CN111825730B - 一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物源花色苷的提取、纯化、分离以及生产领域，特别涉及一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法。该方法包括如下步骤：将葡萄皮渣或鲜果果皮速冻，研磨成粉；将粉末与酸化甲醇混合，并采用超声波辅助提取，得到过滤液；将过滤液浓缩，回收甲醇，将所得粗提物溶于酸化水中，得到粗提物水溶液；粗提物水溶液经过微孔滤膜过滤、超声波脱气处理后，采用大孔吸附树脂进行纯化；采用半制备高效液相色谱对花色苷提取物进行分离，得到14种花色苷单体。本发明通过半制备高效液相色谱在40min内实现了14种花色苷的制备，分离效果优，制备速度快，不需进行多次分离。

Description

一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的 方法

技术领域

本发明涉及植物源花色苷的提取、纯化、分离以及生产领域，特别涉及一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法。

背景技术

花色苷作为植物的次生代谢产物广泛存在于自然界中，是一种安全的天然色素，并且具有显著的抗氧化能力，已有很多研究表明花色苷具有卓越的营养活性功能，对许多疾病都有预防甚至治疗的作用。葡萄是全世界最重要的水果之一，截至2017年，其在全球范围内的种植面积达到了760万公顷，其中一半以上被用来酿造葡萄酒。在葡萄酒的生产过程中会产生大量的葡萄皮渣废物(约占葡萄起始重量的20％—30％)，每年有近九百万吨的葡萄皮渣在全球各地的酒厂中产生。在这些皮渣中仍然残留着丰富的多酚物质，其中花色苷的含量十分可观，但在酒厂中，绝大部分葡萄皮渣都以废弃物的形式被处理掉，不仅耗费了巨大的处理成本，增加了酒厂的负担，同时也是对自然资源的一种浪费，处理不当还有可能对环境产生负面的影响。

葡萄酒酿造时产生的皮渣废弃物却可以作为制备花色苷的良好原料。一般来说，单体花色苷纯品的制备都需要经过提取、纯化以及分离的过程。目前植物中花色苷的提取方法主要有溶剂法、酶法、发酵法、超临界萃取等，纯化可以采用柱层析(大孔吸附树脂、离子交换树脂、凝胶柱等)、膜分离、重结晶等技术，而对于含有复杂种类花色苷的葡萄来说，往往需要借助高效液相色谱才能实现对不同花色苷单体的分离制备。已有许多针对不同植物来源花色苷的制备技术，比如蓝莓、桑葚、紫薯、黑果枸杞等，然而，当前的花色苷制备技术大多采用溶剂浸提，耗时较长，效果不佳，还易造成花色苷的降解。此外，由于葡萄中花色苷种类的多样性，目前许多分离技术使用多个层析柱、色谱柱相结合的技术，或者在同一色谱柱上采用多次进样和不同的液相洗脱模式，逐步实现不同花色苷单体的分离，操作复杂且耗时，成本较高。

此外，尽管自然界中花色苷的种类繁多，在全球范围内市售花色苷标准品的种类却十分稀少，这在很大程度上成为了阻碍花色苷领域相关研究进一步深入的屏障。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法。该方法通过半制备高效液相色谱在40min内实现了14种花色苷的制备，分离效果优，制备速度快，不需进行多次分离。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法，包括如下步骤：

将葡萄皮渣或鲜果果皮速冻，研磨成粉；将粉末与酸化甲醇混合，并采用超声波辅助提取，得到过滤液；

将过滤液浓缩，回收甲醇，将所得粗提物溶于酸化水中，得到粗提物水溶液；

粗提物水溶液经过微孔滤膜过滤、超声波脱气处理后，采用大孔吸附树脂进行纯化，纯化为：将粗提物水溶液加样于大孔吸附树脂，先用酸化水洗脱除杂，再用酸化甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，过滤，得到花色苷提取物；

采用半制备高效液相色谱对花色苷提取物进行分离，得到14种花色苷单体；半制备高效液相色谱的条件为：流动相A为水、甲酸和乙腈的混合液，流动相A中水、甲酸与乙腈的体积比为(90～94)：(1～3)：(5～7)；流动相B为水、甲酸和乙腈的混合液，流动相B中水、甲酸与乙腈的体积比为(42～46)：(1～3)：(53～55)；梯度洗脱程序。

本发明的目的在于从欧亚种葡萄皮渣中制备多种高纯度的花色苷单体，一方面是对葡萄酒产业中废弃物的再利用，实现变废为宝，可以减轻酒厂的成本甚至为酒厂额外创收；另一方面通过本法可以制备出葡萄中存在的主要花色苷，其纯度高达90％以上，并且操作过程简单易行，制备出的高纯度花色苷可用于其呈色机制以及生理活性等方面的研究，一定程度上弥补了市场上花色苷纯品种类单一的缺陷，也为大规模生产提供了技术上的借鉴。

在本发明中，14种花色苷单体为：花翠素-3-O-葡萄糖苷Dp-G、花青素-3-O-葡萄糖苷Cy-G、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷Pt-G、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷Pn-G、二甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷Mv-G、甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷Pt-AG、花翠素-3-O-(反式-6-O-p-香豆酰化)-葡萄糖苷Dp-CouG(t)、甲基花青素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷Pn-AG、二甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷Mv-AG、二甲基花翠素-3-O-(6-O-p-咖啡酰化)-葡萄糖苷Mv-CafG、甲基花翠素-3-O-(反式-6-O-p-香豆酰化)-葡萄糖苷Pt-CouG(t)、二甲基花翠素-3-O-(顺式-6-O-p-香豆酰化)-葡萄糖苷Mv-CouG(c)、甲基花青素-3-O-(反式-6-O-p-香豆酰化)-葡萄糖苷Pn-CouG(t)、二甲基花翠素-3-O-(反式-6-O-p-香豆酰化)-葡萄糖苷Mv-CouG(t)。

作为优选，以g/mL计，粉末与酸化甲醇的比例为1：(8～12)。

优选地，以g/mL计，粉末与酸化甲醇的比例为1：10。

作为优选，酸化甲醇为含有体积百分含量为2％～4％甲酸的甲醇。

优选地，酸化甲醇为含有体积百分含量为3％甲酸的甲醇。

作为优选，超声波辅助提取的温度为10～35℃，提取的时间为5～15min，提取的次数为2～4次。

优选地，超声波辅助提取的温度为35℃，提取的时间为10min，提取的次数为3次。

作为优选，浓缩的温度为33～37℃。

优选地，浓缩的温度为35℃。

作为优选，酸化水为含有体积百分含量为2％～4％甲酸的水。

优选地，酸化水为含有体积百分含量为3％甲酸的水。

作为优选，大孔吸附树脂为大孔吸附树脂XAD-7HP。

作为优选，微孔滤膜的孔径为0.4～0.5μm的聚四氟乙烯微孔滤膜。

优选地，微孔滤膜的孔径为0.45μm的聚四氟乙烯微孔滤膜。

作为优选，在大孔吸附树脂进行纯化的步骤中，酸化水的用量为2.5～3.5倍柱体积，流速为2.5～3.5BV/h。

作为优选，酸化甲醇的流速为2.5～3.5BV/h。

优选地，在大孔吸附树脂进行纯化的步骤中，酸化水的用量为3倍柱体积，流速为3BV/h。

优选地，酸化甲醇的流速为3BV/h。

作为优选，流动相A中水、甲酸与乙腈的体积比为92：2：6；流动相B中水、甲酸与乙腈的体积比为44：2：54。

作为优选，梯度洗脱程序为：0min-18min，10％-25％B；18min-20min，25％B；20min-30min，25％-40％B；30min-35min，40％-70％B；35min-40min，70％-100％B，用A相补足100％。

作为优选，半制备高效液相色谱的流速为0.8～1.2mL/min；柱温为48～52℃；检测波长为520～530nm。

优选地，半制备高效液相色谱的流速为1.0mL/min；柱温为50℃；检测波长为525nm。

作为优选，半制备高效液相色谱的色谱柱为安捷伦Zorbax SB-C18，型号为9.4×250mm，5μm。

本发明提供了一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法。该方法包括如下步骤：将葡萄皮渣或鲜果果皮速冻，研磨成粉；将粉末与酸化甲醇混合，并采用超声波辅助提取，得到过滤液；将过滤液浓缩，回收甲醇，将所得粗提物溶于酸化水中，得到粗提物水溶液；粗提物水溶液经过微孔滤膜过滤、超声波脱气处理后，采用大孔吸附树脂进行纯化，纯化为：将粗提物水溶液加样于大孔吸附树脂，先用酸化水洗脱除杂，再用酸化甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，过滤，得到花色苷提取物；采用半制备高效液相色谱对花色苷提取物进行分离，得到14种花色苷单体。本发明的优点如下：

(1)采用酸化甲醇结合超声波辅助提取，极大地缩短了提取时间，且设备简单，操作容易，提高了制备的效率。

(2)大孔吸附树脂XAD-7HP的纯化效率较高且价格低廉、能够重复使用，不需再借助其他纯化手段，降低了纯化成本。

(3)通过半制备高效液相色谱在40min内实现了14种花色苷的制备，分离效果优，制备速度快，不需进行多次分离。

本方法不仅适用于葡萄皮渣，同样可以应用到葡萄鲜果果皮中花色苷的制备。几乎制备出了葡萄中所有主要的花色苷。高纯度的花色苷单体，尤其是目前市面上缺乏的酰基化花色苷纯品，后续可作为标准品或是实验材料用于其呈色机制、生理活性等方面的研究。

附图说明

图1为高纯度花色苷制备流程图；

图2为半制备液相分离结果；

图3为花色苷单体Q-Tof检测结果；从左至右为HPLC-DAD(525nm)色谱图、总离子流图和产物离子图；从上至下依次为Dp-G、Cy-G、Pt-G、Pn-G、Mv-G、Pt-AG、Dp-CouG(t)、Pn-AG、Mv-AG、Mv-CafG、Pt-CouG(t)、Mv-CouG(c)、Pn-CouG(t)、Mv-CouG(t)。

具体实施方式

本发明公开了一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

14种花色苷单体制备的详细步骤如下：

(1)前处理：挑除葡萄皮渣中的梗和籽，液氮速冻，随即研磨成粉后置于-40℃冰箱中冷冻待用。

(2)提取：由于甲醇对花色苷的提取效果较好，并且微酸性的环境能够促进花色苷的提取、有利于花色苷的稳定性，本方法采用酸化甲醇作为提取液，结合超声波辅助提取，料液比为1g:10mL，提取时间为10min，提取液经真空抽滤，取皮渣重复上述步骤反复提取3次至基本无色，合并过滤后的清液。

(3)浓缩：真空旋转蒸发合并后的提取液至粘稠的紫色膏状物，控制水浴温度为35℃，回收甲醇，并将粗提物溶于少量的酸化水中。

(4)大孔吸附树脂纯化：将花色苷的粗提液过滤，加样于XAD-7HP大孔树脂，先用3倍BV(柱床体积)的酸化水以3BV/h的流速洗脱，可将大部分的多糖、盐类以及蛋白质等强极性杂质除去。再用酸化甲醇以3BV/h的流速洗脱，收集颜色明显的流出液，真空旋转蒸发浓缩后即为纯化后的花色苷提取物。

(5)半制备高效液相色谱分离：上机前过滤经大孔吸附树脂纯化后的花色苷浓缩液(花色苷浓度约为1g/L)，进样量为100微升。所用流动相A为水：甲酸：乙腈＝92:2:6(v/v/v)，流动相B为水：甲酸：乙腈＝44:2:54(v/v/v)，洗脱程序如下：0min-18min，10％-25％B；18min-20min，25％B；20min-30min，25％-40％B；30min-35min，40％-70％B；35min-40min，70％-100％B，用A相补足100％。流速：1.0mL/min；柱温：50℃；检测波长：525nm。通过馏分收集器收集单一组分，经后续鉴定纯度均达到90％以上。

所述步骤(1)中的葡萄皮渣为酒精发酵结束后分离出罐，经压榨后收集所得。

所述步骤(2)中超声波提取时的水浴温度≤35℃。

所述步骤(2)、(4)、(5)中过滤所用聚四氟乙烯微孔滤膜(孔径0.45微米)。

所述步骤(2)、(3)、(4)、(5)中的酸化甲醇或水均含有3％甲酸，除液相色谱所用流动相为色谱纯之外，其余所有试剂均为分析纯。

所述步骤(3)与(4)中真空旋转蒸发时回收的甲醇可以再次作为提取溶剂循环使用。

所述步骤(4)中大孔吸附树脂的预处理：首先用超纯水冲洗除去破碎或细小的树脂，然后再用无水甲醇浸泡24h，浸泡后使用无水甲醇再洗涤多次，取适量洗出液，向其中加适量水后未出现白色浑浊现象作为洗涤的终点，最后再使用超纯水反复冲洗除去乙醇，将处理好的树脂浸泡于超纯水中备用。新填料在首次使用前还需使用酸、碱清洗除掉未聚合单体以及致孔剂、分散剂、防腐剂等。酸、碱洗：5％盐酸溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性；再用5％氢氧化钠溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性。

所述步骤(5)中所用半制备高效液相色谱柱为安捷伦Zorbax SB-C18(9.4×250mm，5微米)。

特别声明：在上述所有制备过程中严格禁止花色苷溶液与塑料制品(除聚四氟乙烯滤膜等耐甲醇腐蚀的制品)的接触，以避免塑料中的杂质溶到花色苷溶液中造成污染。

本发明提供的从葡萄皮渣中提取分离14种花色苷单体的方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：美乐葡萄皮渣花色苷的制备

制备流程图见图1，具体操作步骤如下：

(1)原料：美乐葡萄为2017年采摘自河北省承德市，经除梗破碎、冷浸渍、带皮发酵，酒精发酵结束后分离皮渣出罐，经气囊压榨机压榨后放置于-18℃冰箱冷冻保藏。

(2)皮渣前处理：挑除葡萄皮渣中的梗和籽，液氮速冻，随即使用IKA A11研磨机(德国IKA集团)研磨成粉后置于-40℃冰箱冷冻待用。

(3)提取：准确称取50.0g皮渣粉末于棕色玻璃试剂瓶中，加入500mL甲醇(含3％甲酸)超声波辅助提取(水浴温度≤35℃)10min，抽滤(孔径0.45微米聚四氟乙烯微孔滤膜，天津市津腾有限公司)后取皮渣继续重复上述步骤提取2次，合并过滤液。

(4)浓缩：真空旋转蒸发花色苷提取液至粘稠的紫色膏状物，控制水浴温度为35℃，回收甲醇可作为提取试剂重复使用，并将粗提物溶于少量的蒸馏水(含3％甲酸)中。

(5)大孔吸附树脂XAD-7HP纯化：XAD-7HP大孔吸附树脂填料购于Amberlite公司(美国)，所用的玻璃层析柱(400mm×28.5mm)购于济南博纳生物技术有限公司。

装柱：用蒸馏水湿法装柱，装柱前在玻璃层析柱中加入适量的蒸馏水，将柱料浆(以干柱料与溶剂3:1的比例制备并脱气处理)沿着玻璃棒(必要时使用布氏漏斗)一次性倒入柱中，同时开启柱子底部活塞，水会从柱底缓慢流出，填料自然沉降，并用甲醇流动清洗，直到流出液与水混合不呈白色浑浊为止。

平衡：以2倍柱体积的无水甲醇(含3％甲酸)以3BV/h的流速平衡柱子。

上样：样品溶液用微孔滤膜(孔径0.45微米聚四氟乙烯微孔滤膜，天津市津腾有限公司)过滤并经超声波脱气处理，以3BV/h的流速上样50mL(样液中花色苷浓度约为500mg/L)。

除杂：用3倍柱体积的蒸馏水(含3％甲酸)以3BV/h的流速通过树脂层，洗去花色苷粗提液中绝大部分多糖、盐类以及蛋白质等强极性杂质。

洗脱：用无水甲醇(含3％甲酸)以3BV/h的流速通过树脂层，以洗脱吸附在树脂上的花色苷，收集颜色明显的组分，即为纯化后的花色苷。

纯化效果见表1：

表1大孔吸附树脂纯化效果

评价指标	纯化前	纯化后
			葡萄糖(g/L)	20.36±0.65	ND
果糖(g/L)	6.11±0.23	ND
			甘油(g/L)	8.37±0.30	ND
总氨基酸(mg/L)	458.58±15.27	12.27±0.42
			总回收花色苷(mg)	56.15±1.71	52.09±0.57

注：ND代表未检出。

(6)浓缩：真空旋转蒸发经大孔吸附树脂纯化后的花色苷溶液至粘稠的紫色膏状物，控制水浴温度为35℃，回收甲醇可作为提取试剂重复使用，并将花色苷膏状物溶于少量的蒸馏水(含3％甲酸)中。

(7)半制备高效液相色谱分离：采用美国安捷伦1100系列高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器(DAD)，所用半制备高效液相色谱柱为安捷伦Zorbax SB-C18(9.4×250mm，5微米)，上机前过滤经大孔吸附树脂纯化后的花色苷浓缩液(花色苷浓度约为1g/L)，进样量为100微升。所用流动相A为水：甲酸：乙腈＝92:2:6(v/v/v)，流动相B为水：甲酸：乙腈＝44:2:54(v/v/v)，洗脱程序如下：0min-18min，10％-25％B；18min-20min，25％B；20min-30min，25％-40％B；30min-35min，40％-70％B；35min-40min，70％-100％B，用A相补足100％。流速：4.0mL/min；柱温：55℃；检测波长：525nm。通过自动分部收集器收集得到各花色苷单体溶液，经真空旋转蒸发(≤35℃)和冷冻干燥后得到高纯度的花色苷单体粉末(图2)。

(8)制备结果检测：采用美国安捷伦1290系列高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器(DAD)和安捷伦6545系列四极杆-飞行时间质谱联用仪(Q-Tof)。所用色谱柱为ZorbaxSB-C18柱(150×2.1mm，1.8μm，美国安捷伦公司)。样品测定前经0.45μm滤膜过滤，进样量10μL。实验的流动相A：水：甲酸：乙腈＝92:2:6，v/v/v；流动相B：水：甲酸：乙腈＝44:2:54，v/v/v。洗脱程序：0min-18min，10％-25％B；18min-20min，25％B；20min-30min，25％-40％B；30min-35min，40％-70％B；35min-40min，70％-100％B；流速：0.25mL/min；柱温：55℃；检测波长：525nm(280nm)。质谱采用DualAJS ESI离子源，采集模式使用Auto MS/MS正离子模式，离子扫描范围：100-1500m/z；雾化器压力：35psig；干燥气流速：10L/min；干燥气温度：350℃。花色苷的定性依据本实验建立的谱库进行判定，通过比对谱库中HPLC-DAD-MS/MS图谱中的质谱信息、光谱信息和保留时间，确定花色苷组分。采用外标法定量，所有花色苷均以相当含量的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量计算。试验结果见图3、表2。

表2制备得到的花色苷单体液相-质谱信息与纯度

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种从葡萄皮渣中提取分离14种花色苷单体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将葡萄皮渣速冻，研磨成粉；将粉末与酸化甲醇混合，并采用超声波辅助提取，得到过滤液；以g/mL计，所述粉末与所述酸化甲醇的比例为1：（8~12）；所述酸化甲醇为含有体积百分含量为2%~4%甲酸的甲醇；

将过滤液浓缩，回收甲醇，将所得粗提物溶于酸化水中，得到粗提物水溶液；

粗提物水溶液经过微孔滤膜过滤、超声波脱气处理后，采用大孔吸附树脂进行纯化，所述纯化为：将粗提物水溶液加样于大孔吸附树脂，先用酸化水洗脱除杂，再用酸化甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，过滤，得到花色苷提取物；所述大孔吸附树脂为大孔吸附树脂XAD-7HP；在大孔吸附树脂进行纯化的步骤中，所述酸化水的用量为2.5~3.5倍柱体积，流速为2.5~3.5 BV/h；所述酸化甲醇的流速为2.5~3.5 BV/h；

采用半制备高效液相色谱对所述花色苷提取物进行分离，得到14种花色苷单体；所述半制备高效液相色谱的条件为：所述半制备高效液相色谱的色谱柱为安捷伦Zorbax SB-C18，型号为9.4×250mm，5μm；

流动相A中水、甲酸与乙腈的体积比为92：2：6；流动相B中水、甲酸与乙腈的体积比为44：2：54；

梯度洗脱程序为：0 min−18 min，10%−25% B；18 min−20 min，25% B；20 min−30 min，25%−40% B；30 min−35 min，40%−70% B；35 min−40 min，70%−100% B，用A相补足100%；

所述14种花色苷单体为：花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、二甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷、花翠素-3-O-(反式-6-O-p-香豆酰化)-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷、二甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷、二甲基花翠素-3-O-(6-O-p-咖啡酰化)-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-(反式-6-O-p-香豆酰化)-葡萄糖苷、二甲基花翠素-3-O-(顺式-6-O-p-香豆酰化)-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-(反式-6-O-p-香豆酰化)-葡萄糖苷、二甲基花翠素-3-O-(反式-6-O-p-香豆酰化)-葡萄糖苷。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声波辅助提取的温度为10~35℃，提取的时间为5~15min，提取的次数为2~4次。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酸化水为含有体积百分含量为2%~4%甲酸的水。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，微孔滤膜的孔径为0.4~0.5μm的聚四氟乙烯微孔滤膜。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述半制备高效液相色谱的流速为0.8~1.2 mL/min；柱温为48~52℃；检测波长为520~530 nm。