CN102617669B - 一种从芒果果皮中分离纯化芒果苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种有效的从芒果果皮中分离纯化芒果苷的方法，采用液液萃取，大孔树脂和HSCCC的联用技术，以芒果果皮干燥粉末为原料，经乙酸乙酯萃取，HPD100大孔树脂、HSCCC分离纯化得到高纯度的芒果苷。本发明方法设计合理，操作简单，生产流程安全易操作，生产周期短，样品用量少，设备投入少，整个纯化过程通过HPLC进行精确定量，准确度高，条件稳定容易控制，HSCCC所用的溶剂可回收后重复利用，成本较低。本发明方法纯化产物回收率高，纯度高，最终纯化的芒果苷纯度≥98%，适用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于天然化合物的提取分离纯化技术领域，具体涉及以芒果果皮为原料，采用液液萃取，大孔树脂和HSCCC的联用技术分离纯化芒果苷的方法。
背景技术
芒果苷（mangiferin）， 别名芒果素，莞知母宁，分子式：C19H18O11，分子量：422.34，CAS号：4773-96-0，是一种四羟基吡啶的碳糖苷，属于双苯吡酮类化合物。芒果苷存在于漆树科植物芒果（Mangifera indica L.）的果实、叶、树皮，百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge.）的根茎、地上部分，鸢尾科植物射干[Belamcanda chinensis（L.）DC.]的花、叶等植物中。芒果苷结构式如下：
近年研究表明，芒果苷具有较强的抗氧化，消炎，抑菌，免疫调节，抑制肿瘤以及降血糖等活性，受到人们的广泛关注。现有提取纯化芒果苷的原料大多集中于药材和芒果叶中，技术手段多采用碱液提取或一定浓度的醇提取结合结晶获取芒果苷，但这些工艺比较粗放，得到的芒果苷产品纯度不能保证。
近年来，大孔树脂结合高速逆流色谱技术提取纯化高纯度天然产物已在很多方面取得成功，但利用芒果果皮采用大孔树脂和高速逆流色谱联用技术纯化获得高纯度芒果苷（98%以上）的研究未见报道。芒果作为一种美味的热带水果深受人们喜爱，然而，芒果果皮占果实10%左右（重量），在果实加工或鲜食过程中都成为废弃物，研究从芒果果皮中提取高纯度的芒果苷不仅可以变废为宝，在一定程度上还可以给芒果的深加工提供思路，并可为芒果苷药理作用及其相关功能活性的研究提供技术支撑和工作基础，最大程度地提高芒果的附加值。
发明内容
本发明的目的是提供一种从芒果果皮分离纯化芒果苷的方法，通过以下步骤实现：
（1）粗提物的准备：一定质量干燥的芒果果皮粉末，用石油醚（固液比1:20）浸泡2 h，超声30 min，过滤去掉石油醚，滤渣45℃减压蒸干石油醚后再用提取液（甲醇：乙醇：丙酮1:1:1, v/v/v）超声提取两次（固液比1:20），过滤，合并两次滤液，浓缩蒸干得浸膏，然后溶于ddH2O中；
（2）乙酸乙酯萃取：将步骤（1）得到的粗提水溶液经过乙酸乙酯等体积萃取两次，上相合并后再经水等体积萃取一次后，合并下相溶液45℃减压蒸出溶液中残留的乙酸乙酯；
（3）将（2）步骤得到的提取液上样HPD100大孔树脂，上样流速2 ml/min。上样后的HPD100大孔树脂先用水和5%乙醇各10 BV（柱床体积）洗脱以去掉极性较高的杂质，然后用10 BV 30%乙醇洗脱芒果苷，洗脱流速为2 ml/min，收集30%洗脱液，在旋转蒸发仪上45℃蒸干得大孔树脂粗提物粉末；
（4）分离纯化芒果苷：配制乙酸乙酯-正丁醇-水（4:1:5）溶剂体系，充分摇匀过夜后，将上下相分开，超声脱气，上相为固定相，下相为流动相，将固定相以20 ml/min流速泵入高速逆流色谱仪（HSCCC），稳定后，调节逆流色谱仪转速800 rpm，同时流动相以2 ml/min流速泵入HSCCC，待流出液分层后进样大孔树脂粗提物粉末，根据HSCCC图谱收集出峰处各组分（每管1.8 ml），并对各管样品进行HPLC检测，合并含有单一芒果苷的各管样品，在旋转蒸发仪上蒸干即得到高纯度的芒果苷，回收率≥70%，产品纯度均≥98%。本发明纯化得到的芒果苷经过高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）鉴定，与文献报道一致。
现有提取纯化芒果苷的原料大多集中于药材和芒果叶中，且技术手段多采用碱液提取或一定浓度的醇提取大孔树脂纯化后结晶获取的芒果苷，利用芒果果皮采用大孔树脂和高速逆流色谱联用技术纯化获得高纯度芒果苷（98%以上）的研究未见报道。本发明采用液液萃取，大孔树脂和HSCCC的联用技术，以芒果果皮干燥粉末为原料分离纯化得到高纯度的芒果苷。本发明相对于过去的工艺有如下优点：（1）生产流程安全易操作；（2）生产周期短；（3）纯化产物回收率高，纯度高；（4）整个纯化过程通过HPLC进行精确定量，准确度高；（5）HSCCC所用的溶剂可回收后重复利用，成本较低。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
图2为‘绿皮芒’果皮粗提液HPLC色谱图。
图3为乙酸乙酯萃取后下相HPLC色谱图。
图4为HPD100大孔树脂纯化所得样品的HPLC色谱图。
图5为HSCCC进一步纯化得到芒果苷单体HPLC色谱图。
图6为来自‘绿皮芒’果皮HPD100粗提物20 mg进样HSCCC分离纯化图谱。
图7为来自‘留香芒’果皮HPD100粗提物20 mg进样HSCCC分离纯化图谱。
图8为来自‘绿皮芒’果皮HPD100粗提物连续两次进样（20 mg和30 mg）HSCCC分离纯化图谱。
图9为纯化得到芒果苷单体的质谱鉴定图。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1 本发明通过以下试验进行影响因素的筛选确定
1、纯化材料的选择
经冷冻干燥的‘马切苏’芒果果实材料，包括果皮，果肉，种皮，种仁，用磨样机粉碎打成细小的粉末。精确称取一定量的冷冻干燥粉末，用提取液（甲醇：乙醇：丙酮1:1:1, v/v/v）浸泡2h（固液比1:20），超声提取两次，10000 rpm离心10 min，合并上清液用于芒果苷的HPLC分析。HPLC流动相包括2%乙酸（A）和0.5%乙酸：色谱乙腈（1:1, v/v）（B），采用0-2 min: 95% A, 2-10 min: 95-75% A, 10-40 min: 75-45% A, 40-45 min: 45-10% A, 45-50min: 10-45% A, 50-55 min: 45-95% A, 55-60 min: 95% A梯度洗脱，流速为0.6 ml/min，固定相为Waters C18色谱柱，柱温25℃，检测波长258 nm。结果表明‘马切苏’芒果果实四个部位中，果皮中含有的芒果苷最高（表1）。
表1
| ‘马切苏’芒果 | 芒果苷（mg/g 干重） |
| 果皮 | 1.91 ± 0.33 |
| 果肉 | 0.20 ± 0.07 |
| 种皮 | 0.14 ± 0.01 |
| 种仁 | 0.15 ± 0.01 |
采用同样的提取检测条件筛选不同品种的芒果果皮，包括‘绿皮芒’，‘新红2号’，‘桂热265’，‘粤西1号’，‘斯里兰卡811’，‘马切苏’，‘留香芒’，发现‘绿皮芒’中含有较高的芒果苷，可作为纯化材料（表2）。
表2
| 不同品种芒果果皮 | 芒果苷（mg/g 干重） |
| 绿皮芒 | 6.36 ± 0.31 |
| 新红2号 | 0.67±0.36 |
| 桂热265 | 3.76 ± 0.63 |
| 粤西1号 | 0.13 ± 0.10 |
| 斯里兰卡811 | 0.52 ± 0.09 |
| 马切苏 | 1.91 ± 0.33 |
| 留香芒 | 3.93 ± 1.48 |
2、乙酸乙酯萃取
按照图1的提取方式获得芒果果皮提取水溶液，将其用乙酸乙酯等体积萃取2次，乙酸乙酯相浓缩后再用水萃取1次，合并下相溶液，45℃旋转蒸发去除乙酸乙酯得水相萃取液，结果发现乙酸乙酯萃取能去掉粗提液中的大部分弱极性杂质（图2，图3）。
3、大孔树脂的选择
精确称取一定质量不同型号的大孔树脂（AB8，ADS17，D101，DM130, HPD100，XAD16），各加入一定体积芒果果皮提取水溶液，在摇床上以170 rpm，25℃培养12-15 h，吸附平衡后的溶液经过滤用HPLC检测, 发现六种树脂均能吸附芒果苷，但HPD100吸附的杂质较少。故本发明选择HPD100大孔树脂进行芒果苷的纯化。
4、乙醇洗脱浓度的选择
乙酸乙酯萃取后的水相进HPD100大孔树脂，上样流速2 ml/min, 直至流出液中检测的芒果苷浓度为上样液中5%时停止上样。上样后的D101大孔树脂先用水冲洗8个柱床体积（BV），以洗掉提取液中的杂质，然后依次用10%，20%，30%，40%，50%乙醇洗脱，每个梯度8BV，洗脱流速为2 ml/min，用HPLC检测各乙醇浓度下洗脱液中芒果苷的含量，确定最适乙醇洗脱浓度。结果表明，10-30%的乙醇能洗脱大多数的芒果苷（表3），故本发明将30%的乙醇作为等度洗脱时芒果苷的洗脱溶剂，以简化纯化步骤。洗脱液蒸干得大孔树脂粗提物粉末。经大孔树脂纯化过的粗提物芒果苷纯度提高（图3，图4）。
表3
| 乙醇浓度（%） | 芒果苷洗脱量（mg) |
| 0 | 0 |
| 10 | 1.90 |
| 20 | 24.73 |
| 30 | 14.71 |
| 40 | 0.15 |
| 50 | 0.00 |
5、HSCCC溶剂体系的选择
通过测定分配系数（K）来初步筛选用于HSCCC的溶剂体系。将预先配好的不同的溶剂体系充分混匀，静置分层后，吸取同样体积的上下相，加入大孔树脂粗提物粉末，分别测定上下相中芒果苷的峰面积，固定相与流动相中的芒果苷峰面积之比为分配系数。结果表明，乙酸乙酯-正丁醇-水（4:1:5）溶剂体系中芒果苷的分配系数为1.76，适合用作芒果苷的分离纯化体系。经HSCCC进一步纯化得到纯度较高的粉末（图5，图6-8），其结构做质谱（MS）鉴定。质谱条件：ESI离子源，负离子模式(ESI-)；干燥气(N2)温度：350℃；流速：10.0 L／min；雾化器压力：35psi；毛细管电压：4000V；质量扫描范围：m/z 50～1000。质谱数据采集采用MRM模式。特征碎片与文献报道一致，确认为芒果苷（图9）。
表4
| 溶剂体系 (v/v) | 比例 | K |
| 正丁醇–1%乙酸 | 1:1 | 6.37 |
| 正丁醇–甲醇–1%乙酸 | 1:0.1:1 | 2.56 |
| 正丁醇–甲醇–1%乙酸 | 1:0.2:1 | 3.70 |
| 石油醚–乙酸乙酯–甲醇–水 | 1:1:1.4:0.6 | <0.01 |
| 乙酸乙酯–正丁醇–水 | 4:1:5 | 1.76 |
实施例2
本发明分离纯化芒果苷的操作方法按照以下步骤来进行：
参见图1，（1）称取‘绿皮芒’果皮10 g，加200 ml提取液（甲醇：乙醇：丙酮1:1:1，v/v/v）浸泡2 h，超声30 min，过滤取上清，滤渣再添加200 ml提取液超声30 min，过滤，合并两次上清液，45℃旋转蒸发至浸膏，双蒸水溶解浸膏得到210 ml粗提液；
（2）210 ml（0.35 mg/ml 芒果苷）粗提液，乙酸乙酯等体积萃取2次，乙酸乙酯相浓缩后再用水萃取1次，合并下相45℃旋转蒸发去除乙酸乙酯得到207 ml水相萃取液；
（3）207 ml（0.25 mg/ml 芒果苷），进HPD100大孔树脂（20 ml），流速2 ml/min，进样结束后静置1 h，水洗10 BV，5%乙醇洗10 BV，30%乙醇洗脱10 BV，合并30%洗脱部分45℃旋转蒸发至浸膏，得到粉末0.17g，芒果苷纯度≥30%。
（4）采用HSCCC分离芒果苷：配制乙酸乙酯–正丁醇–水（4:1:5，v/v/v）溶剂体系，充分摇匀过夜后，上相为固定相，下相为流动相，固定相首先以20 ml/min流速泵入HSCCC，稳定后，调逆流色谱仪转速至800 rpm，同时流动相以2 ml/min速度通过HSCCC，待流出液分层后，将过HPD100后得到的粉末20mg溶于5 ml下相中进样，根据色谱仪检测器采集的图谱分管收集各组分，用HPLC测定各组分的纯度，分别合并含有单一芒果苷的试管，在旋转蒸发仪上45℃蒸干即得到芒果苷。该步纯化得到芒果苷5.8 mg，纯度≥98%。结果参见图6。
实施例3
本发明分离纯化芒果苷的操作方法按照以下步骤来进行：
参见图1，（1）称取‘留香芒’芒果皮10 g，加200 ml石油醚浸泡2 h，超声30 min，过滤去掉石油醚层，滤渣45℃挥发掉石油醚之后添加200 ml提取液（甲醇：乙醇：丙酮1:1:1，v/v/v），超声30 min，过滤取上清，滤渣再添加200 ml提取液超声30 min，过滤，合并两次上清液，45℃旋转蒸发至浸膏，双蒸水溶解浸膏得到235 ml粗提液；
（2）235 ml（0.15 mg/ml 芒果苷）粗提液，乙酸乙酯等体积萃取2次，乙酸乙酯相浓缩后再用水萃取1次，合并下相45℃旋转蒸发去除乙酸乙酯得到188 ml水相萃取液；
（3）188 ml（0.15 mg/ml 芒果苷），进HPD100大孔树脂（20 ml），流速2 ml/min，进样结束后静置1 h，水洗10 BV，5%乙醇洗10 BV，30%乙醇洗脱10 BV，合并30%洗脱部分45℃旋转蒸发至浸膏，得到粉末0.12g，芒果苷纯度≥30%。
（4）采用HSCCC分离芒果苷：配制乙酸乙酯–正丁醇–水（4:1:5，v/v/v）溶剂体系，充分摇匀过夜后，上相为固定相，下相为流动相，固定相首先以20 ml/min流速泵入HSCCC，稳定后，调逆流色谱仪转速至800 rpm，同时流动相以2 ml/min速度通过HSCCC，待流出液分层后，将过HPD100后得到的粉末20 mg溶于5 ml下相中进样，根据色谱仪检测器采集的图谱分管收集各组分，用HPLC测定各组分的纯度，分别合并含有单一芒果苷的试管，在旋转蒸发仪上45℃蒸干即得到芒果苷。该步纯化得到芒果苷6.2 mg，纯度≥98%。结果参见图7。
实施例4
本发明分离纯化芒果苷的操作方法按照以下步骤来进行：
参见图1，（1）称取‘绿皮芒’果皮20 g，加400 ml石油醚浸泡2 h，超声30 min，过滤去掉石油醚层，滤渣45℃挥发掉石油醚之后添加400 ml提取液（甲醇：乙醇：丙酮1:1:1， v/v/v）超声30 min，过滤取上清，滤渣再添加400 ml提取液，超声30 min，过滤，合并两次上清液，45℃旋转蒸发至浸膏，双蒸水溶解浸膏得到425 ml粗提液；
（2）425 ml（0.35 mg/ml 芒果苷）粗提液，乙酸乙酯等体积萃取2次，乙酸乙酯相浓缩后再用水萃取1次，合并下相45 ℃旋转蒸发去除乙酸乙酯得到407 ml水相萃取液；
（3）407 ml（0.33 mg/ml 芒果苷），进HPD100大孔树脂（40 ml），流速2 ml/min，进样结束后静置1 h，水洗10 BV，5%乙醇洗10 BV，30%乙醇洗脱10 BV，合并30%洗脱部分45℃旋转蒸发至浸膏，得到粉末0.32 g，芒果苷纯度≥30%；
（4）采用HSCCC分离芒果苷：配制乙酸乙酯–正丁醇–水（4:1:5，v/v/v）溶剂体系，充分摇匀过夜后，上相为固定相，下相为流动相，固定相首先以20 ml/min流速泵入HSCCC，稳定后，调逆流色谱仪转速至800 rpm，同时流动相以2 ml/min速度通过HSCCC，待流出液分层后，将过HPD100后得到的粉末20 mg溶于5 ml下相中进样，过1 h后将过HPD100后得到的粉末30 mg溶于5 ml下相第二次进样，根据色谱仪检测器采集的图谱分管收集各组分，用HPLC测定各组分的纯度，分别合并含有单一芒果苷的试管，在旋转蒸发仪上45℃蒸干即得到芒果苷。该步纯化得到芒果苷15.7 mg，纯度≥98%。结果参见图8。
Claims (1)
1.一种从芒果果皮分离纯化芒果苷的方法，通过以下步骤实现：
（1）粗提物的准备：取干燥的芒果果皮粉末，用固液比1:20的石油醚浸泡2 小时，超声30 分钟，过滤去掉石油醚，滤渣45℃减压蒸干石油醚后再用固液比1:20的提取液超声提取两次，过滤，合并两次滤液，浓缩蒸干得浸膏，然后溶于ddH2O中；
（2）乙酸乙酯萃取：将步骤（1）得到的粗提水溶液经过乙酸乙酯等体积萃取两次，上相合并后再经水等体积萃取一次后，合并下相溶液45℃减压蒸出溶液中残留的乙酸乙酯；
（3）将（2）步骤得到的提取液上样HPD100大孔树脂，上样流速2 ml/min，上样后的HPD100大孔树脂先用水和5%乙醇各10柱床体积洗脱，然后用10 柱床体积 30%乙醇洗脱芒果苷，洗脱流速为2 ml/min，收集30%乙醇洗脱液，在旋转蒸发仪上45℃蒸干得大孔树脂粗提物粉末；
（4）分离纯化芒果苷：配制4:1:5的乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂体系，充分摇匀过夜后，将上下相分开，超声脱气，上相为固定相，下相为流动相，将固定相以20 ml/min流速泵入高速逆流色谱仪，稳定后，调节逆流色谱仪转速800 rpm，同时流动相以2 ml/min流速泵入高速逆流色谱仪，待流出液分层后进样大孔树脂粗提物粉末，根据HSCCC图谱收集出峰处各组分，并对各管样品进行HPLC检测，合并含有单一芒果苷的各管样品，在旋转蒸发仪上蒸干即得到芒果苷；
步骤（1）所述提取液为体积为1:1:1的甲醇:乙醇:丙酮溶液。
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