CN106478579B - 一种从新鲜紫苏茎叶中提取的原花青素及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种从新鲜紫苏茎叶中提取的原花青素及其应用，所述原花青素提取方法为：将预处理后的紫苏茎叶加入体积浓度45‑65％的乙醇水溶液中研磨成浆液，再经微波和超声波联合提取，分离纯化，获得原花青素。本发明涉及一种采用微波萃取联合超声波辅助快速提取紫苏茎叶中的低聚原花青素工艺，利用该方法可从紫苏茎叶中快速、简单地提取得到含量大于76％，提取率可达9.5％的低聚原花青素制品。提取得到的低聚原花青素制品可应用在缓解或保护PM2.5呼吸暴露导致的肺上皮细胞氧化应激损伤过程中。

Description

一种从新鲜紫苏茎叶中提取的原花青素及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种花青素的提取，特别涉及一种采用微波萃取联合超声波辅助快速提取紫苏茎叶中的低聚原花青素方法。
(二)背景技术
原花青素是一种黄烷醇单体及其聚合物的多醇类化合物，广泛存在于植物界中。它是由不同数量的儿茶素、表儿茶素、棓儿茶素、表棓儿茶素或没食子酸聚合而成。简单的原花青素一般指二聚体，因键合位置和构型不同常形成不同的异构体。原花青素中二聚体是最重要也是在植物中分布最广的。原花青素除二聚体外还有其他多聚体。根据聚合度的大小，把聚合度小于5的称为低聚体，大于或等于5的称为高聚体。通常根据低聚原花青素的键合位置将其分为A、B、C、T、D等几种类型，如原花青素B1、B2、A1、C1等。相关研究表明，原花青素具有多种生物学功能，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂，具有如抗氧化、防衰老、抗肿瘤、调节免疫力、预防心血管疾病等活性，还有滋润皮肤、防晒美白功能、治疗眼科疾病、抑菌作用、消除水肿、保护肝脏、防止静脉曲张、改善缺氧等功效，可广泛应用于食品、化妆品等行业，具有广阔的应用前景。
自从20世纪中期，法国科学家就从松树皮提取出含有原花青素的物质以来迄今，全世界对原花青素的研究日益广泛，目前已有对葡萄籽、苹果、山楂、可可豆、蔓越橘、海岸松等几十种植物原花青素含量、分布和组成进行了研究，认为原花青素大部分存在于植物的核、皮、茎、叶和种子中。紫苏，学名：Perilla frutescens(L.)Britt.，别名：桂荏、白苏、赤苏等，为唇形科一年生草本植物。紫苏植株含各种特有的活性物质及营养成分，经济价值很高，尤其茎叶中高含原花青素更是倍受世界学术界关注。
从植物植株茎叶中提取原花青素的方法有直接浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法以及超临界流体提取法等。以上方法一般都是将植物茎叶进行干燥、粉碎、过筛，脱脂得到粉末，再将粉末经提取、过滤、浓缩，再溶解最后固相萃取得到精制原花青素。以上方法过程繁琐，提取周期长，原花青素不稳定容易遭到破坏，尤其干燥和粉碎过程极其容易破坏原花青素的组成。本发明提出直接从新鲜的紫苏茎叶中，采用微波萃取联合超声波辅助湿法快速提取低聚原花青素的工艺，并利用紫外分光光度法对其进行检测，具有选择性好、提取效率高、工艺简单、提取时间短等优点。
迄今尚没有从新鲜紫苏茎叶中采用微波萃取联合超声波辅助快速提取低聚原花青素工艺的报道。
(三)发明内容
本发明涉及一种采用微波萃取联合超声波辅助快速提取紫苏茎叶中的低聚原花青素的方法及其应用，具有选择性好、提取效率高、工艺简单、提取时间短等优点。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种从新鲜紫苏茎叶中提取的原花青素，所述原花青素提取方法为：(1)采集新鲜紫苏茎叶，清洗，晾干，获得预处理后的紫苏茎叶；将预处理后的紫苏茎叶加入体积浓度45-65％的乙醇水溶液中研磨成浆液，过滤，取滤液，获得初提液；(2)将初提液在微波功率280-320W条件下提取30-40s，获得微波提取液，减压浓缩至原体积的1/2，获得微波浓缩液；(3)将微波浓缩液进行超声波提取，超声波功率420-460W，提取温度50-60℃，提取时间30-50min，获得超声提取液，离心，取上清液减压浓缩至干，即获得原花青素粗品，将原花青素粗品用体积浓度5％的乙醇水溶液溶解，采用NKA-II型大孔吸附树脂进行吸附，以体积浓度60％的乙醇水溶液进行洗脱，收集流出液，浓缩至干，获得原花青素。
进一步，步骤(1)所述乙醇水溶液体积用量以预处理后紫苏茎叶质量计为0.5-3ml/g，优选3ml/g。
进一步，步骤(2)所述提取是在微波功率320W条件下提取40s。
进一步，步骤(3)所述提取条件为超声波功率460W，提取温度60℃，提取时间30min。
本发明提取工艺流程：优质紫苏茎叶→研磨、捣汁→过滤→浓浆→微波萃取→蒸发浓缩→超声波提取→真空浓缩→粗产品→洗脱→真空浓缩→干燥→精产品。精制原花青素可通过紫外分光光度法进行检测。
本发明还提供一种所述从新鲜紫苏茎叶中提取的原花青素在制备肺上皮细胞氧化应激损伤保护剂中的应用，即在PM2.5致肺上皮细胞氧化应激损伤过程中起着保护性作用。
本发明的有益效果主要体现在：本发明涉及一种采用微波萃取联合超声波辅助快速提取紫苏茎叶中的低聚原花青素工艺，利用该方法可从紫苏茎叶中快速、简单地提取得到含量大于76％，提取率可达9.5％的低聚原花青素制品，二聚体的分子量检测图见图7。提取得到的低聚原花青素制品可应用在缓解或保护PM2.5呼吸暴露导致的肺上皮细胞氧化应激损伤过程中。
(四)附图说明
图1为紫苏茎叶中快速提取的低聚原花青素制品；
图2为儿茶素标准曲线；
图3为NKA-II型大孔吸附树脂洗脱曲线；
图4为原花青素粗产品红外光谱图；
图5为原花青素粗产品洗脱精制后的红外光谱图；
图6为MTT法检测紫苏原花青素提取物能提高H2O2损伤的A549细胞的存活率图；
图7为原花青素与蛇毒磷脂酶A2连接反应后的SDS-PAGE图，1.Marker；2.纯蛇毒蛋白PLA2；3，4，5为原花青素与PLA2反应物。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：微波萃取联合超声波辅助快速提取紫苏茎叶中的低聚原花青素
(1)采摘生长正常植株的无病损、无干枯优质紫苏茎叶，清水洗干净，晾干，获得预处理后的新鲜紫苏茎叶；称取500克新鲜紫苏茎叶，加入1.5L体积浓度为65％的乙醇水溶液(v/v)，于普通研磨粉碎机(九阳牌JYZ-D51)中连续研磨2分钟，取出浓浆，纱布挤压过滤，得初提液。取初提液经12000rpm离心15min，吸取1.0mL上清液用体积浓度0.5％甲醇水溶液稀释3倍体积后，按实施例2方法采用香草醛-盐酸比色法方法计算原花青素含量44％和提取率3.5％。
(2)微波萃取
将步骤(1)中的初提液用格兰仕微波炉，在微波功率320W条件下提取40s，获得微波提取液。取微波提取液，10000rmp离心15min，吸取上清液，采用香草醛-盐酸比色法测定原花青素含量69％和提取率6.3％。
(3)蒸发浓缩
采用旋转蒸发仪将步骤(2)微波提取液旋转蒸发浓缩至原体积1/2，获得微波提取浓缩液。
(4)超声波提取
将步骤(3)微波提取浓缩液采用KQ-600DE型数控超声波清洗器进行超声辅助提取，超声波功率460W，提取温度60℃，提取时间30min，获得超声提取液；取出，10000rmp离心15min，上清液加入3倍体积体积浓度0.5％甲醇水溶液配制成溶液，然后用乙酸乙酯进行萃取，比例为1:3.5(原花青素：乙酸乙酯溶剂)，提取液经真空浓缩至干燥，获得低聚原花青素提取物粗品，香草醛-盐酸比色法测定原花青素含量。测定结果：原花青素质量含量大于76％，提取率可达9.5％(图1)。
现有方法首先是将紫苏叶进行干燥、粉碎、过筛，脱脂得到紫苏叶粉末，再将紫苏叶粉末按照本实施例经提取、过滤、浓缩，再溶解最后经NKA-II型大孔吸附树脂精制得到的原花青素，利用该方法从紫苏叶中快速、简单的提取得到的低聚原花青素，干燥粉碎后经微波萃取得到的原花青素提取率为4.8％。
表1不同条件对原花青素提取率的影响
实施例2：微波萃取快速提取紫苏茎叶中的低聚原花青素
(1)采摘生长正常植株的无病损、无干枯优质紫苏茎叶，清水洗干净，晾干，获得预处理后的新鲜紫苏茎叶；称取500克新鲜紫苏茎叶，加入1.5L体积浓度为65％的乙醇水溶液(v/v)，于普通研磨粉碎机(九阳牌JYZ-D51)中连续研磨2分钟，取出浓浆，纱布挤压过滤，得初提液。取初提液经12000rpm离心15min，吸取1.0mL上清液用体积浓度0.5％甲醇水溶液稀释3倍体积后，按实施例2方法采用香草醛-盐酸比色法方法计算原花青素含量44％和提取率3.5％。
(2)微波萃取
将步骤(1)中的初提液用格兰仕微波炉，在微波功率260、280、300、320、340W条件下提取40s，获得微波提取液。取微波提取液，10000rmp离心15min，吸取上清液，采用香草醛-盐酸比色法测定原花青素提取率分别为4.2％、4.8％、5.3％、6.3％和5.2％。
实施例3：超声波辅助快速提取紫苏茎叶中的低聚原花青素
(1)采摘生长正常植株的无病损、无干枯优质紫苏茎叶，清水洗干净，晾干，获得预处理后的新鲜紫苏茎叶；称取500克新鲜紫苏茎叶，加入1.5L体积浓度为65％的乙醇水溶液(v/v)，于普通研磨粉碎机(九阳牌JYZ-D51)中连续研磨2分钟，取出浓浆，纱布挤压过滤，得初提液。取初提液经12000rpm离心15min，吸取1.0mL上清液用体积浓度0.5％甲醇水溶液稀释3倍体积后，按实施例2方法采用香草醛-盐酸比色法方法计算原花青素含量44％和提取率3.5％。
(2)超声波辅助提取
将步骤(1)中的提取浓缩液采用KQ-600DE型数控超声波清洗器进行超声辅助提取，在超声波功率340、380、420、460、500W条件下提取40s，获得提取液。取提取液，10000rmp离心15min，吸取上清液，采用香草醛-盐酸比色法测定原花青素提取率分别为4.6％、4.7％、5.4％、5.6％和5.3％。
实施例4：原花青素含量测定
(1)绘制标准曲线
采用香草醛-盐酸比色法，用甲醇将儿茶素标准品配置成浓度为0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.07mg/mL、0.lmg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL标准溶液。量取儿茶素标准溶液1mL后依次加入6mL体积浓度0.5％的香草醛-甲醇溶液、质量浓度36-38％浓盐酸3mL，混合均匀后在水浴锅中恒温(30℃)，避光反应40min，测定500nm处吸光值。空白对照用“甲醇:香草醛-甲醇溶液:浓盐酸＝1:6:3，v/v/v”的混合溶液，横坐标为儿茶素浓度、纵坐标为吸光度，绘制标准曲线(图2)。
(2)原花青素含量测定和提取率的计算
采用香草酸-盐酸比色法测定原花青素的含量，准确移取1mL样品溶液，按照上述标准曲线方法进行测定。根据标准曲线计算出提取液中原花青素的浓度C，再按公式(1)计算原花青素的提取率，公式如下:
提取率＝(V×C×N/W)×100％ (1)
其中N表示提取液的稀释倍数；C表示提取液稀释后原花青素的浓度(mg/mL)；V表示提取液体积(mL)；W表示茎叶的质量(g)。
实施例5：低聚原花青素的精制与光谱分析
(1)选用NKA-II型大孔吸附树脂，对实施例1步骤(4)获得的低聚原花青素提取物粗品10g进行精分离。
树脂预处理：将NKA-II型大孔吸附树脂放置于烧杯中，用无水乙醇浸泡24h，充分溶胀后用无水乙醇冲洗至树脂无白色浑浊时停止冲洗，再用去离子水洗至无醇备用。
取经预处理的树脂2g装柱(15mm×90mm)；
将实施例1步骤(4)获得的低聚原花青素提取物粗品10g用体积浓度0.5％甲醇水溶液100mL溶解，制成样液。取体积浓度0.5％甲醇水溶液100mL上柱(15mm×90mm)，静置30min后，取等量样液缓慢加入NKA树脂柱中，先用去离子水洗脱除去其它成分，再用体积浓度60％乙醇水溶液300mL进行洗脱，收集洗脱液，经真空浓缩至干，获得低聚原花青素2.5g，测定其吸光值(图3)。
(2)分别对实施例1步骤(4)获得的原花青素粗产品和步骤(1)经洗脱精制后低聚原花青素进行红外光谱分析，结果见图4和图5，紫苏茎叶原花青素特征骨架振动主要集中在1000～1800cm–1和800～900cm–1区域，因粗产品与精产品结构单元相似，故其红外光谱图相一致。粗产品和精产品红外光谱曲线清晰一致，故紫苏茎叶中原花青素红外光谱受杂质影响较小。将紫苏茎叶原花青素提取物与5类(A、B、C、D、E)聚原花青素红外光谱进行比较后，发现紫苏茎叶原花青素提取物红外谱图与原花青素A类红外图谱相一致。由此可推断出：紫苏茎叶原花青素提取物中主要成分为原花青素A类物质。
实施例6：紫苏原花青素对氧化应激损伤肺上皮细胞的保护作用
(1)采用H2O2建立体外培养的A549细胞氧化应激损伤模型。具体操作：将A549细胞分为组1(正常对照组)、组2(H2O2氧化损伤组)、组3-组5(H2O2加低聚原花青素低、中、高剂量组)，低聚原花青素低、中、高剂量组为：实施例3制备的低聚原花青素用超纯水溶解，配制成浓度为1mg/mL的母液，-2℃保存，使用时用超纯水稀释成终浓度分别为100、200、400μg/mL的溶液。组1(正常对照组)低聚原花青素为0μg/mL。组2(H2O2氧化损伤组)加入400μmol·L- 1H2O2培养12h，组3-组5给予低聚原花青素溶液100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL预培养24h后加入400μmol·L-1H2O2，然后继续培养12h。
(2)MTT法检测细胞存活率，检测各组细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)活性和检测细胞内丙二醛(MDA)水平；用流式细胞仪检测细胞凋亡及周期改变。
细胞存活率：
将100μL(1×105个/mL)处于对数生长期的A549细胞接种到96孔板中，待细胞生长至融合状态时，弃原培养液，组1(正常对照组)加入100μL无血清DMEM培养基(低聚原花青素为0μg/mL)，组2(H2O2氧化损伤组)加入100μL含400μmol·L-1H2O2无血清DMEM培养基，组3、组4、组5加入50μL含不同浓度低聚原花青素溶液(浓度分别为100、200、400μg/mL)的无血清DMEM培养基培养24h后再加入50μL 400μmol·L-1H2O2，每组设6个复孔，在37℃、含5％CO2和饱和湿度的孵育培养箱中培养24h后用酶标仪于570nm处测定吸光度(A)。A实验组表示各加原花青素组的吸光度，A对照组表示原花青素浓度为0的组的吸光度。按照公式(2)计算细胞存活率。
细胞存活率＝A实验组/A对照组×100％ (2)
将2mL(5×104个/mL)处于对数生长期的A549细胞接种到96孔板中，待细胞生长至融合状态时，按照步骤(1)1的方法进行分组，对各处理组进行药物处理。细胞分为组1(对照组)、组2(H2O2氧化损伤组)、组3(H2O2加低聚原花青素低、中、高剂量组)。在37℃、含5％CO2和饱和湿度的孵育培养箱中培养24h后，用胰酶消化收集细胞，按照试剂盒说明书处理细胞，检测各组细胞内超氧化物歧化酶(SOD)(SOD Assay Kit–WST，上海索来宝)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)(GSH-Px Assay Kit，上海酶联生物科技有限公司)、一氧化氮合酶(NOS)活性(NOS Assay Kit，长春汇力生物科技有限公司)和细胞内丙二醛(MDA)水平(MDA AssayKit，上海信裕生物科技有限公司)。
(3)结果：低聚原花青素能明显提高H2O2损伤的A549细胞的存活率，减少H2O2诱导的细胞凋亡率，恢复血细胞增殖(见图6)；低聚原花青素提高H2O2损伤的A549细胞内SOD、GSH-Px、NOS活性，降低细胞内MDA水平，见表2。结论：低聚原花青素具有较强的抗氧化能力及细胞保护作用，可减轻肺内皮细胞的氧化损伤。
表2低聚原花青素对H2O2损伤A549细胞抗氧化指标的影响(平均值±标准差，n＝3)
注：与对照组比较，*：P＜0.05；**：P＜0.01。

Claims (2)

1.一种源自新鲜紫苏茎叶的原花青素提取物，其特征在于所述原花青素提取物按如下方法制备：(1)采集新鲜紫苏茎叶，清洗，晾干，获得预处理后的紫苏茎叶；将预处理后的紫苏茎叶加入体积浓度45-65％的乙醇水溶液中研磨成浆液，过滤，取滤液，获得初提液；所述乙醇水溶液体积用量以预处理后紫苏茎叶质量计为0.5-3mL/g；(2)将初提液在微波功率320W条件下提取40s，获得微波提取液，减压浓缩至原体积的1/2，获得微波浓缩液；(3)将微波浓缩液进行超声波提取，超声波功率460W，提取温度60℃，提取时间30min，获得超声提取液，离心，取上清液减压浓缩至干，即获得原花青素粗品，将原花青素粗品用体积浓度5％的乙醇水溶液溶解，采用NKA-II型大孔吸附树脂进行吸附，以体积浓度60％的乙醇水溶液进行洗脱，收集流出液，浓缩至干，获得原花青素。
2.一种权利要求1所述源自新鲜紫苏茎叶的原花青素提取物在制备PM2.5致肺上皮细胞氧化应激损伤保护剂中的应用。
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