CN108003128A - 一种葡萄籽原花青素的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种葡萄籽原花青素的提取方法。本发明克服了葡萄籽种皮中原花青素难以溶出及其提取物中原花青素聚合度高的难题，采用黑曲霉为菌种发酵葡萄籽，利用黑曲霉产生的纤维素酶、果胶酶等酶类降解葡萄籽种皮利于原花青素的溶出，采用不同体积分数的乙醇作为解吸液洗脱大孔吸附树脂，将原花青素分级，然后进行部分酸解，以利于增加提取物中原花青素低聚体的含量。本发明所得的提取物中低聚原花青素含量≥98％，其平均聚合度在2.5～3.0之间，在体内易吸收，抗氧化活性强。

Description

一种葡萄籽原花青素的提取方法

技术领域

本发明属于天然产物活性物质提取领域，具体涉及一种葡萄籽原花青素的提取方法。

背景技术

原花青素(proanthocyanidins)又称为缩合单宁(condensed tannins)，是黄烷-3醇单体通过C4-C8或C4-C6位连接成一定聚合度的分子，存在形式为游离、寡聚和多聚物，其基本单元主要是儿茶素、表儿茶素、没食子酸及表儿茶素没食子酸酯等。按聚合度大小可分为低聚原花青素(简称OPC，基本单元的二、三、四聚体)和高聚原花青素(简称PPC，基本单元的聚合度大于4)。其中低聚原花青素可被人体吸收利用，且具有比其组成单元更高的抗氧化活性；高聚原花青素难以透过生物膜，不能被人体吸收利用，因此降低葡萄籽提取物中原花青素的聚合度可增加提取物的吸收利用率。

原花青素广泛分布于葡萄籽、松树皮等高等植物组织中。在植物体中原花青素具有抗生物或非生物胁迫的功能，如抗紫外线、抗病以及调节种子休眠和萌发等。一系列研究表明原花青素是一种强的抗氧化剂，其抗氧化、清除自由基的能力是VE的50倍、VC的20倍。从食品中摄取原花青素可以延缓衰老，预防动脉粥样硬化和心血管疾病如心脏病、心血管病、高血压，而且对糖尿病、帕金森病、肥胖症和癌症等有一定的药理功效。现已广泛应用于食品、化妆品和保健品等领域。

葡萄籽提取物作为一种天然存在的强效抗氧化剂，具有显著清除人体自由基的功能，其应用已经有40多年的历史，到上个世纪90年代欧美等发达国家对葡萄籽提取物的应用与开发成为热点。在此潮流的影响下，国内相关的研究也逐渐展开，近年来国内以葡萄籽提取物为原料的保健食品越来越多。由于葡萄籽提取物中功效成分含量太复杂，而且各葡萄籽提取物原料生产厂家和应用厂家对葡萄籽提取物中功效成分的认识不统一。但目前国内厂家对自己葡萄籽提取物的标注多为原花青素含量≥95％，未提到原花青素聚合度及单体的含量，经测定其产品原青花素的平均聚合度较大，一般都在8.0以上。

中国专利CN105130941A公开了一种葡萄籽提取物的制备方法，采用粉碎后的葡萄籽添加水和酵母后密封发酵，然后再用丙烷和二甲醚萃取葡萄籽油，用无水乙醇作为萃取剂进行亚临界萃取，获得原花青素提取物。中国专利CN101100464A中公开了高氧化自由基吸收能力(ORAC)的低聚原花青素及其提纯方法，所述的低聚原花青素产品含有质量百分数为45～65％的低聚原花青素，其制备方法为采用超滤膜截留相对分子量在5～100万之间的分子，制得高ORAC值的低聚原花青素。中国专利CN103910706B公开了一种低成本的低聚原花青素的制备方法，其采用冷溶、过滤、纳滤、喷雾干燥等技术，在其制备过程中采用质量浓度为4～6％的亚硫酸氢钠溶液，进行高聚原花青素的降解，取得了一定的效果。中国专利CN200510013084.3通过用截留相对分子量为5000和1000的低蛋白吸附的改性聚醚砜平板超滤膜，提纯葡萄籽提取物中的低聚原花青素，其中5000膜超滤原花青素得率为25.18％，单体儿茶素得率为74.11％；1000膜超滤原花青素得率为34.76％，单体儿茶素得率为48.58％。中国专利CN104529990A公开了一种从葡萄籽中提取原花青素的方法，其采用纤维素酶进行葡萄籽中纤维素的降解以利于种皮中原花青素溶出，得到纯度95％以上的寡聚原花青素。

在上述文献中所涉及的原花青素的提取方法中，采用酶进行纤维素的降解以利于原花青素的溶出，其成本投入较高，而且在酶解过程中需要适宜酶解的温和条件，操作较为复杂。采用超滤膜过滤提取特定分子段的原花青素过程中，目前仍还存在膜通量小、所需膜面积大、处理量少、超滤时间长、难以实现规模化工业生产等缺陷。

发明内容

为克服葡萄籽种皮中原花青素难以溶出及其提取物中原花青素聚合度高的问题，本发明提供了一种利于葡萄籽种皮中原花青素溶出及降低其提取物中原花青素聚合度的制备方法。

本发明技术方案如下：

一种葡萄籽原花青素的提取方法，以葡萄籽为原料，经清洗、碾压粉碎，发酵处理，逆流提取、大孔树脂吸附、分级解吸附、酸解、降温过滤，喷雾干燥制得。

具体地，上述葡萄籽原花青素的提取方法，包括以下步骤：

1)葡萄籽的预处理，选取无霉变的葡萄籽(鲜品)，放入清洗池中，用无菌水清洗，沥干或采用干燥的葡萄籽为原料，将干燥的葡萄籽在无菌水中浸泡，使其充分吸水，浸泡清洗后沥干。将沥干后的葡萄籽放入滚筒式碾压机中，使葡萄籽碾压通过碾压间隙。

2)葡萄籽进行发酵处理，以黑曲霉为菌种，经过活化、一级扩培、二级扩培制得发酵菌种。将预处理后的葡萄籽与菌种按一定比例进行接种，混合后在一定条件下进行固体发酵。

3)原花青素粗品的制备，将发酵后的葡萄籽采用三级四罐式逆流提取方式进行提取，提取后合并提取液进行减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液，将水溶液进行喷雾干燥，获得原花青素粗品。

4)原花青素分级：将原花青素粗品配成一定浓度的水溶液进行大孔树脂吸附，先用低浓度解吸液洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液组分1；再采用高浓度解吸液洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液组分1。

5)原花青素的制备，取原花青素水溶液组分2加入混合酸，在一定条件下进行酸解，获得酸解液。调整酸解液pH，并于原花青素水溶液组分1进行混合，降温，低温滤去不溶物，喷雾干燥；获得原花青素提取物。

所述葡萄籽碾压为将沥干后的葡萄籽放入滚筒式碾压机中，使葡萄籽碾压通过0.5～1.0mm的碾压间隙。经过碾压机处理后葡萄籽成扁平形状，成粒性好，种皮被碾出几道裂缝，清晰可见胚乳渗出。经过碾压后的葡萄籽在黑曲霉发酵过程中，渗出的胚乳可提供充足的营养利于黑曲霉的生长。且碾压后的葡萄籽成粒性较好，有利于黑曲霉生长过程中的氧气供应，有利于生长过程中酶的产生。

所述葡萄籽发酵所采用的菌种为黑曲霉(Aspergillus niger)，可采用市售高产纤维素酶和果胶酶的黑曲霉菌株。发酵条件为温度24～28℃，湿度80～90％，发酵时间36～60h，期间每隔8h进行翻拌一次。黑曲霉在生长的过程中，其在菌丝顶端不断分泌相应的酶类，如纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、脂肪酶等，其中纤维素酶和果胶酶可降解葡萄籽种皮中的纤维素和果胶，从而利于种皮中包裹的原花青素在提取中释放出来。蛋白酶和脂肪酶可分解胚乳中的蛋白质和脂肪，其分解产物既有利于自身的生长，同时还可降低提取过程中葡萄籽油的含量。在研究中发现，合适的温度、湿度及环境中存在的营养物质，对酶及酶的产量有关。研究发现黑曲霉发酵能使葡萄籽中可提取的总酚含量增加，其产生的酶系可降解葡萄籽种皮中的结合态多酚，控制好发酵时间，即可使提取物中的低聚原花青素含量增高。

所述三级四罐式逆流提取方式，提取溶剂为pH为4.5～5.5(乙酸调pH)的体积分数为80～85％乙醇溶液；和/或提取温度为70～75℃；和/或每罐的提取时间为10～20min。按照上述方式循环进行提取，合并上述存储的提取液，离心或过滤除去絮状沉淀，获得无沉淀液提取液。将无沉淀提取液进行减压蒸馏(蒸馏条件为:60～80℃，真空度为0.06～0.08MPa)，回收乙醇，获得原花青素水溶液，将原花青素水溶液进行喷雾干燥，获得原花青素粗提取物。研究发现，采用相对低pH的提取溶剂可增加提取物中原花青素的含量，也有利于高聚原花青素的降解，从而增加提取物中的低聚原花青素的含量。采用三级四罐逆流提取方式提取，可使单元物料与溶剂之间均保持了较大的有效成分浓度差，固液相之间浓度梯度大，大大增加了提取推动力。将多个提取罐按浓度梯度合理组合，以达到循环利用溶媒的目的，降低了溶剂对物料的绝对用量，无论是单位物料的溶剂用量还是单位溶剂提取的物料，均大幅度增加。

所述原花青素的分级为将原花青素粗产品配制成浓度为1.5～2.5％水溶液，微波促溶(一般5min)，过滤除去不溶性杂质。对所得的原花青素溶液进行AB-8型大孔树脂进行吸附，然后用3～5倍柱体积的体积分数为25～30％的乙醇(即低浓度解吸液)进行解吸，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液组分1。再用2～4倍柱体积的体积分数为60～65％的乙醇(即高浓度解吸液)作为洗脱剂进行解吸，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液组分2。在洗脱液解吸的过程中，低浓度的乙醇洗脱液中含有的物质多为儿茶素、表儿茶素等单体和原花青素二、三、四聚体；高浓度乙醇洗脱液解吸的主要是高聚原花青素。原花青素分级的目的是将低聚原花青素及单体和高聚原花青素分离开来，以便在后续高聚原花青素酸解过程中，可防止低聚原花青素的降解，从而影响产品中的低聚原花青素含量。

所述原花青素酸解是向原花青素水溶液组分2中加入体积分数为5～15％的混合酸(其是由6％亚硫酸溶液和99.5％冰乙酸按体积比(0.5～1):(1～2)组成，优选按体积比(0.5～0.8):(1～1.5)组成)，在70～75℃条件下保温60～120min，获得酸解液。再用NaOH溶液将酸解液的pH调至6.0左右，并将此酸解后的原花青素水溶液2与原花青素水溶液组分1混合，降温至4℃左右，低温滤去不溶物，并将滤液进行喷雾干燥，喷雾干燥机设置进口温度为120℃，出口温度80℃，获得原花青素提取物。

本发明通过原花青素分级，先将高聚原花青素分离出来单独进行酸解，在低浓度乙醇和混合酸的作用下，高聚原花青素降解为低聚原花青素。研究还发现若混合酸中增加亚硫酸的含量，则会造成提取物中单体含量高；若降低其含量，在相同酸解条件下，高聚原花青素降解较少。调pH及降温后会使部分杂质沉淀出来，溶液中存留的低聚原花青素含量升高。

本发明所用原料均可市售购得，或按本领域常规方法制备。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。

较佳地，上述葡萄籽原花青素的提取方法，包括以下步骤：

1)葡萄籽的预处理：选取无霉变的葡萄籽，洗净，晾干，碾压；所述碾压间隙为0.5～1.0mm；

2)葡萄籽进行发酵处理：将预处理后的葡萄籽接种黑曲霉菌，进行固体发酵；发酵条件为温度24～28℃，湿度80～90％，发酵36～60h，期间每隔8h进行翻拌一次；

3)原花青素粗品的制备：以pH为4.5～5.5的80～85％乙醇溶液为提取溶剂，将发酵后的葡萄籽采用三级四罐式逆流提取方式进行提取，合并提取液进行减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液，喷雾干燥，获得原花青素粗品；所述提取温度为70～75℃；每罐的提取时间为10～20min；

4)原花青素分级：将原花青素粗品配成浓度为1.5～2.5％的水溶液，过滤除去不溶性杂质后，进行AB-8型大孔树脂吸附，先用低浓度解吸液洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液组分1；再采用高浓度解吸液洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液组分2；所述低浓度解吸液为体积分数为25～30％的乙醇；所述高浓度解吸液为体积分数为60～65％的乙醇；

所述低浓度解吸液的洗脱量为3～5倍的柱体积；所述高浓度解吸液的洗脱量为2～4倍的柱体积；

5)原花青素的制备：向原花青素水溶液组分2中加入混合酸，进行酸解，获得酸解液；调整该酸解液pH，将其与所述原花青素水溶液组分1混合，将混合物降温至4～6℃，并在此温度下静置30min，低温滤去不溶物，喷雾干燥；获得原花青素提取物；所述混合酸由6％亚硫酸溶液和99.5％冰乙酸按体积比(0.5～1):(1～2)组成；所述酸解包括向原花青素水溶液组分2中加入体积分数为5～15％的所述混合酸，在70～75℃条件下保温60～120min，获得酸解液。

本发明还包括上述方法所制备的原花青素提取物。

本发明中所制备的原花青素提取物中原花青素含量≥98％，原花青素平均聚合度在2.5～3.0之间，单体含量10～15％，且在水、1％的乙醇、1％的甲醇、1％异丙醇溶液中的不溶物和≤3.0％；产品外观为淡红棕色粉末，无异臭，200mL温开水中加入0.2g样品，入口有麻涩感。

本发明还包括上述原花青素提取物在制备抗氧化和/或治疗糖尿病及其并发症药物、食品、保健食品中的应用。

综上所述，与现有技术相比，本发明原花青素的提取方法具有如下优点:

1.本发明所述的葡萄籽原花青素的提取方法，其中采用黑曲霉发酵产生的纤维素酶、果胶酶等酶类降解葡萄籽种皮以利于原花青素的溶出，与现有技术相比其成本投入底。

2.本发明采用不同体积分数的乙醇作为解吸液，洗脱大孔吸附树脂树脂将原花青素分级，然后进行酸解可防止低聚原花青素降解，以利于增加提取物中原花青素低聚体的含量。

3.本发明所得的提取物中低聚原花青素含量≥98％，其平均聚合度在2.5～3.0之间，在体内易吸收，抗氧化活性强。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1

本实施例提供了一种葡萄籽原花青素的提取方法，包括以下步骤:

1)葡萄籽预处理

选取无霉变的葡萄籽，放入清洗池中，用无菌水清洗3次，沥干或采用干燥的葡萄籽为原料，将干燥的葡萄籽在无菌水中浸泡2h，使其充分吸水，浸泡清洗后沥干。将沥干后的葡萄籽放入滚筒式碾压机中，使葡萄籽碾压通过1.0mm的碾压间隙，经过碾压机处理后葡萄籽成扁平形状，种皮被碾出几道裂缝，清晰可见胚乳渗出。

2)发酵葡萄籽制备

a)菌种活化:将黑曲霉菌种接种于经过无菌验证的含有土豆培养基的试管斜面或平板中，然后将接种后的斜面或平板在25～30℃条件下培养72h，获得活化黑曲霉菌种。

b)菌种一级扩培:取500mL的锥形瓶，每瓶加入预处理后的葡萄籽40g和面粉2g，以此作为培养基；将培养基进行湿热灭菌，灭菌条件为温度为121℃，时间为15min；当培养基温度降到25℃左右时，移至超净工作台中，接入活化后的菌种，在25～30℃恒温箱中培养72h，期间每12h摇动锥形瓶一次。制得一级扩培菌种。

c)菌种二级扩培:取碾压后的葡萄籽10kg，进行湿热灭菌，灭菌条件为温度为121℃，时间为15min，灭菌完成后当葡萄籽的温度降至25℃左右时进行接种，接种量为1％，菌种与发酵基质混匀后，平铺于灭菌过的发酵间进行恒温发酵，保持室内湿度为85％，共保温发酵培养48h，每隔12h进行翻拌一次。制得二级扩培菌种。

d)葡萄籽发酵:将预处理后的葡萄籽与菌种按质量比20:1的比例进行接种，翻拌混匀后平铺于灭菌过的发酵间中进行发酵，在温度为28℃，湿度为90％的条件下，发酵48h，期间每隔8h进行翻拌一次。

3)原花青素提取液制备

采用三级四罐(罐体编号为A、B、C、D)式逆流提取方式，具体操作为，每罐加入发酵后葡萄籽50kg，将pH为5.0(乙酸调pH)的80％乙醇溶液200L加入到A罐中，在温度为75℃条件下搅拌浸提20min，获得浸提液A1，将A1储存。将相同量的溶剂加入到A罐中，在相同条件下搅拌浸提20min，获得浸提液A2；再将浸提液A2抽入到B罐中，在相同的浸提条件下浸提，获得浸提液B1，将B1储存。将相同量的溶剂加入到A罐中，在相同的条件下浸提，浸提完成后，获得浸提液A3和料渣，将料渣从A罐中清除，并向A罐中再加入50kg发酵葡萄籽。再将浸提液A3加入到B罐中，在相同条件下浸提，获得浸提液B2；将B2加入到C罐中获得浸提液C1，将C1储存。将浸提液加入到B罐中浸提，在相同条件下浸提，获得浸提液B3和料渣，清除B罐中的料渣，并向B罐中加入发酵葡萄籽50kg；将滤液B3加入到C罐中在相同条件下浸提，获得浸提液C2；将C2加入到D罐中在相同条件下浸提，获得浸提液D1，将D1储存。将溶剂加入到C罐中在相同条件下浸提，获得浸提液C3和料渣，清除C罐中的料渣，并向C罐中加入发酵葡萄籽50kg；将C3提取液加入到D罐中在相同条件下浸提，获得浸提液D2；将D2加入到A罐中，获得浸提液A1，将A1储存。按照上述方式循环进行提取，合并上述存储的提取液，离心(过滤)除去絮状沉淀，获得无沉淀液提取液。

4)原花青素粗提物

将无沉淀提取液进行减压蒸馏，条件为:60～80℃，真空度为0.06～0.08MPa，在此条件下蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液，将原花青素水溶液进行喷雾干燥，获得原花青素粗提取物。

5)原花青素精制

将AB-8大孔树脂分别用乙醇浸泡24h，用乙醇冲洗至流出液与蒸馏水混合无混浊现象，再用蒸馏水冲洗至流出液无乙醇味。将预处理后的吸附树脂进行装柱(层析柱径高比1:30)，要求树脂均匀分散且无气泡。称取原花青素粗产品配制成浓度为2.5％水溶液，过滤除去不溶性杂质，对原花青素溶液进行过柱。用3倍柱体积为30％(体积分数)的乙醇溶液进行解吸，收集洗脱液减压蒸馏，获得原花青素水溶液标记为提取组分1。再用3倍柱体积60％(体积分数)的乙醇溶液作为洗脱剂进行解吸，收集洗脱液，减压蒸馏回收乙醇，获得原花青素将水溶液标记为提取组分2。

6)低聚原花青素制备

取原花青素水溶液提取组分2加入体积分数为10％的混合酸(由6％亚硫酸溶液和99.5％冰乙酸体积比0.8:1组成)，在70℃条件下保温60min。用NaOH溶液调pH为6.0，并将原花青素水溶液与提取组分1进行混合，降温到4℃左右，低温滤去不溶物，混合后进行喷雾干燥，干燥条件进口温度为120℃，出口温度80℃获得原花青素提取物。

此实施例制备提取物中，原花青素含量≥98.2％，原花青素平均聚合度为2.82，单体含量12.3％，且在水、1％的乙醇、1％的甲醇、1％异丙醇溶液中的不溶物和为2.7％。

实施例2

本实施例提供了一种葡萄籽原花青素的提取方法，包括以下步骤:

其中步骤1)-步骤2)与实施例1相同。

3)原花青素提取液制备

采用三级四罐(罐体编号为A、B、C、D)式逆流提取方式，具体操作为，每罐加入发酵后葡萄籽60kg，将pH为4.5(乙酸调pH)的85％乙醇溶液200L加入到A罐中，在温度为75℃条件下搅拌浸提20min，获得浸提液A1，将A1储存。将相同量的溶剂加入到A罐中，在相同条件下搅拌浸提15min，获得浸提液A2；再将浸提液A2抽入到B罐中，在相同的浸提条件下浸提，获得浸提液B1，将B1储存。将相同量的溶剂加入到A罐中，在相同的条件下浸提，浸提完成后，获得浸提液A3和料渣，将料渣从A罐中清除，并向A罐中再加入60kg发酵葡萄籽。再将浸提液A3加入到B罐中，在相同条件下浸提，获得浸提液B2；将B2加入到C罐中获得浸提液C1，将C1储存。将浸提液加入到B罐中浸提，在相同条件下浸提，获得浸提液B3和料渣，清除B罐中的料渣，并向B罐中加入发酵葡萄籽60kg；将滤液B3加入到C罐中在相同条件下浸提，获得浸提液C2；将C2加入到D罐中在相同条件下浸提，获得浸提液D1，将D1储存。将溶剂加入到C罐中在相同条件下浸提，获得浸提液C3和料渣，清除C罐中的料渣，并向C罐中加入发酵葡萄籽60kg；将C3提取液加入到D罐中在相同条件下浸提，获得浸提液D2；将D2加入到A罐中，获得浸提液A1，将A1储存。按照上述方式循环进行提取，合并上述存储的提取液，离心(过滤)除去絮状沉淀，获得无沉淀液提取液。

步骤4)-步骤6)与实施例1相同。

此实施例制备的提取物中，原花青素含量≥98.4％，原花青素平均聚合度为2.78，单体含量13.5％，且在水、1％的乙醇、1％的甲醇、1％异丙醇溶液中的不溶物和为2.9％。

实施例3

本实施例提供了一种葡萄籽原花青素的提取方法，包括以下步骤:

其中步骤1)-步骤4)与实施例1相同。

5)原花青素精制

将AB-8大孔树脂分别用乙醇浸泡24h，用乙醇冲洗至流出液与蒸馏水混合无混浊现象，再用蒸馏水冲洗至流出液无乙醇味。将预处理后的吸附树脂进行装柱(层析柱径高比1:30)，要求树脂均匀分散且无气泡。称取原花青素粗产品配制成浓度为1.5％水溶液，过滤除去不溶性杂质，对原花青素溶液进行过柱。用4倍柱体积25％(体积分数)的乙醇溶液进行解吸，收集洗脱液减压蒸馏，获得原花青素水溶液标记为提取组分1。再用2倍柱体积60％(体积分数)乙醇溶液作为洗脱剂进行解吸，收集洗脱液，减压蒸馏回收乙醇，获得原花青素将水溶液标记为提取组分2。

6)低聚原花青素制备

取原花青素水溶液提取组分2加入体积分数为10％的混合酸(由6％亚硫酸溶液和99.5％冰乙酸体积比0.5:1.5组成)，在70℃条件下保温80min。用NaOH溶液调pH为6.0，并将原花青素水溶液与提取组分1进行混合，降温到4℃左右，低温滤去不溶物，混合后进行喷雾，干燥，干燥条件进口温度为120℃，出口温度80℃获得原花青素提取物。

此实施例制备的提取物中，原花青素含量≥98.1％，原花青素平均聚合度为2.96，单体含量10.2％，且在水、1％的乙醇、1％的甲醇、1％异丙醇溶液中的不溶物和为2.5％。

对比例1

本对比例中所述的葡萄籽原花青素的提取方法，包括如下步骤:

1)将原花青素粗提物(即实施例1步骤4)所制备的原花青素粗提物)1重量份，用7重量份的0℃冷水复溶，得到原花青素悬浊液；

2)使用定性滤纸对原花青素悬浊液进行常压过滤，分别收集滤饼和滤液；

3)用15％的乙醇水溶液溶解滤饼，加入10倍体积的6％的亚硫酸氢钠溶液，在80℃水浴搅拌反应1.5h，旋转蒸发浓缩反应液直至反应液的原体积的70％，合并浓缩后的反应液与滤液；

4)将合并后的溶液用截留分子量为900道尔顿的纳滤膜(安得膜分离技术工程(北京)有限公司，NF-1812)纳滤，操作压力为2bar，并循环浓缩至截留液的体积为合并后的溶液体积的50％；

5)将所收集的截留液在进口温度120℃、出口温度80℃条件下进行喷雾干燥，即制得低聚原花青素。

此对比例制备的提取物中，原花青素含量≥96.2％，原花青素平均聚合度为3.20，单体含量4.7％，且在水、1％的乙醇、1％的甲醇、1％异丙醇溶液中的不溶物和为2.6％。

对比例2

本对比例中所述的葡萄籽提取物粗品的制备方法，包括如下步骤:

1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量35％的水和0.1％的酵母，室温下密封发酵6天，真空干燥至含水率≤6％，得到预处理葡萄籽粉；

2)称取粉碎后的上述葡萄籽粉，加入质量体积比为1:10的体积分数为99.5％的石油醚，在提取温度为60℃的条件下提取15min，活得葡萄籽提取液和滤渣。

3)将上述滤渣以体积分数为70％的乙醇溶剂进行提取，料液比为1:4，提取温度为75℃，连续提取三次，合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，制得原花青素溶液。

4)将上述原花青素溶液进行喷雾干燥，干燥条件进口温度为120℃，出口温度80℃获得原花青素粗品。

此实施例制备的提取物中，原花青素含量≥53.6％，原花青素平均聚合度为6.52，单体含量10.3％，且在水、1％的乙醇、1％的甲醇、1％异丙醇溶液中的不溶物和为10.4％。

对比例3

本对比例中所述的葡萄籽提取物粗品的制备方法，包括如下步骤:

1)将葡萄籽粉碎，过100目筛；

2)将上述粉碎后的葡萄籽以体积分数为70％的乙醇溶剂进行提取，料液比为1:4，提取温度为75℃，连续提取三次，合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，制得原花青素溶液。

3)将上述原花青素溶液进行喷雾干燥，干燥条件进口温度为130℃，出口温度80℃获得原花青素粗品。

此实施例制备的提取物中，原花青素含量≥52.0％，原花青素平均聚合度为6.52，单体含量10.3％，且在水、1％的乙醇、1％的甲醇、1％异丙醇溶液中的不溶物和为11.4％。

实施例1-3及对比例1-3中葡萄籽提取物的质量指标，如表1所示，产品的溶解性检测如表2所示。

表1各实施例及对比例产品的质量检测指标

注:1.提取率％＝提取物粗品质量/发酵葡萄籽质量×100％；2.纯度以多酚含量计；3.回收率％＝原花青素提取物质量/提取物粗品质量。

由表1结果可知，实施例1-3与对比例1相比，其回收率明显提高，且产品的平均聚合度相对较小。实施例1-3与对比例2、3相比，其提取物粗品的提取率和纯度较对比例2、3高，说明黑曲霉发酵明显提升了原花青素的溶出率。

表2产品中不溶物含量的检测

项目	实施例1	实施例2	实施例3	对比例1	对比例2	对比例3
							水(％)	0.4	0.4	0.4	0.4	2.4	2.6
1％乙醇(％)	0.6	0.7	0.6	0.5	2.3	2.2
							1％甲醇(％)	0.5	0.5	0.4	0.5	1.6	1.7
1％异丙醇(％)	1.2	1.3	1.1	1.2	4.1	4.9

从表2结果可以看出实施例1-3和对比例1各溶剂中不溶物之和≤3％，对比例2和3的各溶剂不溶物之和≥10％。这些不溶物都是人体不可利用的高聚物或杂质，其含量越低越好。

其中表1、2的参数测定方法如下：

1.葡萄籽提取物粗品中多酚物质含量的测定

材料:实施例1-3提取物，对比例1-3提取物，没食子酸标准品。

方法:准确称取真空干燥至恒重的没食子酸标准品44.3g，用水溶解并定容到100mL。以此溶液配成浓度为8.86、17.72、35.44、53.16、70.88、88.60μg/mL的溶液。分别取上述不同浓度溶液1mL加到10mL比色管中，然后依次加入1mL去离子水，0.5mL Folin-Ciocalteau试剂，1.5mL 26.7％碳酸钠溶液，最后定容到10mL，室温下反应2小时，在760nm下测定其吸光度。由吸光度对浓度进行回归，求得标准曲线。

准确称取适量的葡萄籽提取物，用水溶解，浓度在0.08mg/mL左右。取1mL样品液加入到10mL比色管中，然后依次加入1mL去离子水，0.5mL Folin-Ciocalteau试剂，1.5mL26.7％碳酸钠溶液，最后用定容到10mL，室温下反应2小时，在760nm下测定其吸光度。测得的吸光度代入上述绘制的标准曲线，求得葡萄籽提取物中总多酚的含量。

2.原花青素含量的测定方法

材料:实施例1-3提取物，对比例1-3提取物，儿茶素标准品(99％)。

方法:标准曲线的获得:准确称取5mg儿茶素，用蒸馏水定容到50mL容量瓶中，配制成0.1mg/mL的标准液。从标准液中分别取2、4、6、8、10mL于5个10mL容量瓶中，定容，获得浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL的标准溶液。将2.5mL质量分数4％的香草醛甲醇溶液和2.5mL体积分数30％的浓硫酸甲醇溶液加入到10mL外表包有锡箔的试管中，再分别加入0.5mL儿茶素标准溶液，加盖摇匀，30℃水浴避光反应15min，以甲醇作为空白对照，在500nm处测定吸光度。绘制标准曲线，获得线性回归方程。

称取5mg样品，用蒸馏水定容到50mL容量瓶中，配制成0.1mg/mL的样品溶液。将2.5mL质量分数4％的香草醛甲醇溶液和2.5mL体积分数30％的浓硫酸甲醇溶液加入到10mL外表包有锡箔的试管中，再分别加入0.5mL样品溶液，加盖摇匀，30℃水浴避光反应15min，以甲醇作为空白对照，在500nm处测定吸光度。将其代入标准曲线即可计算出原花青素产品的含量，进而计算原花青素含量。3.原花青素产品聚合度的测定方法

测定所述原花青素产品的聚合度时，采用的方法为改良香草醛法，该方法所使用的试剂与仪器及测试步骤如下:

材料:实施例1-3提取物，对比例1-3提取物，儿茶素标准品(99％)。

方法:标准曲线的获得，称取5mg儿茶素标品，用乙酸定容到50mL容量瓶中，制成物质的量浓度为0.032μmol/mL的标准液。从标准液中分别移取1、2、3、4、5、6mL于6个10mL容量瓶中，用乙酸定容，获得物质的量浓度为0.0032、0.0064、0.0096、0.0128、0.016、0.0192μmol/mL标准溶液，分别移取1mL上述标准溶液，添加到装有4％盐酸和1％香草醛的冰乙酸溶液5mL的10mL外表包有锡箔的试管中，加盖摇匀，20℃反应10min，以乙酸作为空白对照，在500nm处测定吸光度。按照上述比色条件，测定吸光度并绘制标准曲线。

称取10mg原花青素产品，加入至4～6mL甲醇中，用乙酸定容到100mL容量瓶中，超声10min促溶，配成物质的量浓度为0.025～0.25μmol/mL的样品溶液。

物质的量浓度计算，移取配好的样品溶液1mL按照上述比色条件，测定样品溶液的吸光度，将其代入标准曲线并计算得到原花青素产品的物质的量浓度，然后结合测定方法2得到的原花青素产品的含量，经计算可得出产物的分子量，进而可以得到原花青素产品的聚合度。

4.提取物中单体含量测定

材料:实施例1-3提取物，对比例1-3提取物，儿茶素标准品(99％)。

方法:精密称取在80℃条件下干燥恒重的儿茶素、表儿茶素、没食子酸和表儿茶素没食子酸酯对照品适量，用甲醇分别配制标准溶液，浓度在10～100μg/mL之间。分别精密取10μL注入色谱仪。色谱条件为:色谱柱:Inertsil HPLC色谱柱RP C18(250×4.6mm)，检测波长:280nm，流速:1.0mL/min，色谱进样体积:10μL。流动相A:1％乙酸，B:100％乙腈，洗脱梯度为0～5min内B相到10％，5～10min，B相由10％到17％；10min到17min B相由17％到35％，25～39min，B相为35％，39～45min B相由35％到50％，35～55min，B相由50％到10％，57min程序停止。以峰面积积分值对单体的进样浓度进行回归，求得标准曲线。

准确称取适量的葡萄籽提取物，用甲醇溶解，配置成1mg/mL的原花青素溶液。进样前，用0.22μm膜过滤样品，进样体积为10μL，按照以上色谱条件进行检测样品并计算各单体峰面积积分值，并利用上述标准曲线求得各单体含量，各单体含量的加和为产品单体含量。

5.产品的溶解性检查

聚合度低的原花青素在水、甲醇、乙醇、异丙醇中是完全溶解的，所以高品质的葡萄籽提取物在以上溶剂的1％溶液中不溶物之和应越少越好。

材料:实施例1-3提取物，对比例1-3提取物。

方法：将材料在80℃条件下干燥恒重，准确称取1.0g，加溶剂(水、1％乙醇溶液、1％甲醇溶液、1％异丙醇溶液)100mL溶解，水温控制在20～25℃，溶解后用4号恒重后的垂熔漏斗滤过，在105℃条件下恒重后称重，计算其不溶物。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种葡萄籽原花青素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)葡萄籽的预处理：选取无霉变的葡萄籽，洗净，晾干，碾压；

2)葡萄籽进行发酵处理：将预处理后的葡萄籽接种黑曲霉菌，进行固体发酵；

3)原花青素粗品的制备：以乙醇为提取溶剂，将发酵后的葡萄籽采用三级四罐式逆流提取方式进行提取，合并提取液进行减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液，喷雾干燥，获得原花青素粗品；

4)原花青素分级：将原花青素粗品配成一定浓度的水溶液进行大孔树脂吸附，先用低浓度解吸液洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液组分1；再采用高浓度解吸液洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液组分2；所述低浓度解吸液为体积分数为25～30％的乙醇；所述高浓度解吸液为体积分数为60～65％的乙醇；

5)原花青素的制备：向原花青素水溶液组分2中加入混合酸，进行酸解，获得酸解液；调整该酸解液pH，将其与所述原花青素水溶液组分1混合，滤去不溶物，喷雾干燥；获得原花青素提取物；所述混合酸由6％亚硫酸溶液和99.5％冰乙酸按体积比(0.5～1):(1～2)组成。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤4)中采用AB-8型大孔树脂；

优选地，所述低浓度解吸液的洗脱量为3～5倍的柱体积；和/或，所述高浓度解吸液的洗脱量为2～4倍的柱体积。

3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步骤5)所述酸解包括向原花青素水溶液组分2中加入体积分数为5～15％的所述混合酸，在70～75℃条件下保温60～120min，获得酸解液；

优选地，所述混合酸是由6％亚硫酸溶液和99.5％冰乙酸按体积比(0.5～0.8):(1～1.5)组成。

4.根据权利要求1-3任一项所述的提取方法，其特征在于，步骤3)中所述提取溶剂为pH为4.5～5.5的80～85％乙醇溶液；和/或所述提取温度为70～75℃；和/或每罐的提取时间为10～20min。

5.根据权利要求1-4任一项所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中葡萄籽碾压为将沥干后的葡萄籽放入滚筒式碾压机中，使葡萄籽碾压通过0.5～1.0mm的碾压间隙。

6.根据权利要求1-5任一项所述的提取方法，其特征在于，步骤2)中发酵条件为温度24～28℃，湿度80～90％，发酵36～60h，期间每隔8h进行翻拌一次。

7.根据权利要求1-6任一项所述的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)葡萄籽的预处理：选取无霉变的葡萄籽，洗净，晾干，碾压；所述碾压间隙为0.5～1.0mm；

2)葡萄籽进行发酵处理：将预处理后的葡萄籽接种黑曲霉菌，进行固体发酵；发酵条件为温度24～28℃，湿度80～90％，发酵36～60h，期间每隔8h进行翻拌一次；

3)原花青素粗品的制备：以pH为4.5～5.5的80～85％乙醇溶液为提取溶剂，将发酵后的葡萄籽采用三级四罐式逆流提取方式进行提取，合并提取液进行减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液，喷雾干燥，获得原花青素粗品；所述提取温度为70～75℃；每罐的提取时间为10～20min；

4)原花青素分级：将原花青素粗品配成浓度为1.5～2.5％的水溶液，过滤除去不溶性杂质后，进行AB-8型大孔树脂吸附，先用低浓度解吸液洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液组分1；再采用高浓度解吸液洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液组分2；所述低浓度解吸液为体积分数为25～30％的乙醇；所述高浓度解吸液为体积分数为60～65％的乙醇；

所述低浓度解吸液的洗脱量为3～5倍的柱体积；所述高浓度解吸液的洗脱量为2～4倍的柱体积；

5)原花青素的制备：向原花青素水溶液组分2中加入混合酸，进行酸解，获得酸解液；调整该酸解液pH，将其与所述原花青素水溶液组分1混合，将混合液进行降温，低温滤去不溶物，喷雾干燥；获得原花青素提取物；所述混合酸由6％亚硫酸溶液和99.5％冰乙酸按体积比(0.5～1):(1～2)组成；所述酸解包括向原花青素水溶液组分2中加入体积分数为5～15％的所述混合酸，在70～75℃条件下保温60～120min，获得酸解液。

8.权利要求1-7任一项所述提取方法制备的原花青素提取物。

9.一种原花青素提取物，其中原花青素含量≥98％，原花青素平均聚合度在2.5～3.0之间，单体含量10～15％，且在水、1％的乙醇、1％的甲醇、1％异丙醇溶液中的不溶物和≤3.0％。

10.权利要求8或9所述原花青素提取物在制备药物、食品、保健食品中的应用。