CN113024503B - 一种连续化制备低聚原花青素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种连续化制备低聚原花青素的方法，包括以下步骤：(1)配制催化降解液；(2)催化降解：将降解液上柱于聚酰胺层析柱，收集流出液I；(3)膜分离：将流出液过膜，分别收集截留液和透过液；(4)富集：透过液上柱于大孔吸附树脂至饱和，更换同规格同类型的大孔吸附树脂继续上柱，两根以上的树脂循环交替使用，先用水赶和除杂，再醇水解吸，分别收集合并上柱流出液II和解吸液；(5)循环套用：将步骤(4)流出液II与步骤(3)截留液合并，加入含高聚原花青素原料溶解后，作为步骤(1)的降解液的补充套用，继续按步骤(2)方法上柱；(6)浓缩干燥：将步骤(4)得到的解吸液浓缩、干燥，即得低聚原花青素产品。

Description

一种连续化制备低聚原花青素的方法

技术领域

本发明涉及制备低聚原花青素的方法，具体涉及一种连续化制备低聚原花青素的方法。

背景技术

原花青素是自然界中广泛存在的一大类天然多酸类化合物的总称。原花青素资源分布广泛，存在于葡萄、山楂、可可豆、野草莓、樱桃、芒果、苹果、柏树、白桦树、银杏、茶叶、高粱、大麦、日本罗汉柏、北美崖柏、土耳其侧柏、落叶松、莲房，野草墓、樱桃等植物中。

花青素是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂，其抗氧化和清除自由基的能力极强，约为Ve的50倍，Ve的50倍，在欧美被广泛用于各种普通食品中如蛋糕、奶酪等，既作为营养强化剂，又作为天然防腐剂来代替合成防腐剂。原花青素作为健康食品的原料直接制成胶囊等剂型已成为美国天然植物药十大畅销品之一。高品质的原花青素在水和醇中有良好的溶解性，加上其色泽亮丽，被广泛用于饮料和酒中。

原花青素(Proanthocyanidins，PC)是一种常见的聚多酚类黄酮，广泛存在于自然界的植物中，如葡萄籽中原花青素含量很丰富。研究表明，葡萄籽原花青素具有良好的抗氧化功能，可以很好地清除自由基，医治一些由自由基造成的疾病，还有抗毒消炎、防治心血管疾病等功效。按聚合度差异可将原花青素分为3类：聚合度为1的单体，具体包括表儿茶素、没食子酸、儿茶素等，聚合度在2-4的称为低聚原花青素，聚合度在≥5的称为高聚原花青素。研究发现，原花青素在人体的内的吸收是通过肠道微生物的分解作用，而这种分解只针对单体和二聚体，当分子量变大，分解作用也及鞥地。可能的原因是高聚原花青素的分子量比低聚体大，受到空间位阻的影响更大，因此，高聚体的抗氧化能力低于低聚体。因此，为了使原花青素的利用效益达到最大化，有必要对高聚原花青素进行降解处理来提高其使用价值。

现有技术中有一些关于制备低聚原花青素的公开资料。

CN106478580公开了一种从荔枝提取物中制备含低聚提原花青素的方法，通过提取、离心、浓缩、大孔吸附树脂分离纯化、干燥、有机酸水解后即得。该方法连续化程度低，不利于规模化生产，且有机酸为进行除去，直接导致最终产品含有大量的有机酸残留。

CN101239963公开了肉桂原花青素高聚物催化氢解为低聚物的方法，通过钯/碳催化剂，在氢气气氛的醇相水溶液中进行催化降解而制得。该方法对设备要求高，且催化剂成本高，产业化难度也较大。

CN108586416公开了一种高压脉冲电场协同超高压微射流制备低聚原花青素的方法，通过高压脉冲电场和超高压微射流处理后，浓缩干燥即得。该工艺对设备要求较高。

CN106381319公开了一种葡萄籽原花青素低聚体高效提取分离方法，通过粉碎、脱脂、酶处理、提取、低温浓缩、复合酸降解、大孔吸附树脂纯化、浓缩干燥后即得。该方法连续化程度低，对有机酸等溶剂的利用次数只有一次，利用率较低。

CN1654463公开了一种低聚体原花青素及制备方法和应用，通过提取、双氧水氧化降解、浓缩脱水和除双氧水、干燥即得。该工艺未进行纯化，所得的产品含量极低。

CN105837548公开了一种用亚硫酸化学降度高聚原花青素的方法，通过粗提物复溶、亚硫酸降解、碳酸钙中和、固液分离、浓缩干燥后即得。该方法连续化程度低，对有机酸等溶剂的利用次数只有一次，利用率较低。

CN102229592公开了一种蔷薇红景天原花青素的制备方法，通过提取、乙酸乙酯萃取、大孔吸附树脂纯化、分别浓缩干燥后即得。该工艺需要大量的乙酸乙酯且没有反复利用，有机溶剂使用量较大。

CN111205259公开了一种柿子低聚原花青素的制备方法及其应用，通过高聚原花青素溶解于乙醇水溶液、氢气条件下钯/碳催化降解、冷却、过滤、真空浓缩、干燥后即得。该方法对设备要求高，且催化剂成本高，产业化难度也较大。

CN101597273公开了一种低聚体葡萄籽原花青素的制备方法，通过乙醇浸提、碱液纯化、酸液纯化、膜分离、丙酮和乙醇洗涤、浓缩干燥即得。该方法连续化程度低、有机溶剂利用率低。

CN108409702公开了一种用氢氧化锂化学降解高聚原花青素的方法，通过氢氧化锂降解、盐酸中和、浓缩、冻干即得。该方法连续化程度低，且未对中和后产生的盐进行除去，对产品含量和安全性有影响。

CN101012216公开了一种低聚体原花青素的制备方法，通过酸性催化剂(酸或者酸性树脂)隔绝空气中降解后即得。该方法连续化程度低、且需要隔离空气反应，对设备条件要求高。

CN102432580公开了一种高聚原花青素的降解方法，通过亚硫酸盐或亚硫酸氢盐降解、AB-8吸附、醇洗脱、纯化、浓缩干燥后即得。该方法连续化程度低。

上述方法中有的采用钯/碳或者其他稀有金属作为降解催化剂，其价格昂贵，甚至有残留，还需要保持在氢气的气氛条件下；有的是直接加入酸性或者碱性催化剂，连续化程度极低，甚至未对催化剂残留进行有效除去，对催化剂的利用率也较低。

因此，开发一种能够连续化纯度高、降解催化剂可以反复多次利用的低聚原花青素制备方法，对于节约资源，促进环保，提高产业化能力，具有重要的环保意义和经济价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种连续化制备低聚原花青素的方法，其可以制备低聚原花青素，且可以实现连续化作业，同时降解催化剂可以反复多次使用，该方法工艺简单，对设备要求低，产业化能力强。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种连续化制备低聚原花青素的方法，包括以下步骤：

(1)配制催化降解液：将含高聚原花青素原料溶解于碱性的催化降解液中，搅拌至充分溶解；

(2)催化降解：将降解液上柱于聚酰胺层析柱，收集流出液I；

(3)膜分离：将流出液过膜，分别收集截留液和透过液；

(4)富集：透过液上柱于大孔吸附树脂至饱和，更换同规格同类型的大孔吸附树脂继续上柱，同时对饱和的大孔吸附树脂水赶后除杂，再加醇水解吸备用，透过液在另一根大孔吸附树脂上柱至饱和时，更换上述水赶后除杂、解吸后备用的大孔吸附树脂继续上柱至饱和，两根以上的树脂循环交替使用，分别收集合并上柱流出液II和解吸液；

(5)循环套用：将步骤(4)流出液II与步骤(3)截留液合并，加入含高聚原花青素原料溶解后，作为步骤(1)的降解液的补充套用，继续按步骤(2)方法上柱；

(6)浓缩干燥：将步骤(4)得到的解吸液浓缩、干燥，即得低聚原花青素产品。

步骤(1)中，所述含高聚原花青素原料中，聚合度≥5的高聚花青素含量在60wt％以上的原花青素混合物。所述含高聚原花青素原料是植物原料经过提取精制而制得，包括但不限于蔓越橘原花青素、越橘原花青素、玫瑰茄原花青素、葡萄籽原花青素、蝶豆花原花青素、蓝莓原花青素、紫甘薯原花青素、紫米原花青素或黑米原花青素中的任意一种。

步骤(1)中，所述催化降解液是有碱、乙酸乙酯、乙醇和水的混合物；优选地，其中乙酸乙酯、乙醇和水的质量比为0.1-0.5：0.5-2：10-15，碱的加入量为使催化降解液的pH值为10-14，优选为12-13；所述的碱为金属氢氧化物。

进一步地，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾，氢氧化钡中的至少一种。

优选地，所述碱为氢氧化钠/氢氧化钾和氢氧化钡的混合碱；进一步优选为氢氧化钠/氢氧化钾和氢氧化钡按照质量比2-10:1的混合碱；最优选地，所述碱为氢氧化钠/氢氧化钾和氢氧化钡按照质量比4-7：1的混合碱。发明人预料不到地发现，采用氢氧化钠/氢氧化钾和氢氧化钡的混合碱，能够进一步加强高聚原花青素的降解效率，产生更多的低聚体。推测原因可能在于，氢氧化钡除了能够发挥碱的作用，金属钡离子可能也对降解具有一定作用。

步骤(1)中，所述含高聚原花青素原料与催化降解液的比例为使溶液中含高聚原花青素原料量浓度为30-100g/L，优选50-70g/L。

步骤(2)中，所述聚酰胺层析柱填料为聚酰胺树脂，粒径为80-200μm，所述聚酰胺树脂的体积为催化降解液的0.1至0.3倍，优选为0.2-0.25倍，所述层析柱的径高比为1:3-8，上柱流速为0.1-0.5BV/h。

步骤(2)中，所述层析柱柱温保持在40-70℃之间。

步骤(3)中，所述膜优选为旋转错流过滤膜，相对于常规的静态膜过滤而言，采用旋转错流过滤膜通量大，不易堵柱，所述旋转错流过滤膜的截留分子量为1000-3000Da。

步骤(4)中，两根以上的大孔吸附树脂的数量是2-10根，根据实际情况，比如原料的量，树脂柱的处理量等条件可以灵活调整，比如适用2根，3根，4根，5根大孔吸附树脂交替使用。

所述大孔吸附树脂的为D101、AB-8、DM130、LSA-10、LX-12、XDA-6、XDA-7、LX-68、XDA-200B中的任意一种；所述大孔吸附树脂的提及为催化降解液的0.1至0.3倍；所述层析柱的径高比为1:3-8，上柱流速为0.5-1BV/h。

步骤(4)中，所述的水赶为0.7-1.5BV纯水，流速为1-2BV/h；所述解吸是用2-3BV的体积分数40-70％的醇水溶液洗脱，流速0.5-1BV/h；所述醇为乙醇或甲醇中的至少一种。

优选地，步骤(4)中，在水洗和解吸之间还有用2-3BV的低度乙酸乙酯/醇的水溶液除杂的步骤，流速0.5-1BV/h；所述低度乙酸乙酯/醇的水溶液中，乙酸乙酯的体积分数为2-4％，醇的体积分数为5-10％；所述醇为乙醇或甲醇中的至少一种。

步骤(4)中，所述上柱流出液II为上柱过程中柱流出液，不包括水洗流出液和除杂流出液。

步骤(5)中，所述含高聚原花青素原料的加入量为使合并的降解液中，含高聚原花青素原料质量浓度接近步骤(1)中配制催化降解液中的浓度，即30-100g/L，优选50-70g/L，并用碱调节pH值为10-14，所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡中至少一种。

步骤(6)中，所述浓缩为以减少水分为目的，包括但不限于真空旋转浓缩、单效减压蒸发浓缩、多效减压蒸发浓缩中的一种，浓缩温度不高于70℃，真空度为-0.06至-0.1MPa；所述干燥为以除去水分为目的，包括但不包括真空干燥、鼓风干燥、真空微波干燥、真空冷冻干燥中的任意一种，干燥温度不高于70℃。

本发明方法的原理是：

将一定量的高聚原花青素溶解于催化降解液(乙酸乙酯、醇、水及碱的混合物)中，上柱于聚酰胺树脂进行过饱和吸附而被固定在层析柱上，被吸附的高聚原花青素在催化降解液的作用下被降解为低聚原花青素，随后在竞争性吸附的作用下，低聚原花青素随同流出液脱离层析柱而得以分离，同时层析柱的结合位点再次被高聚原花青素附着吸附。含有低聚原花青素的流出液再次经过保险膜分离，其富含低聚原花青素上柱于大孔吸附树脂，吸附饱和后进行水洗和解吸，同时更替同类型的大孔吸附树脂继续吸附，两根以上交替使用。收集到的解吸液浓缩干燥后即得低聚原花青素。膜分离得到截留液和大孔吸附树脂的上柱流出液合并后进行套用，即再次加入高聚原花青素作为新的催化降解液继续上柱于聚酰胺层析柱，从而实现整个生产工艺的连续性。所得产品纯度高，整体收率好，是一种便于工业化生产的连续化制备低聚原花青素产品的方法。

本发明方法的有益效果如下：

本发明方法是一种连续化的生产低聚原花青素产品的便于工业化生产的方法，巧妙地利用了树脂的利用方式和溶剂循环方式，树脂和溶剂利用率远远超过现有的制备低聚原花青素的工艺，工艺过程简便易曹组，不需要使用复杂或者大型的设备，适宜于工业化生产。所得低聚原花青素产品品质高，产率高，具有产业上的优势。

附图说明

图1是本发明低聚原花青素制备的流程示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的高聚原花青素产品由江西海富生物工程有限公司提供，葡萄籽原花青素平均聚合度11.6，含量76.4wt％；蔓越橘原花青素平均聚合度16.4，含量80.2wt％。

本发明实施例所使用的原料或化学试剂或所用设备，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

所述旋转错流过滤膜采购自南京福林德环保科技有限公司FLD-SYS-1000，截留分子量为1000Da。

聚酰胺树脂层析柱采购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司，规格为粒径约150μm。

(1)平均聚合度的检测方法为：

1)物质质量浓度的测定：分别配置浓度为30、90、150、210、270μg/ml的儿茶素甲醇对照品，精确称取对照品0.5ml，分别置于10ml具塞玻璃试管中，再分别精密加入4％的香草醛甲醇溶液3ml及浓盐酸1.5ml，摇匀，在20℃水浴15min，在500nm波长处测定吸光度并制作标准曲线。用同样的方法，将精确称取一定量的待测样品代替标准品用以上方法进行配置和检测，并通过标准曲线进行计算后，即可得出待测样品质量浓度。

2)物质的量浓度的测定：精密量取儿茶素对照品溶液适量，分别置5ml量瓶中，加入乙酸溶液(含2％甲醇)至刻度，分别制得0.025、0.050、0.075、0.100、0.125μmol/ml的对照品溶液，分别取1ml并置于10ml具塞试管中，加入4％盐酸及1.0％香草醛乙酸溶液5ml，摇匀，20℃水浴20min，在500nm波长处测定吸光度并制作标准曲线。用同样的方法，将步骤1)的待测样品稀释液稀释成一定浓度倍数后，代替对照品用以上方法进行检测，并通过标准曲线和稀释倍数进行计算后，即可得出待测样品物质的量浓度。

3)平均聚合度的测定：平均聚合度＝(待测样品物质质量浓度/待测样品物质的量浓度)/对照品的摩尔质量。

(2)含量的测定方法

采用方法(1)中得出待测样品的质量浓度后，按照样品稀释比例折算即可得到花青素含量。

实施例1

(1)催化降解液的制备：取葡萄籽原花青素4000g，先取500g溶于10L乙酸乙酯、乙醇及水的体积比例为0.3：1：10的催化降解液中，再用氢氧化钠调节pH值为12。

(2)催化降解：将催化降解液上柱于100目2L、径高比为1:4的聚酰胺树脂层析柱，底端上柱流速为0.1BV/h，柱温度为50℃，收集流出液I。

(3)膜过滤：将流出液Ⅰ通过旋转错流过滤膜，膜为截留分子量为1000Da，分别收集截留液和透过液。

(4)富集：将透过液上柱于2L的D101大孔吸附树脂，层析柱径高比为1:4，流速为0.5BV/h，待饱和替换同规格的D101大孔吸附树脂。吸附饱和的层析柱用1BV的纯水以流速1BV/h洗柱后，先用2.5BV低度乙酸乙酯醇水溶剂除杂(乙酸乙酯体积分数为2％、乙醇体积分数为6％)，流速为1BV/h；再用3BV体积分数为60％的乙醇水溶液解吸，流速为1BV/h，解吸后的大孔吸附树脂可以继续上柱直至饱和，分别合并两根D101大孔吸附树脂的上柱流出II和解吸液。

(5)套用：将步骤(4)流出液Ⅱ和步骤(3)截留液合并，并加入高聚原花青素溶解，使其浓度为5％，用氢氧化钠调节pH值为12后，继续返回步骤(2)进行上柱。

(6)浓缩干燥：将步骤(4)得到的解吸液在65℃、-0.09MPa条件下真空浓缩至45brix后，再将其置于70℃、-0.09MPa条件下真空干燥，即得3018g低聚原花青素产品。

经检测计算得到：低聚原花青素产品平均聚合度为3.5，含量为93.1％，收率91.9％。

实施例2

其他操作和条件和实施例1相同，区别在于步骤(1)中原料为蔓越橘原花青素，经检测计算得到：本实施例低聚原花青素产品平均聚合度为3.7，含量为94.5％，收率92.3％。

实施例3

其他操作和条件和实施例1相同，区别在于步骤(1)中催化降解液用氢氧化钾调节pH值为13。经检测计算得到：本实施例低聚原花青素产品平均聚合度为3.5，含量为93.4％，收率92.2％。

实施例4

其他操作和条件和实施例1相同，区别在于步骤(1)中催化降解液用氢氧化钠调节pH值为10。经检测计算得到：本实施例低聚原花青素产品平均聚合度为3.8，含量为93.5％，收率88.7％。

实施例5

其他操作和条件和实施例1相同，区别在于步骤(1)中催化降解液用氢氧化钠调节pH值为14。经检测计算得到：本实施例低聚原花青素产品平均聚合度为3.5，含量为89.7％，收率91.6％。

实施例6

其他操作和条件和实施例1相同，区别在于步骤(1)中催化降解液用氢氧化钠/氢氧化钡按照质量比4：1的混合碱调节pH值为12。经检测计算得到：本实施例低聚原花青素产品平均聚合度为3.2，含量为94.2％，收率94.7％L。

实施例7

其他操作和条件和实施例1相同，区别在于步骤(1)中催化降解液用氢氧化钠/氢氧化钡按照质量比7：1的混合碱调节pH值为12。经检测计算得到：本实施例低聚原花青素产品平均聚合度为3.3，含量为91.6％，收率94.4％。

实施例8

其他操作和条件和实施例1相同，区别在于步骤(1)中催化降解液用氢氧化钠/氢氧化钡按照质量比2：1的混合碱调节pH值为12。经检测计算得到：本实施例低聚原花青素产品平均聚合度为3.0，含量为88.6％，收率95.1％。

实施例9

其他操作和条件和实施例1相同，区别在于步骤(1)中催化降解液用氢氧化钠/氢氧化钡按照质量比10：1的混合碱调节pH值为12。经检测计算得到：本实施例低聚原花青素产品平均聚合度为3.2，含量为92.9％，收率92.8％。

对比例1

其他操作和条件和实施例1相同，区别在于步骤(2)中聚酰胺层析柱替换为大孔吸附树脂D101。经检测计算得到：本实施例低聚原花青素产品平均聚合度为4.7，含量为82.3％，收率78.5％。

Claims (9)

1.一种连续化制备低聚原花青素的方法，包括以下步骤：

（1）配制催化降解液：将含高聚原花青素原料溶解于碱性的催化降解液中，搅拌至充分溶解；所述催化降解液是有碱、乙酸乙酯、乙醇和水的混合物；其中乙酸乙酯、乙醇和水的质量比为0.1-0.5：0.5-2：10-15，碱的加入量为使催化降解液的pH值为12-13；所述碱为氢氧化钠/氢氧化钾和氢氧化钡按照质量比4-7：1的混合碱；

（2）催化降解：将降解液上柱于聚酰胺层析柱，收集流出液I；

（3）膜分离：将流出液I过膜，分别收集截留液和透过液；

（4）富集：透过液上柱于大孔吸附树脂至饱和，更换同规格同类型的大孔吸附树脂继续上柱，同时对饱和的大孔吸附树脂水赶后，再加醇水解吸备用，透过液在另一根大孔吸附树脂上柱至饱和时，更换上述水赶、解吸后备用的大孔吸附树脂继续上柱至饱和，两根以上的树脂循环交替使用，分别收集合并上柱流出液II和解吸液；

（5）循环套用：将步骤（4）流出液II与步骤（3）截留液合并，加入含高聚原花青素原料溶解后，作为步骤（1）的降解液的补充套用，继续按步骤（2）方法上柱；

（6）浓缩干燥：将步骤（4）得到的解吸液浓缩、干燥，即得低聚原花青素产品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述含高聚原花青素原料中，聚合度≥5的高聚花青素含量在60wt%以上；所述含高聚原花青素原料是植物原料经过提取精制而制得，包括蔓越橘原花青素、越橘原花青素、玫瑰茄原花青素、葡萄籽原花青素、蝶豆花原花青素、蓝莓原花青素、紫甘薯原花青素、紫米原花青素或黑米原花青素中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含高聚原花青素原料与催化降解液的比例为使溶液中含高聚原花青素原料质量浓度为30-100g/L。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述含高聚原花青素原料与催化降解液的比例为使溶液中含高聚原花青素原料质量浓度为50-70g/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述聚酰胺层析柱填料为聚酰胺树脂，粒径为80-200μm，所述聚酰胺树脂的体积为催化降解液的0.1至0.3倍，所述层析柱的径高比为1:3-8，上柱流速为0.1-0.5BV/h。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚酰胺树脂的体积为催化降解液的0.2-0.25倍。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述膜为旋转错流过滤膜，所述旋转错流过滤膜的截留分子量为1000-3000Da；和/或

步骤（4）中，两根以上的大孔吸附树脂的数量是2-10根；所述大孔吸附树脂的为D101、AB-8、DM130、LSA-10、LX-12、XDA-6、XDA-7、LX-68、XDA-200B中的任意一种；所述大孔吸附树脂的体积为催化降解液的0.1至0.3倍；所述大孔吸附树脂柱的径高比为1:3-8，上柱流速为0.5-1BV/h。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述水赶为0.7-1.5BV纯水，流速为1-2BV/h；所述解吸是用2-3BV的体积分数40-70%的醇水溶液洗脱，流速0.5-1BV/h；所述醇为乙醇或甲醇中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，在水洗和解吸之间还有用2-3BV的低度乙酸乙酯/醇的水溶液除杂的步骤，流速0.5-1BV/h；所述低度乙酸乙酯/醇的水溶液中，乙酸乙酯的体积分数为2-4%，醇的体积分数为5-10%；所述醇为乙醇或甲醇中的至少一种。

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