JP2007531734A - パッションフルーツの抽出物及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は一般的に植物抽出物に関し、さらに詳しくはパッションフルーツ(トケイソウ科、Passiflora sp.)の抽出物、特にパッションフルーツの果皮の抽出物、並びに該抽出物の食品、栄養補助食品、及び医学用への使用に関する。
発明の要旨
第一の側面において、本発明は、哺乳動物に有効量のパッションフルーツ抽出物を投与することを含む、哺乳動物における血圧の低下法を提供する。
本発明はさらに、哺乳動物に有効量のパッションフルーツ抽出物を投与することを含む、哺乳動物における肝機能関連疾患又は障害の治療法も提供する。
(i)好ましくは、パッションフルーツを小片に切り分けて表面積を増加させ;
(ii)パッションフルーツの小片を水と接触させて水性抽出物と固体残渣とを得;
(iii)水性抽出物を固体残渣から分離し;
(iv)水性抽出物を高分子マトリックスと接触させて抽出物の一つ以上の成分をマトリックスに吸着させ;
(v)マトリックスを水で洗浄し;そして
(vi)有機溶媒又は有機溶媒の混合物を用いて一つ以上の成分をマトリックスから溶出する。
有機溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、1−プロパノール、又はアセトンが好適である。
該組成物は食物又は食品でありうる。該組成物は、栄養補助食品又はその他の栄養組成物のようなサプリメントであってもよい。
更なる側面において、本発明は、サプリメントのような栄養補助食品として、又は医学的もしくは機能性食品及び飲料の製造における有効成分としてのパッションフルーツ果皮抽出物の使用を提供する。
詳細な説明
本明細書中に記載されている“パッションフルーツ”は、一般的に果皮及び食用果肉の両方を含む果実を意味する。“パッションフルーツ果皮”という用語は、内部の食用果肉を取り除いた後の残りの果実部分を意味するために使用される。HPLC分析によれば、本発明のパッションフルーツ抽出物は、ケルセチン、ケルセチンガラクトシド、ケルセチングルコシド、ルテオリン、ルテオリングルコシド、シアニジン−3−グルコシド、カテキン及びエピカテキンを含むいくつかのフラボノイドを含有することが示されている(図1)。
高血圧自然発症ラット(SHR)を用いた研究で、出願人らは、50mg/kgの抽出物を補給した食餌はSHRの血圧を下げ、加齢による正常の血圧上昇を遅らせることを見出した。収縮期血圧は、50mg/kgの抽出物を摂取したラットでは、対照群と比べて12.3mmHg低かった(P<0.01)(図2)。
医薬組成物の場合、抽出物は、固体又は液体製剤、例えば錠剤、カプセル、散剤、溶液、懸濁液及び分散液に製剤化できる。液体形は、水及びエタノールのような担体を、製薬学的に許容しうる界面活性剤又は懸濁化剤のようなその他の薬剤と共に、又はそれらの薬剤なしで含む。
実施例
実施例1:パッションフルーツ抽出物の製造
パッションフルーツ(Passiflora edulis)を半分にカットし、果汁の多い果肉を除去して中身のないパッションフルーツ果皮の殻を得た。この殻を切り刻んで長さ10mm未満の小片にし、容器に入れた。熱水(65〜75℃)を容器に加え、刻んだ殻を完全に浸した。該混合物を最初の1時間は時々撹拌し、その後一晩浸漬放置した。該混合物をろ過し、ろ液を非イオン性高分子樹脂のカラムに通し、フェノール性及びその他の有機化合物を吸収させた。蒸留水をカラムに通し、糖及びその他の極性成分を洗い流した。次に吸収された化合物をメタノールを用いてカラムから溶出し、溶出液を減圧下で濃縮して暗色の濃縮物を得た。該濃縮液を凍結乾燥し、パッションフルーツ抽出物を暗赤色粉末として得た。メタノールを溶離剤として使用したが、エタノール、イソプロピルアルコール、1−プロパノール、又はアセトンを使用することもできた。
実施例2:パッションフルーツ抽出物の成分の決定
抽出物の成分はHPLCによって決定した。実験は、DAD検出器及び30℃に保たれたLiChrospher 100RP−18(um)カラム(125×4)を備えたHewlett Packard 1100装置で実施した。溶媒プログラムは、溶媒A(水中2%HOAc)中3.6%のB(アセトニトリル中2%HOAc)で開始し、20分で12%のB、30分で20%のB、そして45分で50%のBまで上げていった。流速はmL/分にセットし、化合物は、フェノール酸については280nm、フラボノイドについては350nm及びアントシアニンについては520nmにセットされたUV吸収によってモニタした。化合物の同定は、リテンションタイム及びUV/可視スペクトルを標準材料と比較することによって確認した。
実施例3:赤血球膜の調製とATPアーゼアッセイ
赤血球膜は既報の通りに調製した(Farrance,ML.,& Vincenzi,FF.(1977)Biochem Biophys Acta 471:49−58)。手短に言えば、血液は健常人から採取した。赤血球を生理食塩水で洗浄し、EGTA(100mM、Sigma)及びPMSF(10mM、Sigma)入りの低張イミダゾール緩衝液(pH7.4、20mM、Sigma)中で溶解した。膜を、EGTA及びPMSF含有イミダゾール緩衝液(20mM)、EGTA含有イミダゾール緩衝液、及びイミダゾール緩衝液のみで各1回ずつ順に洗浄した。最後の洗浄は40mMのヒスチジン−イミダゾール緩衝液(pH7.4)中で行い、膜を窒素下で冷蔵庫(4〜8℃)に保管した。アッセイに先立ち、RBC膜(0.75mg/mL)を30分間37℃で、0、0.25、1、2.5mg/mLのパッションフルーツ果皮抽出物及び最終体積1mLを達成するに足る生理食塩水と共にインキュベートした。インキュベーション及び遠心分離の後、上清を除去し、膜を生理食塩水中に再懸濁させ1mLとした。その後、膜ATPアーゼ活性をマルチウェルプレートで同時に測定した。典型的なアッセイ混合物は、RBC膜(75μg/mL)、18mMのヒスチジン−イミダゾール(pH7.1、Sigma)、3mMのMgCl2、80mMのNaCl、15mMのKCl、0.2mMのCaCl2、0.1mMのEGTA、0.1mMのウワバイン(Sigma)及び30nMのCaM(CaM−活性化Ca2+ポンプについてのみ、Sigma)を含有していた。37℃で15分間の予備インキュベーション後、5%のSDS(Sigma)を対照群に加えた。酵素反応は3mMのATPで開始した。37℃で60分間後、反応を5%SDSで停止し;放出された無機ホスフェートをモリブデン酸アンモニウム/アスコルビン酸混合物を用いて測定し、Microplate Autoreader(Bio−Tek Instruments,EL31 1.USA)によって吸収を波長820nmで測定した。正確さを追加するために、BCAアッセイを実施して各アッセイ終了時における管内のタンパク質の最終濃度を決定した。上記実験の膜(25μl)、25μlのddH2O及び1mLのカラー試薬を管に加え、次いで30分間37℃でインキュベートした。その間、異なる濃度の標準タンパク質(アルブミン、Sigma)をインキュベートした。インキュベーション後、各管を室温に冷却した。分光光度計(Beckman Coulter,DU640)によりX=562nmで吸光度を測定した。膜のタンパク質濃度を標準曲線から読み取った。
ATPアーゼの活性は下記式によって算出した。
実施例4:動物と食餌−SHR研究
6週齢の高血圧自然発症ラット(SHR)は、実験中、22〜20℃及び湿度50%に保った。24匹のSHRを各群8匹ずつの3群に分けた。動物には以下の食餌:すなわち、基本食、50mg/kgのパッションフルーツ抽出物を補給した基本食、又は10mg/kgのパッションフルーツ抽出物を補給した基本食を与えた(表1)。摂取した食餌の量、体重及び収縮期血圧を週1回記録した。収縮期血圧はテイルカフ(tail cuff)法(Softron,Co.Ltd,東京、日本)によって測定した。8週間の給餌後、全ラットをネンブタール(Nembutal)(0.1mg/100g体重、Wako,Co.Ltd.,日本)での麻酔下で犠死させた。胸腺、脾臓、肝臓及び心臓を摘出し、重量測定した。毒性は観察されなかった。
実施例5:一酸化窒素測定
一酸化窒素の測定は既報通りに実施した(Rockett,KA.,Awburn,MM.,Cowden,WB.& Clark,JA.(1991)Infect.Immun.59:3280−3)。一酸化窒素は容易に亜硝酸塩に転化する。一酸化窒素を求めるために硝酸塩を測定した。NaNO2(BDH;Wako,Co.Ltd.,日本)と試験化合物の希釈液を蒸留水中、96穴平底プレートに製造し、最終体積50ulとした。20マイクロリットルのNH4Clホウ酸緩衝液を一酸化窒素/亜硝酸塩の分析を必要とする全てのウェルに加えた。次に50マイクロリットルのGriess試薬[2MのH2SO4中、1%のスルファニルアミド+0.1%のN−(1−ナフチル)エチレンジアミンジヒドロクロリド(Wako,Co.Ltd.,日本)]を一酸化窒素/亜硝酸塩について分析されるウェルに加えた。プレートを540nm(試験)で読み、一酸化窒素と亜硝酸塩濃度を亜硝酸塩標準曲線から直接読み取った。
実施例6:ヒトの研究
高血圧患者、すなわち57.0±14.48歳(平均±SD)の男性14人と57.56±12.75歳(平均±SD)の女性16人を研究に含めた。患者は、高血圧の検出、評価、及び治療に関する米国合同委員会(Joint National Committee on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure)のガイドラインによればステージ1及び2の高血圧を有していた。反復血圧測定で、彼らの収縮期血圧(SBP)は144〜210mmHg、拡張期血圧(DBP)は80〜120mmHgであった。除外基準は、腎疾患又は心疾患保有者、経口避妊薬服用者、喫煙及び飲酒、又は1日1個のマルチビタミン錠剤以外の何らかのビタミン剤の服用者であった。研究に含めた被験者はいずれも、利尿薬、β遮断薬及びACE阻害薬を含む抗高血圧薬併用療法を受けていた。100人を上回る人をふるいにかけて30人の参加者を選択した。この参加者のうち研究中の脱落者は一人もいなかった。
実施例7:パッションフルーツ果皮抽出物からのエデュリル酸の単離
実施例1に従って製造されたパッションフルーツ果皮抽出物を50%のエタノール水溶液に溶解し、Sephadex LH20カラム上で処理し、50%エタノール水溶液で溶離した。クロマトグラフィーのフラクションを20ml管にフラクションコレクターの助けを借りて回収した。フラクションは、セルロースTLCを用いる薄層クロマトグラフィー(6%酢酸水溶液で展開)によってモニタし、UV下で視覚化した。この条件下で新規化合物(Rf 0.8)が有色アントシアニンフラクション(Rf 0.4〜0.5)と共溶出した。このフラクションを回収し、濃縮して、Mitsubishi Chemical Industries Ltdから購入したMCI GEL CHP 20Pのカラム上で再度クロマトグラフィーにかけた。15%メタノール水溶液を溶離溶媒として用いた。フラクションを回収し、セルロースTLC(ターシャリーBuOH−AcOH−H2O(3/1/1 v/v)で展開)によってモニタした。新規化合物(この溶媒でRf 0.9)含有フラクションを回収し、溶媒を蒸発させ、残渣を凍結乾燥した。
実施例8:パッションフルーツ果肉中のエデュリル酸の検出
パッションフルーツ果肉の水性抽出物を、果皮に関して実施例1に記載したのと同様に製造し、その化学的特徴をHPLCを用いて調べた。アセトニトリルの代わりにメタノールを用いる異なるHPLC溶媒プログラムが、エデュリル酸とプルナシン(prunasin)のピークを分解するのにうまく使用できた。またUV検出の代わりに、プルナシンのような弱UV吸収化合物をよりよく検出するために蒸発光散乱検出(Evaporative Light Scattering Detection)(ELSD)を使用した。図7a及びbに、そのような条件下で得られた果皮及び果肉の抽出物のHPLCクロマトグラムをそれぞれ示す。果皮及び果肉の抽出物は、それらのHPLCの特徴によって明らかに区別可能であったが、エデュリル酸及びプルナシンは両方とも、どちらの抽出物中にも存在していたことも明らかとなった。
Claims (14)
- パッションフルーツ抽出物の製造法であって、
(a)パッションフルーツの果皮を水と接触させて水性抽出物と固体残渣とを得るステップと;
(b)前記水性抽出物を高分子マトリックスと接触させて該水性抽出物から少なくとも一つの成分を吸着させるステップと;そして
(c)前記成分を前記マトリックスから溶出するステップと
を含む方法。 - 溶出ステップが有機溶媒を使用する、請求項1に記載の方法。
- 有機溶媒が、エタノール、イソプロピルアルコール、メタノール、1−プロパノール、及びアセトンからなる群から選ばれる、請求項2に記載の方法。
- 高分子マトリックスが非イオン性高分子マトリックス樹脂である、請求項1に記載の方法。
- 高分子マトリックスを、水性抽出物との接触後、溶出ステップの前に水で洗浄するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法に従って製造されたパッションフルーツの抽出物。
- 哺乳動物における血圧の低下法であって、哺乳動物に有効量の請求項6の抽出物を投与することを含む方法。
- 哺乳動物における血清中一酸化窒素濃度の低下法であって、哺乳動物に有効量の請求項6の抽出物を投与することを含む方法。
- 哺乳動物における肝損傷の防止法であって、哺乳動物に有効量の請求項6の抽出物を投与することを含む方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項7〜9のいずれかに記載の方法。
- カテキン、シアニジン、エデュリル酸、エピカテキン、ルテオリン、フェニルピルビン酸、ケルセチン、及びそのような化合物のいずれかの配糖体からなる群の少なくとも一つの化合物を含む、請求項6に記載のパッションフルーツ果皮の抽出物。
- パッションフルーツの果皮のみが使用される、請求項1に記載の方法。
- 請求項13に記載の方法に従って製造された抽出物。
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