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I. Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Chromatographie und insbesondere
ein Chromatographiemedium in Form eines zusammenhängenden
Granulats, das, wenn es mit Wasser vereinigt wird, schnell hydratisiert,
um ein Gel zu bilden, das für
chromatographische Anwendungen verwendbar ist.
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II. Hintergrund
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Die
Reinigung von Substanzen durch Chromatographie, insbesondere unter
Verwendung von „High Throughput" Technologien, wird
im Bereich der Forschung in den Lebenswissenschaften immer beliebter.
Traditionell wurde die Reinigung unter Verwendung von Säulen, die
das Chromatographiemedium in Gel(Aufschlämmungs)-Form, die aus einzelnen
Kügelchen
des Mediums, die einheitlich in einem ausgewählten wässrigen Puffer dispergiert
waren, bestand, enthielten, durchgeführt. Säulenbasierte Techniken sind
unter dem Gesichtspunkt einer großen Bindungskapazität wünschenswert;
wenn jedoch ein hoher Durchsatz gewünscht ist, tauchen Beschränkungen
auf, da gleichzeitig nur mehrere Säulen untergebracht werden können.
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Um
den Durchfluss zu erhöhen,
wurden Spinsäulen
für Mikrozentrifugen,
die ungefähr
1 ml oder weniger Gelvolumen verwenden, verwendet. Die Geschwindigkeit
genauso wie die Fähigkeit,
eine Vielzahl (~12–24)
Trennungen zur gleichen Zeit durchzuführen, wird dadurch verbessert.
Um einen höheren
Durchfluss mit einem gleichen Gelvolumen zu erreichen, ist die Verwendung
von in Mikrotiter-Filterplatten
dispergiertem Gel, wie zum Beispiel von Whatman, Polyfiltronics,
erhältlich,
beliebt geworden. Bei der Verwendung dieser Platten können 96
oder mehr Reinigungen gleichzeitig durchgeführt werden.
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Wenn
Mikrotiter-Filterplatten verwendet werden, tauchen jedoch eine Reihe
von Problemen auf. Das Chromatographiemedium neigt dazu, sich während dem
Dispergieren des Gels in einzelnen Vertiefungen abzusetzen, was
es schwierig macht, die Medienvolumina in allen Vertiefungen gleich
zu halten, insbesondere wenn das Dispergieren automatisch, zum Beispiel
mittels eines Roboters, durchgeführt
wird. Auch weil das Gel in Form einer wässrigen Aufschlämmung in
den Vertiefungen vorliegt, kann es aus dem „Tropfenleiter" herauslecken oder über die
Seitenwände
der Vertiefungen verschüttet
werden, insbesondere, wenn das Gel vor Ankunft im Labor in die Vertiefungen
gefüllt
wird. Ein weiteres Problem dreht sich um die fehlende Stabilität vieler Gelaufschlämmungen,
insbesondere bei Raumtemperatur. Dies führt dazu, dass größere Mengen
des Gels für die
regelmäßige Verwendung
in einer Vielzahl von Reinigungen und Assays für längere Zeiträume nicht gelagert werden können.
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Ein
letzter Nachteil, der bei der Verwendung von zur Zeit erhältlichen
Chromatographie-Gelen auftritt, ist, dass das Gel gewöhnlich zuerst
gewaschen und danach in dem wässrigen
Medium (Puffer), der für
die gewünschte
Anwendung ausgewählt
wurde, äquilibriert
werden muss. Das erfordert natürlich
zusätzliche
Verfahrensschritte für
den Anwender und ist dementsprechend zeitraubend.
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US-A-5
718 969 beschreibt im Wesentlichen trockene, rehydratisierbare,
wasser-dispergierbare, gelbildende, poröse Hydrokolloid-Mikropartikel,
die intern oder intern und extern mindestens ein wasserlösliches,
nicht-gelbildendes,
hydrationsverstärkendes
Hydrokolloid enthalten.
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US-A-5
114 577 beschreibt ein verbundstofftrennendes Mittel für wässrige Gelpermeations-Chromatographie.
Das hydrophile verbundstofftrennende Mittel wird durch das Laden
einer nichtvernetzten hydrophilen Startpolymerlösung in den Poren eines organischen
Polymersubstrates und der Zugabe eines Quervernetzungsmittels dazu,
um dadurch besagtes hydrophiles Startmaterial in den Poren querzuvernetzen,
hergestellt.
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III. Zusammenfassung der
Erfindung
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Nun
wird gemäß der vorliegenden
Erfindung jedoch ein Chromatographiemedium in einer Form bereitgestellt,
die die Probleme, denen zuvor begegnet wurde, und die oben diskutiert
wurden, umgeht. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Granulat
und ein Verfahren für
seine Herstellung und Verwendung, wobei das Granulat ein Chromatographiemedium
ist, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein zusammenhängendes
Aggregat von einzelnen Kügelchen
ist, das die Fähigkeit
hat einer Kraft, wie durch eine Schleuinger Pharmatron-Härte von
mindestens ungefähr
19,61 N (2 Kilopond) unter Beweis gestellt, zu widerstehen, und
das in der Lage ist, bei Zugabe von Wasser schnell hydratisiert
zu werden, um ein Gel zu bilden.
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In
einer Form definiert die Erfindung ein Material in Form eines praktisch
trockenen Granulats, das ein Aggregat von einzelnen Kügelchen
eines ausgewählten
Chromatographiemediums umfasst. Bei Zugabe eines wässrigen
Mediums hydratisiert das Granulat schnell, um ein Chromatographiegel
zu bilden, in dem die Kügelchen
geschwollen und im Wesentlichen einheitlich in der wässrigen
Phase verteilt sind. Ein weiteres wichtiges Merkmals des Granulats
der vorliegenden Erfindung ist, dass das Aggregat aus den Kügelchen
zusammenhängend
ist, gekennzeichnet durch das Aufweisen einer Schleuinger Pharmatron
Härte,
die wie hierin später
beschrieben bestimmt wird, von mindestens ungefähr 19,61 N (2 Kilopond (KP)).
In einem zusätzlichen Aspekt
dieser Erfindung ist das Chromatographiemedium quervernetzte Agarose,
Dextran oder ein Acrylamid/Azlacton Copolymer, vorzugsweise die
Varianten davon, die als hochvernetzt angesehen werden, was anzeigt,
dass das Medium unter hohem Säulendruck
dem Zerfall widerstehen kann. Agarose, die von dem Hersteller als „fast" oder „super
flow" bezeichnet
wird, ist typisch für
ein hochvernetztes Medium.
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Da
sie im wesentlichen trocken und zusammenhängend sind, können die
Granulate in den Vertiefungen einer Mikrotiter- oder Mikrofilterplatte
platziert oder wie hierin später
beschrieben in situ gebildet werden und die Platten sofort verwendet,
gelagert oder für
die zukünftige
Verwendung verschickt werden, wobei die Probleme des Auslaufens,
Verschüttens
und der Stabilität,
denen bei anderen vorgeformten Gelen begegnet wird, beseitigt sind.
Für die
Verwendung muss man nur das entsprechende wässrige Medium zugeben, und, da
die Hydration nahezu augenblicklich auftritt, können schnelle Assays und hoher
Durchsatz erreicht werden.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Herstellung
des granulierten Chromatographiemediums, das oben beschrieben wird,
bereitgestellt. Das Verfahren schließt das Platzieren eines ausgewählten Bettvolumens
eines wässrigen
Gels, das Kügelchen
eines Chromatographiemediums enthält, auf dem Boden eines Gefäßes ein,
so dass sich das Gel auf dem Boden des Gefäßes bis zu einer erkennbaren
Tiefe formt. Danach wird das Gel unter Zeit-, Temperatur- und Luftfeuchtigkeits-Bedingungen
getrocknet, die so ausgewählt sind,
dass ein Granulat bereitgestellt wird, das kohärent ist und die Fähigkeit besitzt,
einer Kraft zu widerstehen, und das in der Lage ist, bei Zugabe
bei Wasser schnell hydratisiert zu werden, um ein Gel zu bilden,
in dem die Kügelchen
geschwollen und im wesentlichen einheitlich in der Wasserphase verteilt
sind.
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IV. Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine Kopie einer Elektronenmikroskop-Fotografie eines Granulats der vorliegenden
Erfindung, das die einzelnen Kügelchen
eines Chromatographiemediums (Nickel chelatisierte vernetzte Agarose) darstellt,
das wie in Beispiel II hergestellt wurde.
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2 ist
zu Vergleichszwecken eine Kopie einer Elektronenmikroskop-Fotografie
eines Nickel chelatisierten nicht-quervernetzten Agarose Chromatographiemediums,
wobei keine einzelnen Kügelchen
vorhanden sind und als Ergebnis dieses Granulat nicht schnell rehydratisiert.
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3 ist
eine Fotografie eines im Wesentlichen trockenen Granulats der vorliegenden
Erfindung, das sich auf dem Boden des gezeigten Teströhrchens
befindet und dort gebildet wurde.
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4 ist
eine Fotografie eines Gels, das durch das Hydratisieren des Granulats,
das in 3 gezeigt ist, gebildet wird; die Fotografie wurde
ungefähr
60 Sekunden nach der Zugabe von Wasser zu dem Teströhrchen aufgenommen.
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V. Beschreibung der gezeigten
Ausführungsform
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Wie
hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „im wesentlichen bestehend
aus" in Bezug auf
ein Granulat, dass eine Ansammlung von Kügelchen eines Chromatographiemediums
unbedingt notwendig ist, aber andere Bestandteile, die die gewünschten
Eigenschaften des Granulats nicht beeinträchtigen, ebenfalls vorhanden
sein können.
Solche Bestandteile können,
ohne darauf begrenzt zu sein, Reste von Puffern, in denen das Gel
ursprünglich
vorlag oder in denen sie vor der Granulatbildung äquilibriert
oder derivatisiert wurden, einschließen. Um die Integrität des Granulats
zu fördern
und/oder die Ligandenaktivität
beizubehalten, wenn das Medium einen Liganden einschließt, können ebenfalls
Stabilisatoren, wie zum Beispiel Saccharose, vorhanden sein.
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Um
die zuvor identifizierten Vorteile zu realisieren, ist es ein wichtiger
Aspekt der vorliegenden Erfindung, dass das Granulat praktisch trocken
und kohärent
ist. Die Bezugnahme auf „praktisch
trocken" bedeutet, dass
das Granulat im Erscheinungsbild und beim Anfühlen trocken ist, aber ausreichende
Restluftfeuchtigkeit besitzt, um, vermutlich über Wasserstoffbrückenbindungen
zwischen den Kügelchen
des Chromatographiemediums, Kohärenz
zu erreichen. Der nützlichste
Feuchtigkeitsgehalt hängt
von dem entsprechenden beteiligten Medium ab. Mit Bezug auf diesen
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird jedoch ein Feuchtigkeitsgehalt des
Granulats von weniger als ungefähr
10%, vorzugsweise 1%–6%
und insbesondere 2–4%
als nützlich
betrachtet. Wie hierin verwiesen wird, wird der Feuchtigkeitsgehalt
mittels des Karl-Fischer Verfahrens unter Verwendung eines Metrohm
688 KF Ofens, eines Methrom 684 KF Koulometers und einer Methrom
649 KF Titrationseinheit mit einer Extraktionszeit von 15 Minuten
und einer Ofentemperatur von ungefähr 142°C gemessen.
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Das
Granulat der vorliegenden Erfindung hat im Allgemeinen ein Gewicht
von ungefähr
4–30 mg.
Granulate mit größerem Gewicht,
zum Beispiel bis zu 65 mg und darüber, sind jedoch nicht ausgeschlossen,
solange sie die anderen Eigenschaften besitzen, die mit der vorliegenden Erfindung
verbunden sind. Höhere
Gewichte sind im Allgemeinen mit Granulaten die Zusatzstoffe oder
Stabilisatoren enthalten verbunden.
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Wie
angegeben und in 1 gezeigt, ist das Granulat
dieser Erfindung ein kohärentes
Aggregat von Kügelchen
des Chromatographiemediums, das die angegebene Härte besitzt. Der Aspekt ein „kohärentes Aggregat" zu sein, unterscheidet
das Granulat von einer simplen Anhäufung von kugelförmigen Partikeln
in Pulverform, die sich zum Beispiel aus der Gefriertrocknung von üblichen
Gelen ergibt. Im Gegensatz zu einem Pulver hat das kohärente Aggregat
von Kügelchen
dieser Erfindung die Fähigkeit
einer Kraft zu widerstehen, wie durch das Aufweisen einer Schleuinger
Pharmatron (SP) Härte
bewiesen wird. Diese Härte
wird in einem Schleuinger Pharmatron Tablettentester 6D im Einklang
mit den Instruktionen des Herstellers gemessen. Ein Granulat mit
einer Schleuinger Pharmatronhärte
von mindestens ungefähr
19,61 N (2 KP), im allgemeinen mindestens ungefähr 58,84 N (6 KP) und vorzugsweise
mindestens ungefähr
78,5 N (8 KP) zeigt eine Kohärenz, die
die Ziele der vorliegenden Erfindung erfüllt.
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Immer
noch bezugnehmend auf die wichtigen Eigenschaften des Granulats
der vorliegenden Erfindung, ist das Granulat bei der Zugabe von
Wasser, gewöhnlich
als wässriger
Puffer, der basierend auf der gewünschten chromatographischen
Anwendung ausgewählt
wird, in der Lage zu schneller Hydration, d.h. dem Anschwellen der
Kügelchen
und der Bildung eines Gels oder einer Aufschlämmung, in dem/der die Kügelchen des
Chromatographiemediums im wesentlichen einheitlich in dem wässrigen
Medium verteilt sind. Wie in 4 gezeigt,
wird das Erfüllen
des Aspekts der schnellen Hydration am besten durch einfache visuelle
Betrachtung festgestellt, da eine einheitliche Gelbildung einfach sichtbar
ist. Die Hydrationsgeschwindigkeit zur Bildung des Gels, ist im
allgemeinen innerhalb von ungefähr
120 Sekunden und gewöhnlich
innerhalb von ungefähr
60 Sekunden nach der Zugabe von Wasser vollständig. Um eine Gelbildung zu
erreichen, ist Schütteln im
Allgemeinen nicht notwendig.
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Die
Bildung des Granulats der vorliegenden Erfindung kann durch das
Dehydratisieren (Trocknen) eines ausgewählten Bettvolumens eines wässrigen
Gels, das Kügelchen
eines Chromatographiemediums enthält, und das auf dem Boden eines
Behälters,
zum Beispiel einem Teströhrchen
oder Vertiefungen einer Mikrotiterplatte oder anderen Vertiefungen,
platziert ist, unter ausgewählten
Bedingungen von Zeit, Temperatur und Luftfeuchtigkeit erreicht werden.
Bettvolumina des Gels (50–75%
Harz) im Bereich von 100 μl–1000 μl werden
als am nützlichsten
betrachtet, wobei eine wichtige Erwägung ist, dass sich das feuchte
Gel bis zu einer erkennbaren Tiefe am Boden des Behälters, in
welches es gegeben wird, formt, so dass die Granulatbildung erreicht
werden kann. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass, für ein gegebenes
Medium und Volumen, die ausgewählten
Bedingungen der Bildung eines Granulats mit den spezifizierten Eigenschaften
hinsichtlich Kohärenz
und schneller Hydration zuträglich
sind. Zum Beispiel kann die schnelle Trocknung, wie zum Beispiel
unter Vakuum oder bei sehr niedriger Luftfeuchtigkeit oder hoher
Temperatur, zu der Bildung eines bruchstückhaften, nicht-kohärenten Granulats,
oder wie in 2 gezeigt, eines trockenen Granulats,
das kohärent
sein kann aber nicht in einer annehmbaren Zeit hydratisiert, führen. Daher
müssen
ausreichende Zeit, eine angemessene Temperatur und die notwendige
Luftfeuchtigkeit bereitgestellt werden, um eine angemessene Bindung
der einzelnen Kügelchen
zu erzielen, um für
die Kohärenz
des Granulats zu sorgen und in dem hydratisierten Gel eine einheitliche
Verteilung der Kügelchen
sicherzustellen.
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Ein
bevorzugtes Verfahren der Granulatbildung gemäß der vorliegenden Erfindung
schließt
das offene atmosphärische
Trocknen einer Aufschlämmung
von Kügelchen
unter Temperatur- und Luftfeuchtigkeitsbedingungen, die gemäßigt sind
oder sich bestehenden gemäßigten annähern, d.h.
eine Temperatur von 20–35°C und eine
Luftfeuchtigkeit von 20%–60%.
Ein anderes bevorzugtes Verfahren verwendet eine Temperatur- und Luftfeuchtigkeitskontrollierte
Kammer mit Temperaturen von 10°C–40°C und Luftfeuchtigkeiten
von 15%– 30%.
Mit beiden obigen Verfahren können
in ungefähr
24–96
Stunden brauchbare Granulate gebildet werden. Der Trocknungsprozess
kann durch eine höhere
Temperatur und niedrigere Luftfeuchtigkeiten beschleunigt werden,
aber das Risiko der Bildung eines mangelhaften Granulats steigt.
Die Menge von brauchbaren Granulaten hängt von dem verwendeten Chromatographiemedium
und der Menge der ursprünglichen
Aufschlämmung
ab. Im Allgemeinen haben Granulate, die aus 100–1000 μl einer 50%–75% Aufschlämmung hergestellt sind,
ein Gewicht von ungefähr
4–65 mg.
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Obwohl
die vorliegende Erfindung als mit einer Vielzahl von Chromatographiemedium
anwendbar betrachtet wird, werden Medien, die auf Agarose, Dextran
und Arcylamid/Azlacton Copolymer basieren, als am nützlichsten
betrachtet, insbesondere die quervernetzten Variationen, und insbesondere
die, die als hochquervernetzt angesehen werden. Mit dem bevorzugten
Medium kann die Bildung von Granulats gemäß der vorliegenden Erfindung,
die die gewünschten
Kohärenz-
und Hydrations-Eigenschaften besitzen, in geeigneter Weise unter
den Bedingungen, die zuvor identifiziert wurden, hergestellt werden.
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung.
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Beispiel I
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Dieses
Beispiel zeigt die Herstellung von Granulaten gemäß der vorliegenden
Erfindung aus den folgenden kommerziell erhältlichen Chromatographiegelen
von Amersham Pharmacia Biotech (APB).
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Die „Sepharose" Gele enthielten
20% Ethanol, das entfernt wurde, und die Gele wurden wie folgt äquilibriert:
175 ml einer 75% Gelaufschlämmung
(130 ml Harz) wurden 5x mit einem gleichen Volumen „Milli
Q" Wasser Trisgepufferter
Salzlösung
(TBS) gewaschen und das Harz wurde dann durch die Zugabe eines gleichen
Volumens Trisgepufferter Salzlösung
(TBS), ph 8,0, äquilibriert.
Nach dem Dekantieren wurde durch die Zugabe von 130 ml TBS eine
50% Aufschlämmungsmischung
erzeugt. Das „Sephadex" Gel wurde unter
Verwendung von Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) anstelle von TBS
in einer ähnlichen
Weise äquilibriert.
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200 μl der 50%
Aufschlämmungsmischungen,
die oben hergestellt wurden, wurden in die Vertiefungen von fünf verschiedenen
herkömmluchen
Polystyrol Miktrotiterplatten mit 96 Vertiefungen und mit flachem
Boden und ebenfalls in die Vertiefungen von fünf Filterplatten mit 800 μl Kapazität (Polyfiltronics
Unifilter 800) pipettiert. Die Gele, die in den Vertiefungen enthalten
waren, wurden dann unter den folgenden Bedingungen getrocknet: Temperatur
22–25°C; Luftfeuchtigkeitsgrad
40–45%.
Nach 96 Stunden Trocknung unter den obigen Bedingungen wurde beobachtet,
dass sich am Boden der Vertiefungen beider Arten von Platten weiße, undurchsichtige,
scheibenförmige
kohärente
Granulate gebildet hatten. Mehrere Granulate wurden intakt aus den
Vertiefungen entfernt. Die Granulate, die aus den Vertiefungen jeder
Platte entfernt wurden, wurden auf Feuchtigkeitsgehalt und Härte getestet,
wobei die durchschnittlichen Ergebnisse wie folgt waren:
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100 μl Wasser
wurden in die Vertiefungen der Platten pipettiert, die noch Granulate
enthielten. In allen Fällen
kam es innerhalb von 1 Minute ohne Schütteln zur Hydration der Granulate,
um Gele mit angeschwollenen Kügelchen,
die einheitlich im Wasser verteilt sind, zu bilden.
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Beispiel II
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Dieses
Beispiel zeigt die Herstellung von Granulaten gemäß der vorliegenden
Erfindung, wobei das Chromatographiemedium mit Nickel chelatisierte
Agarose ist, ein Medium das für
die Affinitätsreinigung
von 6 × His-markierten Fusionsproteinen
verwendet wird.
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Mit
Nickel chelatisierte „Sepharose" Fast Flow von APB
(Code #17-0575, eine hochquervernetzte Agarose) wurde mit fünf Gelvolumen „Milli
Q" Wasser gewaschen
und unter Verwendung von 0,1 M Nickelsulfat mit Nickel chelatisiert.
Das ungebundene Nickel wurde durch wiederholtes Waschen mit „Milli
Q" Wasser entfernt
und das chelatisierte Gel mit 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 8,0),
der 300 mM NaCl und 10 mM Imidazol enthielt, äquilibriert, dekantiert und
dann in einem Gelvolumen desselben Puffers resuspendiert, um eine 50%
Gelaufschlämmung
zu erzeugen.
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200-μl der 50%
Gelaufschlämmung
wurden in die Vertiefungen einer Filterplatte mit 96 Vertiefungen (Polyfiltronics)
gegeben und die Aufschlämmung
bei ungefähr
25°C und
einer Luftfeuchtigkeit von ungefähr 40%
getrocknet. Nach ungefähr
96 Stunden hatten sich praktisch trockene (weniger als 5% Feuchtigkeit)
kohärente
Granulate, die ungefähr
11 mg wogen, auf dem Boden der Vertiefungen gebildet. Die Granulate
hatten eine Härte
von ungefähr
68,6 N (7 KP) und einen Feuchtigkeitsgehalt von 2–4%.
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100-μl E.coli
Lysat, das ein 6 × His-markiertes
GFP Fusionsprotein enthielt, wurde direkt zu jedem Granulat gegeben,
das in einem well der Platte enthalten war. Nahezu sofort (innerhalb
von ungefähr
30 Sekunden) war zu beobachten, dass die Granulate in dem Lysat
vollständig
hydratisiert waren.
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Eine
Sammelplatte mit flachen Vertiefungen wurde dann unter der Filterplatte
platziert und die Einheit bei 500 × g für 3 Minuten zentrifugiert,
um den Durchfluss zu entfernen. Nach darauf folgenden Waschschritten mit
50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 8,0), der 300 mM NaCl und 75 mM
Imidazol enthielt, wurde das gebundene GFP Fusionsprotein vier Mal
mit demselben Puffer, der aber 250 mM Imidazol enthielt, eluiert.
Proben von jedem Schritt wurden über
einen Proteinassay (BCA-Verfahren) und über SDS-PAGE Analyse analysiert. Die
Ergebnisse, die unter Verwendung von Granulaten, die gemäß der vorliegenden
Erfindung gebildet wurden, erhalten wurden, waren im wesentlichen
die gleichen wie die, die bei einer auf die gleiche Weise durchgeführten Trennung
unter direkter Verwendung des Nickel chelatisierten Fast Flow „Sepharose" Gels erhalten wurden,
was andeutet, dass die Bildung des Granulats die Affinitätstrennungsfähigkeiten
des Nickel chelatisierten Gels nicht negativ beeinflusst.
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Beispiel III
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Dieses
Beispiel zeigt die Herstellung eines Chromatographiemediums gemäß der vorliegenden
Erfindung, wobei die Agarose als Liganden Protein A oder Protein
L einschließt,
für die
zusammen mit Protein G gefunden wurde, dass sie Antikörper binden
und dementsprechend für
Immunassaytechniken, die Affinitätschromatographie
verwenden, verwendbar sind.
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Protein
A und Protein L derivatisierte quervernetzte Agarosegele, die von
dem Inhaber der vorliegenden Erfindung, Pierce Chemical Company,
unter der Marke „Immuno-Pure" erhältlich sind,
wurden gewaschen und in Pierce IgG Bindungspuffer äquilibriert,
um eine 50% Gelaufschlämmung
zu erzeugen. 200 μl
der so äquilibrierten
Aufschlämmungen
wurden in die Vertiefungen von Filterplatten mit 96 Vertiefungen
gegeben und für
72 Stunden bei 25°C–35°C und 40–45% Luftfeuchtigkeit
getrocknet. Es wurden kohärente,
scheibenförmige,
undurchsichtige, kohärente
Granulate gebildet.
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Zu
jeder der Vertiefungen, das Granulate enthielt, wurden 100 μl Ziegenantiserum
verdünnt
1:1 mit Pierce IgG Bindungspuffer zugegeben. Es wurde beobachtet,
dass schnell hydratisierte Gele, die die hierin beschriebenen gewünschten
Eigenschaften hinsichtlich ihrer Einheitlichkeit besitzen, gebildet
wurden. Nach der Zentrifugation, wiederholtem Waschen und der Elution,
wurde das Ziegenprotein über
SDS-PAGE analysiert und mit „GelCode" blauem Proteinfärbungsreagenz
von der Pierce Chemical Company gefärbt. Wie die derivatisierten
Agarosegranulate, die in Beispiel II beschrieben wurden, funktionierten
die Granulate, die in diesem Beispiel III beschrieben werden, nach
der Hydration in gleicher Weise wie das Gel, das direkt von Pierce
erhältlich
ist.
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Die
vorhergehenden Beispiele haben die Herstellung von Granulate gezeigt,
die bei der Hydration im Wesentlichen auf dieselbe Weise funktionieren
wie das ursprüngliche
feuchte Gel. Es gibt jedoch Umstände, wo
das nicht genau so sein wird, insbesondere mit Bezug auf bestimmte
Gele, die auf so eine Weise derivatisiert worden sind, dass der
Ligand einige Instabilität
zeigt, wenn er getrocknet wird. In solchen Fällen können während dem Trocknen des Granulats
Zusatzstoffe eingeschlossen werden, um durch das Verhindern der
Denaturierung die Ligandenaktivität beizubehalten. Es ist bekannt,
dass Zucker, wie zum Beispiel Saccharose, Trehalose und Sorbitol,
für diesen
Zweck nützlich
sind.
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Beispiele
IV und V zeigen zwei solche Fälle.
Beispiel IV zeigt die Herstellung eines Granulats, das aus Agarose
hergestellt wird, die mit Streptavidin als Liganden derivatisiert
ist. Beispiel V zeigt die Herstellung eines Granulats, das aus Agarose
hergestellt wird, die mit Glutathion als Liganden derivatisiert
ist. Bei der Chromatographie ist Streptavidin aufgrund seiner starken
Affinität
zu Biotin und somit der Fähigkeit,
biotinylierte Moleküle,
wie zum Beispiel Nukleotide und Peptide, einzufangen nützlich.
Dagegen ist Glutathion für
die Reinigung von Glutathion-S-Transferase (GST) Fusionsproteinen,
die durch rekombinante Verfahren hergestellt wurden, nützlich.
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Beispiel IV
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200 μl (50% Gelaufschlämmung) „Ultra-Link", einem mit Streptavidin
derivatisierten quervernetzten Bis-Acrylamid/Azlacton Copolymer, das von
Pierce Chemical Company erhältlich
ist, wurden gewaschen, äquilibriert
(0,1 M Natriumbikarbonat, pH 8,1–8,3, das 10% Saccharose enthält) und
dann bei 35°C
und 40% Luftfeuchtigkeit unter einer 50 Watt Glühbirne (152–178 mm (6–7 Inches) entfernt) für ungefähr 3 Tage,
wie hierin zuvor beschrieben, mit begleitender Granulatbildung getrocknet.
Das Granulat rehydratisierte bei Zugabe von 100 μl Wasser in 15 Sekunden.
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Mit
der Zugabe von Saccharose zu dem Äquilibrierungspuffer funktionierte
das Granulat hinsichtlich der Bindungseffizienz in derselben Weise,
wie das feuchte Gel von Pierce ohne Saccharosezugabe.
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Beispiel V
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„Sepharose" 6 Fast Flow in einer
Gelaufschlämmung
wurde mittels konventioneller Techniken mit einem Linker, 1–4-Butandiol Diglycidylether,
derivatisiert und dann mit Glutathion umgesetzt. Nach dem Waschen
mit Wasser und dem Rekonstituieren mit Wasser, das 2,5% Sucrose
enthielt, wurde die Granulatbildung gemäß dieser Erfindung durch Trocknen
von 400 μl
einer 50% Aufschlämmung
in einer Kammer, die für
ungefähr
70 Stunden bei 28°C
und 15% Luftfeuchtigkeit gehalten wurde, erreicht. Das Granulat
wurde durch die Zugabe von 200 μl
Wasser innerhalb von drei Minuten rehydratisiert. Danach wurde ein
bakterielles Lysat, das GST markiertes Protein enthielt, zu dem
hydratisierten Granulat zugegeben. Ungebundene Proteine wurden durch
Waschen entfernt und das GST durch bekannte Verfahren eluiert. Das
derivatisierte Chromatographiemedium dieses Beispiels V ergab im
Wesentlichen eine vergleichbare Leistung bei der Reinigung des GST markierten
Proteins, wie das ursprüngliche
feuchte Gel ohne Zugabe des Zusatzstoffes.
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V. Industrielle Anwendbarkeit
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Ein
schnell hydratisierbares, kohärentes,
zerfallstabiles, monolithisches Chromatographiemediumgranulat, das
bei Rehydratation ein Gel liefert, das einen hohen Durchsatz bei
der Reinigung von Substanzen aufweist, wobei sich das Gel durch
einheitlich verteilte geschwollene Kügelchen auszeichnet. Das Granulatmedium
kann in eine ausgewählten Struktur
geformt werden und liefert in seiner unhydratisierten Form einen
formstabilen Körper
für die
Lagerung, den Transport und die Handhabung und kann mit einem Liganden
derivatisiert werden, um die Reinigung zu ermöglichen. Das Medium wird ohne
merklichen Verlust der Bindungseffizienz zur Bildung eines Gels
schnell hydratisiert und ist, basierend auf seiner funktionellen
und strukturellen Stabilität,
insbesondere für
die Verwendung in einem großen
Bereich von Umgebungen einschließlich Chromatographieanwendungen
im Labor und im Freiland geeignet. Wie oben beschrieben ist das
Medium insbesondere für
Anwendungen die Mikrotiterplatten verwenden nützlich und insbesondere für die Verwendung
in den Lebenswissenschaften geeignet.
