3-glu一种标样对所有花色苷进行相对定量，无法做到绝对定量。花色苷标样的缺乏使花色苷颜色、口感、生理活性等方面的深入研究受到了限制。Mv3-acet-glu和Mv3-coum-glu两种花色苷在葡萄皮中含量丰富，但因分离难度大至今仍无标样供购买。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从葡萄皮中分离制备五种高纯度花色苷单体的方法，该方法简便，易于操作，经济环保，可以较大规模的从葡萄皮中分离制备上述五种花色苷单体。

本发明的技术方案：一种花色苷的提取方法，以葡萄皮为原料依次进行花色苷的提取、纯化、分离；从葡萄皮中分离制备五种高纯度花色苷单体为：花翠素葡萄糖苷Dp3-glu、3’甲基花翠素葡萄糖苷Pt3-glu、二甲花翠素葡萄糖苷Mv3-glu、二甲花翠素乙酰化葡萄糖苷Mv3-acet-glu、二甲花翠素反式香豆酰化葡萄糖苷Mv3-coum-glu；其步骤为：

（1）提取：采用95%乙醇（分析纯，V/V）浸提葡萄皮，得到花色苷的提取液，离心后真空旋蒸除乙醇，然后真空冷冻干燥得到花色苷的粗提取物；

（2）大孔树脂纯化：将花色苷的粗提取物用50%乙醇（分析纯稀释成50%，V/V）溶解，离心去沉淀，将上清液加样于XAD-7HP大孔树脂，用50%乙醇（分析纯稀释成50%，V/V）1BV/h（1BV(柱床容积) =每1m³树脂为1m³溶液）流速洗脱，收集颜色明显的流出液，真空冷冻干燥后得到初步纯化的提取物；

（3）制备液相分离：将初步纯化的提取物用15%乙醇（分析纯稀释成15%，V/V）溶解至饱和，8000r离心6min，上清液用于制备液相分离。用程序1制备分离，按照时间顺序收集得到了Dp3-glu、Pt3-glu、Mv3-glu、Mv3-acet-glu、Mv3-coum-glu五种花色苷单体；对首次分离后纯度较低的3’甲基花翠素葡萄糖苷（Pt3-glu）及二甲花翠素葡萄糖苷（Mv3-glu）再用程序2分别进行二次分离获得纯度高的Pt3-glu及Mv3-glu；

分离后Dp3-glu、Pt3-glu、Mv3-glu、Mv3-acet-glu、Mv3-coum-glu的纯度分别达99.9%、99.9%、99.9%、91.7%、95.5%；

所述程序1中的流动相分别为A 相：色谱纯，V/V，2%甲酸的乙醇，B相：2%甲酸的纯水；程序1采用梯度洗脱：0-20min：15%-40%A，用B相补足100%；20-28min：40%-80%A，用B相补足100%；28-30min：80%-15%A，用B相补足100%；30-35min：15%A，用B相补足100%；

程序2中的流动相分别为C 相：乙醇/纯水/甲酸=60/40/3，V/V/V，D相：纯水/甲酸=100/3，V/V；程序2采用梯度洗脱：0-15min：40%-45%C，用D相补足100%；15-30min：45%-60%C，用D相补足100%；30-35min：60%-40%C，用D相补足100%。

步骤（1）中所述的花色苷提取所用的葡萄皮是人工剥离的：采集新鲜酿酒葡萄置于-20℃下冷冻，剥皮时将冷冻的葡萄放置室温下待表皮化冻而果肉未解冻时将葡萄皮剥下。花色苷的提取条件为：95%乙醇（分析纯）中添加1%盐酸（分析纯，V/V），30℃，浸提过夜。

步骤（2）中所述花色苷的大孔树脂纯化时选用XAD-7HP大孔树脂，纯化条件为：0.5BV/h流速加样，含0.1%盐酸（V/V）的50%乙醇（分析纯稀释成50%，V/V）1BV/h流速洗脱。

步骤（3）中所述花色苷的制备液相分离，使用了Xbridge Prep C₁₈（250mm×19mm i.d., 10μm）制备分离柱，流动相为99.9%乙醇、色谱纯甲酸和超纯水，流速为8ml/min。

本发明的优点是：

（1）全程使用乙醇作为溶剂，环境友好。

（2）花色苷的提取、纯化、分离操作简便易行。

（3）在制备液相分离花色苷单体的阶段，一个程序可以同时对多种花色苷进行分离得到单体成分，一次分离后三种花色苷的纯度在90%以上，对另两种纯度较低的花色苷进行二次分离后纯度都达到99%以上。

（4）制备的花色苷为食品级的高纯单体，可以作为标样用于颜色机理、生理活性和风味特性等的研究，也可作为天然色素用于食品、饮料调色。

（5）在制备液相分离花色苷单体的阶段，仅使用了Xbridge Prep C₁₈（250mm×19mm i.d., 10μm）制备分离柱，通过不同的洗脱条件即可得到五种花色苷的单体。

附图说明

图1 花色苷单体的制备流程图。

图2 XAD-7HP大孔树脂对花色苷的纯化效果。

图3 制备液相对花色苷的一次分离及收集情况。

图4 Pt3-glu、Mv3-glu的二次分离及收集情况。

图5 高效液相检测的花色苷单体的色谱图。图5A：Dp3-glu纯度为99.9%，图5 B：Pt3-glu纯度为99.9%，图5 C：Mv3-glu纯度为99.9%，图5 D：Mv3-acet-glu纯度为91.7%，图5 E：Mv3-coum-glu纯度为95.5%。

图6 自制花色苷单体与购买的花色苷标准品的比较。图6A：520nm，购买的和自制的Dp3-glu标准品对比图；图6B：280nm，购买的和自制的Dp3-glu标准品对比图；图6C：520nm，购买的和自制的Mv3-glu标准品对比图；图6D：280nm，购买的和自制的Mv3-glu标准品对比图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细阐述，图1列出了制备的流程图。

实施例1：葡萄皮花色苷的提取

将收获的新鲜成熟的赤霞珠酿酒葡萄在-20℃下冷冻，待冷冻完全，将其拿出冰箱放置到室温下，使果皮解冻并将果皮剥下（此方法可将果皮和果肉较好的分离而不粘连果肉）。提取液为含1%盐酸（V/V）的95%乙醇（分析纯），按提取液︰葡萄皮重量比1.5︰1的液料比在30℃下浸提过夜。滤去果皮并在6000r下离心10min去除沉淀，得提取液。

实施例2：大孔树脂的处理和上样样品的准备

将XAD-7HP大孔树脂先用乙醇（分析纯）浸泡，每12h换洗一次，至洗出液无色透明为止，再用去离子水洗至无醇。接着用1mol/L NaOH浸泡12h，然后用去离子水洗至中性pH。换用1mol/L HCl浸泡12h，最后再用去离子水洗至中性pH，装柱备用。

将实施例1中处理得到的提取液在30℃下真空旋蒸去除乙醇，再经真空冷冻干燥得到花色苷的粗提取物。将粗提取物溶解于50%的乙醇（分析纯稀释到50%，V/V）中至溶液饱和，8000r离心6min，用0.45μm有机微孔滤膜过滤后准备进样。

实施例3：大孔树脂纯化葡萄皮中的花色苷

将处理好的XAD-7HP大孔树脂装柱，用含0.1%盐酸（V/V）的50%乙醇（分析纯乙醇稀释到50%，V/V）溶液平衡0.5h。0.5BV/h流速进样，用含0.1%盐酸（V/V）的50%乙醇（分析纯乙醇稀释到50%，V/V）溶液1BV/h流速洗脱，收集洗脱液（红色）。

花色苷特征吸收峰在520nm左右，因此以520nm的光谱吸收信号来监测洗脱液中花色苷的含量变化。带有苯环的杂质类物质在280nm下均有较强的光谱吸收，因此以280nm来监测流出液中的杂质类物质的含量。

自有花色苷流出时起每5min取样测定其在520nm和280nm下的吸光值，以收集时间为横坐标，以吸光强度（OD值）为纵坐标，绘制曲线（图2）。图2显示了XAD-7HP大孔树脂在实验条件下对花色苷有较好的纯化效果，杂质峰与花色苷峰相继出现。280nm下显示的杂质峰峰型不对称是因为花色苷的分子结构中含有苯环，在280nm下有一定的光吸收强度。

实施例4：制备液相（Waters）分离

（1）样品的准备

将大孔树脂纯化后收集的样品真空旋蒸去除乙醇并真空冷冻干燥。将浓缩后的花色苷溶解到15%的乙醇（分析纯乙醇稀释到15%，含2%色谱纯甲酸，V/V）溶液中，用0.45μm有机微孔滤膜过滤后准备进样。

（2）花色苷的一次分离（程序1）

将准备好的样品进行第一次分离纯化。使用Xbridge Prep C18 （250mm×19mm i.d., 10μm）制备分离柱，流动相为99.9%乙醇、色谱纯甲酸和超纯水，流速为8mL/min。流动相分别为A 相：2%甲酸（色谱纯，V/V）的乙醇，B相：2%甲酸（V/V）的纯水。程序1采用梯度洗脱：0-20min，15%-40%A，用B相补足100%；20-28min，40%-80%A，用B相补足100%；28-30min，80%-15%A，用B相补足100%；30-35min，15%A，用B相补足100%。经程序1分离，按照时间顺序收集得到了Dp3-glu、Pt3-glu、Mv3-glu、Mv3-acet-glu、Mv3-coum-glu五种花色苷单体，纯度分别为99.9%、75.2%、82.8%、91.7%、95.5%（纯度检测采用实施例7中的方法）。图3显示的是运用程序1时对花色苷的分离效果，色谱图中的颜色标记是收集到的花色苷（下同）。

（3）Pt3-glu与Mv3-glu分别进行二次分离（采用相同的程序2）

对第一次分离后纯度较低的Pt3-glu、Mv3-glu再运用程序2分别进行第二次分离。使用Xbridge Prep C18（250mm×19mm i.d., 10μm）制备分离柱，流动相为99.9%乙醇、色谱纯甲酸和超纯水，流速为8mL/min对Pt3-glu及Mv3-glu分别进行二次分离。流动相分别为C 相：乙醇（99.9%）:纯水（超纯水）:甲酸（色谱纯）=60:40:3（V/V/V），D相：纯水:甲酸=100: 3（V/V）。程序2采用梯度洗脱：0-15min，40%-45%C，用D相补足100%；15-30min，45% -60%C，用D相补足100%；30-35min，60%-40%C，用D相补足100%。分离程序2是将Pt3-glu与杂质花色苷分开，换用程序2后Pt3-glu得到了非常好的分离效果（图4A）。如图4B所示虽然程序2无法将Mv3-glu与杂质花色苷彻底分开，但按照图4B所示进行峰切割收集，可以得到纯度为99.9%的Mv3-glu单体（纯度检测采用实施例7中的方法）。

实施例5：花色苷的质谱鉴定

五种花色苷单体在ESI-MS/MS的正离子模式下，丢失3位上的葡萄糖或酰化葡萄糖，产生相应的花色苷配基碎片离子。Dp3-glu、Pt3-glu、Mv3-glu裂解丢失葡萄糖[M-162]⁺，分别得到m/z 303、317、331的碎片。Mv3-acet-glu裂解丢失乙酰化葡萄糖[M-204]⁺，得到m/z 331的碎片。Mv3-coum-glu裂解丢失香豆酰化葡萄糖[M-324]⁺，得到m/z 331的碎片。

实施例6：粉末状花色苷单体的获得

将制备液相纯化后得到的花色苷单体溶液30℃真空旋蒸去除乙醇在真空冷冻至完全干燥。纯化后得到的花色苷单体为紫黑色粉末状固体。在实验条件下，300g新鲜葡萄皮可制备得到5mg Dp3-glu，3mg Pt3-glu，15mg Mv3-glu，8mg Mv3-acet-glu，3mg Mv3-coum-glu。

实施例7：花色苷最终纯度的检测

将得到的花色苷粉末溶解于10%的乙腈（色谱纯，V/V）中进行高效液相（Dienox）检测确定其纯度（图5）。柱子采用Kromasil C-18（250mm ×4.6mmi.d.,5μm），流动相为：E相溶液为乙腈（色谱纯）/水（超纯水）/甲酸（色谱纯）=500/400/25（V/V/V）；F相溶液为纯水/乙腈/甲酸=900/30/25（V/V/V），程序为：0-2min，5%-10%E，用F相补足100%；2-15min，10%-20%E，用F相补足100%；15-30min，20%-30%E，用F相补足100%；30-40min，30% -35%E，用F相补足100%；40-50min，35%-40%E，用F相补足100%；50-55min，40%-80%E，用F相补足100%；55-60min，80%-5%E，用F相补足100%；60-65min，5%E，用F相补足100%。检测的结果如图5所示，运用面积归一化算法，Dp3-glu、Pt3-glu、Mv3-glu、Mv3-acet-glu、Mv3-coum-glu五种花色苷的最终纯度分别为99.9%（图5A）、99.9%（图5 B）、99.9%（图5 C）、91.7%（图5 D）、95.5%（图5 E）。利用上述高效液相程序将购买的Dp3-glu、Mv3-glu（购自法国Extrasynthese公司）与自制的Dp3-glu、Mv3-glu标准品分别在520nm、280nm进行了色谱检测，发现自制的标准品纯度要明显高于购买的标准品（图6）。

Claims

1.一种花色苷的提取方法，其特征在于以赤霞珠酿酒葡萄的葡萄皮为原料依次进行花色苷的提取、纯化、分离；从葡萄皮中分离制备五种高纯度花色苷单体为：花翠素葡萄糖苷Dp3-glu、3’甲基花翠素葡萄糖苷Pt3-glu、二甲花翠素葡萄糖苷Mv3-glu、二甲花翠素乙酰化葡萄糖苷Mv3-acet-glu、二甲花翠素反式香豆酰化葡萄糖苷Mv3-coum-glu；其步骤为：

（1）提取：采用分析纯95%乙醇，V/V，浸提葡萄皮，得到花色苷的提取液，离心后真空旋蒸除乙醇，然后真空冷冻干燥得到花色苷的粗提取物；

（2）大孔树脂纯化：将花色苷的粗提取物用稀释到50%的分析纯乙醇溶解，V/V，离心去沉淀，将上清液加样于XAD-7HP大孔树脂，用稀释到50%的分析纯乙醇，V/V，1BV/h流速洗脱，收集颜色明显的流出液，真空冷冻干燥后得到初步纯化的提取物；

（3）制备液相分离：将初步纯化的提取物用稀释到15%的分析纯乙醇溶解至饱和，V/V， 8000r离心6min，上清液用于制备液相分离，经程序1分离，按照时间顺序收集得到了Dp3-glu、Pt3-glu、Mv3-glu、Mv3-acet-glu、Mv3-coum-glu五种花色苷单体；对首次分离后纯度较低的3’甲基花翠素葡萄糖苷Pt3-glu及二甲花翠素葡萄糖苷Mv3-glu再用程序2分别进行二次分离获得纯度高的Pt3-glu及Mv3-glu；

2.根据权利要求1所述花色苷的提取方法，其特征在于，步骤（1）中所述的提取，花色苷的提取条件为：浸提液95%分析纯乙醇中添加1%盐酸，V/V，30℃，浸提过夜。