CN114380875B - 一种植物花色苷的提取分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物花色苷的提取分离方法，包括以下步骤：用酸化乙醇溶液浸提含有花色苷的植物，用乙酸乙酯萃取含有花色苷的提取液，强阳离子交换纯化提取液，然后进行高压液相色谱分离花色苷单体。本发明利用本发明的花色苷的提取分离方法有效地将花色苷提取物中的黄酮类杂质去除，进一步能够成功的分离四种花色苷单体(矢车菊素‑3‑O‑葡萄糖苷、矢车菊素‑3‑O‑桑布糖苷、飞燕草素‑3‑O‑葡萄糖苷、和飞燕草素‑3‑O‑桑布糖苷)，各个花色苷单体浓度为97％～100％。
Description
技术领域
本发明涉及植物天然产物的提取技术领域，具体地，涉及一种植物花色苷的提取分离方法。
背景技术
花色苷广泛存在于深色植物的根、茎、叶、花和果实中，使其呈现红、紫、蓝等不同色彩，是桑葚、蓝莓、洛神花、紫甘薯等果蔬的主要色素来源。花色苷由游离花青素(2-苯并吡喃母核)与糖基通过糖苷键结合而成，自然界中花青素普遍以此形式存在。花色苷属于类黄酮化合物，其多羟基的结构赋予其独特的功能性，因而具有清除体内自由基、抗炎、抗肿瘤的作用，还具有降血脂、降血糖等功能活性(Stintzing F.C.,Carle R.(2004).Functional properties of anthocyanins and betalains in plants,food,and inhuman nutrition.Trends in Food Science and Technology,2004,15(1):19-38)。自然界已有超过635种天然花色苷得到鉴定，根据母环上取代基及糖苷的不同，它们被分为不同的单体，并且呈现不同的颜色。
目前，大孔树脂是花色苷纯化中应用最广泛的色谱技术。例如：CN201210559011.4一种蓝莓花色苷的制备方法与所制备的蓝莓花色苷的应用、CN200710144872.5大孔树脂纯化蓝靛果花色苷的制备工艺、CN201810508968.3黑果小檗总花色苷提取物及其纯化分离方法、201610397110.5一种在桑葚果渣中提取纯化花色苷的方法，等。然而，大孔树脂纯化后的花色苷纯度还不够理想，含有与花色苷极性相似的其他黄酮类物质，使得得到的花色苷纯度不高。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供种植物花色苷的提取分离方法。
阳离子交换树脂中含有大量强酸性基团，如磺酸基-SO3H，容易在溶液中离解出H+而呈酸性。树脂离解后，本体所含的负电基团吸附溶液中的其他阳离子。这两个反应使得树脂中的H+与溶液中的阳离子互相交换，达到目标物质的吸附。花色苷在酸性条件下带正电，大部分黄酮类物质带负电，阳离子交换树脂可以将花色苷提取物中的黄酮类杂质去除，进行洗脱得到花色苷混合物。
反相色谱是花色苷分离中应用最广泛的色谱技术。但对于含有黄酮类杂质的花色苷提取物，仅仅依靠反相色谱的分离能力常常不足，主要由于分离选择性有限。
而混合模式色谱先将提取物中含负离子的杂质去除，仅剩下花色苷混合物，花色苷根据极性大小，依次从固定相分离流出，完成不同花色苷单体的分离制备。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
因此本发明要求保护一种植物花色苷的提取分离方法，包括以下步骤：
S1.用酸化乙醇溶液浸提待提取的含有花色苷的植物，得到含有花色苷的提取液；
S2.用乙酸乙酯萃取含有花色苷的提取液，得到含有花色苷的萃取液；
S3.用强阳离子交换柱纯化含有花色苷的萃取液，产物冷冻干燥；
S4.上一步的产物进行高压液相色谱分离花色苷；
其中，采用半制备型反相高效液相色谱进行花色苷单体的高压液相色谱分离，所述的半制备型反相高效液相色谱采用C18反相色谱柱作为制备柱。
优选地，步骤S1的具体步骤为：按质量：体积为1：5～1：30的比例，使用酸化乙醇溶液浸泡提取1～5次，其中乙醇体积浓度为50％～95％，乙醇溶液中加入盐酸、甲酸、三氟乙酸中的一种或两种以上调节乙醇溶液pH值至1～3，每次浸泡时间为8～12小时，去掉浸泡提取液中的乙醇得到含有花色苷的提取液。
更优选地，减压蒸馏去掉浸泡提取液中的乙醇。
更优选地，步骤S1的具体步骤为：按质量：体积为1：5比例，使用酸化乙醇溶液浸泡提取3次，其中乙醇体积浓度为95％，乙醇溶液中加入三氟乙酸调节乙醇溶液pH值至2，每次浸泡时间为12小时，去掉浸泡提取液中的乙醇得到含有花色苷的提取液。
进一步更优选地，旋转蒸发仪45℃减压蒸馏去掉浸泡提取液中的乙醇。
优选地，步骤S2的具体步骤为：含有花色苷的提取液与乙酸乙酯充分混匀后充分静置，得到含有花色苷的乙酸乙酯萃取液，含有花色苷的乙酸乙酯萃取液去除有机溶剂，得到有花色苷萃取液。
更优选地，含有花色苷的乙酸乙酯萃取液旋转蒸发仪45℃，旋转减压蒸馏1～3次，得到有花色苷萃取液。
优选地，步骤S3中：
漂洗液为体积比为(10～30)：1的甲醇和乙酸的混合液；
样品洗脱液为体积比为上述漂洗液：NaCl(0.5～10mol/L)＝1：1的混合液。
更优选地，步骤S3中：
漂洗液为体积比为19：1的甲醇和乙酸的混合液；
样品洗脱液为体积比为1：1的漂洗液和2mol/LNaCl溶液的混合液。
更优选地，步骤S3中的具体步骤为：用2倍柱体积浓度为0.1～10mol/L的NaOH溶液冲洗柱体后，水洗至中性；再用2倍柱体积浓度为0.001～0.1mol/L的HCl冲洗柱体，并水洗至中性；使用2倍柱体积漂洗液冲洗柱体；再将漂洗液配制的花色苷样品加入柱体，吸附5min；用2倍柱体积漂洗液淋洗柱体除去杂质；最后用适量样品洗脱液洗脱。
进一步更优选地，步骤S3中：用2倍柱体积浓度为1mol/L的NaOH溶液冲洗柱体后，水洗至中性；再用2倍柱体积浓度为0.01mol/L的HCl冲洗柱体，并水洗至中性；使用2倍柱体积漂洗液冲洗柱体；再将漂洗液配制的花色苷样品加入柱体，吸附5min；用2倍柱体积漂洗液淋洗柱体除去杂质；最后用适量样品洗脱液洗脱。
更优选地，步骤S3中，洗脱产物真空冷冻干燥，干燥过程中物料温度不超过25℃，真空度为20～50Pa。
优选地，步骤S4中，采用梯度洗脱的方法，梯度洗脱参数为：梯度时间范围为45～120min；流动相为甲酸水溶液或三氟乙酸水溶液，流动相B为甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇或正丁醇中的一种；流速为2～10mL/min；检测波长为280～520nm。
更优选地，梯度时间范围为75min；流动相为体积分数2％甲酸水溶液，流动相B为乙腈；流速为6mL/min；检测波长为280～520nm。
更优选地，步骤S4中，流动相B的体积比例变化依次为6％～15％、15％～25％、25％～60％、60％～90％。
进一步优选地，步骤S4中，流动相B的体积比例变化依次为0～15min，6％～15％；15～45min，15％～25％；45～50min，25％～60％；50～60min，60％～90％；60～75min，6％～6％。
进一步优选地，步骤S4中，色谱柱内径为4.6～10μm，样品浓度为1mg/mL～100mg/mL，进样量为0.1μL～1mL，流速为2～10mL/min，柱温为4～60℃。
进一步更优选地，步骤S4中，色谱柱内径为5μm，样品浓度为200mg/mL，进样量为0.8mL，流速为6mL/min，柱温为25℃。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
一种植物花色苷的提取分离方法，利用本发明的花色苷的提取分离方法有效的将花色苷提取物中的黄酮类杂质去除，进一步能够成功地分离四种花色苷单体(矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-桑布糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、和飞燕草素-3-O-桑布糖苷)，各个花色苷单体浓度为97％～100％。
附图说明
图1为花色苷纯化分离流程。
图2为花色苷纯化过程液相色谱图；A：SCX柱纯化前；B：SCX柱纯化后。
图3为花色苷纯化过程中不同盐浓度洗脱效果图。
图4为花色苷单体制备液相色谱图。
图5为花色苷中压液相色谱图。
图6为花色苷单体及标准品液相色谱图。
图7为花色苷液相光谱信息图。
图8为花色苷质谱鉴定图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
花色苷提取物选用洛神花，购自云南；强阳离子交换柱填料购自山东。
实施例1一种花色苷的分离方法
一、实验方法
本实施例通过乙醇浸提、乙酸乙酯萃取制备洛神花提取物；用强阳离子交换(Strong cation exchange，SCX)柱除去其他黄酮类物质，得到花色苷混合物。采用半制备型高效液相色谱分离制备花色苷，得到4种花色苷单体纯品(如图1所示)。
(一)花色苷混合物的制备
1、洛神花提取物的制备
(1)浸提：选用富含花色苷的洛神花花萼，制成粉末状，按质量：体积为1：5加入酸化乙醇溶液浸泡提取3次，其中乙醇浓度为50％～95％，乙醇溶液中加入盐酸、甲酸、三氟乙酸中的一种或两种以上调节乙醇溶液pH值至1～3，每次浸泡时间为8～12小时，将浸泡液用旋转蒸发仪在45℃条件下减压回收乙醇，得到浓缩液；
(2)萃取：用乙酸乙酯萃取上述浓缩液，加入乙酸乙酯静置过夜，得到萃取液，将所得萃取液用旋转蒸发仪在45℃条件下减压回收有机溶剂，重复2次，得到浓缩液。
2、SCX交换柱除去其他黄酮类物质
配制1mol/L的NaOH溶液、0.01mol/L的HCl溶液用于柱活化，配制2mol/L的NaCl溶液作为阳离子交换溶液备用。
以体积比为甲醇：乙酸＝19：1的混合液作为漂洗液，以体积比为甲醇：NaCl(2mol/L)＝1：1的混合液作为样品洗脱液。
预处理后所得花色苷混合物用漂洗液配制成10mg/mL浓度，用以进行SCX柱纯化。
包括柱活化、漂洗、上样、淋洗、洗脱，具体的步骤如下：
用2倍柱体积(BV)浓度为1mol/L的NaOH溶液冲洗柱体后，水洗至中性，再用2BV浓度为0.01mol/L的HCl冲洗柱体，并水洗至中性，完成柱活化；使用2BV漂洗液冲洗柱体；再将漂洗液配制的花色苷样品加入柱体，吸附5min；用2BV漂洗液淋洗柱体除去杂质；最后用适量样品洗脱液洗脱得到花色苷溶液。将花色苷溶液减压浓缩，再冷冻干燥得花色苷混合物。其中，干燥过程中物料温度不超过25℃，真空度为20～50Pa。
(二)半制备型高效液相分离制备花色苷单体
将冷冻干燥得到的花色苷样品溶解后进行半制备型高效液相分离制备花色苷单体。半制备型高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)具体参数如下，色谱柱：YMC-Pack ODS-A(20×250mm，5μm)C18反相色谱分析柱，流动相A为2％甲酸水，流动相B为乙腈，流速6mL/min，用梯度洗脱的方法分离花色苷单体。
梯度洗脱程序：0～15min，6％～15％B；15～45min，15％～25％B；45～50min，25％～60％B；50～60min，60％～90％B；60～75min，6％～6％B。
检测波长为280～520nm。
色谱柱内径为5μm，样品浓度为0.2g/mL，进样量为0.8mL，流速为6mL/min，柱温为25℃。
(三)花色苷单体分析鉴定方法
1、高效液相色谱
对制备过程中的花色苷单体的采用分析型HPLC分析其纯度，色谱柱：C18 column(4.6×250mm，5μm，Thermo)反相色谱分析柱，流动相A为2％甲酸水，流动相B为乙腈，流速1mL/min，用梯度洗脱的方法分析样品中的花色苷。梯度洗脱程序：0～34min，6％～30％B；34～35min，30％～90％B；35～40min，95％～95％B；40～41min，95％～6％B；41～45min，6％～6％B。
2、高效液相色谱质谱联用
对分离制得的花色苷单体采用HPLC-MS联用鉴定其结构，在200m/z～1000m/z范围内进行Q3扫描，选取含量较高的分子离子峰，进行二级质谱产物离子扫描，优化电压以达到分离特征离子峰，对其进行鉴定。A相为1％甲酸水溶液，B相为乙腈，流速为0.5mL/min。采用正离子模式；氮气作为碰撞气体，雾化气流量为3.0L/min，干燥气流量为10.0L/min；加热器流量为10.0L/min；接口温度为300℃，DL温度为250℃，加热块温度为400℃。
二、实验结果
(1)SCX柱纯化后的鉴定
洛神花花色苷纯化过程中HPLC鉴定结果如图2所示，图2A、图2B分别为洛神花提取物、SCX柱纯化后样品。280nm下显示花色苷和黄酮类物质的特征吸收，520nm下仅显示花色苷的特征吸收。图2A与图2B比较发现，洛神花提取物经SCX柱纯化后，280nm下和520nm下特征吸收基本相同，说明样品中黄酮类物质得到去除。传统花色苷的分离方法难以得到高纯度单体的原因之一在于，花色苷提取物中所含黄酮类物质结构和极性与花色苷相似较高，分离难度较高。
在SCX柱洗脱过程中不同的洗脱液中盐浓度对花色苷洗脱效率有影响，图3为在仅改变NaCl浓度条件下样品洗脱液实物图。结果表明在NaCl浓度为2mol/L时能用最少体积的洗脱液将样品全部洗脱完成。
(2)花色苷单体的分离与鉴定
经SCX柱纯化后的洛神花样品中含有多种花色苷混合物，通过半制备液相色谱法分离，得到的液相色谱如图4所示。不同结构的花色苷由于极性不同，在梯度洗脱下，得到较大程度的分离。以280nm下的图谱为参考线，520nm下的图谱为采集线，收集前4个主要的单个色谱峰的洗脱液。
中压液相色谱也是分离制备花色苷常用的方法之一，可以获得较高纯度花色苷单体。但从本实验前期方法开发结果来看，中压液相色谱对于洛神花中4种花色苷分离度不佳，单体未能完全分离，结果如图5所示，其中蓝色曲线为样品在520nm下吸收曲线，也是样品采集曲线。这可能与花色苷结构相似度较高从而极性差距小有关，而制备型高效液相色谱在这方面效果突出。
洛神花中4种花色苷单体在制备型液相色谱中得到有效分离，收集得到的前4个色谱峰的样品通过HPLC与标准品进行比对，并进行纯度鉴定。图6为分离不同花色苷以及标准品的液相色谱图，所得花色苷单体的纯度为：飞燕草素-3-O-桑布糖苷(D3S，式Ⅰ所示)>99％，飞燕草素-3-O-葡萄糖苷(D3G，式Ⅱ所示)>98％，矢车菊素-3-O-桑布糖苷(C3S，式Ⅲ所示)>98％，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G，式Ⅳ所示)>97％。图7为花色苷液相光谱吸收图，D3S与D3G在277nm、524nm左右有最大吸收，C3S与C3G在280nm、517nm左右有最大吸收。图8为4种花色苷质谱鉴定图，由一级和二级质谱结构确定花色苷结构。结合标准品通过HPLC进行比对，花色苷鉴定信息如表1所示。D3S与D3G母环结构相同，C3S与C3G母环结构相同，母环二级质谱碎片离子相同。
表1花色苷鉴定信息
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种洛神花花色苷的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.用酸化乙醇溶液浸提待提取的含有花色苷的洛神花，得到含有花色苷的提取液；
S2.用乙酸乙酯萃取含有花色苷的提取液，得到含有花色苷的萃取液；
S3.用强阳离子交换柱纯化含有花色苷的萃取液，产物冷冻干燥；
S4.上一步的产物进行高压液相色谱分离花色苷；
其中，采用半制备型反相高效液相色谱进行花色苷单体的高压液相色谱分离，所述的半制备型反相高效液相色谱采用C18反相色谱柱作为制备柱；
步骤S1中，按质量：体积为1：5～1：30的比例，使用酸化乙醇溶液浸泡提取1～5次，其中乙醇体积浓度为50％～95％，乙醇溶液中加入盐酸、甲酸、三氟乙酸中的一种或两种以上调节乙醇溶液pH值至1～3，每次浸泡时间为8～12小时，减压浓缩，去掉浸泡提取液中的乙醇，得到含有花色苷的提取液；
步骤S3中，用2倍柱体积浓度为0.1～10mol/L的NaOH溶液冲洗柱体后，水洗至中性；再用2倍柱体积浓度为0.001～0.1mol/L的HCl冲洗柱体，并水洗至中性；使用2倍柱体积漂洗液冲洗柱体；再将漂洗液配制的花色苷样品加入柱体，吸附5min；用2倍柱体积漂洗液淋洗柱体除去杂质；最后用适量样品洗脱液洗脱；所述漂洗液为体积比为(10～30)：1的甲醇和乙酸的混合液；所述样品洗脱液为体积比为甲醇：0.5～10mol/L NaCl＝1：1的混合液；
步骤S4中，采用梯度洗脱的方法，梯度洗脱参数为：梯度时间范围为45～120min；流动相A为2％甲酸水溶液，流动相B为乙腈；流速为2～10mL/min；检测波长为280～520nm；流动相B的体积比例变化依次为0～15min 6％～15％、15～45min 15％～25％、45～50min 25％～60％、50～60min 60％～90％、60～75min，6％；色谱柱内径为4.6～10μm，样品浓度为1mg/mL～100mg/mL，进样量为0.1μL～1mL，流速为2～10mL/min，柱温为4～60℃。
2.根据权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于，步骤S2的具体步骤为：含有花色苷的提取液与乙酸乙酯充分混匀后充分静置，得到含有花色苷的乙酸乙酯萃取液，含有花色苷的乙酸乙酯萃取液去除有机溶剂，得到花色苷萃取液。
3.根据权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于，步骤S3中，干燥过程中物料温度不超过25℃，真空度为20～50Pa。
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