DE112010001347T5

DE112010001347T5 - Verfahren zur Herstellung von kristallinen und nicht-hygroskopischen phenolreichen Farbfraktionen aus Pflanzen

Info

Publication number: DE112010001347T5
Application number: DE112010001347T
Authority: DE
Inventors: Arun K. SINHA; Upendra Kumar Sharma; Abhishek Sharma; Nandini Sharma
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2009-03-24
Filing date: 2010-03-12
Publication date: 2012-07-05
Also published as: WO2010109286A1

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein grünes Verfahren zur Isolation von nicht hygroskopischen und kristallinen Farbfraktionen aus verschiedenen phenolreichen Pflanzen, nämlich wie Rhododendron arboreum, Hippophae rhamnoides, Camellia sinensis, Rheum emodi, Ginkgo biloba, Glycirrhiza glabra, Coffea arabica, Rubia tinctorum, Rubia cordifolia, Punica granatum, Emblica officinalis, Capsicum spp., Citrus sinensis Schale, Syzygium cumini, Curcuma spp., Aloe Vera, Nyctanthes arbortristis, Quercus infectoria, Juglans nigra, Acacia nilotica, Berberis spp., Tagetes spp., Schleichera oleosa, Lawsonia inermis, Hibiscus spp., Daucus carota ssp. sativus var. atrorubens Alef. (schwarze Möhre), Trigonella foenum-graecum, Spinacia oleracea, Stevia rebaudiana, Acacia catechu, Butea spp., Rumex spp., Terminalia chebula und dergleichen. Die Farbfraktionen sind Befunden zufolge bei Umgebungstemperaturen und gegenüber Angriff durch Mikroben stabil. Das Verfahren umfasst die Extraktion (Mikrowelle, Ultraschall, Perkolation, Rückfluss und Soxhlet) von getrocknetem Pulver aus Pflanzenmaterial mit einem alkoholischen/hydroalkoholischen Lösungsmittel. Konzentrieren des extrahierten Lösungsmittels im Vakuum, Verdünnen des Extraktes mit Wasser, Filtrieren und darauf folgendes Leiten des Filtrates durch die Harzsäule zur Reinigung. Die Säule wird zuerst mit Wasser gewaschen, um die wasserlöslichen, hygroskopischen Komponenten zu entfernen. Danach wird die Säule mit Alkohol eluiert, so dass man den kristallinen Farbstoff erhält, der Befunden zufolge antioxidative und phenolreiche Beschaffenheit aufweist.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von phenolreichen, kristallinen und nicht hygroskopischen natürlichen Farben aus Pflanzenextrakten. Sie betrifft insbesondere ein grünes Verfahren zur Herstellung natürlicher Farben aus Pflanzenextrakten, wobei Pflanzen, die verschiedene phenolische Verbindungen enthalten, einschließlich Flavonoiden, Isoflavonoiden, Tanninen, Lignanen, Neolignanen, Stilbenoiden, Chinonen, Phenolsäuren und ihren Derivaten usw. verwendet werden, damit man Farbfraktionen erhält, die neben verschiedenen therapeutischen Aktivitäten, einschließlich Antioxidans-Aktivität usw. mehrfache Vorteile aufweisen, wie u. a nicht hygroskopische kristalline Beschaffenheit, verbesserte Stabilität, Reproduzierbarkeit bei der Produktion von Farben und Löslichkeit in Wasser und Alkohol. Das entwickelte Protokoll verwendet grüne Extraktionswerkzeuge, wie Mikrowelle und Ultraschall, die ihre Umweltfreundlichkeit steigern. Das Verfahren eignet sich zur Isolation von Farbfraktionen aus verschiedenen Pflanzen, nämlich, Rhododendron arboreum, Hippophae rhamnoides, Camellia sinensis, Rheum emodi, Ginkgo biloba, Glycirrhiza glabra, Coffea arabica, Rubia tinctorum, Rubia cordifolia, Punica granatum, Emblica officinalis, Capsicum spp., Citrus sinensis-Schale, Syzygium cumini, Curcuma spp., Aloe Vera, Nyctanthes arbortristis, Quercus infectoria, Juglans nigra, Acacia nilotica, Berberis spp., Tagetes spp., Schleichera oleosa, Lawsonia inermis, Hibiscus spp., Daucus carota ssp. sativus var. atrorubens Alef. (schwarze Möhre), Trigonella foenum-graecum, Spinacia oleracea, Momordica charantia, Stevia rebaudiana, Acacia catechu, Butea spp., Rumex spp., Terminalia chebula und dergleichen. Die Farben, die aus dem erfindungsgemäßen Verfahren hergeleitet werden, enthalten ein starkes Potential zur Anwendung bei Kosmetika (einschließlich Haarfarben), Textilien, Nahrungsmitteln und Getränken, in der Landwirtschafts- und Pharmaindustrie.
Hintergrund der Erfindung
”Natürlicher Farbstoff” steht für Farben, die aus pflanzen, Insekten und Mineralsubstraten erhalten werden und die zum Färben in der Kosmetik-, Pharma-, Textil- und Nahrungsmittelindustrie verwendet werden. Das Pflanzenreich bietet eine große Quelle für natürliche Farbstoffe/Farben, die sich aus verschiedenen Pflanzenteilen erhalten lassen. Die natürlichen Haupt-Farbstoff/Farbsubstanzen, die weltweit verwendet werden, wurden aus den Blättern, Früchten, Samen, Blüten, Borken und Wurzeln von farbstoffliefernden Pflanzen extrahiert. In prähistorischen Zeiten verwendete der Mensch zum Färben von Fellen, Textilien und anderen Gegenständen natürliche Pflanzensubstanzen und im geringeren Maße auch Substanzen aus Tieren. Mit dem Zugang synthetischer Farbersatzstoffe für natürliche Farbstoffe im 18. und 19. Jahrhundert nahm die Verwendung von natürlichem Farbstoff in den meisten Teilen der Welt ab. Dies beruht auf der Tatsache, dass synthetische Farbstoffe billiger und leichter zu verwenden sind. Aufgrund von strikten Umweltstandards, die in vielen Ländern als Antwort auf toxische und allergische Reaktionen, die mit synthetischen Farbstoffen einhergehen, auferlegt werden, besteht ein erneutes Interesse an der Verwendung natürlicher Farbstoffe/Farben für verschiedene Anwendungen.
Viele der Pflanzen werden aufgrund ihrer medizinischen Eigenschaften beschrieben und werden im traditionellen System der Medizin verschiedentlich verwendet. Beispielsweise: Rhododendron arboreum (Ericaceae), das örtlich auch als Baras bezeichnet wird, ist im westlichen Himalaya üblich und tritt vorwiegend in einer Höhe von 5000–8000 Fuß auf. Die Wurzeln, Blätter und Blüten von R. arboreum sind eine wichtige Rohstoffquelle für Arzneimittel im traditionellen und modernen System der Arzneimittel. Die Blüten werden auch zur Heilung von Diarrhoe, Fieber und Kopfschmerz verwendet und besitzen bekanntlich auch eine entzündungshemmende Aktivität [Swaroop et al., Chromatographia, 2005, 62, 649–652].
Entsprechend wurde Hippophae rhamnoides (Elaeagnaceae), das gemeinhin als Sanddorn bezeichnet wird, ausgiebig im traditionellen Medizinsystem in Tibet, in der Mongolei und China zur Behandlung von Kreislaufstörungen, Wundheilung, Hautstörungen, Leberverletzung usw. verwendet [Beveridge et al., J. Agric. Food Chem., 1999, 47, 3480–3488; Eccleston et al., J. Nutr. Biochem., 2002, 13, 346–354]. Moderne medizinische Forschungen haben ergeben, dass H. rhamnoides ein hocheffizientes radioprotektives, hepatoprotektives, gastroprotektives Mittel ist [Sharma R. K., Arora R., in Herbal Drugs: A Twenty First Century perspective, Jaypee publications, New Delhi, 2006, S 317–321].
Entsprechend werden andere Pflanzen, wie Camellia sinensis, Rheum emodi, Ginkgo biloba, Glycirrhiza glabra, Coffea arabica, Rubia tinctorum, Rubia cordifolia, Punica granatum, Emblica officinalis, Capsicum spp., Citrus sinensis-Schale, Syzygium cumini, Curcuma spp., Aloe Vera, Nyctanthes arbortristis, Quercus infectoria, Juglans nigra, Acacia nilotica, Berberis spp., Tagetes spp., Schleichera oleosa, Lawsonia inermis, Hibiscus spp., Daucus carota ssp. sativus var. atrorubens Alef. (schwarze Möhre), Trigonella foenum-graecum, Spinacia oleracea, Momordica charantia, Stevia rebaudiana, Acacia catechu, Butea spp., Rumex spp., Terminalia chebula und dergleichen von den Einheimischen über die Jahrhunderte als Nahrungsmittel, Farbstoffe und für medizinische Zwecke verwendet.
Natürliche Farbstoffe bzw. Farben sind umweltfreundlicher als synthetische Farbstoffe, die eine bessere biologische Abbaubarkeit aufweisen und im Allgemeinen eine höhere Kompatibilität mit der Umgebung haben [F. A. Nagia, R. S. R. EL-Mohamedy, Dyes und Pigments, 2006, 1–6]. Eine Reihe von Untersuchungen wurde für die Extraktion von Farbstoffen bzw. Farben aus natürlichen Quellen, wie Pflanzen [ US-4156077 , US-4358286 ], Meeresorganismen [ US-7012093 B2 ], Pilzen [ WO9831824 ] und anderen Pflanzenteilen beschrieben.
Die folgenden Literaturstellen des Standes der Technik sind nachstehend offenbart:
U.S. Patent Nr. US-4302200 offenbart ein Verfahren zum Extrahieren von Farbstoffen des Anthocyanin-Typs aus Naturprodukten.
U.S. Patent Nr. US-4383833 offenbart ein Verfahren für natürliche genießbare Farbstoffpräparate aus Bohnenhülsen, die rote Farbtöne ergeben.
U.S. Patent Nr. US-4452822 offenbart ein Verfahren zur Extraktion und Intensivierung von Anthocyaninen aus Weintrester und anderem Material.
WO 2006061847 A1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines pflanzlichen schwarzen Farbstoffes aus natürlichen Materialien, umfassend die Extrakte von Juglans regia, Indigofera tinctoria, Terminalia chebula, Acacia sinuata, Lawsonia inermis, Trigonella foenum-graecum, Sapindus mukorossi, Eclipta alba, Emblica officinalis, Acacia catechu und Piper betle.
US Patent-6406503 B1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines natürlichen schwarzen Farbstoffs aus Walnussschalen.
US Patent Nr. US-3963700 offenbart ein Verfahren zur Gewinnung von Anthocyanin aus Pflanzenquellen.
US Patent Nr. US-5789647 offenbart ein Verfahren zur Extraktion natürlicher Carotinoid-Farbstoffe.
WO 2004072182 A2 offenbart ein neues Verfahren zum Färben von Textilartikeln aus medizinisch reichhaltigen Kräutern.
EP Patent Nr. EP-0754734 A1 offenbart ein einfaches Verfahren zur Herstellung natürlicher Farbstoffe aus verschiedenen Teilen von Pflanzen, wie Granatapfel, Dolu und Tesu etc.
Einige andere typische Literaturstellen des Standes der Technik umfassen Bioresource Tech, 2005, 96, 363–372; Industrial Crops und Products, 1997, 6, 303–311; Int. J. Food Sci. Tech, 2004, 39, 1087–1091; Int. J. Food Sci. Tech, 2000, 35, 5–22; J. Cleaner Production, 2003, 11, 499–509; Int. J. Pharmaceutics, 2002, 241, 293–299; J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 2772–2776; Industrial Crops und Products, 2003, 17, 199–207.
In einem Großteil des Standes der Technik wird im Allgemeinen Wasser oder ein hydroalkoholisches Gemisch zur Extraktion verwendet, das bei der Lyophilisation oder beim Sprühtrocknen bei hohen Temperaturen farbliefernde Produkte erzeugt. Ein großes Problem, das jedoch bei den vorstehenden Verfahren auftritt, ist, dass die Farbstoffe im Allgemeinen viskos/hygroskopisch werden, wenn sie einige Zeit der Luft ausgesetzt sind, da die Extrakte gewöhnlich mit Wasser oder einem hydroalkoholischen Gemisch als Lösungsmittel hergestellt werden, das zur Anwesenheit verschiedener Arten von Zuckereinheiten, Fettsäuren oder anderen primären Metaboliten zusammen mit dem erforderlichen Farbstoffprodukt führt. Schließlich wird das Farbprodukt gegenüber einem mikrobiellen Angriff sehr stark anfällig. Somit erfordern solche Farbstoffe Zusätze, wie Konservierungsmittel und Schädlingsbekämpfungsmittel, wie sie in der europäischen Patentanmeldung EP 0754734A1 erwähnt werden, so dass die Lebensdauer verlängert wird.
Die Verwendung von Säuren oder Basen während der Extraktion von Farbstoffen aus natürlichen Quellen ist ebenfalls weitverbreitet, wie es im US-Patent 4156077 und EP 0754734A1 erwähnt wird. Ein solches stringentes Extraktionsverfahren führt zum Abbau einiger aktiver Bestandteile, was zu einer verminderten therapeutischen Aktivität und geringerem Interesse bei den Verbrauchern zum Gebrauch in Nahrungsmittelprodukten und Kosmetika führt.
Darüber hinaus variiert der Gehalt an farbaktiven Verbindungen in Pflanzen gewöhnlich mit Umweltveränderungen, Aufbewahrungs-Bedingungen und der Art der Extraktion, was zu Abwandlungen bei den Farbstoffertragseigenschaften der Extrakte führt.
Zudem sollte man angemessen erwähnen, dass die Isolation von natürlichen Farbstoffen auf Einzelmolekül-Basis aufgrund ihrer Anwesenheit in Spuren gewöhnlich arbeitsintensiv und somit nicht billig ist. Gleichzeitig verschlechtern mögliche Zersetzungen eines Luft-, Licht- und wärmeempfindlichen Moleküls weiter die Qualität des natürlichen Farbstoffs auf Einzelmolekül-Basis. Zur Lösung der vorstehend genannten Probleme möchte man farbstoffreiche Fraktionen anstelle von Farbstoffen auf Einzelmolekül-Basis erhalten, welche bessere therapeutische Eigenschaften und Stabilität aufgrund von synergistischen Effekten aufweisen.
Der Einfachheit halber und sogar für die Notwendigkeit zum Auffinden neuer Quellen, aus denen natürliche Farbstoffe bzw. Farben extrahiert werden können, stammt die vorliegende Erfindung aus einer Forschungsarbeit, die sich mit der Isolation natürlicher Farbstoffe pflanzlichen Ursprungs beschäftigte, und insbesondere aus Pflanzen, die reich an phenolischen Verbindungen sind, wie Flavonoiden, Isoflavonoiden, Tanninen, Lignanen, Neolignanen, Stilbenoiden, Chinonen, Phenolsäuren und ihren Derivaten etc. Die erfindungsgemäß verwendeten Pflanzen, nämlich Rhododendron arboreum, Hippophae rhamnoides, Camellia sinensis, Rheum emodi, Ginkgo biloba, Glycirrhiza glabra, Coffea arabica, Rubia tinctorum, Rubia cordifolia, Punica granatum, Emblica officinalis, Capsicum spp., Citrus sinensis-Schale, Syzygium cumini, Curcuma spp., Aloe Vera, Nyctanthes arbortristis, Quercus infectoria, Juglans nigra, Acacia nilotica, Berberis spp., Tagetes spp., Schleichera oleosa, Lawsonia inermis, Hibiscus spp., Daucus carota ssp. sativus var. atrorubens Alef. (schwarze Möhre), Trigonella foenum-graecum, Spinacia oleracea, Momordica charantia, Stevia rebaudiana, Acacia catechu, Butea spp., Rumex spp., Terminalia chebula und dergleichen werden von den Einheimischen seit Jahrhunderten für Nahrungs- und Medizinzwecke verwendet, so dass eine erhaltene Farbfraktion für den menschlichen Gebrauch sicher und nicht toxisch ist, wie es durch die Toxizitätsdaten für Farbstoff, erhalten aus Rhododendron arboreum, gezeigt wurde. Zudem haben diese phenolreichen Pflanzen eine Unmenge an bioaktiven Eigenschaften, wie Antioxidans-, Antikrebs-, Antimutagen-, Antimikrobielle, Pestizid- Antimalaria-, Proteinbindungs-Kapazität und Radioprotektion, die der isolierten Farbfraktion dieser Pflanzen verliehen wird, was einen erhöhten therapeutischen und kommerziellen Wert ergibt. In diesem Zusammenhang offenbart unsere Erfindung ein einfaches und grünes Verfahren zur Herstellung nicht hygroskopischer kristalliner natürlicher Farbstoffe aus den Extrakten verschiedener phenolreicher Pflanzen mit umweltfreundlichen Extraktionstechniken, wie Mikrowellen- und ultraschallgestützter Extraktion. Die erfindungsgemäß isolierten Farbstoffe besitzen Befunden zufolge mehrere vorteilhafte Eigenschaften, wie kristalline Form, nicht hygroskopische Beschaffenheit, verbesserte Lebensdauer, Undurchlässigkeit für Mikroben und Antioxidans-Eigenschaften (gemessen als % Hemmung gemäß DPPH Assay), welche gleichzeitig die physikalisch-chemische Stabilität und das medizinische Profil der isolierten Farbstoffe steigern. Die Anwesenheit bioaktiver phenolischer Verbindungen, d. h. Chlorogensäure, Syringasäure, P-Cumarinsäure, Quercetin, Quercitrin, Quercetin-3-O-galactosid, Rutin, Isorhamnetin-3-O-glucosid, Isorhamnetin und Kaempferol erhöht die medizinischen Vorteile der isolierten Farbstoffe. Das Verfahren wurde effizient angewendet zur Isolation kristalliner Farbfraktion aus verschiedenen kommerziell wichtigen farbstoffliefernden Pflanzen, wie Rhododendron arboreum, Hippophae rhamnoides, Camellia sinensis, Rheum emodi, Ginkgo biloba, Glycirrhiza glabra, Coffea arabica, Rubia tinctarum, Rubia cordifolia, Punica granatum, Emblica officinalis, Capsicum spp., Citrus sinensis-Schale, Syzygium cumini, Curcuma spp., Aloe Vera, Nyctanthes arbortristis, Quercus infectoria, Juglans nigra, Acacia nilotica, Berberis spp., Tagetes spp., Schleichera oleosa, Lawsonia inermis, Hibiscus spp., Daucus carota ssp. sativus var. atrorubens Alef. (schwarze Möhre), Trigonella foenum-graecum, Spinacia oleracea, Momordica charantia, Stevia rebaudiana, Acacia catechu, Butea spp., Rumex spp., Terminalia chebula und dergleichen.
Aufgaben der Erfindung
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen und grünen Verfahrens des in der Einleitung beschriebenen Typs, mit dem kristalline und nicht hygroskopische phenolreiche Farbfraktionen, die verschiedene Bioaktivitäten besitzen, wie Antioxidanseigenschaften, angemessen aus verschiedenen Pflanzenteilen mittels grüner Extraktionstechniken, wie Mikrowelle oder Ultraschall, produziert werden können, so dass die Nachteile, die mit solchen vorhergehenden Berichten einhergehen, beseitigt werden.
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines grünen, einfachen, effizienten und kommerziell machbaren Verfahrens zur Isolation farbstoffreicher Fraktionen aus Pflanzen.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Isolation phenolreicher Fraktionen aus Pflanzenmaterialien und ist nicht auf einzelnes Pflanzenmaterial oder Pflanzen eingeschränkt.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist der Einsatz der umweltfreundlichen Mikrowellentechnik zur Extraktion der natürlichen Farben.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist der Einsatz der umweltfreundlichen Ultraschalltechnik zur Extraktion der natürlichen Farben.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Reduktion der Extraktionszeit in Minuten, von Tagen, die bei dem herkömmlichen Extraktionsverfahren nötig sind.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung einer Zusammensetzung mit erhöhten bioaktiven Eigenschaften, einschließlich Antioxidans und somit mit erhöhter kommerzieller Bedeutung.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung eines einfachen Reinigungsverfahrens für die Farbstoffe bzw. Farben aus den vorstehend genannten Pflanzen.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens, das weniger schädliche oder unschädliche Lösungsmittel für die Extraktion der farbstoffreichen Fraktionen verwendet und die wiederverwendet werden können.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung eines einfachen Reinigungsverfahrens, das bei der Extraktion und Säulenreinigung keine Säure/Basen-Behandlung verwendet.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung natürlicher Farben mit mehrfachen Vorteilen, wie kristalline Form, nicht hygroskopische Beschaffenheit, stabile Lebensdauer, Undurchlässigkeit gegenüber Mikroben und mit Antioxidans-Eigenschaften.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein grünes Verfahren zur Isolation phenolreicher kristalliner Farbfraktionen aus verschiedenen Pflanzen bereit. Diese Pflanzen wurden aus verschiedenen Regionen Indiens gesammelt und dann bei Raumtemperatur getrocknet. Die getrockneten und gemahlenen Pflanzenteile wurden im Mikrowellenofen, Ultraschallbad, Soxhlet-Extraktor unter Rückfluss extrahiert oder einfach perkoliert mit Lösungsmittel, das aus der aus Wasser, Methanol, Ethanol, Methanol/Wasser, Ethanol/Wasser, Isopropanol, Butanol, Hexanen, Chloroform, Ethern, Dichlormethan, Aceton, Ethylacetat, Acetonitril und Gemischen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Die erhaltenen Extrakte wurden dann im Vakuum bei einer Temperatur von 40–50°C konzentriert, so dass das organische Lösungsmittel entfernt wurde, und mit Wasser verdünnt. Der verdünnte Extrakt wurde filtriert und durch eine Säule (mit oder ohne Vakuum) geleitet, die eine stationäre Phase von Harz enthielt, das aus der aus Amberlyte XAD-2, XAD-4, XAD-7, XAD-16, IRA 400, IRA 67, Dianion HP-20 und dergleichen bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Die Säule wurde mit destilliertem Wasser oder einem Wasser:Alkohol-Gemisch in verschiedenen Verhältnissen eluiert, so dass die stark wasserlöslichen hygroskopischen Komponenten entfernt wurden, die separat sprühgetrocknet oder konzentriert wurden, damit ein hygroskopisches Pulver erhalten wurde, das Aminosäuren, Zucker, und andere primäre Metaboliten enthielt. Die letzte Elution erfolgte mit einem organischen Lösungsmittel, das aus der Gruppe von Alkoholen ausgewählt ist, die aus Methanol, Ethanol, Propanol und dergleichen besteht. Das organische Elutionsmittel wurde dann im Vakuum konzentriert, so dass die kristallinen Farbfraktionen erhalten wurden. Die erhaltenen farbstoffreichen Fraktionen wurden dann einem Bioaktivitäts-Assay unterworfen, einschließlich Antioxidans, toxikologische Bewertung und HPLC-Analyse.
Kurze Beschreibung der beigefügten Zeichnungen

Tabelle 1: Antioxidans-Aktivität und phenolischer Gesamtgehalt der isolierten Farbfraktionen und Rohextrakte einiger Pflanzen
Tabelle 2: Die toxikologischen Tests für den aus Rhododendron arboreum isolierten Farbstoff

1: HPLC-Chromatogramm eines alkoholischen Extrakts aus Rhododendron arboreum (viskoses Material)
2: HPLC-Chromatogramm der farbstoffreichen Fraktion aus Rhododendron arboreum (fließfähiges Material)
3: HPLC-Chromatogramm eines alkoholischen Extrakts aus Hippophae rhamnoides (viskoses Material)
4: HPLC-Chromatogramm der farbstoffreichen Fraktion aus Hippophae rhamnoides (fließfähiges Material)
5: Wärmestabilitätsdaten von Rhododendron arboreum Farbstoff bis zu 12 Std.
6: Stabilitätsdaten zeigen die stabile Lebensdauer von Rhododendron arboreum Farbstoff bis zu sechs Monate bei Raumtemperatur
7: Mikroskopische Aufnahme von Rhododendron arboreum Farbfraktionen zeigen Kristalle
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein verfahren zur Herstellung phenolreicher kristalliner und nicht hygraskopischer Naturfarben aus Pflanzenextrakten bereit, wobei das vorstehende verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Trocknen und Mahlen eines Pflanzenmaterials, so dass man ein Pulver erhält;
b) Extrahieren des in Schritt (a) erhaltenen pulverisierten Materials durch Mikrowellen- oder Ultraschall- oder Soxhlet-Extraktion oder Perkolation oder Rückfluss;
c) Konzentrieren des alkoholischen oder hydroalkoholischen Extraktes, wie er in Schritt (b) erhalten wird, im Vakuum, so dass das organische Lösungsmittel entfernt wird, und der konzentrierte Extrakt erhalten wird;
d) Verdünnen des konzentrierten Extrakts, wie er in Schritt (c) erhalten wird, mit Wasser;
e) Filtrieren des verdünnten Extraktes, wie er in Schritt (d) erhalten wird, so dass die wasserunlöslichen Verunreinigungen entfernt werden;
f) Leiten des Filtrats über eine Harzsäule, die aus Amberlyte XAD 2, XAD 4, XAD 7, XAD 16, IRA 400, IRA 67, Dianion HP-20 und dergleichen ausgewählt wird;
g) Eluieren der Säule zuerst mit Wasser, so dass stark polare wasserlösliche hygroskopische Komponenten entfernt werden, und anschließend mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem Alkohol, und Sammeln der organischen Lösungsmittel-Schicht;
h) Konzentrieren der organischen Lösungsmittel-Schicht von Schritt (g) im Vakuum, so dass man kristalline und nicht hygroskopische Farbfraktionen erhält, die reich an phenolischen Verbindungen sind;
i) Sprühtrocknen oder Lyophilisieren der stark polaren wasserlöslichen hygroskopischen Komponenten von Schritt (g), die Aminosäuren, Zucker, und andere primäre Metaboliten enthalten können.

In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die isolierten Farben aus Pflanzenteilen erhalten, die aus Blättern, Blüten, Früchten Rhizomen/Wurzeln ausgewählt sind, oder aus der vollständigen Pflanze.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform erfolgt die Extraktion durch Einsatz von Mikrowelle oder Ultraschall oder herkömmliche Verfahren, wie Soxhlet, Rückfluss oder Perkolation.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die verwendete Mikrowelle ausgewählt aus Mikrowellen im Einfach- oder Mehrfachmodus bei einer Arbeitsfrequenz von 2450 MHz In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die elektrische Arbeitsleistung der Mikrowellenstrahlung im Bereich von 150 bis 700 W.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die zur mikrowellengestützten Extraktion erforderliche Extraktionszeit im Bereich von 2 bis 20 min, vorzugsweise 5 min.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Ausmaß der Ultraschallenergie für das Ultraschallbad im Bereich von 80 bis 100%.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die zur ultraschallgestützten Extraktion erforderliche Extraktionszeit im Bereich von 40–100 min, vorzugsweise 60 min.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Extraktion mit Lösungsmittel durchgeführt, das aus der aus Alkohol oder Wasser oder einem Gemisch aus Alkohol/Wasser in verschiedenen Verhältnissen oder einem Gemisch von Lösungsmitteln mit einer Polarität im Bereich von unpolaren bis zu polaren Lösungsmitteln mit oder ohne Ionenflüssigkeiten bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Verhältnis des trockenen Pflanzenmaterials zum Extraktions-Lösungsmittel im Bereich von 1:1 bis 1:10 bezogen auf das Gewicht, vorzugsweise 1:5.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die zur Extraktion verwendeten Lösungsmittel bei einer Temperatur im Bereich von 40–45°C entfernt, so dass man einen konzentrierten Extrakt erhält.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Verdünnung des konzentrierten Extrakts mit Wasser oder seinem Gemisch mit Alkohol in einem Verhältnis im Bereich von 1:10 bis 1:50, vorzugsweise 1:20.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird der verdünnte Extrakt auf ein Harz aufgetragen, gefolgt von Elution mit einer hinreichenden Menge Wasser oder einem Gemisch aus Wasser mit Alkohol in verschiedenen Verhältnissen, bis zur Farblosigkeit und dann abschließend Waschen der Säule mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Alkohol.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform besteht das Elutions-Lösungsmittel aus Wasser oder einem Gemisch von Wasser und Alkohol im Verhältnis im Bereich von 100:0 bis 90:10, das beim Sprühtrocknen oder bei der Lyophilisation oder Konzentration im Vakuum ein hygroskopisches Pulver ergibt, das Zucker, Aminosäuren usw. enthalten kann.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der zum Eluieren der Säule verwendete Alkohol aus der aus Methanol, Ethanol, Isopropanol oder Butanol, vorzugsweise Ethanol, bestehenden Gruppe ausgewählt.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform erfolgt die Konzentration des Alkohols im Vakuum bei einer Temperatur im Bereich von 40–50°C, so dass eine Farbfraktion erhalten wird, die kristalline und nicht hygroskopische Beschaffenheit aufweist.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform beinhaltet der Begriff nicht hygroskopisch, dass die Farbfraktion bei Einwirkung von Luft bei Raumtemperatur keine Feuchtigkeit absorbiert.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die isolierten Farbfraktionen bei einer Temperatur bis zu 80°C für bis zu 12 Std. hitzestabil.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die isolierten Farbfraktionen eine Kombination verschiedener Moleküle, einschließlich phenolischer Verbindungen, wie Flavonoide und Phenolsäuren, die primär für ihre Farbeigenschaften verantwortlich sind.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform enthalten die isolierten phenolreichen Farbfraktionen ebenfalls auch einige andere Stickstoff-, Schwefel- oder sauerstoffhaltige Sekundärmetaboliten, wie Koffein.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die isolierten Farbfraktionen sowohl in Alkohol als auch in Wasser löslich.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform stellt die isolierte Farbfraktion einen Farbbereich mit oder ohne Verwendung von Beizmitteln und pH-Wert-Einstellung bereit.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die Lösungsmittel und das Harz mehrmals recycelt und wiederverwendet.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann die isolierte kristalline Farbfraktion in der Nahrungsmittel-, Getränke-, Kosmetik-, Textil- und Pharmaindustrie sowie als nanoeingekapselte Produkte verwendet werden.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform weisen die isolierten Farbfraktionen eine gesteigerte Bioaktivität, einschließlich Antioxidans-Eigenschaften, auf.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die isolierten Farbfraktionen für den Gebrauch durch den Menschen Befunden zufolge nicht allergisch und nicht toxisch.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das vorstehende Verfahren nicht anwendbar bei Pflanzen, die reich an essentiellen Ölen oder anderen nicht polaren Verbindungen sind.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform setzt das entwickelte Verfahren keine Säure- oder Basenbehandlung während der Extraktion und Säulenreinigung ein, wodurch seine natürlichen Eigenschaften bewahrt bleiben.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das verwendete Ausgangsmaterial aus medizinischen Pflanzen ausgewählt, die Rhododendron arboreum, Hippophae rhamnoides, Camellia sinensis, Rheum emodi, Ginkgo biloba, Glycirrhiza glabra, Coffea arabica, Rubia tinctorum, Rubia cordifolia, Punica granatum, Emblica officinalis, Capsicum spp., Citrus sinensis-Schale, Syzygium cumini, Curcuma spp., Aloe Vera, Nyctanthes arbortristis, Quercus infectoria, Juglans nigra, Acacia nilotica, Schleichera oleosa, Berberis spp., Tagetes spp., Lawsonia inermis, Hibiscus spp., Stevia rebaudiana, Acacia catechu, Butea spp., Rumex spp., Terminalia chebula und Gemüsepflanzen, wie Daucus carota ssp. sativus var. atrorubens Alef. (schwarze Möhre), Trigonella foenum-graecum, Spinacia oleracea, Momordica charantia und dergleichen umfassen.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das gewählte Ausgangsmaterial aus kommerziell wichtigen Getränkepflanzen wie Camellia sinensis, Hippophae rhamnoides, Emblica officinalis, Glycirrhiza glabra und Coffea arabica ausgewählt, die sie bei Instant-Getränkeprodukten geeignet machen.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform besitzt das kristalline Farbmaterial, das aus Tee und Kaffee erhalten wird, einen hohen Koffeingehalt, so dass es sich für stark Koffeinhaltige Getränkeprodukte eignet.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein entKoffeiniertes kristallines Farbmaterial, das aus Tee und Kaffee erhalten wird, produziert, indem der verdünnte Wasserextrakt in Schritt 1(d) mit einem organischen Lösungsmittel gewaschen wird, das aus der aus Ethylacetat oder Chloroform bestehenden Gruppe ausgewählt ist, gefolgt von den Schritten 1(f)–1(h).
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die isolierten Farbfraktionen in Luft und Feuchtigkeit stabil.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die isolierten, nicht-hygroskopischen phenolreichen Farbfraktionen ohne Konservierungsmittel verwendet, da sie gegenüber einem mikrobiellen Angriff weniger anfällig sind.
Die antioxidativen Eigenschaften wurden mit 2,2'-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Radikal-Einfang-Assays gemessen und als % Hemmung (Tabelle 1) dargestellt. Der Gesamt-Phenol-Gehalt wurde als GAE (Gallussäureäquivalent) geschätzt. Die toxikologischen Daten wurden für die Farben erzeugt (Tabelle 2), die aus Rhododendron arboreum isoliert wurden. Die HPLC-Analyse zeigt, dass die isolierten Farbfraktionen phenolische Verbindungen enthalten, wie Chlorogensäure (Rt 9,86), Syringasäure (Rt 11,29), p-Cumarinsäure (Rt 13,33), Quercetin (Rt 17,28), Quercitrin (Rt 13,63), Quercetin-3-O-galactosid (Rt 12,58), Rutin (Rt 12,064), Isorhamnetin-3-O-glucosid (Rt 13,58), Isorhamnetin (Rt 20,043), Kaempferol (Rt 19,64), die bekanntlich verschiedene Bioaktivitäten besitzen. Der Gehalt dieser phenolischen Verbindungen war Befunden zufolge höher in Farbfraktionen im Vergleich zu ihren Parentalextrakten, was aus der viel höheren Absorption der in der HPLC-Analyse beobachteten Peaks ersichtlich ist. Das entwickelte Verfahren kann ebenfalls stark polare Glycoside sowie nicht polare Verbindungen entfernen, wie es aus der HPLC Untersuchung von methanolischem Extrakt und solchen von isolierten Farben ersichtlich ist, was weiter zu fließfähigen festen kristallinen Farbfraktionen führt. Die Anwendung moderner Extraktionsverfahren, wie Mikrowelle und Ultraschall, ergibt eine höhere Ausbeute an Farbfraktion.
Angesichts des Vorstehenden offenbart die vorliegende Erfindung ein einfaches und sauberes Verfahren zur Isolation von Farbfraktionen aus den Extrakten verschiedener phenolhaltiger Pflanzen, wie Rhododendron arboreum, Hippophae rhamnoides, Camellia sinensis, Rheum emodi, Ginkgo biloba, Glycirrhiza glabra, Coffea arabica, Rubia tinctorum, Rubia cordifolia, Punica granatum, Emblica officinalis, Capsicum spp., Citrus sinensis-Schale, Syzygium cumini, Curcuma spp., Aloe Vera, Nyctanthes arbortristis, Quercus infectoria, Juglans nigra, Acacia nilotica, Berberis spp., Tagetes spp., Schleichera oleosa, Lawsonia inermis, Hibiscus spp., Daucus carota ssp. sativus var. atrorubens Alef. (schwarze Möhre), Trigonella foenum-graecum, Spinacia oleracea, Momordica charantia, Stevia rebaudiana, Acacia catechu, Butea spp., Rumex spp., Terminalia chebula und dergleichen. Die erfindungsgemäß isolierten Farbfraktionen besitzen Befunden zufolge mehrere vorteilhafte Eigenschaften, wie kristalline Form, nicht hygroskopische Beschaffenheit, stabile Lebensdauer, Undurchlässigkeit gegenüber Mikroben und Antioxidans-Eigenschaften, die gleichzeitig die physikalisch chemische Stabilität und das medizinische Profil der isolierten Farben erhöht. Die Anwesenheit von bioaktiven phenolischen Verbindungen, d. h. Chlorogensäure, Syringasäure, p-Cumarinsäure, Quercetin, Quercitrin, Quercetin-3-O-galactosid, Rutin, Isorhamnetin-3-O-glucosid, Isorhamnetin und Kaempferol, erhöht den Erwartungen zufolge die medizinischen Vorteile der isolierten Farbfraktionen.
Das verfahren kann zudem bei anderen Pflanzen angewendet werden, wie Abrus precatorius, Adina cordifolia, Barringtonia racemosa, Caesalpinia sappan, Cassia spp., Dolichos biflorus, Entada rheedii, Plumbago spp., Mucuna pruriens, Garcinia mangostana, Mesua ferrea, Gymnema sylvestre, Helicteres isora, Tinospora cordifolia, Azadirachta indica, andere Lawsonia spp., Mimusops elengi, Murraya spp., andere Aloe spp., Phyllanthus amarus, Bombax malabaricum, Solanum xanthocarpum, andere Syzygium spp., Terminalia arjuna, Terminalia bellirica, Withania somnifera, Vernonia anthelmintica, Tectona spp., Berberis spp., Urtica spp., Wrichtia spp., Aegle spp., Juniperus communis, andere Rhododendron spp., andere Hippophae spp., andere Rheum spp., Mangifera indica, Bidens spp., Dahlia, Salix caprea, Pterocarpus spp., Polygonum multiflorum, Hamamelis virginiana, andere Citrus spp., Indigofera spp., andere Glycirrhiza spp., Adiantum spp., Symplocos spp., Baccharis spp., Betula spp., Berginia spp., Ruta graveolens, Swertia spp., Piccrorhiza spp., andere Gingko spp., Petunia spp., Vitis vinifera, Morus spp., Potentilla spp., Agrimonia spp., Alnus sieboldiana, Casuarina stritca, Psidium guajava, Bixa orellana, Phyllanthus spp., Sapium japonicum, Ricinus communis, Rhus semialata, Rhus succedanea, Tellima grandifolia, Dioscorea spp., Jatropa spp., Piper spp., Fuchsia spp., Euphorbia spp., Acer spp., Mallotus japonicus, Aleurites cordata, Rubus spp., Camellia japonica, Cotinus spp., Stachyurus praecox, Asculus hippocastanum, Persea gratissima, Coriandrum sativum, Brassica spp., Malus spp., Crocus sativus, Allium cepa, Tamarindus indica, Cuminum cyminum, Nigella sativa, Lonicera spp., Solanum lycopersicum, Morus spp., Boswellia spp., Pyrus spp. Eclipta spp., Rosa spp., Arachis hypogaea, Artemisia spp., Fagopyrum esculentum, Zingiber officinale, Vanilla spp., Cicer arietinum, Phaseolus vulgaris, Vaccinium spp., Fragaria spp., Prunus spp., Hypericum perforatum, Solanum trilobatum, Beta vulgaris, andere Daucus carota ssp., Saccharum spp. sowie auch Pilze, Algen, Mikroben, Honig, Lac und dergleichen, welche reich an Phenolen sind und die zusätzliche andere Einheiten enthalten, wie heterozyklische Moleküle oder Terpenoide usw.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung gegeben, und sollen den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung nicht einschränken.
Beispiel 1. Isolation der kristallinen Farbfraktion aus Rhododendron arboreum mittels Soxhlet-Extraktion
Die getrockneten und pulverisierten Blüten von Rhododendron (100 g) wurden in der Soxhlet-Vorrichtung aufgenommen und mit Ethanol (500 ml; Verhältnis von Probe zu Lösungsmittel 1:5) für 8 Std. bei 55–60°C extrahiert. Der Extrakt wurde im Vakuum konzentriert, so dass das Lösungsmittel entfernt wurde (der erhaltene konzentrierte Extrakt war viskos). Der konzentrierte Extrakt wurde dann mit Wasser (200 ml; Verhältnis von Extrakt zu Wasser 1:20) verdünnt und filtriert. Der verdünnte Extrakt wurde dann über eine XAD-7 Harzsäule geleitet. Die Säule wurde zuerst mit Wasser gewaschen, so dass die stark wasserlöslichen Komponenten entfernt wurden, die dann separat sprühgetrocknet oder konzentriert wurden. Dann wurde die Säule mit Ethanol eluiert. Die organische Schicht wurde im Vakuum bei 45°C konzentriert, so dass eine kristalline, nicht hygroskopische und phenolreiche bioaktive rötlich braun gefärbte Fraktion in einer Ausbeute von 9,72% erhalten wurde. Die Stabilität dieser Fraktion gegenüber Wärme (im Ofen) wurde auch bis zu 80°C für 12 Std., gefolgt von HPLC-Analyse überprüft.
Beispiel 2. Isolation der kristallinen Farbfraktion aus Rhododendron arboreum mittels Perkolation
Die getrockneten und pulverisierten Blüten von Rhododendron (100 g) wurden im Perkolator aufgenommen und mit Ethanol (500 ml; Verhältnis von Probe zu Lösungsmittel 1:5) für 48 Std. bei Raumtemperatur extrahiert. Der Extrakt wurde im Vakuum konzentriert, so dass das Lösungsmittel entfernt wurde. Der konzentrierte viskose Extrakt wurde dann mit Wasser (200 ml; Verhältnis von Extrakt zu Wasser 1:20) verdünnt und filtriert. Der verdünnte Extrakt wurde dann über eine XAD-7 Harzsäule geleitet. Die Säule wurde zuerst mit Wasser gewaschen, so dass die stark wasserlöslichen Komponenten entfernt wurden, die dann separat sprühgetrocknet oder konzentriert wurden. Dann wurde die Säule mit Ethanol eluiert. Die organische Schicht wurde im Vakuum bei 45°C konzentriert, so dass eine kristalline, nicht hygroskopische und phenolreiche bioaktive rötlich braun gefärbte Fraktion in einer Ausbeute von 8,56% erhalten wurde.
Beispiel 3. Isolation der kristallinen Farbfraktion aus Rhododendron arboreum mittels Ultraschall und Mikrowelle
Die getrockneten und pulverisierten Blüten von Rhododendron (100 g) wurden in einem Kolben aufgenommen und mit Ethanol (500 ml; Verhältnis von Probe zu Lösungsmittel 1:5) mittels ultraschallgestützter Extraktion (für 60 min bei Raumtemperatur bei 80% Ultraschallleistung) und mikrowellengestützter Extraktion (für 5 min in kleinen Zyklen von 30 sec, Mehrfachmodus-Mikrowelle mit einer Arbeitsfrequenz von 2450 MHz und Arbeitsleistung von 700 W) extrahiert. Der Extrakt wurde im Vakuum konzentriert, so dass das Lösungsmittel entfernt wurde. Der konzentrierte viskose Extrakt wurde dann mit Wasser (200 ml; Verhältnis von Extrakt zu Wasser 1:20) verdünnt und filtriert. Der verdünnte Extrakt wurde dann über eine XAD-7 Harzsäule geleitet. Die Säule wurde zuerst mit Wasser gewaschen, so dass die stark wasserlöslichen Komponenten entfernt wurden, die dann separat sprühgetrocknet oder konzentriert wurden. Dann wurde die Säule mit Ethanol eluiert. Die organische Schicht wurde im Vakuum bei 45°C konzentriert, so dass kristalline, nicht hygroskopische und phenolreiche bioaktive rötlich braun gefärbte Fraktionen in einer Ausbeute von 9,40% bei UAE und 9,89% bei MAE erhalten wurde.
Beispiel 4. Isolation der kristallinen Farbfraktion aus Rhododendron arboreum mit anderen Harzen
Die getrockneten und pulverisierten Blüten von Rhododendron (5 g) wurden in einem Kolben aufgenommen und mit Wasser (100 ml; Verhältnis von Probe zu Lösungsmittel 1:5) mittels mikrowellengestützter Extraktion (für 5 min in kleinen Zyklen von 30 sec, Mehrfachmodus-Mikrowelle mit einer Arbeitsfrequenz von 2450 MHz und Arbeitsleistung von 700 W) extrahiert. Die verdünnten und filtrierten Extrakte wurden dann über XAD-16 und XAD-4 Harzsäulen geleitet. Die Säule wurde zuerst mit Wasser gewaschen, so dass die stark wasserlöslichen Komponenten entfernt wurden, die dann separat sprühgetrocknet oder konzentriert wurden. Dann wurde die Säule mit Ethanol eluiert. Die organische Schicht wurde im Vakuum bei 45°C konzentriert, so dass kristalline, nicht hygroskopische und phenolreiche bioaktive rötlich braun gefärbte Fraktionen in einer Ausbeute von 0,82% bei XAD-4 und 1,16% bei XAD-16 erhalten wurden.
Beispiel 5. Isolation der kristallinen Farbfraktion aus Rhododendron arboreum mittels benutzter Harze
Die getrockneten und pulverisierten Blüten von Rhododendron (100 g) wurden im Perkolator aufgenommen und mit Ethanol (500 ml; Verhältnis von Probe zu Lösungsmittel 1:5) für 48 Std. bei Raumtemperatur extrahiert. Der Extrakt wurde im Vakuum konzentriert, so dass das Lösungsmittel entfernt wurde. Der konzentrierte viskose Extrakt wurde dann mit Wasser (200 ml; Verhältnis von Extrakt zu Wasser 120) verdünnt und filtriert. Der verdünnte Extrakt wurde dann über eine zuvor benutzte XAD-7 Harzsäule (das Harz wurde durch Waschen mit Alkohol bzw. Wasser regeneriert) geleitet. Die Säule wurde zuerst mit Wasser gewaschen, so dass die stark wasserlöslichen Komponenten entfernt wurden, die dann separat sprühgetrocknet oder konzentriert wurden. Dann wurde die Säule mit wiedergewonnenem Ethanol eluiert. Die organische Schicht wurde im Vakuum bei 45°C konzentriert, so dass eine kristalline, nicht hygroskopische und phenolreiche bioaktive rötlich braun gefärbte Fraktion in einer Ausbeute von 8,46% erhalten wurde.
Beispiel 6. Isolation der kristallinen Farbfraktion aus Hippophae rhamnoides mittels Mikrowelle
100 g getrocknete und pulverisierte Früchte von Hippophae rhamnoides wurden in der Mikrowelle (Mehrfachmodus-Mikrowelle mit einer Arbeitsfrequenz von 2450 MHz und einer Arbeitsleistung von 700 W) mit Ethanol (500 ml; Verhältnis von Probe zu Lösungsmittel 1:5) für 5 min in kleinen Zyklen von 30 sec extrahiert. Der Extrakt wurde im Vakuum konzentriert, so dass das Lösungsmittel entfernt wurde. Der konzentrierte viskose Extrakt wurde dann mit Wasser (200 ml; Verhältnis von Extrakt zu Wasser 1:20) verdünnt und filtriert. Der verdünnte Extrakt wurde dann über eine XAD-7 Harzsäule geleitet. Die Säule wurde zuerst mit Wasser gewaschen, so dass die stark wasserlöslichen Komponenten entfernt wurden, die dann separat sprühgetrocknet oder konzentriert wurden. Dann wurde die Säule mit Ethanol eluiert. Die organische Schicht wurde im Vakuum bei 45°C konzentriert, so dass eine kristalline, nicht hygroskopische und phenolreiche bioaktive braun gefärbte Fraktion in einer Ausbeute von 5,34% erhalten wurde.
Beispiel 7. Isolation der kristallinen Farbfraktion aus Rhododendron und Hippophae mittels Mikrowelle und Wasser als Lösungsmittel
20 g pulverisierte Rhododendron-Blüten wurden in der Mikrowelle (Mehrfachmodus-Mikrowelle mit einer Arbeitsfrequenz von 2450 MHz und einer Arbeitsleistung von 700 W) mit Wasser (200 ml; Verhältnis von Probe zu Lösungsmittel 1:10) für 5 min in kleinen Zyklen von 30 sec extrahiert. Der Extrakt wurde dann filtriert. Der filtrierte Extrakt wurde anschließend über ein Bett von XAD-7 Harz unter einem Vakuum geleitet, um das Verfahren zu beschleunigen. Das Harz wurde zuerst mit Wasser gewaschen, um die stark wasserlöslichen Komponenten zu entfernen, die dann separat sprühgetrocknet oder konzentriert wurden. Das Harzbett wurde dann mit Ethanol eluiert. Die organische Schicht wurde im Vakuum bei 45°C konzentriert, so dass eine kristalline, nicht hygroskopische und phenolreiche bioaktive Farbfraktion in einer Ausbeute von 7,5% erhalten wurde. Entsprechend wurden Hippophae-Früchte (20 g) mit dem vorstehenden Verfahren verarbeitet, das eine Ausbeute von 5,2% ergab.
Beispiel 8. Isolation der kristallinen Farbfraktion aus Camilla sinensis
100 g pulverisierte schwarze bzw. grüne Teeblätter wurden in der Mikrowelle (Mehrfachmodus-Mikrowelle mit einer Arbeitsfrequenz von 2450 MHz und einer Arbeitsleistung von 700 W) mit Wasser (500 ml; Verhältnis von Probe zu Lösungsmittel 1:5) für 5 min in kleinen Zyklen von 30 sec extrahiert. Der Extrakt wurde dann filtriert. Der filtrierte Extrakt wurde dann über eine XAD-7 Harzsäule geleitet. Die Säule wurde zuerst mit Wasser:Ethanol Lösung (90:10 v/v) gewaschen, um die stark wasserlöslichen Komponenten zu entfernen. Diese Fraktion wurde dann konzentriert und sprühgetrocknet, so dass ein hygroskopisches Farbpulver erhalten wurde, das Aminosäuren und Zucker usw. enthielt. Die Säule wurde dann mit Ethanol eluiert. Die organische Schicht wurde im Vakuum bei 45°C konzentriert, so dass eine kristalline, nicht hygroskopische und phenolreiche bioaktive braun gefärbte Fraktion in einer Ausbeute von 10,34–12,68% erhalten wurde. Die HPLC-Analyse der isolierten Farbfraktion zeigt das Vorhandensein von Koffein als Hauptbestandteil, der es für Koffeinreiche Getränkeprodukte geeignet macht.
Beispiel 9. Isolation der entKoffeinierten kristallinen Farbfraktion aus Camilla sinensis
100 g pulverisierte schwarze bzw. grüne Teeblätter wurden in der Mikrowelle (Mehrfachmodus-Mikrowelle mit einer Arbeitsfrequenz von 2450 MHz und einer Arbeitsleistung von 700 W) mit Wasser (500 ml; Verhältnis von Probe zu Lösungsmittel 1:5) für 5 min in kleinen Zyklen von 30 sec extrahiert. Der Wasserextrakt wurde dann filtriert und mit Ethylacetat ausgeschüttelt, so dass das Koffein entfernt wurde. Der verbleibende Wasserteil wurde dann über eine XAD-7 Harzsäule geleitet. Die Säule wurde zuerst mit Wasser gewaschen, um die wasserlöslichen Komponenten zu entfernen. Die Säule wurde dann mit Ethanol eluiert. Die organische Schicht wurde im Vakuum bei 45°C konzentriert, so dass eine kristalline, nicht hygroskopische und phenolreiche bioaktive braun gefärbte Fraktion in einer Ausbeute von 7–8% erhalten wurde, die sich bei HPLC-Analyse als Koffeinfrei erwies.
Beispiel 10. Isolation der kristallinen Farbfraktionen von Emblica officinalis mit Wasser und Ethanol als aufeinanderfolgendes Extraktions-Lösungsmittel
375 g Pulver von getrocknetem Emblica officinalis wurde mit Wasser (3,75 l; Verhältnis von Probe zu Lösungsmittel 1:10) für 2 Std unter Rückfluss erhitzt. Der Extrakt wurde dann filtriert. Der filtrierte Extrakt wurde dann über eine XAD-7 Harzsäule geleitet. Die Säule wurde zuerst mit Wasser gewaschen, um die stark wasserlöslichen Komponenten zu entfernen. Diese Fraktion wurde dann sprühgetrocknet, so dass ein hygroskopisches Pulver erhalten wurde. Die Säule wurde dann mit Ethanol eluiert. Die organische Schicht wurde im Vakuum bei 45°C konzentriert, so dass eine kristalline, nicht hygroskopische und phenolreiche bioaktive braun gefärbte Fraktion in einer Ausbeute von 10% erhalten wurde
Das vorstehende restliche Pflanzenmaterial (nach der Extraktion mit Wasser) wurde an der Luft getrocknet und mit Ethanol (2 1) reextrahiert. Der Extrakt wurde dann filtriert und im Vakuum konzentriert, so dass das organische Lösungsmittel entfernt wurde. Der erhaltene Extrakt wurde mit 1 l heißem Wasser verdünnt, gekühlt und filtriert. Der filtrierte Extrakt wurde dann über eine XAD-7 Harzsäule geleitet. Die Säule wurde zuerst mit Wasser und schließlich mit Ethanol gewaschen. Die organische Schicht wurde konzentriert, so dass eine weitere kristalline, nicht hygroskopische braun gefärbte Fraktion mit einer Ausbeute von 2–3% erhalten wurde.
Beispiel 11. Isolation von hygroskopischem Farbpulver aus Bixa orellana
5 g Pulver von Annatto Samen (Bixa orellana) wurde in der Mikrowelle mit Wasser (100 ml; Verhältnis von Probe zu Lösungsmittel 120) für 5 min (Einfachmodus-Mikrowelle mit einer Arbeitsfrequenz von 2450 MHz und einer Arbeitsleistung von 150 W) extrahiert. Der Extrakt wurde dann filtriert. Der filtrierte Extrakt wurde dann über eine XAD-7 Harzsäule geleitet. Die Säule wurde zuerst mit Wasser gewaschen, um die stark wasserlöslichen Komponenten zu entfernen. Die Säule wurde dann mit Ethanol eluiert. Die organische Schicht wurde im Vakuum bei 45°C konzentriert, so dass eine kristalline und nicht hygroskopische orangerote gefärbte Fraktion in einer Ausbeute von 5%–6% erhalten wurde. Die Wasserfraktion wurde konzentriert und sprühgetrocknet, so dass ein gelb gefärbtes hygroskopisches Pulver in einer Ausbeute von 20%–25% erhalten wurde.
Beispiel 12. Isolation der Farbfraktion aus Curcuma longa
5 g Pulver aus Curcuma longa wurde in der Mikrowelle mit Wasser (75 ml; Verhältnis von Probe zu Lösungsmittel 1:15) für 3 min (Einfachmodus-Mikrowelle mit einer Arbeitsfrequenz von 2450 MHz und einer Arbeitsleistung von 150 W) extrahiert. Der Extrakt wurde dann filtriert. Der filtrierte Extrakt wurde dann über eine XAD-7 Harzsäule geleitet. Die Säule wurde zuerst mit Wasser gewaschen, um die stark wasserlöslichen Komponenten zu entfernen. Die Säule wurde dann mit Ethanol eluiert. Die organische Schicht wurde im Vakuum bei 45°C konzentriert, so dass eine viskose gefärbte Fraktion in einer Ausbeute von 2–3% erhalten wurde. Die Wasserfraktion wurde konzentriert und sprühgetrocknet, so dass ein glänzend gelb gefärbtes Pulver in einer Ausbeute von 7–8% erhalten wurde.
Beispiel 13. Isolation der kristallinen Farbfraktion aus Rheum emodi mit Ultraschall
Die getrockneten und pulverisierten Wurzeln von Rheum emodi (5 g) wurden genommen und mit Ethanol (50 ml; Verhältnis von Probe zu Lösungsmittel 1:10) für 60 min bei 40°C und 80% Ultraschallleistung extrahiert. Der Extrakt wurde im Vakuum konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der konzentrierte viskose Extrakt wurde dann mit Wasser (100 ml; Verhältnis von Extrakt zu Wasser 1:20) verdünnt und filtriert. Der verdünnte Extrakt wurde dann über eine XAD-7 Harzsäule geleitet. Die Säule wurde zuerst mit Wasser gewaschen, um die stark wasserlöslichen Komponenten zu entfernen. Die Säule wurde dann mit Ethanol eluiert. Die organische Schicht wurde im Vakuum bei 45°C konzentriert, so dass eine kristalline, nicht hygroskopische und phenolreiche bioaktive braun gefärbte Fraktion in einer Ausbeute von 14,98% erhalten wurde.
Beispiel 14. Messung der Antioxidans-Aktivität und Gesamtphenolgehalt der isolierten Farbfraktionen und Rohextrakte einiger Pflanzen
Die Fähigkeit des Extraktes zum Einfangen von DPPH*-Radikalen wurde wie von Brand-Williams et al. (Lebensm.-Wiss. Technol. 1995, 28, 25–30) beschrieben mit einer leichten Modifikation bestimmt. Ein 100 μl Aliquot Ethanolextrakt wurde mit 3,9 ml ethanolischer DPPH* (3 × 10^–4 mol/l) Lösung gemischt. Nach einer 30 min Reaktion bei 25°C wurde die Extinktion bei 517 nm aufgezeichnet und die Fähigkeit zum Einfangen des DPPH* Radikals, d. h. die prozentuale Hemmung, mit der folgenden Gleichung berechnet: % Hemmung = ((A_C – A_S)/A_C] × 100 wobei A_C die Absorption der Kontrollreaktion ist und A_S die Absorption der Probenlösung ist. Eine Kontrolle bestand aus 0,1 ml Ethanol und 2,9 ml DPPH* Lösung. Alle Ablesungen wurden dreifach ausgeführt.
Der Gesamtphenolgehalt wurde als GAE (Gallussäureäquivalent) wie von Singleton et al. 1999 (V. L. Singleton, R. Orthofer, R. M. Lamuela-Raventós, Analysis of total phenols und other oxidation substrates und antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Ed. L. Packer in Methods in enzymology, San. Diego, CA: Academic Press, 1999, vol. 299, S 152–178) beschrieben, bestimmt. Kurz gesagt, wurde ein 200 μl Aliquot von gelöstem Extrakt in einen 10 ml volumetrischen Kolben überführt, in den anschließend 1 ml unverdünntes Folin-Ciocalteu Reagens zugegeben wurde und weiter nach 1 min, 800 μl 7,5% Na₂CO₃ zugegeben wurde. Nach 30 min Inkubation bei 25°C wurde die Extinktion bei 765 nm gemessen und mit einer GA-Kalibrierungskurve verglichen.
Beispiel 15. Isolation der kristallinen Farbfraktion aus Rhododendron und Hippophae rhamnoides im großen Maßstab (kg)
Das getrocknete und pulverisierte Pflanzenmaterial von Rhododendron und Hippophae rhamnoides (jeweils 1 kg) wurde im Perkolator aufgenommen und mit Ethanol (5 l; Verhältnis von Probe zu Lösungsmittel 1:5) für 48 Std. bei Raumtemperatur extrahiert. Der Extrakt wurde im Vakuum konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der konzentrierte viskose Extrakt wurde dann mit Wasser (1,5 l; Verhältnis von Extrakt zu Wasser 1:10) verdünnt und filtriert. Der verdünnte Extrakt wurde dann über eine XAD-7 Harzsäule geleitet. Die Säule wurde zuerst mit Wasser gewaschen, um die stark wasserlöslichen Komponenten zu entfernen, die dann separat sprühgetrocknet oder konzentriert wurden. Die Säule wurde dann mit Ethanol eluiert. Die organische Schicht wurde im Vakuum bei 45°C konzentriert, so dass eine kristalline, nicht hygroskopische und phenolreiche bioaktive Farbfraktion in einer Ausbeute von 8,54% für Rhododendron arboreum und 5,26% für Hippophae rhamnoides erhalten wurde.
Beispiel 16. HPLC-Analyse der aus Rhododendron arboreum und Hippophae rhamnoides isolierten Farbfraktion
Die HPLC-Analyse der isolierten Farbfraktionen erfolgte auf dem Shimadzu LC-20 Gerät, das mit PDA Detektor (SPD M20A) ausgerüstet war, mittels Umkehrphase Phenomenex Luna RP-18 Säule (4,6 mm Id. × 250 mm, 5 μm). Eine Gradientenelution, umfassend angesäuertes Wasser (0,1% Essigsäure) und Acetonitril, erfolgte bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min mit dem folgenden Programm, 10 bis 40% Acetonitril in 0 bis 10 min, 40 bis 50% Acetonitril in 10 bis 15 min, 50 bis 70% Acetonitril 15 bis 20 min und 70 bis 100% Acetonitril in 20 bis 25 min. Der PDA Nachweis erfolgte bei 290 nm für Rhododendron und 355 nm für Hippophae. Folgende Moleküle wurden identifiziert, indem ihre Retentionszeit und W Spektren mit Referenzstandards abgeglichen wurden: Chlorogensäure (Rt 9,86), Syringasäure (Rt 11,29), p-Cumarsäure (Rt 13,33), Quercetin (Rt 17,28), Quercitrin (Rt 13,63), Quercetin-3-D-galactosid (Rt 12,58), Rutin (Rt 12,064), isorhamnetin-3-Oglucosid (Rt 13,58), Isorhamnetin (Rt 20,043), Kaempferol (Rt 19,64).
Beispiel 17. Experiment in Bezug auf Stabilität gegenüber Angriff durch Mikroben
Der viskose Hippophae-Extrakt (1,0 g) und sein isolierter Farbstoff (1,0 g) wurden bei Raumtemperatur in einer offenen Atmosphäre gehalten. Es wurde beobachtet, dass auf dem Extrakt das Pilzwachstum nach einer Woche zu erscheinen begann, wohingegen kein solches Pilzwachstum in dem isolierten Farbstoffmaterial beobachtet wurde.
Beispiel 18. Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens bei anderen Pflanzenarten
Zur Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens auf andere farbstoffliefernde Pflanzen wurden verschiedene Pflanzenarten wie Rheum emodi, Ginkgo biloba, Glycirrhiza glabra, Coffea arabica, Rubia tinctorum, Rubia cordifolia, Punica granatum, Emblica officinalis, Capsicum spp., Citrus sinensis Schale, Syzygium cumini, Curcuma spp., Aloe Vera, Nyctanthes arbortristis, Quercus infectoria, Juglans nigra, Acacia nilotica, Berberis spp., Tagetes spp., Schleichera oleosa, Lawsonia inermis, Hibiscus spp., Daucus carota ssp. sativus var. atrorubens Alef. (schwarze Möhre), Trigonella foenum-graecum, Spinacia oleracea, Stevia rebaudiana, Acacia catechu, Butea spp., Rumex spp., Terminalia chebula und dergleichen ausgewählt. Das getrocknete und pulverisierte Pflanzenmaterial (100 g; Verhältnis von Probe zu Lösungsmittel 1:5) wurde im Ultraschallgerät mit Ethanol (500 ml) für 60 min bei 40°C und 100% Ultraschallleistung extrahiert. Der Extrakt wurde im Vakuum extrahiert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der konzentrierte Extrakt wurde mit Wasser (200 ml; Verhältnis von Extrakt zu Wasser 1:20) verdünnt und filtriert. Der verdünnte Extrakt wurde dann über eine XAD-7 Harzsäule (mit oder ohne Vakuum) geleitet. Die Säule wurde zuerst mit Wasser gewaschen, um die stark wasserlöslichen Komponenten zu entfernen, die dann separat sprühgetrocknet oder konzentriert wurden, so dass ein hygroskopisches gefärbtes Pulver erhalten wurde. Die Säule wurde dann schließlich mit Ethanol eluiert. Die organische Schicht wurde im Vakuum bei 45°C konzentriert, so dass kristalline, nicht hygroskopische gefärbte Fraktionen in guter Ausbeute erhalten wurden, und zwar in einer Farbe im Bereich von hellgelb bis rötlich braun. Die Ausbeute für verschiedene Pflanzen variiert von 2,38–32,16%.
Beispiel 19: Die toxikologischen Tests*, vorgenommen für den aus Rhododendron arboreum isolierten Farbstoff
Die am Shriram Institute for Industrial Research, Delhi durchgeführten toxikologischen Tests, die für den aus Rhododendron arboreum isolierten Farbstoff vorgenommen wurden, waren wie unter:
Die Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung
Die Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung sind, dass sie Folgendes bereitstellt:

1. Ein neues, billiges und industriell machbares Verfahren zur Isolation nicht hygroskopischer, kristalliner und anti-oxidativer Farbfraktionen aus verschiedenen Pflanzen.
2. Ein Verfahren unter Einsatz umweltfreundlicher Mikrowellen- und Ultraschalltechnik für eine schnelle und effiziente Extraktion.
3. Ein Verfahren, bei dem eine kürzere Extraktionszeit erforderlich ist, die von 5 bis 40 min für mikrowellengestützte Extraktion und 30–120 min für ultraschallgestützte Extraktion reicht, was eine erhebliche Reduktion gegenüber herkömmlichen Extraktionstechniken (in Tagen) ist.
4. Ein Verfahren ohne Säure-Basenbehandlung.
5. Ein Verfahren, bei dem eine isolierte farbstoffreiche Fraktion mehrfache Vorteile hat, wie kristalline Form, nicht hygroskopische Eigenschaft, stabile Lebensdauer, Undurchlässigkeit für Mikroben und Antioxidans-Eigenschaften.
6. Ein Verfahren, bei dem die isolierte farbstoffreiche Fraktion reich an bioaktiven phenolischen Verbindungen ist.
7. Ein Verfahren für extrem leichte Säulenreinigung mit einem einzelnen Elutionsmittel in einem erheblich kurzen Zeitraum.
8. Ein umweltfreundliches und ökonomisches Industrieverfahren zur Trennung der phenolangereicherten Fraktion von wasserlöslichen Verbindungen.
9. Ein Verfahren, bei dem der wasserlösliche Teil beim Konzentrieren und beim Sprühtrocknen hygroskopisches gefärbtes Pulver ergibt.
10. Ein Verfahren, das wenige oder unschädliche Chemikalien verwendet.
11. Ein Verfahren, das die Wiederverwendung von Lösungsmitteln und Harzen ermöglicht.

Diese Vorteile sind von signifikantem ökonomischem Wert und leicht in einem großen kommerziellen Maßstab zur Produktion von nicht hygroskopischem, kristallinen und phenolreichen bioaktiven Farbfraktionen durchführbar. Tabelle 1. Antioxidansaktivität und Gesamtphenolgehalt der isolierten Farbfraktionen und Rohextrakte einiger Pflanzen

Bezeichnung der Pflanze	Gesamtphenolgehalt (mg/GA Äquivalent)		Antioxidansaktivität (DPPH Radikaleinfang-Aktivität) % Hemmung (nach 30 min Inkubation)
Bezeichnung der Pflanze	Rohextrakt	Farbstoff	Rohextrakt	Farbstoff
Rhododendron arboreum	0,125	0,478	90,27	94,42
Hippophae rhamnoides	0,074	0,295	19,79	28,09
Camellia sinensis	0,217	0,416	90,52	91,75
Quercus infectoria	0,677	0,857	94,64	95,01
Daucus carota (schwarze Möhre)*	0,063	0,085	8,83	20,98
Rheum emodi	0,266	0,337	40,56	54,36

*Die % Hemmung stieg bis zu 80% nach 120 min Inkubation Tabelle 2: Die toxikologischen Tests für den aus Rhododendron arboreum isolierten Farbstoff

S. No.	Toxikologischer Test	Ergebnis
1.	Subchronische orale Toxizitätsuntersuchung in Ratten (90 Tage orale Dosisverabreichung) Unter den Bedingungen dieser Untersuchung induzierte die 90 Tage wiederholte orale Verabreichung von ”Naturfarbstoff (erhalten aus R. arboreum)” in einer Dosismenge von 1000 mg/kg Körpergewicht (empfohlene Höchstdosis) an Albinoratten keine toxischen Wirkungen im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von Tieren. Folglich ist der No Observable Adverse Effect Level (N. O. A. E. L)) = > 1000 mg/kg Körpergewicht.	Nicht toxisch
2.	Passiver Hautanaphylaxetest	Nicht allergen
3.	Prausnitz-Kustner-Test	Nicht allergen
4.	Enzymimmuntest (ELISA)	Nicht allergen

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Verfahren zur Herstellung von kristallinen und nicht hygroskopischen phenolreichen Farbfraktionen aus Pflanzen oder Pflanzenteilen, die eine gesteigerte Bioaktivität aufweisen, und die gegenüber einem mikrobiellen Angriff weniger anfällig sind, wobei das vorstehende Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Trocknen und Mahlen eines Pflanzenmaterials, so dass man ein Pulver erhält; b) Extrahieren des in Schritt (a) erhaltenen pulverisierten Materials durch Mikrowellen- oder Ultraschall- oder Soxhlet-Extraktion oder Perkolation oder Rückfluss; c) Konzentrieren des alkoholischen oder hydroalkoholischen Extraktes, wie er in Schritt (b) erhalten wird, im Vakuum, so dass das organische Lösungsmittel entfernt wird, und der konzentrierte Extrakt erhalten wird; d) Verdünnen des konzentrierten Extrakts, wie er in Schritt (c) erhalten wird, mit Wasser; e) Filtrieren des verdünnten Extraktes, wie er in Schritt (d) erhalten wird, so dass die wasserunlöslichen Verunreinigungen entfernt werden; f) Leiten des Filtrats über eine Harzsäule, die aus Amberlyte XAD 2, XAD 4, XAD 7, XAD 16, IRA 400, IRA 67, Dianion HP-20 und dergleichen ausgewählt wird; g) Eluieren der Säule zuerst mit Wasser, so dass stark polare wasserlösliche hygroskopische Komponenten entfernt werden, und anschließend mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem Alkohol, und Sammeln der organischen Lösungsmittel-Schicht; h) Konzentrieren der organischen Lösungsmittel-Schicht von Schritt (g) im Vakuum, so dass man kristalline und nicht hygroskopische Farbfraktionen erhält, die reich an phenolischen Verbindungen sind; i) Sprühtrocknen oder Lyophilisieren der stark polaren wasserlöslichen hygroskopischen Komponenten von Schritt (g), die Aminosäuren, Zucker und andere primäre Metabolite enthalten können.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Farbfraktionen aus einer vollständigen Pflanze oder den Pflanzenteilen erhalten werden, die aus Blättern, Blüten, Früchten, Rhizomen/Wurzeln ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die verwendete Mikrowelle ausgewählt ist aus Mikrowellen im Einfach- oder Mehrfachmodus bei einer Arbeitsfrequenz von 2450 MHz und einer elektrischen Arbeitsleistung der Mikrowellenstrahlung im Bereich von 150 bis 700 W.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zur mikrowellengestützten Extraktion erforderliche Extraktionszeit im Bereich von 2 bis 20 min, vorzugsweise 5 min, liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ausmaß der Ultraschallenergie für das Ultraschallbad im Bereich von 80 bis 100% liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zur ultraschallgestützten Extraktion erforderliche Extraktionszeit im Bereich von 40–100 min, vorzugsweise 60 min, liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Extraktion mit Lösungsmittel durchgeführt wird, das aus der aus Alkohol oder Wasser oder einem Gemisch aus Alkohol/Wasser oder einem Gemisch von Lösungsmitteln mit einer Polarität im Bereich von unpolaren bis zu polaren Lösungsmitteln mit oder ohne Ionenflüssigkeiten bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verhältnis von trockenem Pflanzenmaterial zum Extraktions-Lösungsmittel im Bereich von 1:1 bis 1:10 bezogen auf das Gewicht, vorzugsweise 1:5, ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zur Extraktion verwendeten Lösungsmittel bei einer Temperatur im Bereich von 40–45°C entfernt werden, so dass man einen konzentrierten Extrakt erhält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verdünnung von konzentriertem Extrakt mit Wasser oder seinem Gemisch mit Alkohol in einem Verhältnis im Bereich von 1:10 bis 1:50, vorzugsweise 1:20 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Elutions-Lösungsmittel aus Wasser oder einem Gemisch von Wasser und Alkohol im Verhältnis im Bereich von 1000 bis 90:10 besteht, das beim Sprühtrocknen oder bei der Lyophilisation oder Konzentration im Vakuum ein hygroskopisches Pulver ergibt, das Zucker, Aminosäuren usw. enthalten kann.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der zum Eluieren der Säule verwendete Alkohol aus der aus Methanol, Ethanol, Isopropanol oder Butanol, vorzugsweise Ethanol, bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konzentration des Alkohols im Vakuum bei einer Temperatur im Bereich von 40–50°C erfolgt, so dass eine Farbfraktion erhalten wird, die kristalline und nicht hygroskopische Beschaffenheit aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die isolierten Farbfraktionen bei einer Temperatur bis zu 80°C für bis zu 12 Std. hitzestabil sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die isolierten Farbfraktionen eine Kombination verschiedener Moleküle sind, einschließlich phenolischer Verbindungen, wie Flavonoide und Phenolsäuren, die primär für ihre Farbeigenschaften verantwortlich sind.
verfahren nach Anspruch 1, wobei die isolierten phenolreichen Farbfraktionen ebenfalls auch einige andere stickstoff-, schwefel- oder sauerstoffhaltige Sekundärmetaboliten, wie Koffein, enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die isolierten Farbfraktionen sowohl in Alkohol als auch in Wasser löslich sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die isolierten Farbfraktionen einen Farbbereich mit oder ohne die Verwendung von Beizmitteln und pH-Wert-Einstellung bereitstellen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lösungsmittel und das Harz mehrmals recycelt und wiederverwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die isolierten kristallinen Farbfraktionen in der Nahrungsmittel-, Getränke-, Kosmetik-, Textil- und Pharmaindustrie sowie als nanoeingekapselte Produkte verwendet werden.
Isolierte Farbfraktionen gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1, die gesteigerte Bioaktivität, einschließlich Antioxidans-Eigenschaften, aufweisen.
Isolierte Farbfraktionen aus Rhododendron arboreum gemäß dem Verfahren nach Anspruch 21, die für den Gebrauch durch den Menschen nicht allergisch und nicht toxisch sind.
Isolierte Farbfraktionen gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1, die gegenüber einem mikrobiellen Angriff weniger anfällig sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das entwickelte Verfahren keine Säure- oder Basenbehandlung während der Extraktion und Säulenreinigung einsetzt, wodurch seine natürlichen Eigenschaften bewahrt bleiben.
verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanze oder das Pflanzenteil ausgewählt ist aus medizinischen Pflanzen, umfassend Rhododendron arboreum, Hippophae rhamnoides, Camellia sinensis, Rheum emodi, Ginkgo biloba, Glycirrhiza glabra, Coffea arabica, Rubia tinctorum, Rubia cordifolia, Punica granatum, Emblica officinalis, Capsicum spp., Citrus sinensis-Schale, Syzygium cumini, Curcuma spp., Aloe Vera, Nyctanthes arbortristis, Quercus infectoria, Juglans nigra, Acacia nilotica, Schleichera oleosa, Berberis spp., Tagetes spp., Lawsonia inermis, Hibiscus spp., Stevia rebaudiana, Acacia catechu, Butea spp., Rumex spp., Terminalia chebula und Gemüsepflanzen, wie Daucus carota ssp. sativus var. atrorubens Alef. (schwarze Möhre), Trigonella foenum-graecum, Spinacia oleracea, Momordica charantia und dergleichen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanze oder das Pflanzenteil ausgewählt ist aus kommerziell wichtigen Getränkepflanzen wie Camellia sinensis, Hippophae rhamnoides, Emblica officinalis, Glycirrhiza glabra und Coffea arabica, die sie für Instant-Getränkeprodukte geeignet machen.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei das kristalline Farbmaterial, das aus Tee und Kaffee erhalten wird, einen hohen Koffeingehalt enthält, so dass es sich für stark Koffeinhaltige Getränkeprodukte eignet.
verfahren nach Anspruch 26, wobei ein entkoffeiniertes kristallines Farbmaterial, das aus Tee und Kaffee erhalten wird, produziert wird, indem der verdünnte Wasserextrakt in Schritt 1(d) mit einem organischen Lösungsmittel gewaschen wird, das aus einer aus Ethylacetat oder Chloroform bestehenden Gruppe ausgewählt ist, gefolgt von den Schritten 1(f)–1(h).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei bei den isolierten nicht hygroskopischen phenolreichen Farbfraktionen keine Konservierungsmittel verwendet werden.