JP4100871B2 - タルトチェリー誘導製品を製造するための方法及び組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
関連出願に対するクロスレファレンス
この出願は、1999年３月24日提出の米国出願番号09/317,310、及び1999年２月16日提出の米国仮出願番号60/120,178に対して優先権を主張する。
合衆国政府の後援による研究又は開発に関する供述
なし
【０００２】
発明の背景
（１）発明の概要
本発明は、食用ベリー由来組成物、詳しくはチェリーの調製方法、及びそのベリー類由来組成物の植物性／栄養性食事サプリメントとして又は食品添加物としての使用方法に関する。詳細には、本発明は、食事サプリメント又は食品添加物として使用するためのアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を含有する天然ベリー組成物、詳しくはチェリーに関する。
【０００３】
（２）関連技術の説明
多くの植物由来化合物は、低レベルの活性酸素中間体を維持することによって細胞の抗酸化物として役立つそれら化合物の能力のため、プロスタグランジン合成を阻害することによる抗炎症剤として、又は細胞増殖に関与する酵素のインヒビターとして、食品に薬理学的又は「栄養的」形質を与えることもできる。これら活性は、癌、関節炎、及び循環器病を含む慢性疾患を改善するのに重要である（Kinsellaら,Food Tech. 85-89(1993)）。従って、天然産物について、食事サプリメント／食品業界及び栄養品会社は、合成抗酸化剤と同様に効率的に食品安定性を高めるばかりでなく、消費者に有意に健康的な利益をも提供できる化合物を利用する機会を持っている。
【０００４】
アントシアニンのような色素は、タルト(tart)チェリーにおける品質の指標とみなされている。最も重要なことに、最近の成果は、シアニジン-３-グルコシドのようなアントシアニンが強い抗酸化活性を有することを示した（Tsuda,T.ら,J.Agric.Food Chem. 42:2407-2410(1994)）。抗酸化剤の添加は、過酸化脂質に関係すると考えられている食品の賞味期限を延ばすポピュラーな方法の１つである。天然の抗酸化剤は発癌予防に重要な役割を演じうる。食事性抗酸化剤は、生体系における過酸化障害に対して有効である（Halliwell,B.及びJ.M.C.Gutteridge,生物学及び医学におけるフリーラジカル,オックスフォード大学出版,ニューヨーク 416-494(1989)；Osawa,T.ら,酸化障害に対する保護における食事性抗酸化剤の役割、抗変異原性及び抗癌性メカニズム；Kuroda,Y.；Shankel,D.M.,Waters,M.D.,Eds.；Plenum出版,ニューヨーク 139-453(1990)）。
【０００５】
初期の研究は、モンモランシー(MONTMORENCY)チェリーがアントシアニン シアニジン-３-ゲンチオビオシド及びシアニジン-３-ルチノシドを含むことを示した（Li,K.C.,ら,J.Am.Chem.Soc. 78:979-980(1956)）。また、７種の酸っぱいチェリー変種から６種でシアニジン-３-グルコシルルチノシドも見出された（Harborne,J.B.,ら,Phytochemistry 3:453-463(1964)）。Dekazos（Dekazos,E.D.,J.Food Sci. 35:237-241(1970)）は、モンモランシーチェリー中のアントシアニン色素を、シアニジン-３-ソフォロシド、シアニジン-３-ルチノシド及びシアニジン-３-グルコシドと共にペオニジン-３-ルチノシド、ペオニジン及びシアニジンとして報告した。しかし、シアニジン-３-グルコシド、シアニジン-３-ソフォロシド及びシアニジン-３-ルチノシドのみならずシアニジン-３-グルコシルルチノシドも、酸っぱいチェリーの主要色素として同定された。ＨＰＬＣ保持値を使用して、Chandraら（Chandra,A.,ら,J.Agric.Food Chem. 40:967-969(1992)）は、ミシガンで栽培されたモンモランシーチェリーではシアニジン-３-ソフォロシド及びシアニジン-３-グルコシドが、それぞれ主要及びマイナーアントシアニンであると報告した。同様に、シアニジン-３-キシロシルルチノシドが、モンモランシーチェリーのマイナー色素として検出された（Shrikhande,A.J.及びF.J.Francis,J.Food Sci. 38:649-651(1973)）。
【０００６】
先行技術では、バラトン(BALATON)及びモンモランシーチェリー分泌液から純粋なアントシアニン（図１の化合物１〜３）の生産は、まず該色素をAMBERLITE XAD-2（Sigma Chemicals）カラム上に吸収させることによって行った。溶離液がｐＨ約7.0になるまでカラムを水で洗浄した。他のフェノール類と共に吸収された色素は、ＭｅＯＨと共に溶離された。得られた粗製アントシアニンは、それぞれC-18 ＭＰＬＣ及びＨＰＬＣで分画及び精製され、分光学研究用の純粋なアントシアニンが得られた。AMBERLITE XAD-2による500mgの粗製モンモランシーアントシアニンの精製によって、60mgの純粋なアントシアニン１〜３を得、バラトン由来の391.43mgと比較した。この研究は、XAD-2から得られるモンモランシー由来の粗製アントシアニンが高パーセンテージの他の有機化合物を含むことを示した。AMBERLITE XAD-2は、樹脂の再利用ができなかった。いずれの目的でもフェノール類とアントシアニンの粗製混合物を使用する試みは為されなかった。Garbuttに対する米国特許第5,266,685号、Katzakianらに対する第5,665,783号及びMozaffarに対する第5,817,354号は、種々の吸収性樹脂及び無関係な製品に対するそれらの用途について記載している。これら特許は、吸収性樹脂の使用における技術の一般的な状態を例示しているだけである。
【０００７】
Plevaに対する米国特許第5,503,867号は、挽肉に全粉砕チェリーとオートブランを使用することについて記載している。使用するチェリーの量は、10〜15質量％であり、オートブランは、チェリーの分泌液を補うために添加されると考えられる。いずれにしても、チェリーは、明らかに肉及び一般には受け入れられないその製品の嗜好性に香味を与えている。
【０００８】
チェリー組織による低脂肪牛挽肉の安定化に関する最近の研究は、この植物源が、過酸化脂質を抑制するだけでなく、油で揚げる際の複素環芳香族アミンやコレステロール酸化物の生成を阻害する強力な抗酸化剤を含むことを示唆している（Gomaaら,IFT 抄録番号68E-7(1996)）。これら観察を説明するために使用される仮説は、チェリーのような高等植物の液胞でよく見られるフラボノイド、アントシアニン及びアントシアニジンのようなポリフェノールが、この抗酸化効果の原因であるということだった。
特に食事サプリメント／栄養品又は食品添加物として使用するための天然の食用ベリー誘導組成物に対する要望がある。
【０００９】
発明の概要
本発明は、組成物として食用ベリー由来のアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を含有する混合物を製造する方法であって、以下の工程を包含する方法に関する：
（ａ）ベリー由来のアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を含有する水溶液を供給する工程；
（ｂ）前記水溶液から、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を樹脂表面上に移動させる工程；
（ｃ）前記樹脂表面を溶離剤で溶離して、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を前記樹脂表面から移動させる工程；及び
（ｄ）前記溶離剤を前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類から分離する工程。
【００１０】
さらに、本発明は、組成物として食用ベリー由来のアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を製造する方法であって、以下の工程を包含する方法に関する：
（ａ）新鮮な又は急速冷凍かつ解凍されたチェリーの第１バッチを供給する工程；
（ｂ）前記ベリーを破壊し、かつその分泌液から果肉を分離する工程；
（ｃ）前記果肉から、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を水溶液中に抽出する工程；
（ｄ）前記果肉から分離された前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を含有する前記水溶液から、吸着剤樹脂粒子上に、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を移動させる工程；
（ｅ）前記樹脂粒子を低級アルカノールで洗浄して、前記樹脂粒子から、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を除去する工程；
（ｆ）前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類から、前記アルカノールを分離する工程；及び
（ｇ）第２バッチのベリーについて、前記分離されたアルカノールと、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類が除去された前記樹脂粒子で、工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程。
【００１１】
さらに、本発明は、以下を混合して含む消費組成物に関する：
（ａ）食用ベリーから分離されたアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類の乾燥混合物；及び
（ｂ）食品用グレードのキャリヤー。
但し、（ａ）対（ｂ）の質量比は、約0.1：100〜100：0.1の間である。
【００１２】
最後に、本発明は、哺乳類に、以下を混合して含む消費組成物を与える工程を包含する哺乳類に食物を与える方法に関する：
（ａ）食用ベリーから分離されたアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類の乾燥混合物；及び
（ｂ）食品用グレードのキャリヤー。
但し、（ａ）対（ｂ）の質量比は、約0.1：100〜100：0.1の間である。好ましくは、この組成物は、少なくとも部分的に、前記ベリーの乾燥された果肉を含有する。
【００１３】
用語「アントシアニン」は、キャリヤーに色を与える化合物を意味する。
用語「ビオフラボノイド」は、チェリーに含まれるイソフラボノイド及びフラボノイド化合物を意味する。
用語「フェノール類」は、フェニル基を有し、かつチェリー由来の１個以上のヒドロキシル基を有する化合物を指す。
食用ベリーのいくつかは、クランベリー、ラズベリー、ストロベリー、ブルーベリー、ブラックベリー、エルダーベリー、レッドグレープ、グースベリー、バルバドスチェリー（アセロラチェリー）及びチョークチェリーである。
【００１４】
目的
従って、本発明の目的は、食品中に又は食事サプリメント若しくは栄養品として使用可能な天然源食用ベリー組成物を提供することである。さらに、本発明の目的は、商業規模でこの組成物を分離する方法を提供することである。最終的に、本発明の目的は、経済的に調製でき、かつ使用しやすい天然源組成物を提供することである。これら及び他の目的は、以下の説明及び図面を参照することによりさらに明らかになるだろう。
【００１５】
好ましい実施形態の説明
本発明で使用するチェリーは、甘いか又は酸っぱくてよいが、後者が、他の有機酸に加えてタルト(tart)チェリーの酸味に寄与するリンゴ酸を高レベルで含有するので好ましい。本発明の方法は、食品に酸味及び香味を与えるために使用可能な、糖類含有リンゴ酸及び他の有機酸を分離する。最も好ましくは、バラトン及びモンモランシーチェリーである。
アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類の分離混合物は錠剤にして、天然栄養品／食事サプリメントとして使用できる。一般に、この錠剤は、１日量約１〜200mg、好ましくは１日量60〜100mgのアントシアニン及びビオフラボノイドを与える。100のチェリーは60〜100mgのアントシアニンを与える。フェノール類（図４）は、１日量0.1〜50mgの量で与えられる。100のチェリーは、１〜50mgのフェノール類を与える。アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類の量は、個々の化合物を単離し、それらを一緒にブレンドすることをによって調製することができる。樹脂によって単離されたアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類の天然混合物の使用が好ましい。
【００１６】
この樹脂はアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類が吸着される表面を有する。好ましい分類の吸着樹脂は、例えばRohm ＆ Haas Co.,フィラデルフィア,PAから商業的に入手可能なAMBERLITE XAD-4及びXAD-16のようなAMBERLITEシリーズの樹脂のような、スチレンとジビニルベンゼンで構成される高分子架橋樹脂である。本発明の使用に好適な他の高分子架橋スチレン及びジビニルベンゼン吸着樹脂は、Dow Chemical Company,ミッドランド,ミシガン製のXFS-4257、XFS-4022、XUS-40323及びXUS-40322等である。
【００１７】
商業的に入手可能な、必要な政府認可がされた、スチレン−ジビニル−ベンゼン（ＳＤＶＢ）架橋共重合樹脂（例えばAMBERLITE XAD-16）を使用することが好ましい。従って、好ましい実施形態では、Rohm ＆ Haas Companyから商業的に入手可能、かつ米国特許第4,297,220号に記載されているAMBERLITE XAD-16が樹脂として使用される。この樹脂は、非イオンの疎水性の架橋ポリエステルジビニルベンゼン吸着剤樹脂である。AMBERLITE XAD-16は、連続的な高分子相と連続的な細孔相を有するマクロ孔質構造を持っている。特に好ましい実施形態では、本発明で用いる樹脂は、100〜200μｍ(100〜200ミクロン)の範囲の粒径を有する。
【００１８】
100〜200μｍ(100〜200ミクロン)範囲の粒径の疎水性マクロ孔質樹脂ビーズを含むAMBERLITE XAD 吸着剤シリーズの吸着剤のような他の吸着剤も本発明の方法に有効であると考えられる。さらに、100〜200μｍ(100〜200ミクロン)の範囲の粒径で使用されるAMBERCHROM CGシリーズの吸着剤のような種々のバリエーションのAMBERLITESも本発明での使用に好適である。AMBERLITE XAD-16は多数回（100回以上）再利用できるので好ましい。しかし、食品のためには、本発明の政府認可樹脂が重要及び／又は望ましいと考えられる。
【００１９】
吸着されたアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類は、いずれの溶媒を用いて移動させてもよい。１〜４個の炭素原子を含む低級アルカノールが好ましく、エタノール（エチルアルコール）は食品用途で認可されているので最も好ましい。通常、エタノールは水と共沸される；しかし、無水エタノールを使用できる。チェリー中のリンゴ酸及び糖類を含有する水はカラムを通過する。これを収集し、かつ香味として食品に使用できる。
【００２０】
アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類は、好ましくはバラトン及びモンモランシーチェリーから分離される。該チェリーの組成は、1997年２月12日提出の米国特許出願番号08/799,788に一部が、また1998年12月11日提出の米国出願番号60/111,945に一部が、部分的に示されている。これら出願に記載されているように、モンモランシー（サンカオウトウ(Prunus cerasus)）変種が、ミシガン及び米国のタルトチェリー栽培の95％を超えている。しかし、新しいタルトチェリー栽培品種、バラトンタルトチェリー（P. cerasus）が、いくつかのミシガンの果樹園で、モンモランシーに代えて植えられている。このチェリーは、高いアントシアニン含量を有し、かつより良い変種とみなされている。モンモランシー及びバラトンタルトチェリーのアントシアニン含量については報告されている（Wangら,1997；Chandryら,1993）。しかし、バラトンタルトチェリー中の他のフェノール化合物の詳細な研究は、以前には行われなかった。初期の研究は、モンモランシーチェリーがシアニジン-３-ゲンチオビオシド及びシアニジン-３-ルチノシドを含むことを示した（Li、K.C.ら,J.Am.Chem.Soc. 78:979-980(1956)）。シアニジン-３-グルコシルルチノシドも、７種のタルトチェリー変種から６種で見出されており（Harbone,J.B.ら,Phytochemistry 3:453-463(1964)）、Dekazos（Dekazos,E.D.,J.Food Sci. 35:237-241(1970)）は、モンモランシーチェリーのアントシアニン色素を、シアニジン-３-ソフォロシド、シアニジン-３-ルチノシド及びシアニジン-３-グルコシドと共にペオニジン-３-ルチノシド、ペオニジン及びシアニジンとして報告した。しかし、シアニジン-３-グルコシド、シアニジン-３-ソフォロシド及びシアニジン-３-ルチノシドのみならず、シアニジン-３-グルコシルシルチノシドも酸っぱいチェリーの主要色素として同定された。ＨＰＬＣ保持値を用いて、Chandraらは（Chandra,A.ら,J.Agric.Food Chem. 40:967-969(1992)）、シアニジン-３-ソフォロシド及びシアニジン-３-グルコシドが、それぞれミシガンで成長したモンモランシーチェリーの主要アントシアニン及び少量アントシアニンであると報告した。同様に、シアニジン-３-キシロシルルチノシドが、モンモランシーチェリーの少量色素として検出された（Shrikhande,A.J.及びF.J.Francis,J.Food Sci. 38:649-651(1973)。
【００２１】
用語「キャリヤー」又は「充填剤」は、チェリーから精製された組成物の体積を増量するために添加される成分を意味するのに使用される。好ましくは乾燥されたチェリー果肉である。これらは、いずれの食用デンプン物質、無脂肪ドライミルクのようなタンパク質をも包含する。この群には、小麦粉、糖、ダイズミール、マルトデキストリン及び例えば塩、ペッパー、スパイス及びハーブのような種々の香辛料がある。充填剤は混合物の約10-6〜約106質量部の量で使用される。
【００２２】
該組成物は、食品の活性成分の約0.1〜10mg/gmの量で食品に導入される。量は、好ましくは食品の食味に影響せず、かつ最も有益な結果を果たすように選択される。食品は、当業者には周知のように、高い（ウェット）又は低い水分（ドライ）でよい。食事サプリメントとして使用される場合、錠剤は0.01〜１グラムの活性成分を含む。
【００２３】
植物化学薬品の抽出及び単離の方法（Chandra,A.ら,J.Agric.Food Chem. 41:1062(1992)；Wang,H.ら,J.Agric.Food Chem. 45:0556-2560(1997)）、及び抗酸化活性の高速スクリーニングが開発されている（Arora,A.及びG.M.Strasburg,J.Amer.Oil Chem.Soc. 74:1031-1040(1997)）。これら方法を用いて、バラトン及びモンモランシーチェリー由来の抗酸化化合物を同定し、かつ特徴づける。分泌されたチェリー組織は連続的にヘキサン、エチルアセテート及びメタノールで抽出される。メタノールとエチルアセテートフラクションは、両方ともスクリーニングアッセイで強い抗酸化活性を示した。エチルアセテートフラクションをシリカゲル吸引液体クロマトグラフィーでさらに精製して、４つのサブフラクションを得た；最も強い抗酸化活性を示したサブフラクションを、分取逆相ＨＰＬＣでさらに７つのフラクションに分離した。図２及び３は、バラトンチェリーから単離されたビオフラボノイドを示す。このように、タルトチェリーには多数の類似体又は相同体がある。
【００２４】
２つの新規なフェノール化合物が同定された：
Ｉ）１-(３'-４'-ジヒドロキシシンナミル)-２,３-ジヒドロキシシクロペンタン、及び II）１-(３'-４'-ジヒドロキシシンナミル)-２,５-ジヒドロキシシクロペンタン。チェリー果実のエチルアセテート抽出液から単離され、かつ分光法で特徴づけられた他の化合物としては、以下が挙げられる：１-(３'-メトキシ,４'-ヒドロキシシンナミル)キナ酸、２-ヒドロキシ-３-(２'-ヒドロキシフェニル)プロパン酸、メチル２-ヒドロキシ-３-(２'-ヒドロキシフェニル)プロパノエート、Ｄ(＋)-リンゴ酸、β-シトステロール及びβ-シトステロールグルコシド。図４は、単離されたフェノール類のいくつかを示す。また、分泌フラクションから得られたアントシアニン成分は同定され、かつ完全に特徴づけられており（Chandra,A.ら,J.Agric.Food Chem. 41:1062(1992)；Wang,H.ら,J.Agric.Food Chem. 45:2556-2560(1997)）；その結果は、これら化合物が強力な抗酸化活性を含むことを示している。
【００２５】
（実施例１及び２）
図５に示されるように、個々の急速冷凍（ＩＱＦ）チェリー（核が取り除かれた）を解凍し、かつ工業用WARINGブレンダーでブレンドした。混合物を10,000rpmで遠心分離にかけて分泌液をデカントした。残渣の果肉をチーズクロスでさらに搾って、いかなる付加分泌液をも除去した。
果肉は、15℃で凍結乾燥した。分泌液をAMBERLITE XAD-16 HP 樹脂上で処理して、チェリー酸味、アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を得た。XAD-16樹脂、１kgをエタノール（１〜２Ｌ）で洗浄してから水（６Ｌ）で洗浄した。XAD16樹脂を１時間水中に静置後、ガラスカラム（内径10×90cm長）中に綿栓で装填した。充填カラムを水（２Ｌ）で洗浄後、分離用に分泌液を装填した。800mLの分泌液毎に精製した。分泌液をカラムの表面上に添加し、流れないように安定させた。それを水で溶離し、最初の１Ｌを捨てた。次の２Ｌの洗浄液は、チェリー由来のリンゴ酸及び糖を含んでいるので酸味のあるチェリー分泌液を含んでいるので収集した。カラムをさらに、バラトンの場合は４Ｌの水で、モンモランシーチェリー分泌液は５Ｌの水で洗浄した。チェリー分泌液を収集したら、水による洗浄の残留物を捨てた。そして、カラムをエタノールで（1.3〜1.5Ｌ）溶離し、アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を含有する赤色溶液を収集した（700〜800mL）。カラムの水をきり、10Ｌの水で洗浄した後、このプロセスを多数回繰り返した（100回以上）。
【００２６】
その赤色のアルコール性溶液を減圧下（2.7Pa(20ミリトル)）エバポレートしてエタノールを除去し、その水溶液を50ppmのアスコルビン酸で安定化し、10℃で凍結乾燥した。赤色粉末を収集して貯蔵した。
実施例１の結果：
バラトンチェリー
ＩＱＦチェリーの質量 15.74kg
乾燥果肉の質量 605ｇ
分泌液の体積 12.16Ｌ
アントシアニン、ビオフラボノイド
及びフェノール類の質量（赤色粉末） 31.35ｇ
酸っぱい副生物（リンゴ酸と糖類） ＠35Ｌ
実施例２の結果：
モンモランシーチェリー
ＩＱＦチェリーの質量 30.45kg
乾燥果肉の質量 895ｇ
分泌液の体積 24.03Ｌ
アントシアニン、ビオフラボノイド
及びフェノール類の質量（赤色粉末） 47ｇ
酸っぱい副生物（リンゴ酸と糖類） ＠75Ｌ
実施例１及び２の赤色粉末は、好ましくはキャリヤーとして乾燥果肉と共に混合して、該キャリヤーを含めて１〜1000mgの錠剤にする（１成人１日量）。
【００２７】
種々の食品グレードの酸を分離されたアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類に添加して、分解を防止することができる。好ましくは、それらは香味を加えない。アスコルビン酸（ビタミンＣ）が好ましい。酸はチェリー化合物の乾燥の前後、いずれでも添加できる。
小規模加工では、凍結乾燥を使用して水を除去する。大規模生産では、空気循環オーブン内での乾燥が好ましい。
【００２８】
（実施例３）
図６に示されるように、開放容器１０は、それぞれバルブ１３及び１４を有する入口ライン１１及び出口ライン１２を備える。樹脂ビーズ１５は、開放容器１０内に供給される。水が容器１０中に導入されて、出口ライン１２を経て除去され、捨てられる。実施例１におけるように、チェリー分泌液（果肉又は核のない）が容器１０に導入され、２５分間静置される。水と分泌液の温度は、約２０〜３０℃である。リンゴ酸及び糖類を含有するチェリー分泌液残渣を出口ライン１２から取り出し、食品調味料として保存する。そして、溶器内の樹脂１５を入口ライン１１からの水で再洗浄し、除去して出口ライン１２から排水する。そして、95％エタノールを入口ライン１１から導入して樹脂粒子上のアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を抽出する。アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を含有するエタノールを容器１０から取り出す。エタノールをアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類から除去し、窒素下フラッシュドライングで乾燥する。生じる粉末は、実施例１と同様に、好ましくは乾燥チェリー果肉又は他のキャリヤーと混合する。樹脂粒子を水で洗浄して、樹脂とエタノールは多数回再利用する。
【００２９】
（実施例４）
チェリー由来の粗製エチルアセテート抽出液（アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類含有）は、抗酸化活性についての蛍光分析によって、種々の条件下水溶液中で試験した。まず、蛍光分析について述べる。
抗酸化活性の蛍光分析（一般）：抗酸化活性について非常に多くの化合物又は抽出液をスクリーニングするためには、その組成物単独の又は食品中での構造及び機能特性を合理的にうまく表すモデルシステム（又は複数のシステム）の利用が必要である。また、試験は高感度、迅速かつ安価でなければならない。抗酸化効率を評価するために、蛍光に基づいたアッセイが使用された（Arora,A.及びG.M.Straburg,J.Am.Chem.Soc. (1996)）。過酸化の主要部位の１つである生体膜に非常に似ている１-ステアロイル-２-リノレオイル-sn-グリセロ-３-ホスホコリンから成る大きい単層ベシクルを調製した。蛍光プローブ、１,６-ジフェニルヘキサトリエンプロピオン酸をその膜内に組み入れて、極性の先端基が水性界面の近くにプローブを固定し、一方疎水性部分がその脂肪酸鎖に平行に位置するようにした。このプローブが過酸化の際に生成されるフリーラジカルと反応し、その結果経時的に蛍光強度が減少する。過酸化インヒビター（第１鉄イオン又はフリーラジカルゼネレータＡＡＰＨ（アゾビス-[２-アミジノプロパンハイドロクロライド]のような）を使用してその反応を開始させ、試験すべき抗酸化組成物の存在する場合と存在しない場合で、蛍光性の減少の速度論を決定する。現在、ある濃度の化合物についてのアッセイは、簡単な蛍光光度計で、２１分しかかからず、数ミクログラムの脂肪しか消費しないで容易に行うことができる。
【００３０】
MacDonaldらによって（MacDonald,R,C.ら,Biochem.Biophys.Acta 1061:297-3038(1991）)概要が述べられ手順に従って、１-ステアロイル-２-リノレオイル-sn-グリセロ-３-ホスホコリンから、大きい単層ベシクル（ＬＵＶｓ）を調製した。要するに、その脂質をクロロホルムに溶解し、回転式エバポレータで乾燥して薄膜にした。乾燥膜を水性懸濁液中で再懸濁し、Liposofastピポソーム(piposome)押出機（Avestin,Inc.,オタワ,カナダ）を用いて、100nmの孔サイズのポリカーボネートフィルターを通して押し出した。ベシクルのサイズ均一性（80〜100nm）及び単層の性質は、凍結−破壊走査型電子顕微鏡で確認した。調製時、モル比１：350（プローブ：脂質）でベシクル中に、蛍光プローブ、ジフェニルヘキサトリエン-プロピオン酸（ＤＰＨ-ＰＡ）を組み入れた。蛍光実験のため、ＤＰＨ-ＰＡを含有するＬＵＶｓを、最終濃度100μMで100mM ＮａＣｌ、50mMトリス-ＨＥＰＥＳ緩衝液にｐＨ7.0で懸濁する。蛍光プローブを384nmで励起させ、423nmで発光を検出した。脂質酸化は、第１鉄イオン又はフリーラジカルジェネレータＡＡＰＨを添加することによってＬＵＶｓで阻害され；２１分間の間に生成されるフリーラジカルとの反応の結果生じるＤＰＨ-ＰＡの蛍光強度の減少によって、その進行を観察した。時間の関数としての蛍光強度の減少のプロットを利用して、脂質酸化の速度論を決定した。結果は、エチレンアセテートによる粗製アントシアニン抽出物の混合物が酸化の阻害に有効であることを示している。
【００３１】
アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類の溶媒抽出を使用することができる；しかし、これは生成物を食品として使用する場合には高価なので好ましくない。好ましい吸着剤樹脂を使用すると、この工程は必要ない。クロマトグラフィーで成分を分離かつ再混合することもできる；しかし、これは高圧液体クロマトグラフィーを必要とするので、本発明の目的のためには高価すぎる。
【００３２】
（実施例５）
Wangら,J.Nat.Products 62:294-296(1999)；Wangら,J.of Ag.and Food Chemistry,47:840-844(1999)及びWangら,J.of Nat.Products,62:86-88(1999)に記載されたようなアッセイで、シクロオキシゲナーゼＩ及びII（ＣＯＸ-Ｉ及びＣＯＸ-II）を用いて、組成物の消炎活性について試験した。その結果、該組成物は消炎活性、特にＣＯＸ-Ｉ及びＣＯＸ-IIの強い阻害を示した。
【００３３】
（参考例６、７及び８）
ラズベリー、ブルーベリー、及びブラックベリーの加工：
ラズベリー（339ｇ）、ブルーベリー(350ｇ)及びブラックベリー(670ｇ)を解凍し、別々に工業用Waringブレンダーで500mLの水と共にブレンドした。混合物を10,00rpmで２０分間遠心分離にかけ、分泌液をデカントした。残渣（果肉）を、チーズクロスでさらに搾って、いかなる付加分泌液も除去した。遠心分離後の分泌液は、約775mL（ラズベリー）、700mL（ブルーベリー）、及び1100mL（ブラックベリー）だった。
【００３４】
果肉を１５℃で凍結乾燥した。分泌液は、XAD-16樹脂上で処理して、糖及び酸からアントシアニン及びフェノール類を分離した。XAD-16樹脂（１kg）をエタノール（１〜２Ｌ）で洗浄してから水（６Ｌ）で洗浄した。樹脂を１時間水中に静置後、分離用分泌液を装填した。800mLの分泌液毎に精製した。分泌液をカラムの表面上に添加し、流れないように安定させた。水で溶離し最初の１Ｌを捨てた。次の２Ｌの洗浄物は糖及び酸が含まれるので収集した。カラムをさらに３Ｌの水ですべての分泌液について洗浄した。糖及び酸の除去後、カラムをエタノールで（ラズベリーとブルーベリーについては1.3Ｌ、ブラックベリーについては1.0Ｌ）いちいち洗浄しアントシアニン及びフェノール類を含有する赤色溶液を収集した（700mL）。カラムの水分をきり、10Ｌの水で洗浄後、この処理を繰り返した。
【００３５】
そして、赤色のアルコール性溶液を減圧下エバポレートしてエタノールを除去し、その水溶液を５０ppmのアスコルビン酸で安定化し、１０℃で凍結乾燥した。赤色粉末を収集し、２０℃で貯蔵した。結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
前述の説明は、本発明の単なる例示であり、かつ本発明は特許請求の範囲によってのみ制限されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 バラトン及びモンモランシーチェリーから単離されるアントシアニン（色素）の構造を示しており、アグリコンシアニジンは３位にヒドロキシル基を有する。
【図２】 1998年12月11日提出の仮出願番号60/111,945に記載されているように、チェリーから単離される主要ビオフラボノイドを示す図である。
【図３】 1998年12月11日提出の仮出願番号60/111,945に記載されているように、チェリーから単離される主要ビオフラボノイドを示す図である。
【図４】 タルトチェリーから単離されるフェノール類を示す。
【図５】 実施例１及び２に記載された本発明の方法の工程を示す。
【図６】 アントシアニン及びフェノール類をチェリー分泌液から移動させる樹脂ビーズを保持するための開放容器１０の使用を示す概略図である。
【符号の説明】
１０ 開放容器
１１ 入口ライン
１２ 出口ライン
１３ バルブ
１４ バルブ
１５ 樹脂
関連出願に対するクロスレファレンス
この出願は、1999年３月24日提出の米国出願番号09/317,310、及び1999年２月16日提出の米国仮出願番号60/120,178に対して優先権を主張する。
合衆国政府の後援による研究又は開発に関する供述
なし
【０００２】
発明の背景
（１）発明の概要
本発明は、食用ベリー由来組成物、詳しくはチェリーの調製方法、及びそのベリー類由来組成物の植物性／栄養性食事サプリメントとして又は食品添加物としての使用方法に関する。詳細には、本発明は、食事サプリメント又は食品添加物として使用するためのアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を含有する天然ベリー組成物、詳しくはチェリーに関する。
【０００３】
（２）関連技術の説明
多くの植物由来化合物は、低レベルの活性酸素中間体を維持することによって細胞の抗酸化物として役立つそれら化合物の能力のため、プロスタグランジン合成を阻害することによる抗炎症剤として、又は細胞増殖に関与する酵素のインヒビターとして、食品に薬理学的又は「栄養的」形質を与えることもできる。これら活性は、癌、関節炎、及び循環器病を含む慢性疾患を改善するのに重要である（Kinsellaら,Food Tech. 85-89(1993)）。従って、天然産物について、食事サプリメント／食品業界及び栄養品会社は、合成抗酸化剤と同様に効率的に食品安定性を高めるばかりでなく、消費者に有意に健康的な利益をも提供できる化合物を利用する機会を持っている。
【０００４】
アントシアニンのような色素は、タルト(tart)チェリーにおける品質の指標とみなされている。最も重要なことに、最近の成果は、シアニジン-３-グルコシドのようなアントシアニンが強い抗酸化活性を有することを示した（Tsuda,T.ら,J.Agric.Food Chem. 42:2407-2410(1994)）。抗酸化剤の添加は、過酸化脂質に関係すると考えられている食品の賞味期限を延ばすポピュラーな方法の１つである。天然の抗酸化剤は発癌予防に重要な役割を演じうる。食事性抗酸化剤は、生体系における過酸化障害に対して有効である（Halliwell,B.及びJ.M.C.Gutteridge,生物学及び医学におけるフリーラジカル,オックスフォード大学出版,ニューヨーク 416-494(1989)；Osawa,T.ら,酸化障害に対する保護における食事性抗酸化剤の役割、抗変異原性及び抗癌性メカニズム；Kuroda,Y.；Shankel,D.M.,Waters,M.D.,Eds.；Plenum出版,ニューヨーク 139-453(1990)）。
【０００５】
初期の研究は、モンモランシー(MONTMORENCY)チェリーがアントシアニン シアニジン-３-ゲンチオビオシド及びシアニジン-３-ルチノシドを含むことを示した（Li,K.C.,ら,J.Am.Chem.Soc. 78:979-980(1956)）。また、７種の酸っぱいチェリー変種から６種でシアニジン-３-グルコシルルチノシドも見出された（Harborne,J.B.,ら,Phytochemistry 3:453-463(1964)）。Dekazos（Dekazos,E.D.,J.Food Sci. 35:237-241(1970)）は、モンモランシーチェリー中のアントシアニン色素を、シアニジン-３-ソフォロシド、シアニジン-３-ルチノシド及びシアニジン-３-グルコシドと共にペオニジン-３-ルチノシド、ペオニジン及びシアニジンとして報告した。しかし、シアニジン-３-グルコシド、シアニジン-３-ソフォロシド及びシアニジン-３-ルチノシドのみならずシアニジン-３-グルコシルルチノシドも、酸っぱいチェリーの主要色素として同定された。ＨＰＬＣ保持値を使用して、Chandraら（Chandra,A.,ら,J.Agric.Food Chem. 40:967-969(1992)）は、ミシガンで栽培されたモンモランシーチェリーではシアニジン-３-ソフォロシド及びシアニジン-３-グルコシドが、それぞれ主要及びマイナーアントシアニンであると報告した。同様に、シアニジン-３-キシロシルルチノシドが、モンモランシーチェリーのマイナー色素として検出された（Shrikhande,A.J.及びF.J.Francis,J.Food Sci. 38:649-651(1973)）。
【０００６】
先行技術では、バラトン(BALATON)及びモンモランシーチェリー分泌液から純粋なアントシアニン（図１の化合物１〜３）の生産は、まず該色素をAMBERLITE XAD-2（Sigma Chemicals）カラム上に吸収させることによって行った。溶離液がｐＨ約7.0になるまでカラムを水で洗浄した。他のフェノール類と共に吸収された色素は、ＭｅＯＨと共に溶離された。得られた粗製アントシアニンは、それぞれC-18 ＭＰＬＣ及びＨＰＬＣで分画及び精製され、分光学研究用の純粋なアントシアニンが得られた。AMBERLITE XAD-2による500mgの粗製モンモランシーアントシアニンの精製によって、60mgの純粋なアントシアニン１〜３を得、バラトン由来の391.43mgと比較した。この研究は、XAD-2から得られるモンモランシー由来の粗製アントシアニンが高パーセンテージの他の有機化合物を含むことを示した。AMBERLITE XAD-2は、樹脂の再利用ができなかった。いずれの目的でもフェノール類とアントシアニンの粗製混合物を使用する試みは為されなかった。Garbuttに対する米国特許第5,266,685号、Katzakianらに対する第5,665,783号及びMozaffarに対する第5,817,354号は、種々の吸収性樹脂及び無関係な製品に対するそれらの用途について記載している。これら特許は、吸収性樹脂の使用における技術の一般的な状態を例示しているだけである。
【０００７】
Plevaに対する米国特許第5,503,867号は、挽肉に全粉砕チェリーとオートブランを使用することについて記載している。使用するチェリーの量は、10〜15質量％であり、オートブランは、チェリーの分泌液を補うために添加されると考えられる。いずれにしても、チェリーは、明らかに肉及び一般には受け入れられないその製品の嗜好性に香味を与えている。
【０００８】
チェリー組織による低脂肪牛挽肉の安定化に関する最近の研究は、この植物源が、過酸化脂質を抑制するだけでなく、油で揚げる際の複素環芳香族アミンやコレステロール酸化物の生成を阻害する強力な抗酸化剤を含むことを示唆している（Gomaaら,IFT 抄録番号68E-7(1996)）。これら観察を説明するために使用される仮説は、チェリーのような高等植物の液胞でよく見られるフラボノイド、アントシアニン及びアントシアニジンのようなポリフェノールが、この抗酸化効果の原因であるということだった。
特に食事サプリメント／栄養品又は食品添加物として使用するための天然の食用ベリー誘導組成物に対する要望がある。
【０００９】
発明の概要
本発明は、組成物として食用ベリー由来のアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を含有する混合物を製造する方法であって、以下の工程を包含する方法に関する：
（ａ）ベリー由来のアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を含有する水溶液を供給する工程；
（ｂ）前記水溶液から、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を樹脂表面上に移動させる工程；
（ｃ）前記樹脂表面を溶離剤で溶離して、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を前記樹脂表面から移動させる工程；及び
（ｄ）前記溶離剤を前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類から分離する工程。
【００１０】
さらに、本発明は、組成物として食用ベリー由来のアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を製造する方法であって、以下の工程を包含する方法に関する：
（ａ）新鮮な又は急速冷凍かつ解凍されたチェリーの第１バッチを供給する工程；
（ｂ）前記ベリーを破壊し、かつその分泌液から果肉を分離する工程；
（ｃ）前記果肉から、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を水溶液中に抽出する工程；
（ｄ）前記果肉から分離された前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を含有する前記水溶液から、吸着剤樹脂粒子上に、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を移動させる工程；
（ｅ）前記樹脂粒子を低級アルカノールで洗浄して、前記樹脂粒子から、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を除去する工程；
（ｆ）前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類から、前記アルカノールを分離する工程；及び
（ｇ）第２バッチのベリーについて、前記分離されたアルカノールと、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類が除去された前記樹脂粒子で、工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程。
【００１１】
さらに、本発明は、以下を混合して含む消費組成物に関する：
（ａ）食用ベリーから分離されたアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類の乾燥混合物；及び
（ｂ）食品用グレードのキャリヤー。
但し、（ａ）対（ｂ）の質量比は、約0.1：100〜100：0.1の間である。
【００１２】
最後に、本発明は、哺乳類に、以下を混合して含む消費組成物を与える工程を包含する哺乳類に食物を与える方法に関する：
（ａ）食用ベリーから分離されたアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類の乾燥混合物；及び
（ｂ）食品用グレードのキャリヤー。
但し、（ａ）対（ｂ）の質量比は、約0.1：100〜100：0.1の間である。好ましくは、この組成物は、少なくとも部分的に、前記ベリーの乾燥された果肉を含有する。
【００１３】
用語「アントシアニン」は、キャリヤーに色を与える化合物を意味する。
用語「ビオフラボノイド」は、チェリーに含まれるイソフラボノイド及びフラボノイド化合物を意味する。
用語「フェノール類」は、フェニル基を有し、かつチェリー由来の１個以上のヒドロキシル基を有する化合物を指す。
食用ベリーのいくつかは、クランベリー、ラズベリー、ストロベリー、ブルーベリー、ブラックベリー、エルダーベリー、レッドグレープ、グースベリー、バルバドスチェリー（アセロラチェリー）及びチョークチェリーである。
【００１４】
目的
従って、本発明の目的は、食品中に又は食事サプリメント若しくは栄養品として使用可能な天然源食用ベリー組成物を提供することである。さらに、本発明の目的は、商業規模でこの組成物を分離する方法を提供することである。最終的に、本発明の目的は、経済的に調製でき、かつ使用しやすい天然源組成物を提供することである。これら及び他の目的は、以下の説明及び図面を参照することによりさらに明らかになるだろう。
【００１５】
好ましい実施形態の説明
本発明で使用するチェリーは、甘いか又は酸っぱくてよいが、後者が、他の有機酸に加えてタルト(tart)チェリーの酸味に寄与するリンゴ酸を高レベルで含有するので好ましい。本発明の方法は、食品に酸味及び香味を与えるために使用可能な、糖類含有リンゴ酸及び他の有機酸を分離する。最も好ましくは、バラトン及びモンモランシーチェリーである。
アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類の分離混合物は錠剤にして、天然栄養品／食事サプリメントとして使用できる。一般に、この錠剤は、１日量約１〜200mg、好ましくは１日量60〜100mgのアントシアニン及びビオフラボノイドを与える。100のチェリーは60〜100mgのアントシアニンを与える。フェノール類（図４）は、１日量0.1〜50mgの量で与えられる。100のチェリーは、１〜50mgのフェノール類を与える。アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類の量は、個々の化合物を単離し、それらを一緒にブレンドすることをによって調製することができる。樹脂によって単離されたアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類の天然混合物の使用が好ましい。
【００１６】
この樹脂はアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類が吸着される表面を有する。好ましい分類の吸着樹脂は、例えばRohm ＆ Haas Co.,フィラデルフィア,PAから商業的に入手可能なAMBERLITE XAD-4及びXAD-16のようなAMBERLITEシリーズの樹脂のような、スチレンとジビニルベンゼンで構成される高分子架橋樹脂である。本発明の使用に好適な他の高分子架橋スチレン及びジビニルベンゼン吸着樹脂は、Dow Chemical Company,ミッドランド,ミシガン製のXFS-4257、XFS-4022、XUS-40323及びXUS-40322等である。
【００１７】
商業的に入手可能な、必要な政府認可がされた、スチレン−ジビニル−ベンゼン（ＳＤＶＢ）架橋共重合樹脂（例えばAMBERLITE XAD-16）を使用することが好ましい。従って、好ましい実施形態では、Rohm ＆ Haas Companyから商業的に入手可能、かつ米国特許第4,297,220号に記載されているAMBERLITE XAD-16が樹脂として使用される。この樹脂は、非イオンの疎水性の架橋ポリエステルジビニルベンゼン吸着剤樹脂である。AMBERLITE XAD-16は、連続的な高分子相と連続的な細孔相を有するマクロ孔質構造を持っている。特に好ましい実施形態では、本発明で用いる樹脂は、100〜200μｍ(100〜200ミクロン)の範囲の粒径を有する。
【００１８】
100〜200μｍ(100〜200ミクロン)範囲の粒径の疎水性マクロ孔質樹脂ビーズを含むAMBERLITE XAD 吸着剤シリーズの吸着剤のような他の吸着剤も本発明の方法に有効であると考えられる。さらに、100〜200μｍ(100〜200ミクロン)の範囲の粒径で使用されるAMBERCHROM CGシリーズの吸着剤のような種々のバリエーションのAMBERLITESも本発明での使用に好適である。AMBERLITE XAD-16は多数回（100回以上）再利用できるので好ましい。しかし、食品のためには、本発明の政府認可樹脂が重要及び／又は望ましいと考えられる。
【００１９】
吸着されたアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類は、いずれの溶媒を用いて移動させてもよい。１〜４個の炭素原子を含む低級アルカノールが好ましく、エタノール（エチルアルコール）は食品用途で認可されているので最も好ましい。通常、エタノールは水と共沸される；しかし、無水エタノールを使用できる。チェリー中のリンゴ酸及び糖類を含有する水はカラムを通過する。これを収集し、かつ香味として食品に使用できる。
【００２０】
アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類は、好ましくはバラトン及びモンモランシーチェリーから分離される。該チェリーの組成は、1997年２月12日提出の米国特許出願番号08/799,788に一部が、また1998年12月11日提出の米国出願番号60/111,945に一部が、部分的に示されている。これら出願に記載されているように、モンモランシー（サンカオウトウ(Prunus cerasus)）変種が、ミシガン及び米国のタルトチェリー栽培の95％を超えている。しかし、新しいタルトチェリー栽培品種、バラトンタルトチェリー（P. cerasus）が、いくつかのミシガンの果樹園で、モンモランシーに代えて植えられている。このチェリーは、高いアントシアニン含量を有し、かつより良い変種とみなされている。モンモランシー及びバラトンタルトチェリーのアントシアニン含量については報告されている（Wangら,1997；Chandryら,1993）。しかし、バラトンタルトチェリー中の他のフェノール化合物の詳細な研究は、以前には行われなかった。初期の研究は、モンモランシーチェリーがシアニジン-３-ゲンチオビオシド及びシアニジン-３-ルチノシドを含むことを示した（Li、K.C.ら,J.Am.Chem.Soc. 78:979-980(1956)）。シアニジン-３-グルコシルルチノシドも、７種のタルトチェリー変種から６種で見出されており（Harbone,J.B.ら,Phytochemistry 3:453-463(1964)）、Dekazos（Dekazos,E.D.,J.Food Sci. 35:237-241(1970)）は、モンモランシーチェリーのアントシアニン色素を、シアニジン-３-ソフォロシド、シアニジン-３-ルチノシド及びシアニジン-３-グルコシドと共にペオニジン-３-ルチノシド、ペオニジン及びシアニジンとして報告した。しかし、シアニジン-３-グルコシド、シアニジン-３-ソフォロシド及びシアニジン-３-ルチノシドのみならず、シアニジン-３-グルコシルシルチノシドも酸っぱいチェリーの主要色素として同定された。ＨＰＬＣ保持値を用いて、Chandraらは（Chandra,A.ら,J.Agric.Food Chem. 40:967-969(1992)）、シアニジン-３-ソフォロシド及びシアニジン-３-グルコシドが、それぞれミシガンで成長したモンモランシーチェリーの主要アントシアニン及び少量アントシアニンであると報告した。同様に、シアニジン-３-キシロシルルチノシドが、モンモランシーチェリーの少量色素として検出された（Shrikhande,A.J.及びF.J.Francis,J.Food Sci. 38:649-651(1973)。
【００２１】
用語「キャリヤー」又は「充填剤」は、チェリーから精製された組成物の体積を増量するために添加される成分を意味するのに使用される。好ましくは乾燥されたチェリー果肉である。これらは、いずれの食用デンプン物質、無脂肪ドライミルクのようなタンパク質をも包含する。この群には、小麦粉、糖、ダイズミール、マルトデキストリン及び例えば塩、ペッパー、スパイス及びハーブのような種々の香辛料がある。充填剤は混合物の約10-6〜約106質量部の量で使用される。
【００２２】
該組成物は、食品の活性成分の約0.1〜10mg/gmの量で食品に導入される。量は、好ましくは食品の食味に影響せず、かつ最も有益な結果を果たすように選択される。食品は、当業者には周知のように、高い（ウェット）又は低い水分（ドライ）でよい。食事サプリメントとして使用される場合、錠剤は0.01〜１グラムの活性成分を含む。
【００２３】
植物化学薬品の抽出及び単離の方法（Chandra,A.ら,J.Agric.Food Chem. 41:1062(1992)；Wang,H.ら,J.Agric.Food Chem. 45:0556-2560(1997)）、及び抗酸化活性の高速スクリーニングが開発されている（Arora,A.及びG.M.Strasburg,J.Amer.Oil Chem.Soc. 74:1031-1040(1997)）。これら方法を用いて、バラトン及びモンモランシーチェリー由来の抗酸化化合物を同定し、かつ特徴づける。分泌されたチェリー組織は連続的にヘキサン、エチルアセテート及びメタノールで抽出される。メタノールとエチルアセテートフラクションは、両方ともスクリーニングアッセイで強い抗酸化活性を示した。エチルアセテートフラクションをシリカゲル吸引液体クロマトグラフィーでさらに精製して、４つのサブフラクションを得た；最も強い抗酸化活性を示したサブフラクションを、分取逆相ＨＰＬＣでさらに７つのフラクションに分離した。図２及び３は、バラトンチェリーから単離されたビオフラボノイドを示す。このように、タルトチェリーには多数の類似体又は相同体がある。
【００２４】
２つの新規なフェノール化合物が同定された：
Ｉ）１-(３'-４'-ジヒドロキシシンナミル)-２,３-ジヒドロキシシクロペンタン、及び II）１-(３'-４'-ジヒドロキシシンナミル)-２,５-ジヒドロキシシクロペンタン。チェリー果実のエチルアセテート抽出液から単離され、かつ分光法で特徴づけられた他の化合物としては、以下が挙げられる：１-(３'-メトキシ,４'-ヒドロキシシンナミル)キナ酸、２-ヒドロキシ-３-(２'-ヒドロキシフェニル)プロパン酸、メチル２-ヒドロキシ-３-(２'-ヒドロキシフェニル)プロパノエート、Ｄ(＋)-リンゴ酸、β-シトステロール及びβ-シトステロールグルコシド。図４は、単離されたフェノール類のいくつかを示す。また、分泌フラクションから得られたアントシアニン成分は同定され、かつ完全に特徴づけられており（Chandra,A.ら,J.Agric.Food Chem. 41:1062(1992)；Wang,H.ら,J.Agric.Food Chem. 45:2556-2560(1997)）；その結果は、これら化合物が強力な抗酸化活性を含むことを示している。
【００２５】
（実施例１及び２）
図５に示されるように、個々の急速冷凍（ＩＱＦ）チェリー（核が取り除かれた）を解凍し、かつ工業用WARINGブレンダーでブレンドした。混合物を10,000rpmで遠心分離にかけて分泌液をデカントした。残渣の果肉をチーズクロスでさらに搾って、いかなる付加分泌液をも除去した。
果肉は、15℃で凍結乾燥した。分泌液をAMBERLITE XAD-16 HP 樹脂上で処理して、チェリー酸味、アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を得た。XAD-16樹脂、１kgをエタノール（１〜２Ｌ）で洗浄してから水（６Ｌ）で洗浄した。XAD16樹脂を１時間水中に静置後、ガラスカラム（内径10×90cm長）中に綿栓で装填した。充填カラムを水（２Ｌ）で洗浄後、分離用に分泌液を装填した。800mLの分泌液毎に精製した。分泌液をカラムの表面上に添加し、流れないように安定させた。それを水で溶離し、最初の１Ｌを捨てた。次の２Ｌの洗浄液は、チェリー由来のリンゴ酸及び糖を含んでいるので酸味のあるチェリー分泌液を含んでいるので収集した。カラムをさらに、バラトンの場合は４Ｌの水で、モンモランシーチェリー分泌液は５Ｌの水で洗浄した。チェリー分泌液を収集したら、水による洗浄の残留物を捨てた。そして、カラムをエタノールで（1.3〜1.5Ｌ）溶離し、アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を含有する赤色溶液を収集した（700〜800mL）。カラムの水をきり、10Ｌの水で洗浄した後、このプロセスを多数回繰り返した（100回以上）。
【００２６】
その赤色のアルコール性溶液を減圧下（2.7Pa(20ミリトル)）エバポレートしてエタノールを除去し、その水溶液を50ppmのアスコルビン酸で安定化し、10℃で凍結乾燥した。赤色粉末を収集して貯蔵した。
実施例１の結果：
バラトンチェリー
ＩＱＦチェリーの質量 15.74kg
乾燥果肉の質量 605ｇ
分泌液の体積 12.16Ｌ
アントシアニン、ビオフラボノイド
及びフェノール類の質量（赤色粉末） 31.35ｇ
酸っぱい副生物（リンゴ酸と糖類） ＠35Ｌ
実施例２の結果：
モンモランシーチェリー
ＩＱＦチェリーの質量 30.45kg
乾燥果肉の質量 895ｇ
分泌液の体積 24.03Ｌ
アントシアニン、ビオフラボノイド
及びフェノール類の質量（赤色粉末） 47ｇ
酸っぱい副生物（リンゴ酸と糖類） ＠75Ｌ
実施例１及び２の赤色粉末は、好ましくはキャリヤーとして乾燥果肉と共に混合して、該キャリヤーを含めて１〜1000mgの錠剤にする（１成人１日量）。
【００２７】
種々の食品グレードの酸を分離されたアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類に添加して、分解を防止することができる。好ましくは、それらは香味を加えない。アスコルビン酸（ビタミンＣ）が好ましい。酸はチェリー化合物の乾燥の前後、いずれでも添加できる。
小規模加工では、凍結乾燥を使用して水を除去する。大規模生産では、空気循環オーブン内での乾燥が好ましい。
【００２８】
（実施例３）
図６に示されるように、開放容器１０は、それぞれバルブ１３及び１４を有する入口ライン１１及び出口ライン１２を備える。樹脂ビーズ１５は、開放容器１０内に供給される。水が容器１０中に導入されて、出口ライン１２を経て除去され、捨てられる。実施例１におけるように、チェリー分泌液（果肉又は核のない）が容器１０に導入され、２５分間静置される。水と分泌液の温度は、約２０〜３０℃である。リンゴ酸及び糖類を含有するチェリー分泌液残渣を出口ライン１２から取り出し、食品調味料として保存する。そして、溶器内の樹脂１５を入口ライン１１からの水で再洗浄し、除去して出口ライン１２から排水する。そして、95％エタノールを入口ライン１１から導入して樹脂粒子上のアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を抽出する。アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を含有するエタノールを容器１０から取り出す。エタノールをアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類から除去し、窒素下フラッシュドライングで乾燥する。生じる粉末は、実施例１と同様に、好ましくは乾燥チェリー果肉又は他のキャリヤーと混合する。樹脂粒子を水で洗浄して、樹脂とエタノールは多数回再利用する。
【００２９】
（実施例４）
チェリー由来の粗製エチルアセテート抽出液（アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類含有）は、抗酸化活性についての蛍光分析によって、種々の条件下水溶液中で試験した。まず、蛍光分析について述べる。
抗酸化活性の蛍光分析（一般）：抗酸化活性について非常に多くの化合物又は抽出液をスクリーニングするためには、その組成物単独の又は食品中での構造及び機能特性を合理的にうまく表すモデルシステム（又は複数のシステム）の利用が必要である。また、試験は高感度、迅速かつ安価でなければならない。抗酸化効率を評価するために、蛍光に基づいたアッセイが使用された（Arora,A.及びG.M.Straburg,J.Am.Chem.Soc. (1996)）。過酸化の主要部位の１つである生体膜に非常に似ている１-ステアロイル-２-リノレオイル-sn-グリセロ-３-ホスホコリンから成る大きい単層ベシクルを調製した。蛍光プローブ、１,６-ジフェニルヘキサトリエンプロピオン酸をその膜内に組み入れて、極性の先端基が水性界面の近くにプローブを固定し、一方疎水性部分がその脂肪酸鎖に平行に位置するようにした。このプローブが過酸化の際に生成されるフリーラジカルと反応し、その結果経時的に蛍光強度が減少する。過酸化インヒビター（第１鉄イオン又はフリーラジカルゼネレータＡＡＰＨ（アゾビス-[２-アミジノプロパンハイドロクロライド]のような）を使用してその反応を開始させ、試験すべき抗酸化組成物の存在する場合と存在しない場合で、蛍光性の減少の速度論を決定する。現在、ある濃度の化合物についてのアッセイは、簡単な蛍光光度計で、２１分しかかからず、数ミクログラムの脂肪しか消費しないで容易に行うことができる。
【００３０】
MacDonaldらによって（MacDonald,R,C.ら,Biochem.Biophys.Acta 1061:297-3038(1991）)概要が述べられ手順に従って、１-ステアロイル-２-リノレオイル-sn-グリセロ-３-ホスホコリンから、大きい単層ベシクル（ＬＵＶｓ）を調製した。要するに、その脂質をクロロホルムに溶解し、回転式エバポレータで乾燥して薄膜にした。乾燥膜を水性懸濁液中で再懸濁し、Liposofastピポソーム(piposome)押出機（Avestin,Inc.,オタワ,カナダ）を用いて、100nmの孔サイズのポリカーボネートフィルターを通して押し出した。ベシクルのサイズ均一性（80〜100nm）及び単層の性質は、凍結−破壊走査型電子顕微鏡で確認した。調製時、モル比１：350（プローブ：脂質）でベシクル中に、蛍光プローブ、ジフェニルヘキサトリエン-プロピオン酸（ＤＰＨ-ＰＡ）を組み入れた。蛍光実験のため、ＤＰＨ-ＰＡを含有するＬＵＶｓを、最終濃度100μMで100mM ＮａＣｌ、50mMトリス-ＨＥＰＥＳ緩衝液にｐＨ7.0で懸濁する。蛍光プローブを384nmで励起させ、423nmで発光を検出した。脂質酸化は、第１鉄イオン又はフリーラジカルジェネレータＡＡＰＨを添加することによってＬＵＶｓで阻害され；２１分間の間に生成されるフリーラジカルとの反応の結果生じるＤＰＨ-ＰＡの蛍光強度の減少によって、その進行を観察した。時間の関数としての蛍光強度の減少のプロットを利用して、脂質酸化の速度論を決定した。結果は、エチレンアセテートによる粗製アントシアニン抽出物の混合物が酸化の阻害に有効であることを示している。
【００３１】
アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類の溶媒抽出を使用することができる；しかし、これは生成物を食品として使用する場合には高価なので好ましくない。好ましい吸着剤樹脂を使用すると、この工程は必要ない。クロマトグラフィーで成分を分離かつ再混合することもできる；しかし、これは高圧液体クロマトグラフィーを必要とするので、本発明の目的のためには高価すぎる。
【００３２】
（実施例５）
Wangら,J.Nat.Products 62:294-296(1999)；Wangら,J.of Ag.and Food Chemistry,47:840-844(1999)及びWangら,J.of Nat.Products,62:86-88(1999)に記載されたようなアッセイで、シクロオキシゲナーゼＩ及びII（ＣＯＸ-Ｉ及びＣＯＸ-II）を用いて、組成物の消炎活性について試験した。その結果、該組成物は消炎活性、特にＣＯＸ-Ｉ及びＣＯＸ-IIの強い阻害を示した。
【００３３】
（参考例６、７及び８）
ラズベリー、ブルーベリー、及びブラックベリーの加工：
ラズベリー（339ｇ）、ブルーベリー(350ｇ)及びブラックベリー(670ｇ)を解凍し、別々に工業用Waringブレンダーで500mLの水と共にブレンドした。混合物を10,00rpmで２０分間遠心分離にかけ、分泌液をデカントした。残渣（果肉）を、チーズクロスでさらに搾って、いかなる付加分泌液も除去した。遠心分離後の分泌液は、約775mL（ラズベリー）、700mL（ブルーベリー）、及び1100mL（ブラックベリー）だった。
【００３４】
果肉を１５℃で凍結乾燥した。分泌液は、XAD-16樹脂上で処理して、糖及び酸からアントシアニン及びフェノール類を分離した。XAD-16樹脂（１kg）をエタノール（１〜２Ｌ）で洗浄してから水（６Ｌ）で洗浄した。樹脂を１時間水中に静置後、分離用分泌液を装填した。800mLの分泌液毎に精製した。分泌液をカラムの表面上に添加し、流れないように安定させた。水で溶離し最初の１Ｌを捨てた。次の２Ｌの洗浄物は糖及び酸が含まれるので収集した。カラムをさらに３Ｌの水ですべての分泌液について洗浄した。糖及び酸の除去後、カラムをエタノールで（ラズベリーとブルーベリーについては1.3Ｌ、ブラックベリーについては1.0Ｌ）いちいち洗浄しアントシアニン及びフェノール類を含有する赤色溶液を収集した（700mL）。カラムの水分をきり、10Ｌの水で洗浄後、この処理を繰り返した。
【００３５】
そして、赤色のアルコール性溶液を減圧下エバポレートしてエタノールを除去し、その水溶液を５０ppmのアスコルビン酸で安定化し、１０℃で凍結乾燥した。赤色粉末を収集し、２０℃で貯蔵した。結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
前述の説明は、本発明の単なる例示であり、かつ本発明は特許請求の範囲によってのみ制限されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 バラトン及びモンモランシーチェリーから単離されるアントシアニン（色素）の構造を示しており、アグリコンシアニジンは３位にヒドロキシル基を有する。
【図２】 1998年12月11日提出の仮出願番号60/111,945に記載されているように、チェリーから単離される主要ビオフラボノイドを示す図である。
【図３】 1998年12月11日提出の仮出願番号60/111,945に記載されているように、チェリーから単離される主要ビオフラボノイドを示す図である。
【図４】 タルトチェリーから単離されるフェノール類を示す。
【図５】 実施例１及び２に記載された本発明の方法の工程を示す。
【図６】 アントシアニン及びフェノール類をチェリー分泌液から移動させる樹脂ビーズを保持するための開放容器１０の使用を示す概略図である。
【符号の説明】
１０ 開放容器
１１ 入口ライン
１２ 出口ライン
１３ バルブ
１４ バルブ
１５ 樹脂
Claims (13)
- 組成物としてタルトチェリー由来のアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を含有し、かつリンゴ酸及び糖類を含まない混合物を製造する方法であって、前記フェノール類が以下から成る群から選択される少なくとも1つのフェノール類を含み、
【化１】
；
および、以下の工程を包含する方法：
（ａ）前記タルトチェリー由来のアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を含有する水溶液を供給する工程；
（ｂ）前記水溶液から、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を樹脂表面上に移動させる工程；
（ｃ）前記樹脂表面を溶離剤で溶離して、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を前記樹脂表面から移動させる工程；及び
（ｄ）前記溶離剤を前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類から分離する工程。 - 組成物としてタルトチェリーからのアントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類の、リンゴ酸及び糖類を含まない混合物を製造する方法であって、前記フェノール類が以下から成る群から選択される少なくとも1つのフェノール類を含み、
【化４】
；
および、以下の工程を包含する方法：
（ａ）新鮮な又は急速冷凍及び解凍されたタルトチェリーの第１バッチを供給する工程；
（ｂ）前記タルトチェリーを破壊し、かつその分泌液から果肉を分離する工程；
（ｃ）前記果肉から、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を水溶液中に抽出する工程；
（ｄ）前記果肉から分離された前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を含有する前記水溶液から、吸着剤樹脂粒子上に、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を移動させる工程；
（ｅ）前記樹脂粒子を低級アルカノールで洗浄して、前記樹脂粒子から、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類を除去する工程；
（ｆ）前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類から、前記アルカノールを分離する工程；及び
（ｇ）第２バッチのタルトチェリーについて、前記分離されたアルカノールと、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類が除去された前記樹脂粒子で、工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程。 - 前記アルカノールが、エタノールである請求項２に記載の方法。
- 前記チェリーが、個々に急速凍結されている請求項２又は３に記載の方法。
- 前記樹脂粒子が、カラムの形態である請求項２又は３に記載の方法。
- 前記タルトチェリーが、バラトンタルトチェリー又はモンモランシーチェリーからなる群より選択される請求項２又は３に記載の方法。
- 前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類が前記タルトチェリー由来の果肉と混合され、それから乾燥される請求項１に記載の方法。
- 前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類が乾燥され、それから前記タルトチェリーの乾燥果肉と混合される請求項１に記載の方法。
- 前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類が前記タルトチェリー由来の果肉と混合され、それから乾燥される請求項２又は３に記載の方法。
- 前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類が乾燥され、それから乾燥タルトチェリー果肉と混合される請求項２又は３に記載の方法。
- さらに、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類と前記果肉との前記混合物が錠剤に形成される請求項７に記載の方法。
- さらに、前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類が、前記タルトチェリー由来の果肉と混合され、それから乾燥され、かつ前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類と前記果肉との前記混合物が錠剤に形成される請求項２又は３に記載の方法。
- 前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類が乾燥され、それから前記タルトチェリーの乾燥果肉と混合され、かつ前記アントシアニン、ビオフラボノイド及びフェノール類と前記果肉との前記混合物が錠剤に形成される請求項２又は３に記載の方法。
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