CN103610800A

CN103610800A - 从瓯柑油胞层中分离纯化七种黄酮类化合物的方法

Info

Publication number: CN103610800A
Application number: CN201310565693.4A
Authority: CN
Inventors: 李鲜; 张九凯; 孙崇德; 陈昆松
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-11-13
Filing date: 2013-11-13
Publication date: 2014-03-05

Abstract

本发明提供一种有效的从瓯柑油胞层中分离纯化七种黄酮类化合物的方法，采用溶剂萃取，Sephadex凝胶过滤和高速逆流色谱（HSCCC）纯化三个步骤，以瓯柑果实油胞层为原料，最终纯化得到七种黄酮类化合物，纯度均在97%以上。本发明操作简单，生产周期短，样品用量少，设备投入少，条件稳定容易控制，七种黄酮类化合物包括柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素，本发明方法适用于工业化生产和科学研究。

Description

从瓯柑油胞层中分离纯化七种黄酮类化合物的方法

技术领域

本发明属于天然植物中有效成分的提取分离纯化技术领域，具体涉及以瓯柑油胞层为原料，采用溶剂萃取、Sephadex凝胶过滤和高速逆流色谱（HSCCC）的联用技术同时分离纯化瓯柑油胞层中的七种黄酮类化合物的方法。

背景技术

瓯柑（Citrus reticulata cv. Suavissima）是芸香科柑橘属的一个栽培变种，是浙江温州的传统特产，有两千多年的栽培历史。瓯柑果实在民间具有抗癌、退热降温、止痰化咳、清凉解毒、改善血液循环、降压等特殊疗效，这些作用可能与其果实中富含的黄酮类化合物有关。前人的研究报道柑橘黄酮类化合物具有抗癌、降糖、降血脂、预防心血管疾病、消炎、神经保护等活性，对人体健康起非常重要的作用。另外，黄酮类化合物也是重要的工业生产前体，如柚皮苷和新橙皮苷常用来生产它们相应的二氢查耳酮类。柚皮苷二氢查耳酮和新橙皮苷二氢查耳酮的甜度分别是蔗糖的300倍和1000倍，而且具有低热量和低啮齿性，可以适合糖尿病人和肥胖人群。同时，将黄酮类化合物添加到牙膏或化妆品中，具有较好的消炎、止血和美白的功效，并且在急性毒理实验中也被证明是安全的，因此，黄酮类化合物的分离纯化具有非常重要的保健价值和工业效益。

随着近年来对黄酮类化合物的深入研究，市场需求量迅速增大。现有技术中，柑橘黄酮类化合物的提取分离主要采用有机溶剂提取结合结晶法，但这些工艺效率低，生产周期长，污染严重，不利于大量生产。Sephadex 凝胶柱可以综合利用凝胶过滤和反相分配的原理进行天然产物的分离。基于液液分配原理的HSCCC避免了固体支持物或载体带来的样品吸附、变性、污染等缺点，并具有较高的样品回复率。采用溶剂萃取，凝胶过滤和HSCCC的联用技术可有效快速的分离纯化柑橘中的黄酮类化合物。

发明内容

本发明的目的是提供一种从瓯柑油胞层分离纯化七种黄酮类化合物的方法，通过以下步骤实现：

（1）溶剂萃取：一定质量的瓯柑油胞层粉末先用80%乙醇超声提取3次（固液比1:20），每次30 min，经真空抽滤后，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干至无乙醇相，溶于去离子水中，根据溶剂极性依次用正己烷，氯仿，正丁醇萃取两次，分别合并两次萃取物，得到正己烷萃取物，氯仿萃取物和正丁醇萃取物；

（2）Sephadex LH-20凝胶过滤：蒸干后的正己烷和氯仿萃取物溶于40%甲醇中，上Sephadex LH-20凝胶柱，上样流速2 mL/min。上样后的Sephadex LH-20凝胶柱依次用体积比为40%，60%，80%，100%甲醇洗脱凝胶柱，每个梯度洗4 个柱床体积，洗脱流速为2 mL/min，洗脱液经HPLC检测，合并富含黄酮类化合物的洗脱液，在旋转蒸发仪上50℃蒸干得到去除色素后的黄酮粗提物；

（3）HSCCC分离纯化：配制不同的HSCCC溶剂体系，充分摇匀过夜后，上相为固定相，下相为流动相，固定相首先以20 mL/min流速泵入HSCCC，稳定后，开启逆流色谱仪将转速调至800 rpm，同时流动相以2 mL/min速度通过HSCCC，待流出液分层后，去除色素后的正己烷和氯仿萃取物分别溶于正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（体积比1:0.8:1:1）的下相中，正丁醇萃取物溶于乙酸乙酯-正丁醇-水（体积比4:1:5）下相中，根据色谱仪检测器采集的图谱分管收集各组分，用HPLC测定各组分的组成，分别合并含有单一黄酮类化合物的试管，在旋转蒸发仪上50℃蒸干共得到七种黄酮类化合物，分别为柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素，产品纯度均在97%以上。本发明纯化得到的七种黄酮类化合物经过高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）鉴定，与文献报道一致。

本发明的黄酮类化合物的提取材料选自瓯柑油胞层。利用正己烷、氯仿和正丁醇分段萃取瓯柑油胞层中的黄酮类化合物。利用Sephadex LH-20凝胶柱去除正己烷和氯仿萃取物中的色素分子。进行HSCCC纯化时，选择正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1:0.8:1:1）的溶剂体系，从正己烷和氯仿萃取物中纯化得到甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素，选择乙酸乙酯-正丁醇-水（4:1:5）溶剂体系，从正丁醇萃取物中得到柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷，纯化得到的七种黄酮类化合物纯度均在97%以上。

本发明采用溶剂萃取、Sephadex凝胶过滤和HSCCC的联用技术，以瓯柑油胞层烘干粉末为原料同时分离纯化得到高纯度的七种黄酮类化合物。本发明相对于过去的工艺有如下优点：（1）不需要高温高压及惰性气体的保护，合成工艺简单；（2）HSCCC所用的溶剂可回收后重复利用，成本较低；（3）可用于分离利用性质非常接近的黄酮类化合物，适用性广；（4）生产周期短，仅仅需要几个小时就可以完成整个纯化过程；（5）纯化产物回收率高，纯度高；（6）整个纯化过程通过HPLC进行精确定量，准确度高。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

图2为瓯柑油胞层中七种黄酮类化合物的结构。

图3为正己烷萃取物的HSCCC图谱，图中，1为川陈皮素，2为橘皮素，3为5-去甲川陈皮素。

图4为氯仿萃取物的HSCCC图谱，图中，1为甜橙黄酮，2为川陈皮素，3为橘皮素。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1 本发明通过以下试验进行影响因素的筛选确定

1、纯化材料的选择

新鲜的瓯柑果实分为油胞层，白皮层，囊衣，汁胞四个部位，液氮充分冻干后，在冷冻干燥机中-80℃下干燥72 h至恒重，干样用粉碎机磨碎待用。精确称取一定量瓯柑四个不同部位的干样粉末，用80%乙醇（固液比1:20）超声提取30 min，提取液在离心机上4000 rpm离心10 min，如此重复两次，合并上清液，用于瓯柑果实四个不同部位中黄酮类化合物的HPLC分析。HPLC分析条件为：以水（溶液A）和色谱乙腈（溶液B）为流动相，采用梯度洗脱，洗脱梯度为：0～15 min，保持溶液B 20%不变，15～35 min，溶液B 20%～60%；35～40 min，溶液B 60%～100%；然后保持100%溶液B不变，洗脱2 min；42～45 min，溶液B 100%～20%；保持20%溶液B 5 min后结束一个循环。检测波长为280 nm（黄烷酮）和330 nm（多甲氧基黄酮），温度为25℃，进样量为10 μL。结果表明，在瓯柑果实四个不同部位中，油胞层中含有种类最多的黄酮类化合物，可作为纯化材料（参见表1）。

2、萃取溶剂的选择

根据溶剂极性大小顺序，采用正己烷，氯仿和正丁醇依次萃取瓯柑油胞层提取物水溶液中的黄酮类化合物，结果如表2所示，不同溶剂中萃取到不同的黄酮类化合物，正己烷萃取液中包括大部分的橘皮素以及部分川陈皮素和5-去甲川陈皮素；氯仿萃取液中包括大部分的川陈皮素以及部分甜橙黄酮和橘皮素；正丁醇萃取液中包括柚皮苷，橙皮苷和新橙皮苷，剩余的水萃取液中仅剩下含量较低的黄酮类化合物。

3、Sephadex LH-20凝胶过滤去除色素

采用Sephadex LH-20来分离正己烷和氯仿萃取液中的黄酮类化合物和色素，洗脱结果表明，由于色素分子量较大，在凝胶柱上先被洗脱下来，而黄酮化合物分子量小，后被洗脱下来，多甲氧基黄酮大部分集中在40%-60%甲醇洗脱液中，合并该部分洗脱液，在旋转蒸发仪上50℃蒸干得到去除色素后的黄酮粗提物。经过一步纯化后，可有效的去除色素分子。

4、纯化产物的鉴定

瓯柑油胞层中纯化得到的七种黄酮类化合物经质谱（MS）鉴定。LC-MS实验采用安捷伦Agilent 1290-G6640三重四级杆系统进行，分析过程采用总离子色谱和电喷雾电离法（ESI）进行，黄烷酮的鉴定采用负离子模式（[M-H]^-），多甲氧基黄酮采用正离子模式（[M+H]⁺）。操作条件如下：毛细管气压为正离子3000 v，负离子3500 v，雾化器45 psi，干气体流速5 L/min，325℃。结果如表3所示。

实施例2

本发明分离纯化瓯柑油胞层中黄酮类化合物的方法按照如下三个步骤来进行，参见图1。

（1）溶剂萃取：称取瓯柑果实油胞层干样粉末20 g，用80%乙醇400 mL （固液比1:20）超声40 min（超声频率60 kHz，功率30 W），提取液在离心机上4000 rpm离心10 min，如此重复两次，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干至无乙醇相，溶于约200 mL水中，根据溶剂极性依次用正己烷、氯仿、正丁醇萃取两次（每次用量约200 mL，每次4 h），分别合并两次萃取物，得到正己烷萃取物，氯仿萃取物货物正丁醇萃取物，各萃取物经旋转蒸发后溶于甲醇中，采用HPLC检测确定每部分的黄酮组分。

（2）Sephadex LH-20凝胶过滤：室温下将Sephadex LH-20凝胶溶胀于水中3 h，溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入层析柱（×500 mm，BV=20 mL），在柱内自然沉降。用水平衡2－3 h后，由柱上端加样品溶液0.5 mL（5 mL 正己烷萃取液或氯仿萃取液蒸干后溶于1 mL 40%甲醇中）。上样后的Sephadex LH-20凝胶柱依次用40%，60%，80%，100%甲醇洗脱凝胶柱，每个梯度洗4 个柱床体积（BV），洗脱流速为2 mL/min，洗脱液经HPLC检测，合并富含黄酮类化合物的洗脱液，在旋转蒸发仪上50℃蒸干得到去除色素后的黄酮粗提物。

（3）HSCCC分离纯化：采用两种不同的HSCCC溶剂体系，乙酸乙酯-正丁醇-水（4:1:5, v/v）和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1:0.8:1:1, v/v）分别纯化瓯柑油胞层中的七种黄酮类化合物。溶剂体系配好后充分摇匀过夜后分层，上相为固定相，下相为流动相，首先用上相以流速为20 mL/min充满HSCCC分离柱，再仪器转速调成800 rpm，下相以流速为2 mL/min泵入柱子，当下相从出口稳定流出时，表明分离柱内的两相平衡已建立，去色素后的正己烷萃取物，氯仿萃取物以及正丁醇萃取物分别溶于5 mL对应溶剂体系的下相中，经由进样圈进样，洗脱液经UV检测器检测，并且以2 mL/管收集流出液用HPLC分析。HSCCC图谱如图2-4所示，分别合并各洗脱组分，真空干燥得到粉末，称重。该纯化过程从正己烷萃取物中得到1.6 mg川陈皮素，5.1 mg桔皮素和1.8 mg 5-去甲川陈皮素；从氯仿萃取物中得到1.2 mg甜橙黄酮，3.8 mg川陈皮素和1.7 mg橘皮素；从正丁醇萃取物中得到1.2 mg柚皮苷，2.2 mg橙皮苷和6.7 mg新橙皮苷。本发明纯化得到的七种黄酮类化合物经过高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）鉴定，与文献报道一致，产品纯度均在97%以上。

结构如下：

。

实施例3

（1）溶剂萃取：称取瓯柑果实油胞层干样粉末100 g，用80%乙醇2000 mL （固液比1:20）超声40 min（超声频率60 kHz，功率30 W），提取液在离心机上4000 rpm离心10 min，如此重复两次，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干至无乙醇相，溶于约800 mL水中，根据溶剂极性依次用正己烷、氯仿、正丁醇萃取两次（每次用量约800 mL，每次4 h），分别合并两次萃取物，得到正己烷萃取物，氯仿萃取物和正丁醇萃取物，各萃取物经旋转蒸发后溶于甲醇中，采用HPLC检测确定每部分的黄酮组分。

（2）Sephadex LH-20凝胶过滤：室温下将Sephadex LH-20凝胶溶胀于水中3 h，溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入层析柱（×500 mm，BV=80 mL），在柱内自然沉降。用水平衡2－3 h后，由柱上端加样品溶液0.8 mL（16 mL 正己烷萃取液或氯仿萃取液蒸干后溶于1 mL 40%甲醇中）。上样后的Sephadex LH-20凝胶柱依次用40%，60%，80%，100%甲醇洗脱凝胶柱，每个梯度洗4 个柱床体积，洗脱流速为2 mL/min，洗脱液经HPLC检测，合并富含黄酮类化合物的洗脱液，在旋转蒸发仪上50℃蒸干得到去除色素后的黄酮粗提物。

（3）HSCCC分离纯化：采用两种不同的HSCCC溶剂体系，乙酸乙酯-正丁醇-水（4:1:5, v/v）和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1:0.8:1:1, v/v）分别纯化瓯柑油胞层中的七种黄酮类化合物。溶剂体系配好后充分摇匀过夜后分层，上相为固定相，下相为流动相，首先用上相以流速为20 mL/min充满HSCCC分离柱，再仪器转速调成800 rpm，下相以流速为2 mL/min泵入柱子，当下相从出口稳定流出时，表明分离柱内的两相平衡已建立，去色素后的正己烷萃取物，氯仿萃取物以及正丁醇萃取物分别溶于5 mL对应溶剂体系的下相中经由进样圈进样，洗脱液经UV检测器检测，并且以2 mL/管收集流出液用HPLC分析。HSCCC图谱如图2-4所示，分别合并各洗脱组分，真空干燥得到粉末，称重。该纯化过程从正己烷萃取物中得到8.6 mg川陈皮素，28.5 mg橘皮素和10.5 mg 5-去甲川陈皮素；从氯仿萃取物中得到7.5 mg甜橙黄酮，17.8 mg川陈皮素和9.6 mg橘皮素；从正丁醇萃取物中得到6.8 mg柚皮苷，11.4 mg橙皮苷和29.6 mg新橙皮苷。本发明纯化得到的七种黄酮类化合物经过高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）鉴定，与文献报道一致，产品纯度均在97%以上。

结构如下：

。

Claims

1.一种从瓯柑油胞层分离纯化七种黄酮类化合物的方法，通过以下步骤实现：

（1）溶剂萃取：取瓯柑油胞层粉末先用80%乙醇超声提取3次，固液比1:20，每次30 min，经真空抽滤后，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干至无乙醇相，溶于去离子水中，依次用正己烷，氯仿，正丁醇萃取两次，分别合并两次萃取物，得到正己烷萃取物，氯仿萃取物和正丁醇萃取物；

（2）Sephadex LH-20凝胶过滤：蒸干后的正己烷和氯仿萃取物溶于40%甲醇中，上Sephadex LH-20凝胶柱，上样流速2 mL/min，上样后的Sephadex LH-20凝胶柱依次用40%，60%，80%，100%甲醇洗脱凝胶柱，每个梯度洗4 个柱床体积，洗脱流速为2 mL/min，洗脱液经HPLC检测，合并富含黄酮类化合物的洗脱液，在旋转蒸发仪上50℃蒸干得到去除色素后的黄酮粗提物；

（3）HSCCC分离纯化：配制不同的HSCCC溶剂体系，充分摇匀过夜后，上相为固定相，下相为流动相，固定相首先以20 mL/min流速泵入HSCCC，稳定后，开启逆流色谱仪将转速调至800 rpm，同时流动相以2 mL/min速度通过HSCCC，待流出液分层后，去除色素后的正己烷和氯仿萃取物分别溶于1:0.8:1:1的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的下相中，正丁醇萃取物溶于4:1:5的乙酸乙酯-正丁醇-水下相中，根据色谱仪检测器采集的图谱分管收集各组分，用HPLC测定各组分的组成，分别合并含有单一黄酮类化合物的试管，在旋转蒸发仪上50℃蒸干共得到七种黄酮类化合物，分别为柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素。

2.根据权利要求1所述的一种从瓯柑油胞层分离纯化七种黄酮类化合物的方法，其特征在于，黄酮类化合物的提取材料选自瓯柑油胞层。

3.根据权利要求1所述的一种从瓯柑油胞层分离纯化七种黄酮类化合物的方法，其特征在于利用正己烷、氯仿和正丁醇分段萃取瓯柑油胞层中的黄酮类化合物。

4.根据权利要求1所述的一种从瓯柑油胞层分离纯化七种黄酮类化合物的方法，其特征在于利用Sephadex LH-20凝胶柱去除正己烷和氯仿萃取物中的色素分子。

5.根据权利要求1所述的一种从瓯柑油胞层分离纯化七种黄酮类化合物的方法，其特征在于进行HSCCC纯化时，选择1:0.8:1:1的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的溶剂体系，从正己烷和氯仿萃取物中纯化得到甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素，选择4:1:5的乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂体系，从正丁醇萃取物中得到柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷，纯化得到的七种黄酮类化合物纯度均在97%以上。