DE2601930C2 - - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Es ist oftmals notwendig, Moleküle einer besonderen Substanz von einem Gemisch von Substanzen abzutrennen und wenn es sich um Makromoleküle, (d. h. Moleküle mit hohem Molekulargewicht, zum Beispiel Proteinmoleküle) handelt, ist es bekannt, die Abtrennung und Fraktionierung der Moleküle unter Verwendung von chromatographischen Verfahren durchzuführen. Bei solchen Verfahren werden vorbestimmte Moleküle an ein Material "sorbiert", das geeignet ist, selektiv die Moleküle dem Gemisch zu entziehen und später behandelt man das Material mit Eluierungsmitteln, um die Elution der sorbierten Moleküle zu bewirken. Die Bezeichnung "Sorption" wird in dieser Beschreibung so verwendet, daß darunter die Retention von Molekülen durch das Material zu verstehen ist und sie beinhaltet beispielsweise die Absorption und Adsorption, die die physikalische und chemische Sorption beinhalten.

Zur Abtrennung von Makromolekülen wurden bisher organische und anorganische Materialien verwendet, wobei jedoch diese Materialien bestimmte Nachteile aufweisen. Organische Materialien wie natürliche Polymerisate (zum Beispiel Cellulose), modifizierte natürliche Polymerisate (zum Beispiel Ionenaustauschercellulosen und vernetzte Dextrane) und synthetische Polymerisate (zum Beispiel Ionenaustauscherharze und vernetzte Polyacrylamide) wurden bisher bei Makromolekularabtrennungen verwendet. Um jedoch den großen Molekülen das Eindringen zu ermöglichen, mußten die Poren des Materials groß sein und als Ergebnis dieser offenen Struktur neigen solche Materialien dazu, leicht zusammengepreßt zu werden und dem Aufquellen und Schrumpfen bei Änderungen des pH-Wertes und der Ionenkonzentration der Medien, mit denen diese Materialien in Kontakt gebracht werden, zu unterliegen. Zusätzlich sind die natürlichen Polymerisate und die modifizierten natürlichen Polymerisate gegenüber dem mikrobiologischen Angriff empfindlich und haben nur begrenzte Stabilität gegenüber Säuren und Laugen. Einige dieser organischen Materialien sind ebenso zu teuer. Weiterhin wurde in der Praxis festgestellt, daß Arbeitsverfahren im technischen Umfang mit diesen Materialien wegen ihrer ungünstigen physikalischen Eigenschaften für Säulenverfahren (d. h. als Bett gepackt in einer Säulenvorrichtung) schwierig sind.

Die angegebenen Materialien wurden bisher für Batch- Ansätze und Säulen-Fraktionieren, Deionisieren und im gewissen Ausmaß zum Konzentrieren von Makromolekülen aus verdünnter Lösung verwendet.

Eine Anzahl anorganischer Materialien wurde auch zum Abtrennen von Makromolekülen verwendet. Zu solchen Materialien gehören Calciumphosphat, sowohl als Kristalle (Hydroxylapatit) als auch in Form von Gelen, Bariumsulfat, poröses Siliciumdioxid, poröses Glas, Aluminiumoxid, -hydroxid, und -phosphat als Pulver und in Gelform, Magnesiumpyrophosphat als Gel und Zinkoxidpulver. Von diesen Materialien haben nur Calciumphosphat, Bariumsulfat und Aluminiumoxidgel in größerem Ausmaß Verwendung gefunden.

Hydroxylapatit wurde bisher in Form von Kristallen verwendet, wobei jedoch praktische Schwierigkeiten dadurch eintreten, daß kleine Teilchengrößen erforderlich sind, damit man eine größere Sorptionsfläche erhält und weil die Kristalle zerbrechlich sind und unter Bildung von "Feinstoffen" (d. h. feinsten Kornfraktionen) zerbrechen. Es wurde festgestellt, daß Säulen, die dieses Material enthalten, wegen Vorliegens des feinen Materials zum Verstopfen neigen und daß die Säulen selten wieder verwendet werden können; das Material findet, außer im Laboratoriumsumfang, nur geringe Verwendung.

Bariumsulfat wurde bisher zur Adsorption bestimmter Gerinnungsfaktoren aus Blutplasma verwendet, aber die zur Bildung eines hohen Adsorptionsvermögens erforderliche kleine Kristallgröße hat zur Folge, daß das Material schwierig zu handhaben und zusätzlich zur Verwendung in Säulen ungeeignet ist. Die oben erwähnten Gele sind schwierig reproduzierbar herzustellen und können in Säulen nicht verwendet werden, außer wenn sie mit einem Füllstoff (zum Beispiel Cellulose oder Kieselgur) gemischt werden, wobei jedoch unerwünschte, nicht spezifische Adsorptionswirkungen oftmals auftreten. Poröses Siliciumdioxid und Glas sind kostspielig und werden für Molekularsiebe verwendet. Man hat auch versucht, die Adsorptionswirkungen dieser Materialien zu verringern, weil diese Wirkungen irreversibel sind und/oder zu Verlusten an biologischer Wirksamkeit beitragen.

Aus der DE-OS 23 65 265 ist ein Molekularsieb bekannt, das in einer Grundmasse von polymeren Gelen ein Adsorptionsmittel enthält. Als Adsorptionsmittel werden beispielsweise Aktivkohle, Aluminiumoxid, Ionenaustauscherharz, etc. verwendet. Zur Herstellung dieses Molekularsiebs wird in einem mehrstufigen Verfahren gearbeitet, wobei in einer ersten Stufe die Dispersion des Adsorptionsmittels in einer Lösung des polymeren Materials erfolgt. In der zweiten Stufe wird die erhaltene Dispersion in einem Hilfsmedium mit einem Siedepunkt, der höher ist als der des Lösungsmittels, zur Bildung feiner Tröpfchen dispergiert. In der dritten Stufe wird das Lösungsmittel entfernt.

Weiter ist aus der DE-OS 24 29 196 ein anorganisches poröses Trägermaterial, das im wesentlichen einen wasserunlöslichen Träger großer Oberfläche aus wenigstens einem Metalloxid, porösem Glas oder dergleichen besteht, wobei der Träger an der Oberfläche Iminogruppen aufweist, bekannt.

Am zweckmäßigsten sollten Materialien zur Abtrennung von Makromolekülen gegenüber Druck, Temperatur und chemischen Reagentien (einschließlich wäßrigen Lösungen) stabil sein und sie sollten nur minimale Schäden an den Makromolekülen, mit denen sie in Kontakt kommen, bilden.

Zusammenfassend litten die bisher verwendeten Materialien zur Abtrennung von Makromolekülen aus Substanzen, die solche Makromoleküle enthalten, an praktischen Nachteilen, die den Ursprung in ihren physikalischen Eigenschaften haben.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Molekularsieb zur Verfügung zu stellen, das einfach herzustellen ist und das physikalische Eigenschaften besitzt, die seine Verwendung in der Säulenchromatographie nicht nachteilig beeinflussen. Insbesondere sollten die Bildung von Feinstoff vermieden werden und die Widerstandsfähigkeit gegen Druck, Temperatur und chemische Reagenzien verbessert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird zusätzlich zu einem flüchtigen Additiv ein Bindemittel in die Mischung eingeführt.

Der Begriff "sorptiv", wie er hier in bezug auf ein Material, aus dem die Teilchen gebildet werden können, verwendet wird, bedeutet, daß das Material entweder seiner Beschaffenheit nach sorptiv ist oder daß es behandelt werden kann, um es sorptiv und zum Sorbieren der Makromoleküle geeignet zu machen.

Es ist darauf hinzuweisen, daß bei der Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung die Porenstruktur hauptsächlich durch das flüchtige Additiv in dem dispersen Zustand der Lösung bestimmt wird und daß die Porenstruktur eine solche Größe haben muß, daß die vorbestimmten Makromoleküle in die Partikel eindringen können.

Weiterhin ist darauf hinzuweisen, daß das Gemisch dadurch gebildet werden kann, daß man ein Lösungsmittel für das flüchtige Additiv zu einem Gemisch des anorganischen Materials und des festen flüchtigen Additivs zugibt oder daß man eine Lösung des flüchtigen Additivs in dem Lösungsmittel zu dem anorganischen Material zugibt.

Die Erfindung beinhaltet ferner nach einer weiteren Ausführungsform diskrete poröse Teilchen, die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellt sind.

Vorzugsweise sind die diskreten porösen Teilchen nach der vorliegenden Erfindung im wesentlichen kugelförmig und weisen eine für chromatographische Verfahren geeignete Größe (typischerweise 50 bis 600 µm Durchmesser) auf, wodurch sie leicht gehandhabt werden können und neigen nicht dazu, "Feinstoffe" zu bilden, so daß sie nach einer Anwendung weniger Schwierigkeiten im Hinblick auf Verstopfung bilden, wenn sie in einer Säule verwendet werden. (Für manche Zwecke kann eine Größe von 2 µm brauchbar sein und für andere kann eine Größe von 3 mm bevorzugt werden. Größere Teilchen können dann brauchbar sein, wenn man eine flüssige Substanz mit dem Gehalt einer geringeren Konzentration von Makromolekülen bei hoher Fließgeschwindigkeit und flüssigen Substanzen geringer Qualität (zum Beispiel solche, die partikelförmige Verunreinigungen enthalten, behandelt). Gleichzeitig weisen die Teilchen ein brauchbares Sorptionsvermögen infolge ihrer porösen Struktur (untereinander verbundene Porosität) auf. Die Teilchen haben gute Säuleneigenschaften, sind mechanisch fest und neigen dazu sich schnell unter Bildung gut gepackter Säulenbetten abzusetzen, die mit hohen Fließgeschwindigkeiten durchpumpt werden können. Die Teilchen können in gleicher Weise in ansatzweise durchgeführten Verfahren, in Wirbelbettverfahren und in Gegenstrom- Kreislaufprozessen verwendet werden.

Es wird angenommen, daß neben der Verwendung der sorptiven Eigenschaften des Materials zur Selektion der Makromoleküle in bestimmten Fällen die Abtrennung durch weitere spezifische Wechselwirkungen zwischen dem Material und den sorbierten Molekülen erfolgen kann. Dies kann beispielsweise erreicht werden durch geeignete Auswahl der sorbierenden Materialien oder durch Zuschläge, um die spezifischen Wechselwirkungen zu fördern, zum Beispiel durch Metall-Makromolekül- Wechselwirkungen.

Bei der Durchführung des Verfahrens der Erfindung ist es weiterhin möglich, die Bildung der Porenstruktur der diskreten porösen Teilchen so zu steuern, daß die Porenstruktur in der Weise eines Molekularsiebes wirkt, wodurch größere Makromoleküle als einer vorausbestimmten Größe am Eindringen in die Teilchen und an der Sorption gehindert werden, während kleinere Moleküle als der vorausbestimmten Größe in die diskreten Teilchen eindringen können und sorbiert werden.

Die Erfindung schafft daher in weiterer Hinsicht diskrete poröse Teilchen, die neben dem Verfahren der Erfindung hergestellt sind, mit einer Porenstruktur, die in der Art und Weise eines Molekularsiebes wirken kann, wodurch größere Makromoleküle als eine vorausbestimmte Größe am Eindringen in die diskreten porösen Teilchen und an der Sorption gehindert werden, während kleinere Makromoleküle als der vorausbestimmten Größe in die diskreten Teilchen eindringen können und sorbiert werden.

Es ist darauf hinzuweisen, daß die diskreten, porösen Teilchen nach der unmittelbar voraus beschriebenen Ausführungsform der Erfindung sowohl mit sorptiven als auch Molekularsiebeigenschaften zur Verfügung stehen, um die Bildung einer verbesserten Trennschärfe der Molekularabtrennung zu erreichen. Beispielsweise kann eine erste Makromolekularspezies, die in besondere diskrete poröse Teilchen eindringen kann, von einem Gemisch abgetrennt werden, das eine geringe Konzentration dieser ersten Spezies und einen größeren Anteil einer zweiten makromolekularen Spezies enthält, wobei die letztere nicht in die porösen diskreten Teilchen eindringen kann, weil die zweite makromolekulare Spezies am Eindringen in die Teilchen "ausgeschlossen" ist (zum Beispiel Toxine).

Die Porenstruktur der diskreten porösen Teilchen und damit die Größe der Makromoleküle, deren Eindringen ausgeschlossen oder ermöglicht wird, kann dadurch variiert werden, daß man geeignete flüchtige Additive bei der Herstellungsstufe einbringt.

Wenn die diskreten porösen Teilchen zur Abtrennung von Makromolekülen verwendet werden, können die durch die diskreten porösen Teilchen sorbierten Makromoleküle nachfolgend davon wiedergewonnen werden, indem man die diskreten porösen Teilchen mit einem Eluierungsmittel in Kontakt bringt. In dem Falle, wo verschiedene Arten von Makromolekülen aus der fließfähigen Substanz sorbiert werden, können die sorbierten Arten durch Eluieren mit unterschiedlichen Eluierungsmitteln oder durch anderweitige Änderungen der Eluierungsbedingungen fraktioniert werden.

Es ist darauf hinzuweisen, daß es möglich ist, die diskreten Teilchen so anzuordnen, daß unerwünschte Arten von Makromolekülen aus einem Gemisch von gewünschten und ungewünschten Arten sorbiert werden, wobei in diesem Falle die gewünschten Arten nicht durch die Teilchen zurückgehalten werden und so aus dem Gemisch gewonnen werden können.

Es können viele Materialien nach der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. So werden diskrete Teilchen, die im wesentlichen Kugelform aufweisen, in dem Größenbereich von 50 bis 60 µm aus Titandioxid (TiO₂), Aluminiumoxid (Al₂O₃), Calciumphosphat, Bariumsulfat (BaSO₄), Zirconoxid und Calciumsulfat, Zinkoxid, Magnesiumoxid und Bentonit hergestellt.

Die Porengrößen variieren, wobei 80% bis 87% der Poren Größen zwischen 100 und 1000 nm (bestimmt mittels Quecksilberporosimetrie, einem Standardverfahren) aufweisen. Es wird angenommen, daß Porengrößen im Bereich von 50 nm und aufwärts geeignet sein sollten, wobei jedoch darauf hinzuweisen ist, daß die Porenform von Bedeutung ist und das Quecksilbermeßverfahren nur den Eingangsdurchmesser der Poren angibt.

Unerwarteterweise ist die zur erfolgreichen Sorption eines Makromoleküls erforderliche Porengröße viel größer als die Größe des zur Sorption bestimmten Makromoleküls. So wird beispielsweise Albumin (15,0 nm × 3,8 nm) durch einen porösen Körper, bei dem etwa 80% der Poren zwischen 1000 und 4300 Å aufweisen, nicht sorbiert, jedoch durch einen porösen Körper, bei dem 60% der Poren Größen zwischen 270,0 und 1000,0 nm haben.

Zu den flüchtigen Additiven, die zur Bildung der Porosität verwendet werden, gehören Ammoniumcarbonat, Hämoglobin und Polyvinylalkohol (PVA), die zu Produkten mit sicheren Molekulargewichtsausschlußgrenzen führen. Als weitere flüchtige Additive zur Bildung von Porosität können beispielsweise Dextran, Harnstoff, Rinderserum, Albumin und Ovalbumin verwendet werden. In allen den Beispielen, einschließlich TiO₂, Calciumphosphat und Al₂O₃, liefert die Verwendung von Ammoniumcarbonat als flüchtiges Additiv poröse Teilchen, die Proteine mit niedrigerem Molekulargewicht ausschließen als poröse Partikel mit Hämoglobin als flüchtigem Additiv. Ebenso liefert PVA mit niederem Molekulargewicht poröse Teilchen mit niedereren Molekularausschlußgrenzen als PVA mit hohem Molekulargewicht.

Die Temperaturen, die zur Herstellung der porösen Teilchen verwendet werden, sind bei TiO₂ 900° C, bei Al₂O₃ 600 bis 1200° C, bei BaSO₄ 1200 bis 1400° C und bei Calciumphosphat 1100° C. In allen Fällen erfolgt das Erhitzen in Luft oder O₂ und bei atmosphärischem Druck. Es kann jedoch eine inerte Atmosphäre oder Vakuum verwendet werden.

Um den Einfluß der Wärmebehandlungsbedingungen auf das poröse teilchenförmige Produkt zu prüfen, wurden Proben "grüner" Hydroxylapatitkugeln bei erhöhten Temperaturen verschieden oft und bei unterschiedlichen Temperaturen behandelt. Das Sorptionsvermögen der behandelten Kügelchen wurde dann mit Hämoglobin als "Molekularsonde" geprüft.

Eine einstündige Behandlungstemperatur von 800° C lieferte Teilchen mit der höchsten Sorptionskapazität, wobei die Kapazität mäßig bei Erhöhung der Temperatur und Behandlungszeit abnimmt.

Unter 700° C hatten die Kugeln ein graues Aussehen, wodurch das Vorliegen von nicht umgesetztem Kohlenstoff erkennbar ist.

Bei einer weiteren Prüfung durch Untersuchungen mittels einem Rasterelektronenmikroskop ergab sich, daß die mittels dem "Orbitalsphärodisations"-Weg (siehe nachfolgend) hergestellten Teilchen eine Oberflächenporosität aufwiesen und daß aufgeteilte Teilchen eine Porosität hatten, die durch die gesamten Teilchen hindurch reichte.

Es ergab sich eine ursächliche Übereinstimmung zwischen der Porengrößenverteilung und den Meßverfahren mittels B.E.T. und Quecksilberporosimetrie.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden spezifischen Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Feine TiO₂-Teilchen (<10 µm) wurden zuerst dadurch hergestellt, daß man eine Suspension von TiO₂ in Wasser filtriert. Das Grund-"Orbitalsphäroidisationsverfahren" (orbitale Zusammenballung) wurde, wie in den Britischen Patentschriften 9 92 237 und 10 33 143 beschrieben, verwendet, jedoch, wie nachfolgend noch beschrieben, modifiziert. 500 g TiO₂ wurden mit einer gesättigten Lösung, die 100 g Ammoniumcarbonat enthielt, und mit 25 g Glyzerin in 100 ml Wasser unter Bildung einer Aufschlämmung gemischt. Diese ließ man langsam trocknen und durch ein 50 µm Nylonsieb laufen.

Eine ähnliche Menge TiO₂ wurde mit 100 g Ammoniumcarbonat, jedoch nur 12,5% Glyzerin gemischt. Diese wurde in ähnlicher Weise behandelt.

Das Gemisch mit dem höheren Glyzeringehalt wurde zuerst in Kugelform durch orbitale Zusammenballung in die "Caviar"-Stufe überführt; da jedoch nur kleinere Teilchengrößen von Interesse waren, waren diese nur mikroskopisch sichtbar. Wenn dies erfolgt war, wurden geringe Mengen des zweiten Gemischs allmählich zugegeben, wodurch man nicht abgebundene, "grüne" Kugeln mit Partikelgrößen von 50 µm bis 500 µm erhielt. Diese wurden gesiebt, wodurch man verschiedene Schnitte unterschiedlicher Größenbereiche erhielt. Diese getrennten "grünen" Kugeln wurden dann 2 Stunden bei 900° C in Luft erhitzt um das Additiv zu entfernen und das Sintern zu bewirken und man erhielt ausreichend harte poröse Teilchen, die nur Spuren an freiem Oxid bei Rühren in Wasser freigeben und bei Verwendung in Säulen war kein feines Material in den Eluaten, weder sichtbar noch mittels UV-Absorption festzustellen. Die Teilchen waren stabil gegenüber Behandlung mit Citrat-, Phosphat- und Pyrophosphatpuffern, gegenüber 0,1M NaOH und 1N HCl. Diese Teilchen schließen bei Prüfung alle, selbst die kleinsten Proteine, aus.

Beispiel 2

500 g TiO₂ wurden mit 40 g Hämoglobin (in Schuppenform) 2 Stunden in einer Kugelmühle gemahlen. 120 g dieses Gemischs wurden mit einer Lösung gemischt, die 6 g Glyzerin in 60 ml Wasser enthielt. Wegen der größeren Kristallitgröße des TiO₂ bildeten sich beim Zusammenballen glatte Aggregate nach Trocknen und Sieben durch ein Sieb mit 50 µm. Die "grünen" Teilchen, die hauptsächlich eine Größe von 200 bis 300 µm hatten, wurden bei 900° C 2 Stunden in Luft erhitzt um das flüchtige Additiv zu entfernen und die Versinterung zu bewirken und sie lieferten Partikel mit ähnlichen physikalischen Eigenschaften wie im Beispiel 1, ausgenommen, daß das Sorptionsspektrum der Proteine vollständig unterschiedlich war. Dieses Material sorbierte die meisten der geprüften Proteine.

Beispiel 3

1 kg TiO₂ wurden mit 200 g PVA (Molgew. 125 000) in 2 l H₂O aufgeschlämmt. Nach Trocknen ergab dies einen sehr harten elastischen Feststoff, der unter Bildung von Aggregaten gemahlen wurde und aus dem man 500 g Teilchen (100 µm bis 500 µm) erhielt. Diese wurden 1 Stunde bei 900° C in Luft erhitzt, um das flüchtige Additiv zu entfernen und die Versinterung zu bewirken. Die gebildeten Teilchen hatten eine für die meisten unter Versuch stehenden Proteine offene Struktur und eine ähnliche Kapazität wie in Beispiel 2.

Beispiel 4

200 g Calciumphosphat Ca₃(PO₄)₂ wurden mit 30 g Ammoniumcarbonat und 10 g Glyzerin, gelöst in 165 ml Wasser, aufgeschlämmt. Eine ähnliche Aufschlämmung, die nur 5 g Glyzerin enthielt, wurde ebenso hergestellt.

Die erste Aufschlämmung wurde nach Trocknen und Durchlaufen eines Siebes von 50 µm zur "Caviar"-Stufe zusammengeballt und danach wurden geringe Mengen des zweiten Gemischs zugegeben. Man erhielt dadurch "grüne" Kügelchen zwischen 1000 und 250 µm, die 1 Stunde in Luft bei 1100° C erhitzt wurden, um das flüchtige Additiv zu entfernen und die Versinterung zu bewirken. Diese Teilchen hatten eine für die meisten Proteine offene Struktur, waren aber ebenso für frontale Elution zugänglich. Sie waren gegenüber Phosphatpuffern und 0,1M NaOH (jedoch nicht gegenüber Pyrophosphat) stabil; durch Röntgenbeugung wurde festgestellt, daß dieses Material hauptsächlich Hydroxylapatit war.

Beispiel 5

200 g Ca₃(PO₄)₂ wurden mit 40 g Hämoglobin und 20 g Glyzerin in 100 ml H₂O aufgeschlämmt, das Gemisch getrocknet und durch ein Sieb von 200 µm gegeben. Teilchen von 200 µm bis 150 µm wurden gesammelt und 1 Stunde bei 1100° C erhitzt, um das flüchtige Additiv zu entfernen und die Versinterung zu bewirken. Man erhielt offen strukturierte poröse Partikel, die sich im wesentlichen ähnlich verhielten wie im Handel erhältliches Hydroxylapatit.

Beispiel 6

200 g Bariumsulfat (BaSO₄) wurden mit 20 g Ammoniumcarbonat und 10 g Glyzerin, die vorausgehend in 150 ml H₂O gelöst wurden, aufgeschlämmt. Ein ähnliches Gemisch, das nur 5 g Glyzerin enthielt, wurde ebenso hergestellt. Beide Gemische ließ man trocknen und dann durch ein Sieb mit 50 µm Maschenweite laufen. Das erste Gemisch wurde dann in Kügelchen zur "Caviar"-Stufe verarbeitet und die Kugeln weiter unter allmählicher Zugabe des zweiten Gemischs aufgebaut. Es wurden gute Kügelchen im Bereich von 200 bis 500 µm gebildet und diese wurden 1 Stunde bei 1300° C erhitzt, um das flüchtige Additiv zu entfernen und die Versinterung zu bewirken, wodurch man poröse Kugeln erhielt (geeignet zum Sorbieren von Makromolekülen), die gegenüber Puffer und 0,1M NaOH stabil waren.

Beispiel 7

600 g Aluminiumoxid (Al₂O₃) wurden mit 120 g Ammoniumcarbonat und 60 g Glyzerin in 60 ml Wasser aufgeschlämmt und trocknen lassen. Dieses Gemisch wurde durch ein Sieb von 50 µm durchgelassen und Zusammenballung durchgeführt. Man erhielt glatte Aggregate im Größenbereich von 100 bis 200 µm, die 2 Stunden bei 1200° C erhitzt wurden, um das flüchtige Additiv zu entfernen und die Versinterung zu bewirken. Die porösen Teilchen waren gegenüber Phosphat- und Pyrophosphatpuffern und 0,1M Natriumhydroxid stabil. Eine Ammoniumsulfatfraktion aus Pferdemuskelextrakt, chromatographiert mit einem stufenweise durchgeführten Pufferelutionsprogramm über Säulen dieser porösen Partikel lieferte eine Anzahl gut getrennter Peak's.

Beispiel 8

Eine Aufschlämmung wurde aus 1000 g Ca₃(PO₄)₂ und 200 g Hämoglobin (die vorausgehend in 750 ml Wasser gelöst wurden) hergestellt. Das Volumen der Aufschlämmung wurde auf 3 l eingestellt.

Die Aufschlämmung wurde dann einer Sprühtrocknungsanlage zugeführt unter Bildung von kugelförmigen Teilchen, die dann entsprechend der Größe mit einem Wirbelbett-Druckluftsystem abgetrennt wurden. Die Fraktion mit der gewünschten Größe des Materials wurde 1 Stunde bei 900° C erhitzt, um das flüchtige Additiv zu entfernen und die Versinterung zu bewirken.

Es wurde festgestellt, daß die einheitlichen Teilchen ein vergleichbares Proteinsorptionsvermögen unter Verwendung des "Orbitalsphäroidisationsverfahren" aufwiesen, wie in den vorausgehenden Beispielen.

Die durch Quecksilberporosimetrie erhaltenen Werte für

• a) TiO₂-Partikel, die unter Verwendung von Ammoniumcarbonat als flüchtiges Additiv hergestellt wurden, und für
• b) TiO₂-Teilchen, die unter Verwendung von Hämoglobin als flüchtiges Additiv hergestellt wurden,

ergibt, daß bei a) etwa 80% der Poren einen Größenbereich von 0,45 bis 0,1 µm und bei b) etwa 80% der Poren einen Größenbereich von 2,4 bis 0,1 µm aufwiesen.

Die Erfindung wird weiter erläutert durch Ergebnisse von Versuchen und Beispiele von Abtrennungen, die unter Verwendung von diskreten, porösen Teilchen nach der vorliegenden Erfindung bewirkt wurden.

Im Handel erhältliche einzelne gereinigte Makromoleküle wurden sorbiert und eluiert. Zu diesen gehören Albuminserum, γ-Globulin, Hämoglobin, Lysozym, Ribonuclease, Phosphoglyceratkinase, Lactatdehydrogenase, Cytochrom C, Urease, Ovalbumin, Myoglobin, Thymus DNA, Hefe RNA. Gemische von gereinigten Proteinen (zum Beispiel Ovalbumin, Cytochrom C und γ-Globulin), Muskelextrakte und Blutserum wurden chromatographiert. Die drei Proteine, Rinderserumalbumin, γ-Globulin und Cytochrom C wurden einzeln aus einem synthetischen Gemisch derselben abgetrennt. Die Abtrennungen wurden bei Temperaturen zwischen 2° C und Raumtemperatur (etwa 25° C) und bei atmosphärischen Drücken durchgeführt. Die porösen Teilchen wurden in Glassäulen mit Bettabmessungen bis zu 1 cm Durchmesser und 50 cm Länge verwendet, wobei jedoch größere Kolonnen für Arbeiten im technischen Umfang verwendet werden können.

Es wurden Fließgeschwindigkeiten bis zu 500 ml/Std. bei 1×50-cm-Säulen (660 ml/cm²/Std. oder 10 Bettvolumen/Std.) verwendet und die Abtrennungen wurden bei pH-Werten zwischen 3 und 10 durchgeführt. Der optimale pH-Wert der Sorption hängt von den Oberflächeneigenschaften des Proteins, seiner Stabilität bei den zur Verwendung gebrachten pH-Werten und der Natur des jeweiligen Sorptionsmaterials ab. Die Sorption an Oxide kann über einen großen Bereich von pH-Werten durchgeführt werden, weil das Sorptionsmaterial und das Protein amphoter sind, jedoch braucht dies bei den unlöslichen Salzen nicht so ausgeprägt zu sein.

In den meisten Fällen wurden die Makromoleküle in Lösungen gelöst, die Puffer enthielten, um den optimalen pH-Wert beizubehalten. EDTA kann zur Stabilisierung der Enzyme im Falle von einigen sorbierenden Oxiden verwendet werden. Es ist darauf hinzuweisen, daß im besonderen im Falle von Oxiden die Sorption nicht durch Salze wie NaCl (1M) noch durch (NH₄)₂SO₄ (0,3M) inhibiert wird. Die rasche Sorption aus verdünnten (0,1 mg/ml) Lösungen war bei Verwendung von Säulen mit porösen Teilchen zu beobachten. Weil Makromoleküle enthaltende Substanzen oftmals Salze wie Natriumchlorid und Ammoniumsulfat aus vorausgehenden Trennstufen enthalten, haben anorganische Materialien Vorteile gegenüber organischen Ionenaustauschermaterialien, weil die zuerst bezeichneten Materialien eingesetzt werden können, ohne daß man diese Salze entfernen muß, während die zuletzt bezeichneten Materialien häufig dann nicht arbeiten.

Calciumphosphat wurde durch Eluieren mit 500 mM Phosphatlösung und 0,1N NaOH-Lösung regeneriert, ebenso Bariumsulfat. Oxide wurden mit 400 mM Phosphat, 100 mM Pyrophosphat und 0,1N Natriumhydroxid regeneriert. Im Gegensatz zu den organischen Materialien kann das gründliche Reinigen von anorganischen Materialien, sofern notwendig, durch erneutes Erhitzen auf erhöhte Temperaturen von 100 bis 1400° C, abhängig von dem Material, im allgemeinen in Luft bei atmosphärischem Druck bewirkt werden.

Es wurde festgestellt, daß Makromoleküle aus Calciumphosphat und Bariumsulfat mit Phosphatpuffern wechselnder Ionenstärke eluiert werden können. Bei Oxiden wurden Citrat, Phosphat und Pyrophosphat entweder als Gradienten oder als getrennte Stufen verwendet.

Chromatogramme von Rinderserumalbumin wurden unter Verwendung von Calciumphosphatteilchen erhalten und es wurde festgestellt, daß es möglich ist, Rinderserumalbumin an der Sorption durch Verwendung von porösen Teilchen mit kleinen Poren auszuschließen.

Bei den geprüften Proteinen wurde nur geringe oder keine Elution aus Titandioxid mit Natriumchloridkonzentrationen, die so hoch wie 1M waren, erzielt, jedoch wurden Proteine mit Citrat-, Phosphat- und Pyrophosphatlösungen eluiert.

Im Falle, daß die Makromoleküle, die durch die Teilchen sorbiert werden, als Verunreinigung in einer Substanz (zum Beispiel antigenen Proteinen in einem Vakzin), vorhanden sind, müssen die sorbierten Makromoleküle nicht unter Verwendung eines Eluierungsmittels eluiert werden, da, wenn die Verunreinigung ein unerwünschtes Produkt ist, die Teilchen erhitzt werden können um die Verunreinigungsmoleküle zu inaktivieren und die Teilchen zur Wiederverwendung zurückbleiben. Es können auch die sorbierten Makromoleküle mit starken Säuren oder Alkali, je nach dem Material der Partikel entfernt werden. Es ist klar, daß die Partikel gegenüber dem mikrobiologischen Angriff im wesentlichen resistent sind und daß daher die "Gebrauchsdauer" der Teilchen durch den Kontakt mit Mikroorganismen nicht eingeschränkt wird.

Es folgen nunmehr einige Beispiele für Abtrennungen nach der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 9

Dieses Beispiel erläutert die Abtrennung von Makromolekülen.

Offenporige Titandioxidteilchen, hergestellt nach der vorliegenden Erfindung, wurden in 5 mM Phosphatpuffer bei pH 8,0 suspendiert, wobei die Teilchen mehrmals mit dem gleichen Puffer gewaschen und Feinteile dekantiert wurden. Sie wurden dann in einer 1×50-cm-Glassäule, die mit einer Fritte ausgestattet ist, gegossen. Eine Probe von Makromolekülen, gelöst in dem oben angegebenen Puffer, wurde auf die Kolonne gegeben und die Kolonne wurde dann mit einer Reihe von Puffern behandelt, die automatisch mit Hilfe einer Vorrichtung des programmierten Mehrkanal-Ventiltyps verteilt wurden (beschrieben in der britischen Patentschrift 11 72 356). Das Eluat wurde durch U.V.-Absorption mittels Fließen durch ein Nachweisinstrument überwacht und in einem Fraktionssammelgerät gesammelt.

Eine Ammoniumsulfatfraktion aus Pferdemuskeln wurde unter Bildung einer Anzahl diskreter Protein-enthaltender Peak's fraktioniert. Die Phosphoglyceratkinase enthaltenden Peak's wurden dargestellt, und es wurde festgestellt, daß etwa 70% der Enzymaktivität erreicht wurde.

Beispiel 10

Dieses Beispiel erläutert die Konzentration eines Proteins aus einer verdünnten Lösung.

Eine Säule wurde, wie in Beispiel 9 beschrieben, hergestellt. Eine Lösung, die Proteine in verdünnter Lösung (zum Beispiel 0,1 mg/ml und pH 8, 0,01 M Ammoniumacetat) enthielt, wurde durch eine Säule (zum Beispiel 1 × 50 cm) mit einer Geschwindigkeit von 600 ml/cm²/Std. gepumpt, wobei das Eluat kontinuierlich, wie in Beispiel 10, überwacht wurde. Wenn Protein in dem Eluat erschien, wurde die Beschickung angehalten, 0,1M Natriumpyrophosphat durch die Säule gepumpt und das U.V.-absorbierende Material gesammelt, in einen Behälter gegeben und hinsichtlich der Phosphoglyceratkinase-Aktivität untersucht. Es wurden Konzentrationsfaktoren bis zu 40 erreicht. Eine gute Sorption der enzymatischen Aktivität wurde bei dieser hohen Fließgeschwindigkeit zusammen mit einer akzeptablen Gewinnung an enzymatischer Aktivität (∼70%) erreicht. Es wurde festgestellt, daß die sorbierten Moleküle wie im Beispiel 9 fraktioniert werden konnten. Die Abtrennung und Fraktionierung erfolgte in ähnlicher Weise wie in den Beispielen 9 und 10 mit verschiedenen Oxiden.

Bei den Elutionsversuchen wurden ähnliche Elutionskurven mit im Handel erhältlichem Hydroxylapatit und den diskreten porösen Partikeln der vorliegenden Erfindung erhalten. Es wurde festgestellt, daß reproduzierbare Chromatogramme längere Zeit durch aufeinanderfolgende Regeneration des Säulenmaterials in situ erhalten werden konnten. Beispielsweise konnte Hydroxylapatit zur Abtrennung von Rinderserumalbumin verwendet werden, wobei man als Eluierungsmittel verschiedene Phosphatkonzentrationen in einem automatischen System verwendete. In diesem Falle konnte der Hydroxylapatit durch Waschen mit Alkali zur Entfernung des sorbierten Proteins regeneriert werden und die erneute Äquilibrierung kann leicht unter Verwendung einer geringen Molarität Phosphat erreicht werden.

TiO₂ und Al₂O₃ scheinen "komplementär" im Hinblick auf makromolekulare Abtrennungen zu sein.

Es werden daher Proteine, wie beispielsweise Albumin, nicht leicht in TiO₂ sorbiert, aber leichter in Al₂O₃. Das umgekehrte gilt beispielsweise für γ-Globulin.

Die nachfolgende Liste gibt Beispiele über Anwendungen der erfindungsgemäß hergestellten Teilchen:

• (a) Fraktionierung von Proteinen, einschließlich Enzymen und Antigenen.
• (b) Fraktionierung von Nucleotiden und Polynucleotiden.
• (c) Abtrennung von Proteinen von Polynucleotiden.
• (d) Abtrennung von Makromolekülen von kleinen Molekülen (zum Beispiel von antigenem Protein aus Antibiotika).
• (e) Konzentration von Makromolekülen aus verdünnter Lösung (zum Beispiel aus Kulturfiltraten von Bakterien; aus Abfallprodukten wie Molke).
• (f) Vakzinreinigung (antigene Proteine von Viruspräparaten).
• (g) Reinigung und Abtrennung von Kohlenhydraten.
• (h) Als feste Träger für Enzyme und Immunoadsorbentien.

Beispielsweise kann ein Bett von biologisch aktivem Matrial dadurch hergestellt werden, daß man ein Enzym auf Teilchen, die in einer Kolonne sind, sorbiert. Das Enzym bleibt in dem Bett für eine bestimmte Anzahl von Verwendungen im wesentlichen aktiv und kann nach Verwendung durch Waschen mit Pyrophosphat, Alkali oder durch Erhitzen entfernt werden, womit das Bett zur erneuten Verwendung regeneriert wird.

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung von diskreten porösen Teilchen zur selektiven Retention von im voraus bestimmten Makromolekülen aus einer diese Makromoleküle enthaltenden flüssigen Substanz, wobei die diskreten porösen Teilchen eine untereinander durchgehend verbundene Porigkeit aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) diskrete grüne (nicht abgebundene) Teilchen aus einer Mischung herstellt, die feste Teilchen aus einem feinverteilten, unlöslichen, sorptionsfähigen, anorganischen Material und ein flüchtiges Additiv in Lösung enthält, wobeidie Mischung durch Mischen der festen Teilchen des anorganischen Materials mit einem flüchtigen Additiv und einem Lösungsmittel dafür hergestellt wird, das flüchtige Additiv für die anschließende Bildung einer Porenstruktur in dem anorganischen Material dient und das anorganische Material in dem Lösungsmittel für das flüchtige Additiv unlöslich ist, die Herstellung der diskreten, nicht abgebundenen Teilchen in der Weise erfolgt und das flüchtige Additiv so ausgewählt ist, daß das flüchtige Additiv in fester Form in den nicht abgebundenen Teilchen vorliegt,

und daß man

• b) die nicht abgebundenen Teilchen zur Entfernung des flüchtigen Additivs und zur Sinterung des anorganischen Materials unter Bildung diskreter poröser Teilchen erhitzt,
  wobei das flüchtige Additiv und dessen Menge in den nicht abgebundenen Teilchen so ausgewählt sind, daß die diskreten porösen Teilchen eine untereinander durchgehend verbundene Porigkeit aufweisen, die diskreten porösen Teilchen eine ausgedehnte wirksame Oberfläche aufweisen unddie Porenstruktur derart ist, daß sie es den im voraus bestimmten Makromolekülen ermöglicht, die diskreten porösen Teilchen zu durchdringen und sorbiert zu werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich zu dem flüchtigen Additiv ein Bindemittel in die Mischung einführt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die hergestellten Teilchen kugelförmig sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die hergestellten Teilchen einen Durchmesser im Bereich von 50 bis 600 µm aufweisen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das flüchtige Additiv so auswählt, daß die Porenstruktur Poren mit einem Durchmesser im Größenbereich von 100 bis 1000 nm (1000 bis 10 000 Å) enthält.