CN104177460B

CN104177460B - 一种3,5-二糖类花色苷的制备方法

Info

Publication number: CN104177460B
Application number: CN201410341208.XA
Authority: CN
Inventors: 段长青; 张波; 何非; 吴广枫; 李美仪
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: Ningxia Zhihuiyuanshi Wine Chateau Co ltd
Priority date: 2014-07-17
Filing date: 2014-07-17
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2034-07-17
Also published as: CN104177460A

Abstract

本发明涉及天然色素制备技术领域，尤其涉及一种3,5-二糖类花色苷的制备方法。该方法包括超声辅助提取、萃取、纯化的步骤。该方法以超声辅助提取减少了提取剂的使用、缩短提取时间、提高了提取效率。采用凝胶柱与大孔树脂相结合的方法，去除杂质、分离花色苷单体，从而避免了制备或半制备高效液相色谱的使用，简化了操作；并且，凝胶柱和大孔树脂填料可反复使用，能够节约资源。实验证明：本发明提供的方法提取3,5-二糖类花色苷，每g山葡萄皮干粉能够得到7.36mg的3,5-二糖类花色苷，提取效率和纯度皆较高。

Description

一种3,5-二糖类花色苷的制备方法

技术领域

本发明涉及天然色素制备技术领域，尤其涉及一种3,5-二糖类花色苷的制备方法。

背景技术

近年来，随着食品药品安全问题的日益严重，天然色素的开发与应用己成为各行业科技工作者普遍关注的课题。近年来，天然色素在国际市场上的增长率一直都保持在10％以上。天然色素大多来源于天然植物的根、茎、叶、花、果实等，因此，采用这些天然色素更加安全，也更能得到消费者的青睐。花色苷类色素作为天然色素的一大类，因其丰富艳丽的色泽和抗氧化活性，目前在食品、医药等领域已有广泛应用。

花色苷(anthocyanin)是一类羟基和甲基化的2-苯基-苯并吡喃烊离子(花色素，anthocyanidin)与糖分子通过糖苷键结合而成的多酚类化合物。花色素属于类黄酮，是一种酚类物质，因苯环取代基、羟基和甲氧基数量与位置的不同，花色素单体主要包括以下六类：花翠素、甲基花翠素、二甲基花翠素、花青素、甲基花青素、花葵素。这些花色素单体中，花翠素最不稳定，二甲花翠素最为稳定。而根据成苷糖基位置和数量的不同可将主要的花色苷分为四类，分别是3-单糖类花色苷，3-双糖类花色苷，3,5-二糖类花色苷和3,7-二糖类花色苷等。这四种类型的花色苷中，双糖苷类色素因分子中含有双糖分子，其稳定性明显高于相应的单糖类物质。因此，双糖花色苷作为天然色素，在食品药品行业中具有很高的研究价值和应用前景。但是，由于缺乏低成本的制备工艺导致在我国花色苷类作为天然食用色素的生产很少，且价格十分昂贵，很难应用于工业化生产。

花色苷广泛存在于紫甘薯、葡萄、血橙、红球甘蓝、蓝莓、茄子皮、樱桃、红橙、红莓、草莓、桑葚、山楂皮、紫苏、黑(红)米、牵牛花等植物的组织中。其中以葡萄中的含量较为丰富。近年来的研究结果表明，欧亚种葡萄(VitisamurensisL.)中仅含有单糖类花色苷，而山葡萄(VitisamurensisRupr.)中双糖花色苷的含量十分丰富。且山葡萄在我国分布面积广阔，利用山葡萄作为材料提取双糖类花色苷具有良好的应用前景。目前虽然对花色苷的提取方法已有多方报道，但是，将这些现有的方法应用于双糖花色苷的提取却往往存在提取率低、纯度不足等问题，因此，探究双糖类花色苷的提取纯化分离方法具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种3,5-二糖类花色苷的制备方法。该方法提取率高，所得3.5-二糖类花色苷纯度较高；且无需借助制备型或半制备型高效液相色谱，操作简单；该方法所用试剂毒性较低，对环境友好。

本发明提供的3,5-二糖类花色苷的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：以乙醇溶液超声提取山葡萄皮粉，提取液去除乙醇，制得第一提取液；

步骤2：以乙酸乙酯萃取第一提取液，取水层，去除乙酸乙酯制得第二提取液；

步骤3：将第二提取液上样于XAD-7大孔树脂柱，以蒸馏水冲洗后，以乙醇溶液洗脱，获得第一洗脱液，经干燥，制得粗提物；

步骤4：将粗提物以甲醇溶液溶解，过滤后上样于SephadexLH-20凝胶柱，以甲醇溶液洗脱，获得第二洗脱液，经干燥，即得；

其中，乙醇溶液中各组分的体积分数为：乙醇60％，甲酸2％，水38％；

甲醇溶液中各组分的体积分数为：甲醇20％，甲酸2％，水78％；

山葡萄皮粉与乙醇溶液的质量体积比为：1g:10mL；

超声提取的温度为53.5℃，时间为20min，次数为3次。

本发明提供的方法，以超声辅助提取葡萄皮中的的花色苷，利用超声波在溶液中形成气穴效应，使更多溶剂渗透到样品基质，增加固液相之间的接触面积，将溶质尽快的溶解到溶剂，从而减少了提取剂的使用、缩短提取时间、提高了提取效率。

经超声提取的第一提取液中仍含有糖、蛋白以及其他非花色苷酚类物质，本发明通过采用凝胶柱与大孔树脂相结合的方法，去除杂质、分离花色苷单体，从而避免了制备或半制备高效液相色谱的使用，简化了操作；并且，凝胶柱和大孔树脂填料可反复使用，能够节约资源。

本发明所采用的山葡萄皮粉的制备方法为：取山葡萄果实剥离果皮，果皮经液氮速冻、匀浆机磨粉、冻干机24h冷冻干燥，即得。

本发明通过经实验证明：

乙醇溶液中醇的体积分数会影响提取效果，花色苷的提取率随着醇体积分数的增加，花色苷提取量增加，然而当醇体积分数在60％之后时，花色苷含量增加幅度趋于平缓；

山葡萄皮粉与乙醇溶液的质量体积比会影响提取效果：提取率随液料比的增大而增加，当增加到10:1时上升不再增加。

超声提取的温度对提取效果造成影响：对于提取温度的影响，经响应面分析结果表明，提取效率在53.5℃时达最高值。

超声提取的时间对提取效果造成影响：在20min内，随提取时间延长提取量逐渐增加，此后提取量略微下降，可能是由于长时间高温提取，导致花色苷受热分解。

提取次数对提取效果造成影响：随着提取次数的增加，花色苷提取率增加，第三次提取时，花色苷提取率达到98.6％，但再增加提取次数对提取率影响不大。

对XAD-7、XAD-2、NKA-9、AB-80和D151树脂对花色苷的吸附性能和解吸性能进行评价，结果表明，XAD-7具有较高的吸附性能，其次是XAD-2，而NKA-9、AB-80和D151这三种树脂的效果均不理想。利用60％乙醇进行解析，XAD-7，AB-8都具有较高的解吸率，但后者吸附量较低。

溶剂对XAD-7大孔吸附树脂柱的洗脱效果有影响：对乙醇溶液而言，随着乙醇溶液中醇的体积分数的增加，树脂中花色苷解吸率呈上升趋势，且当体积分数达到60％时，达到较大程度的解吸(解吸率为88％)。甲醇溶液的洗脱效果与此相似，本发明采用低毒的乙醇溶液作为洗脱液。

作为优选，超声提取的频率为59kHz，功率为500W。

作为优选，步骤1中去除乙醇具体为：取提取液经离心、真空旋转蒸发。

作为优选，乙酸乙酯与第一提取液的体积比为1:1。

作为优选，步骤2中去除乙酸乙酯为取水层真空旋转蒸发。

作为优选，步骤2中萃取的次数为3次。

作为优选，XAD-7大孔树脂柱的规格为1.6cm×40cm。

作为优选，蒸馏水的量为5倍柱体积。

作为优选，步骤3中干燥具体为：第一洗脱液经旋转蒸发后，真空冷冻干燥24h；其中，旋转蒸发的温度不超过40℃。

作为优选，步骤3具体为：第二提取液上样与XAD-7大孔树脂柱后，保持1h，以5倍柱体积的蒸馏水冲洗后，柱中加入乙醇溶液保持1h后洗脱，获得第一洗脱液，旋转蒸发、真空冷冻24h。

作为优选，SephadexLH-20凝胶柱的规格为1.6cm×60cm。

作为优选，步骤4中洗脱的流速为1滴/秒。

作为优选，步骤4中，溶解于上样之间还包括以0.45μm微孔滤膜过滤的步骤。

作为优选，步骤4中干燥具体为：第二洗脱液经旋转蒸发后，真空冷冻干燥24h；其中，旋转蒸发的温度不超过40℃。

本发明还提供了以本发明提供的制备方法制得的3,5-二糖类花色苷。

作为优选，以本发明提供的制备方法制得的3,5-二糖类花色苷为二甲花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷。

本发明还提供了本发明提供方法制备的3,5-二糖类花色苷在制备食品或药品中的应用。

本发明提供的3,5-二糖类花色苷的制备方法，包括超声辅助提取、萃取、纯化的步骤。以超声辅助提取减少了提取剂的使用、缩短提取时间、提高了提取效率。采用凝胶柱与大孔树脂相结合的方法，去除杂质、分离花色苷单体，从而避免了制备或半制备高效液相色谱的使用，简化了操作；并且，凝胶柱和大孔树脂填料可反复使用，能够节约资源。实验证明：乙醇溶液和甲醇溶液中纯的体积分数、超声提取的温度和时间是影响提取效果的关键因素，改变这些条件中的任一种都会显著降低提取效率。而步骤2～4的纯化过程中，大孔吸附树脂的种类、洗脱条件是提高纯化效果的关键因素。采用本发明提供的方法提取每g山葡萄皮干粉能够得到7.36mg二甲花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷，占所提取花色苷的98.7％，另外，还包括0.324％的花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷和0.841％的甲基花翠素3,5-O-双葡萄糖苷。检测过程未见其他物质峰，表明本发明提供方法提取的3,5-二糖类花色苷纯度接近100％。

附图说明

图1示固定乙醇浓度(60％)，超声处理温度和提取剂体积对花色苷提取效果的影响；

图2示固定超声处理温度(50℃)，乙醇浓度和提取剂体积影响花色苷提取效果的影响；

图3示乙醇浓度和提取剂体积对花色苷含量的交互影响；

图4示HPLC检测结果；其中，图4-a示本发明实施例3制备的粗提物的色谱图；图4-b示本发明实施例4制备的3,5-二糖类花色苷的色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种3,5-二糖类花色苷的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中，山葡萄成熟果实样品2011年取自中国农业大学上庄试验站。

山葡萄皮粉的制备具体为：室温下将果皮剥离且不带果肉，于液氮中速冻，经搅拌器打粉，于-40℃条件下保存。每g新鲜山葡萄果皮约制备0.3g山葡萄皮干粉。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1山葡萄皮中花色苷的超声提取条件筛选

分别研究提取液种类、体积分数、料液比、超声提取条件对山葡萄皮中总花色苷提取量的影响。花色苷含量的定量分析采用高效液相色谱。

1、提取溶剂种类和体积分数对山葡萄皮总花色苷提取量的影响

准确称取0.5g山葡萄皮粉，按液料比10:1(mL/g)加入2％甲酸甲醇溶液或2％甲酸乙醇溶液，50℃超声振荡温度，超声提取20min。提取溶剂体积分数分别为40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。各组实验设三次重复，以花色苷提取量(mg/g，干粉)为考察指标，研究提取溶剂种类和体积分数对山葡萄皮粉中总花色苷提取率的影响，选取最适溶剂种类和体积分数，结果如表1所示：

表1提取试剂种类和体积分数对山葡萄皮总花色苷提取量的影响

注：同列不同字母表示差异显著，差异性水平p<0.05

结果表明，用酸性乙醇和酸性甲醇水溶液提取所得到的花色苷含量相当，这与花色苷中含有多个酚羟基，属水溶性色素，易溶于甲醇、乙醇等极性溶剂有关。随着醇体积分数的增加，花色苷提取量增加，然而当醇体积分数在60％之后时，花色苷含量增加幅度趋于平缓。这点可能与溶液的渗透能力逐渐增加相关，考虑到甲醇作为提取剂时有毒性，不适于提取食用色素，以及由于较高的乙醇体积分数会增加生产成本及后期浓缩效率，因此选择60％酸性乙醇溶液较为理想。

2、甲酸浓度对山葡萄皮总花色苷提取量的影响

固定乙醇溶液体积分数为60％，按液料比10:1(mL/g)的条件下，于50℃条件下提取山葡萄皮粉的总花色苷20min，改变甲酸体积分数为0、2％、4％、6％、8％、10％，各组实验设三次重复，使用pH示差法测得总花色苷的质量浓度，确定最佳提取温度。

表2甲酸浓度对山葡萄皮总花色苷提取量的影响

体积分数

0

2％

4％

6％

8％

10％

花色苷含量(mg/g)

1.69b

1.84a

1.85a

1.87a

1.90a

注：同列不同字母表示差异显著，差异性水平p<0.05

结果表明，甲酸的加入对提取效果有明显的影响，说明溶液的酸化处理也可以提高花色苷的提取率，但在强酸条件下，长时间加热提取，容易发生花色苷的部分水解，因此在本实验中将甲酸体积分数固定为2％。

3、液料比对山葡萄皮总花色苷提取量的影响

取粉碎的山葡萄皮粉0.5g，提取条件为：采用2％甲酸60％体积分数的乙醇溶液进行提取20min，超声振荡温度50℃，乙醇溶液与山葡萄皮粉的体积质量比分别为5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1(mL/g)，各组实验设三次重复，测定总花色苷质量浓度，确定最佳提取溶剂体积。

表3液料比对山葡萄皮总花色苷提取量的影响

体积质量比(mL/g)

5:1

10:1

15:1

20:1

25:1

30:1

花色苷含量(mg/g)

1.30cd

1.96a

1.56ab

1.52ab

0.96cd

0.62d

注：同列不同字母表示差异显著，差异性水平p<0.05

结果表明，提取率随乙醇溶液与山葡萄皮粉的体积质量比的增大而增加，当增加到10:1后不再上升，因此，选择液料比10:1为宜。

4、提取次数对山葡萄皮总花色苷提取量的影响

将山葡萄皮粉与乙醇溶液以质量体积比为1:10(g/mL)混合，其中乙醇溶液中各组分的体积分数为：乙醇60％、甲酸2％，水38％。53.5℃超声提取20min。重复提取8次。每次提取后测定提取物中花色苷的含量，确定最佳提取次数。

表4提取次数对山葡萄皮总花色苷提取率的影响

注：同列不同字母表示差异显著，差异性水平p<0.05

结果表明：随着提取次数的增加，花色苷提取率增加，第三次提取时，花色苷提取率达到98.6％，显著提高了提取率，再增加提取次数对提取率影响不大，在实际操作中，为节省操作时间及试验成本，采用三级提取。

5、超声时间对山葡萄皮总花色苷提取量的影响

提取液为2％甲酸60％乙醇溶液，按液料比10:1(mL/g)的条件下，于50℃条件下提取葡萄皮中的总花色苷，提取时间分别为10min、20min、30min、40min、50min、60min，各组实验设三次重复，超声条件固定为超声频率59KHz、功率500W、工作状态100％。使用pH示差法测得总花色苷的质量浓度，确定最佳提取时间。

表5超声时间对山葡萄皮总花色苷提取量的影响

超声时间(min)	10	20	30	40	50
						花色苷含量(mg/g)	1.55ab	1.88a	1.71ab	1.61ab	1.50b

注：同列不同字母表示差异显著，差异性水平p<0.05

结果表明：当提取时间为20min时，提取较为充分，随提取时间延长，提取量略微下降，可能是由于长时间高温提取，导致花色苷受热分解。因此将提取时间固定在20min。

6、超声温度对山葡萄皮总花色苷提取量的影响

在提取液为2％甲酸60％乙醇溶液，按液料比10:1(mL/g)的条件下，于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下提取葡萄皮中的总花色苷20min，各组实验设三次重复，超声条件固定为超声频率59KHz、功率500W、工作状态100％。使用pH示差法测得总花色苷的质量浓度，确定最佳提取温度。

表6超声温度对山葡萄皮总花色苷提取量的影响

超声温度(℃)	20	30	40	50	60	70
							花色苷含量(mg/g)	1.35b	1.51b	1.72a	1.80a	1.87a	1.48b

注：同列不同字母表示差异显著，差异性水平p<0.05

结果表明：在70℃的范围内，随提取温度的升高，总花色苷提取量相应增加，当温度达到40℃时提取量达最高值，并且和30℃、70℃处差异显著(P<0.05)，与50℃、60℃差异不显著。因此选择40℃为适宜温度。这主要是由于花色苷物质耐热性较差，长时间高温将导致花色苷的降解。

7、响应面实验确定最佳提取条件

选择提取剂体积、提取温度和乙醇体积分数3个对花色苷提取效果影响较大的因素进行3因素5水平试验，试验设计及结果如表7所示：

表7中心组合设计试验结果

由表7可知，选用中心复合模型，做3因素5水平共20个试验点的响应面分析试验。其中试验号1-14是析因试验，试验号15-20是中心试验，用来估计试验误差。利用SASRSREG程序，采用回归方程Y＝α₀+α₁X₁+α₂X₂+α₃X₃+α₁₁X₁ ²+α₂₂X₂ ²+α₃₃X₃ ²+α₁₂X₁X₂+α₁₃X₁X₃+α₂₃X₂X₃，对表7数据进行处理，回归系数及方差分析结果见表8。

表8响应面回归系数取值

系数	估计系数	显著性
			α₀	-1.05872	**
α₁	0.25827	**
			α₂	0.03879	**
α₃	0.04850	**
			α₁₁	-0.02530	**
α₁₂	-0.00075	NS
			α₁₃	0.00120	NS
α₂₂	-0.00033	***
			α₂₃	0.00002	NS
α₃₃	-0.00047	***
			模型		***
失拟		NS
			R²	0.9055

注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，NSp>0.1

回归方程中各变量对指标(响应值)影响的显著性，由F检验来判定，概率P值越小，则相应变量的显著程度越高。由表8可以看出，模型回归效果极显著，模型失拟不显著(P>0.1)，且决定系数R²为0.9055，说明该模型拟合程度良好。自变量与响应值之间的线性关系显著，可用于实验的理论预测。实验结果显示提取剂体积(X₁)、超声温度(X₂)、乙醇体积分数(X₃)的一次和二次项均对试验结果具有显著性影响(P<0.01)，而交互项的影响不显著。通过剔除对试验结果影响不显著的项，得到如下优化后的模型方程：

Y＝0.25827X₁+0.038790X₂+0.048498X₃-0.025296X₁ ²-0.00033X₂ ²-0.00047X₃ ²-1.05872

图1～3为各试验因子对山葡萄皮花色苷提取效果的直观分析图，可直观的看出各因素间的交互影响：

图1反映的是固定乙醇浓度(60％)后，超声处理温度和提取剂体积对花色苷提取效果的影响。从图中数据可以看出当提取剂体积不变时，超声处理温度对试验结果起到“二次效应”，即随着超声处理温度的增加，花色苷含量明显增加，但是在超过55℃左右时，花色苷含量开始急剧下降；取超声处理温度为固定值，如50℃，随提取剂体积增加至5.7mL，花色苷含量明显升高至2.14mg/g，之后花色苷含量的变化趋于稳定，不再随提取剂体积的增大而变动。

图2为固定超声处理温度(50℃)时，乙醇浓度和提取剂体积影响花色苷提取效果的示意图。当提取体积不变时，随着乙醇浓度的增加，花色苷含量明显增加，当乙醇浓度为60％时，花色苷含量达到最高值，之后花色苷含量明显下降；固定乙醇浓度，提取剂体积对花色苷提取效果的影响与图2-7-A相类似，即随着提取剂体积的增加，花色苷含量呈先增加后基本不变的趋势。

图3示乙醇浓度和提取剂体积对花色苷含量的交互影响，呈现相似的“二次效应”趋势。

综上，使用DesignExpert软件对回归方程进行分析，得出最佳花色苷提取工艺条件为：将山葡萄皮粉与乙醇溶液以质量体积比为1:10(g/mL)混合，其中乙醇溶液中各组分的体积分数为：乙醇60％、甲酸2％，水38％。53.5℃超声提取20min。重复提取三次。其中超声条件固定为超声频率59KHz、功率500W、工作状态100％。提取后，样品液在8000r/min，4℃条件下离心10min，并取清液经0.45μm微孔滤膜真空过滤后，在低于40℃条件下进行真空旋蒸去除乙醇，得到花色苷提取浓缩液。

实施例2乙酸乙酯液-液萃取

将第一提取液于等体积的乙酸乙酯混合，进行液-液萃取，收集下层水层，重复三次后，合并水层，并于低于40℃条件下进行真空旋蒸去除乙酸乙酯，得到第二提取液。

采用乙酸乙酯萃取法能够初步去除溶液中黄烷酮类物质等其他弱极性类物质。

实施例3大孔树脂的纯化条件筛选

1、大孔吸附树脂的筛选

取XAD-7、XAD-2、NKA-9、AB-80和D151树脂进行预处理后，各准确量取5mL，用滤纸吸干树脂表面水分，置于100mL具塞磨口三角瓶中，加入一定质量浓度的花色苷溶液5mL，室温下在恒温震荡器中以130r/min的速度进行避光振荡吸附1h，充分吸收过滤后，测定滤液中花色苷的吸光值，计算葡萄皮花色苷的饱和吸附量Q_e(mg/L)；将过滤后的树脂用5倍柱体积的蒸馏水冲洗，加入10mL2％甲酸酸化的60％体积分数的乙醇溶液对其进行1h静态解吸实验。测定解析溶液中花色苷的吸光值，由此来计算不同型号的大孔树脂对葡萄皮花色苷的解吸量Q_d(mg/L)。以大孔吸附树脂的饱和吸附量和解吸量及解吸率D(％)为指标，考察各种大孔树脂的吸附性能，筛选出最佳的吸附树脂。

计算公式为：

Q_{e} = \frac{(C_{0} - C_{1}) \times V_{1}}{W}

Q_{d} = \frac{C_{2} \times V_{d}}{W}

D = \frac{C_{2} \times V_{d}}{(C_{0} - C_{1})} \times 100

式中：C₀为花色苷的初始质量浓度(mg/L)；C₁为花色苷树脂吸附后质量浓度(mg/L)；C₂为花色苷树脂解吸后质量浓度(mg/L)；V₁为花色苷提取剂体积(mL)；W为树脂湿体积(mL)；V_d为解吸液的体积(mL)。

计算结果如表9所示：

表9树脂类型及物理结构参数

注：同列不同字母表示差异显著，差异性水平p<0.05

结果表明，XAD-7具有较高的吸附性能，其次是XAD-2，而NKA-9、AB-80和D151这三种树脂的效果均不理想。利用60％乙醇进行解析，XAD-7，AB-8都具有较高的解吸率，但后者吸附量较低。

2、洗脱溶剂的筛选

常用的洗脱剂有甲醇、乙醇，同时为了使花色苷在溶液中维持较稳定的花色烊阳离子状态，需要对洗脱剂进行一定的酸化，常见的酸化剂有盐酸、甲酸等。为了确定XAD-7大孔树脂洗脱的最佳溶剂，取5mL饱和吸附花色苷的XAD-7树脂中，改变洗脱液(甲醇溶液或乙醇溶液，体积皆为10mL)的体积分数和酸化溶剂(甲酸)的体积分数两种变量之一，室温下在恒温震荡器中以130r/min的速度进行震荡解吸1h，测定解吸实验前后溶液中花色苷的质量浓度，计算解析率。

其中，固定酸化剂甲酸体积分数为2％时，洗脱溶剂甲醇和乙醇体积分数对花色苷物质解吸效果的影响如表10所示：

表10不同种类、不同体积分数的的洗脱液对解吸率的影响

注：同列不同字母表示差异显著，差异性水平p<0.05

结果表明，对于甲醇、乙醇来说，其在不同体积分数下对花色苷洗脱效果的影响相似(P>0.05)，并随着各自体积分数的增加，树脂中花色苷解吸率呈上升趋势，且当体积分数达到60％时，达到较大程度的解吸(解吸率分别为85％、88％)，之后随着体积分数的继续升高，解吸效果没有明显变化。考虑到乙醇可生物降解、无毒无害的特性以及所得花色苷的安全性，在固定甲酸体积分数为2％的前提下，选用60％的乙醇作为较优洗脱剂。

固定乙醇体积分数(60％)后，甲酸酸化剂体积分数对花色苷洗脱效果的影响如表11所示：

表11不同甲酸体积分数对解析率的影响

注：同列不同字母表示差异显著，差异性水平p<0.05

结果表明通过在洗脱剂中加入甲酸，可以显著提高XAD-7树脂对花色苷的洗脱效果，甲酸体积分数的增加，即在体积分数2％-8％，之间没有显著性差异(P>0.05)，所以最终选择甲酸体积分数为2％。本试验的洗脱剂最终确定为2％甲酸酸化的60％乙醇溶液。

3、采用筛选所得条件纯化对第二提取液

采用2％(体积分数)甲酸酸化的60％(体积分数)的乙醇溶液作为大孔树脂XAD-7的洗脱液，大孔树脂XAD-7使用前，采用1倍柱体积的洗脱液进行平衡。

取本发明实施例2中得到的第二提取液上样于XAD-7大孔吸附树脂，至柱体积的三分之二被染色。用5倍柱体积的蒸馏水进行冲洗以去除第二提取液中的糖、有机酸、蛋白质等杂质，然后采用2％甲酸酸化的60％乙醇水溶液进行洗脱，收集带颜色的第一洗脱液。在低于40℃的条件下旋蒸后，真空冷冻干燥24h成粉即为粗提物。

纯化前后花色苷的色价测定结果如表12所示：

表12花色苷产品的色价测定结果

状态	纯化前	纯化后
			色价	40.6	168.7

结果表明，经XAD-7纯化后花色苷的色价比纯化前提高了3倍多，纯化后的花色苷粉末呈紫红色。

实施例4SephadexLH-20凝胶柱纯化

1、SephadexLH-20凝胶柱预处理及装柱方法

取27gSephadexLH-20干胶，加入40mL水充分溶胀3h，溶胀过程应避免过分搅拌及使用磁力搅拌器。将溶胀后的凝胶置于真空干燥器中抽真空1h，去除胶体中的气泡，搅拌均匀后，利用玻璃棒引流，连续不断地导入层析柱中，沉降过夜。为防止柱体镂空或生成气泡，可以将洗脱剂超声处理20min，并尽量减少洗脱剂梯度跨度。

2、以SephadexLH-20凝胶柱纯化粗提物

SephadexLH-20凝胶柱使用前应先用2倍柱体积的2％(体积分数)甲酸酸化的20％(体积分数)甲醇溶液进行平衡。

之后将实例3中制备的粗提物溶解于2％(体积分数)甲酸酸化的20％(体积分数)甲醇溶液至饱和，经0.45μm微孔滤膜过滤后，上样2mL至SephadexLH-20凝胶柱(柱的规格为1.6cm×60cm)，以20％甲醇溶液(2％甲酸酸化)进行洗脱分离，收集第二洗脱液，在低于40℃的条件下旋蒸后，真空冷冻干燥24h成粉即为3,5-二糖类花色苷。

实施例5以本发明提供方法制备的3,5-二糖类花色苷质量鉴定

以2％(体积分数)甲酸酸化的20％(体积分数)甲醇溶液为溶剂，溶解实施例4制备的3,5-二糖类花色苷，并溶解粗提物作为对照。采用HPLC-MS对所得产物进行定性和定量分析。

HPLC-MS条件为：Kromasil100-5-C18色谱柱(250mm×4.6mmI.D.)，流动相A的组成为水：甲酸＝90:10(v/v)，流动相B的组成为水：甲醇：甲酸＝40:50:10(v/v/v)。洗脱程序：0-4min，6-15％B；4-13min，15-25％B；13-20min，25-50％B；20-35min，50-80％B；35-40min，80-100％B；40-45min，100-6％B；流速为1.0mL/min；柱温为50℃；进样量为30μL，色谱在525nm波长下进行检测并记录，其中花色苷单体相应的纯度按照色谱图中峰面积所占的比例进行计算。

采用二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷作外标，以花色苷浓度为横坐标，以HPLC检测峰面积为纵坐标，建立5-500mg/L之间、9个水平、三个重复的标准曲线，回归方程为Y＝46.01304X-6.99129，相关系数达0.9998。用于本发明提供方法制得3,5-二糖类花色苷的定量分析。

质谱采用电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，离子扫描范围：100-1500m/z；雾化器压力：30psi；干燥气流速：12L/min；干燥气温度：300℃。样品经过0.45μm膜过滤后直接进样分析，每样品重复三次。检测结果参照HeF,LiangN,MuL,etal.AnthocyaninsandtheirvariationinredwinesI.Monomericanthocyaninsandtheircolorexpression.Molecules,2012,17(2):1571-1601.提供的葡萄与葡萄酒中花色苷HPLC-DAD-MS指纹谱库进行定性。

HPLC检测图谱如图4所示。其中，图4-a示本发明实施例3制备的粗提物的色谱图；图4-b示本发明实施例4制备的3,5-二糖类花色苷的色谱图。可以看出，SephadexLH-20凝胶柱纯化大大提高了峰3物质在总花色苷物质中的比例，降低了杂质的含量。并且，图4-b所示的色谱图显示，共检测到三种花色苷物质。对该三种物质做进一步质谱检测，检测结果如表13所示：

表13经SephadexLH-20凝胶柱分离后花色苷的HPLC-MS特征

结果表明：图4-b中3号峰物质为在SephadexLH-20分离的花色苷组分中为最主要的组分，占98.7％，分子离子为655m/z，碎片离子为493m/z([M-C6H10O5]+)，331m/z([M-C6H10O5-C6H10O5]+)。在这过程中丢失两个葡萄糖分子，将该物质初步判定为二甲花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷(Malvidin-3,5-O-diglucoside)。定量结果显示，该物质的含量为7.36mg/g(葡萄皮干粉)。

图4-b中1号和2号峰物质分别为花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷(Delphinidin-3,5-O-diglucoside)及甲基花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷(Petunidin-3,5-O-diglucoside)分别丢失两个葡萄糖分子，得到m/z303、317的分子碎片，分别占0.324％和0.841％。

在色谱检测过程中，除峰1～3外，未检测到其他物质峰，表明本发明提供的方法制备的3,5-二糖类花色苷纯度较高，接近100％。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种3,5-二糖类花色苷的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤2：以乙酸乙酯萃取所述第一提取液，取水层，去除乙酸乙酯制得第二提取液；

步骤3：将所述第二提取液上样于XAD-7大孔树脂柱，以蒸馏水冲洗后，以乙醇溶液洗脱，获得第一洗脱液，经干燥，制得粗提物；

步骤4：将所述粗提物以甲醇溶液溶解，上样于SephadexLH-20凝胶柱，以甲醇溶液洗脱，获得第二洗脱液，经干燥，即得；

其中，所述乙醇溶液中各组分的体积分数为：乙醇60％，甲酸2％，水38％；

所述3,5-二糖类花色苷为二甲花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷、花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷和甲基花翠素3,5-O-双葡萄糖苷；

所述甲醇溶液中各组分的体积分数为：甲醇20％，甲酸2％，水78％；

所述山葡萄皮粉与所述乙醇溶液的质量体积比为：1g:10mL；

所述超声提取的温度为53.5℃，时间为20min，次数为3次。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超声提取的频率为59kHz，功率为500W。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乙酸乙酯与所述第一提取液的体积比为1:1。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述XAD-7大孔树脂柱的规格为1.6cm×40cm。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述SephadexLH-20凝胶柱的规格为1.6cm×60cm。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述干燥具体为：第一洗脱液经旋转蒸发后，真空冷冻干燥24h；其中，旋转蒸发的温度不超过40℃。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述洗脱的流速为1滴/秒。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述干燥具体为：第二洗脱液经旋转蒸发后，真空冷冻干燥24h；其中，旋转蒸发的温度不超过40℃。

9.以权利要求1～8任一项所述制备方法制得的3,5-二糖类花色苷。

10.以权利要求1～8任一项所述制备方法制得的3,5-二糖类花色苷在制备食品或药品中的应用。