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Hintergrund
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neues Adsorbens, umfassend ein
poröses
Mineraloxidmaterial mit Apatit-Kristallen, vorzugsweise Hydroxyapatit-Kristallen,
in den Poren des Mineraloxidmaterials. Das Adsorbens ist geeignet
für Protein-
und Nucleinsäuretrennungen.
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Apatit
ist ein Calciumphosphat-Material in kristalliner Form der allgemeinen
Formel Ca5(F, Cl, OH 1/2 CO3)(PO4)3. Einer der üblicheren
Apatit-Typen ist Hydroxyapatit mit der Formel [Ca2(PO4)2]3Ca(OH)2. Er ist geeignet als Packungsmaterial zum
Befüllen
von Säulen
für die
chromatographische Trennung von Biopolymeren, z.B. Proteinen, Enzymen
und Nucleinsäuren.
Seine Befähigung zur
Adsorption solcher Moleküle
ist abhängig
von der Struktur des Kristalls selbst sowie von der exponierten
Oberfläche
der Kristalle.
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Die
Technik zur Herstellung von Hydroxyapatit, der zur Verwendung für die Säulenchromatographie
geeignet ist, wurde zuerst entwickelt von Tiselius et al. [Arch.
Biochem. Biophys., 65: 132-155 (1956)]. Hydroxyapatit für den Einsatz
in der Säulenchromatographie
wird nach verschiedenen Verfahren hergestellt.
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Konventionellerweise
werden Hydroxyapatite synthetisiert durch (1) Nasssynthese, wobei
ein wasserlösliches
Calciumsalz und Phosphat in wässriger
Lösung
reagieren gelassen werden, (2) Trockensynthese, wobei Calciumphosphat
und Calciumcarbonat in der Gegenwart von Wasserdampf bei 900 bis
1400°C reagieren
gelassen werden, oder (3) hydrothermale Synthese, wobei Calciumhydrogenphosphat
hydrolisiert wird, z.B. bei 200°C
und 15 Atmosphären.
Die nach konventionellen Verfahren erzeugten Hydroxyapatite weisen
die Form von Platten auf, die fein verteilt werden müssen, insbesondere wenn
sie als Säulenpackungsmaterial
für die
chromatographische Trennung verwendet werden sollen. Die Platten
werden in winzige Stücke,
die in Gestalt und Größe variieren,
zerteilt. Die irregulären
Stücke von
Hydroxyapatit können
nicht gleichförmig
oder dicht in die Säule
für die
chromatographische Trennung gepackt werden.
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Hydroxyapatit
in der Form von plattenartigen Kristallen oder Agglomeraten von
Mikrokristallen ist ferner hinsichtlich seiner mechanischen Festigkeit schlecht
und neigt dazu, während
des Packungsvorgangs und Messung zerstört zu werden.
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Chromatographische
Charakteristika des Hydroxyapatits variieren gemäß der verwendeten Packungsmethode
mit der Folge von Variabilität
in den Trennungen und Bettkollaps.
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In
den letzten Jahren ist ein Verfahren zur Herstellung von mikrosphärischem
Hydroxyapatit vorgeschlagen worden, um diese Nachteile zu überwinden,
wobei das sogenannte Sprühtrocknungsverfahren
verwendet wird, welches weit verbreitet im Einsatz ist zur Herstellung
von Granulen von einer pulverförmigen
Substanz (japanische Patent-Offenlegungsschriften Nr. Sho. 62-206445
und Nr. 62-230607). Gemäß dem in
der japanischen Patent-Offenlegungsschrift Nr. 62-206445 offenbarten Verfahren
werden Mikrokristalle von Hydroxyapatit mit einem Durchmesser von
weniger als 1 μm
als Primärpartikel
durch Sprühtrocknen
physikalisch koaguliert, um im Wesentlichen sphärische Partikel von 1-10 μm Durchmesser
als zweite Partikel zu bilden.
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Wenn
die nach diesen Verfahren erhaltenen sphärischen Hydroxyapatit-Partikel
einer Klassifizierung durch Sieben unterworfen werden, um Partikel mit einer
definierten Partikelgröße als Packungsmaterial
für die
Flüssigchromatographie
zu gewinnen, neigen die sphärischen
Partikel wegen ihrer schlechten mechanischen Festigkeit dazu, zerstört zu werden
und werden in Stücke
gebrochen, wenn sie unter hohem Druck dicht in eine Säule gepackt
werden. Dementsprechend sind die durch Sprühtrocknen gebildeten sphärischen
Hydroxyapatit-Partikel einer Wärmebehandlung
zu unterziehen, die bei einer hohen Temperatur über einen langen Zeitabschnitt durchgeführt wird,
um ihnen ausreichend mechanische Festigkeit zu verleihen, so dass
sie dem hohen Druck beim Packen widerstehen. Die strenge Wärmebehandlung
bewirkt jedoch, dass die sphärischen Partikel
dazu tendieren, in einem wechselseitig fusionierten Zustand aneinander
gebunden zu werden, um Granulen im teilweise festen Zustand zu bilden.
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Die
japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. Sho. 62-230607 offenbart
ein Verfahren zur Herstellung von sphärischen Agglomeraten von Apatit, wobei
eine gelierte Hydroxyapatit-Aufschlämmung in eine bei 100-200°C gehaltene
Atmosphäre
gesprüht wird,
um sphärische
Agglomerate von Hydroxyapatit mit einem Durchmesser von 1-10 μm zu bilden.
In einem Hydrogelnetzwerk eingeschlossener Hydroxyapatit ist relativ
weich und die Bindungskapazität
ist mäßig wegen
der begrenzten Menge an Hydroxyapatit-Kristallen, die in einem gegebenen
Volumen an Sorbens vorliegen, ca. 40%. Die Gegenwart eines Hydrogels,
welches Kristalle von Hydroxyapatit umgibt, verhindert den direkten
Kontakt mit sehr großen Molekülen wie
Plasmiden. Somit gehen die konventionellen Verfahren mit einer Anzahl
von Problemen einher, und zwar nicht nur in der Herstellung von sphärischen
Hydroxyapatit-Partikeln, sondern auch in der Verwendung der Partikel
als Packungsmaterial für
chromatographische Zwecke.
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Mineraloxid-Kügelchen
oder -Beads zur Verwendung in der Chromatographie sind bekannt und können mehr
Festigkeit aufweisen als Hydroxyapatit-Sorbentien. Für Anwendungen,
in denen eine weitere Substanz in das Kügelchen eingebracht wird, ist eine
Porengröße von mehr
als 500 Å erforderlich,
um ungehinderte Diffusion von großen Molekülen zu erlauben. Es ist jedoch
schwierig, einen großen
Porendurchmesser zu erhalten, ohne Porosität und Festigkeit abträglich zu
beeinflussen. Ferner zeigen Mineraloxidoberflächen verschiedene Arten von
Wechselwirkungen mit Proteinen, einschließlich elektrostatischer, van
der Waals- und Lewis-Säure-Base-Wechselwirkungen,
die die Qualität
einer Trennung verändern
oder ein Biomolekül
sogar denaturieren können.
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Es
besteht Bedarf nach relativ kleinen porösen Partikeln, welche die Trennfähigkeiten
von Apatit bereitstellen, dabei aber ihre Gestalt, ihre chemischen
und mechanischen Eigenschaften in spezifischen Umgebungen, die für die Biomolekültrennung in
Säulen
sowie in Suspensionen geeignet sind, beibehalten und welche eine
wesentliche Dichtedifferenz zu Flüssigkeiten, die in der Adsorption
und Chromatographie verwendet werden, bieten. Derartige Apatit-Materialien mit hervorragenden
mechanischen Festigkeiten und chromatographischen Eigenschaften
sind bisher noch nicht beschrieben worden.
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Die
US 5 651 884 offenbart Säulenpackungsmaterialien,
welche für
Anwendungen wie die Flüssigchromatographie
geeignet sind. Die Packungsmaterialien umfassen Partikel von Polyestern, Polystyrolen,
Polyacrylen, Kohlenstoff, Siliciumoxid, Aluminiumoxid und Phosphatglas
beschichtet mit einer Calciumphosphat-basierten Verbindung.
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Die
US 5 567 231 offenbart poröse Adsorptions-
und Filterpartikel, umfassend ein Keramikmaterial enthaltend 5 bis
100 Gew.-% einer Calciumphosphat-Verbindung.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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In
Einklang mit der vorliegenden Erfindung wird ein Chromatographie-Sorbens
bereitgestellt, welches die Trennfähigkeiten von Hydroxyapatit-Kristallen
mit der Festigkeit eines Mineraloxidnetzwerkes kombiniert. Dieses
Kompositsorbens zeigt überlegene
Eigenschaften bei seiner Verwendung in der chromatographischen Trennung
oder in der Substanztrennung oder -entwicklung bei seiner Verwendung
als das in eine Säule
gepackte oder geladene Adsorbens oder als ein Stationärphase-Agens
in der Säulenchromatographie.
Chromatographie, die dieses Sorbens als das Adsorbens in Batch-Trennungen oder
in eine Festbett- oder Fließbettsäule gepackt verwendet,
erzielt eine hohe Schärfe
und Präzisionstrennung
und Fraktionierung von Substanzen, die sich in ihrer Struktur nur
sehr wenig voneinander unterscheiden. Dies war mit der Verwendung
von Adsorbentien nach dem Stand der Technik schwierig zu erzielen.
Derartige Substanzen können
biologische Makromolekülmaterialien
mit einem Molekulargewicht von 104 bis 109 Dalton umfassen, z.B. Proteine, einschließlich Immunoglobuline,
Interferon oder Enzyme, oder Nucleinsäuren wie RNA, DNA oder Plasmide
oder Viren. Das Kompositsorbens ist unverzichtbar für die Hochreinheitstrennung
und -reinigung einer Vielfalt von letztendlich nützlichen Substanzen, welche
durch Genrekombination, Zellfusion oder Zellkultur en masse erhalten
werden.
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Das
Komposit-Chromatographiesorbens umfasst Mineraloxid-Kügelchen
oder -Beads mit Poren, welche mit Apatit, insbesondere Hydroxyapatit, gefüllt sind.
Die Mineraloxidkügelchen
des Kompositsorbens sind gekennzeichnet durch hohe Porosität, kleine
Oberfläche,
großen
mittleren Porendurchmesser und hohe mechanische Stabilität. Ferner
zeigen sie eine Dichte, welche das Packen von Festbettsäulen erleichtert,
die Partikelsedimentationsgeschwindigkeit im Batch erhöht und die
Verwendung hoher Geschwindigkeiten in Fließbettverfahren erlaubt. Die
Apatit-Kristalle sind durch ein sehr starkes Mineraloxidskelett,
vorzugsweise ein Zirconoxid-Skelett, geschützt.
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Im
Besonderen betrifft die vorliegende Erfindung ein Komposit-Chromatographiesorbens,
umfassend poröse
Mineraloxidkügelchen
mit einem Porenvolumen, welches 10% des Kügelchenvolumens überschreitet,
vorzugsweise zwischen 30% und 70%, mehr bevorzugt zwischen 30% und
60%, und einem mittleren Porendurchmesser zwischen 1000 Å und 4000 Å, mehr
bevorzugt zwischen 1000 Å und
3000 Å.
Die Poren der Kügelchen
enthalten Apatit-, vorzugsweise Hydroxyapatit-Kristalle. Vorzugsweise
ist das Mineraloxid ausgewählt
aus der Gruppe, welche aus Aluminiumoxid, Titanoxid, Hafniumoxid,
Siliciumoxid, Zirconoxid und Mischungen hiervon besteht, am meisten
bevorzugt Zirconoxid. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mineral
Siliciumoxid, wobei das Porenvolumen zwischen 40% und 70% des Kügelchenvolumens
beträgt
und der mittlere Porendurchmesser zwischen 2000 Å und 5000 Å beträgt.
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Bei
einer Ausführungsform
sind die Kügelchen
des Komposit-Chromatographiesorbens mit einer Lage von hydrophilem
Polymer beschichtet, vor zugsweise einem hydrophilen Polymer, welches
ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Polyoxyethylen, Polyoxypropylen,
vernetzten Polysacchariden und Vinylpolymeren.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
umfassen die Apatit-Kristalle Calciumionen und ein Metallion oder
ein Metalloidion. Vorzugsweise ist das Metallion oder das Metalloidion
Strontium, Barium oder Fluorid.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Chromatographie-Vorrichtung
und -Verfahren. Eine Chromatographiesäule umfasst ein röhrenförmiges Element
mit einem Einlassende und einem Auslassende; ein erstes und ein
zweites poröses
Element, angeordnet innerhalb des röhrenförmigen Elementes; und ein Komposit-Chromatographiesorbens
gemäß der Erfindung,
gepackt innerhalb des röhrenförmigen Elementes
zwischen dem ersten und dem zweiten porösen Element. Vorzugsweise beträgt das Säulenvolumen
zwischen 50 l und 5000 l. Die Säule kann
ferner Mittel umfassen zum aufwärtsgerichteten Fließenlassen
einer Flüssigprobe
durch das Komposit-Chromatographiesorbens.
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Die
Säule kann
Verwendung finden in einem chromatographischen Trennverfahren, umfassend das
Fließenlassen
einer Lösung,
welche Biomoleküle umfasst,
durch die Chromatographiesäule,
so dass die Lösung
die Poren der Mineraloxidkügelchen
permeiert, wobei einige Biomoleküle
in der Lösung
an die Apatit-Kristalle gebunden werden und andere, verschiedene
Biomoleküle
in der Lösung
verbleiben. Im Anschluss hieran kann eine weitere Lösung durch die
Chromatographiesäule
fließen
gelassen werden, um die an die Apatit-Kristalle gebundenen Biomoleküle zu eluieren.
Bei einer Ausführungsform
sind die Biomoleküle
Polypeptide, und bei einer anderen Ausführungsform sind die Biomoleküle Nucleinsäuren. Der
Bereich des Terminus Biomolekül
umfasst Substanzen, welche von Proteinen und Nucleinsäuren verschieden
sind, z.B. Glycopeptide.
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Das
Kompositsorbens kann ferner in Batch-Chromatographie-Vorrichtungen
und -Verfahren verwendet werden. Bei einem Batch-Verfahren wird
eine Lösung,
welche Biomoleküle
umfasst, in Kontakt mit dem Komposit-Chromatographiesorbens gebracht,
so dass die Lösung
die Poren der Mineraloxidkügelchen
permeiert, wobei einige Biomoleküle
in der Lösung
an die Apatit-Kristalle gebunden werden und andere, verschiedene
Biomoleküle
in der Lösung verbleiben.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Herstellung
eines Komposit-Chromatographiesorbens gemäß der Erfindung, umfassend:
(1) Bereitstellen von porösen
Mineraloxidkügelchen
mit einem Porenvolumen, das 10% des Kügelchenvolumens überschreitet,
und einem mittleren Porendurchmesser von mindestens 500 Å; (2) Inkontaktbringen
der porösen
Mineraloxidkügelchen mit
einem Maximum von einem Porenvolumen einer Lösung von entweder (i) Calciumchlorid
oder (ii) Kalium- oder Natriumphosphat, so dass sie die Poren der
Kügelchen
permeiert; (3) Trocknen der Kügelchen;
(4) Inkontaktbringen der getrockneten Kügelchen mit einem Maximum von
einem Porenvolumen einer Lösung
des jeweils anderen von entweder (i) Calciumchlorid oder (ii) Kalium-
oder Natriumphosphat, so dass sie die Poren der Kügelchen
permeiert, wodurch Calciumphosphat in den Poren gebildet wird; (5)
Waschen der Kügelchen
mit Wasser, um überschüssige Calcium-
oder Phosphationen zu eliminieren; (6) Inkontaktbringen der gewaschenen
Kügelchen
mit einer Lösung
von Natriumhydroxid; (7) Waschen der Kügelchen mit Wasser; und (8)
Inkontaktbringen der gewaschenen Kügelchen mit einer Lösung von
Dinatriumphosphat, um Hydroxyapatit-Kristalle in den Poren der Kügelchen
zu bilden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Kügelchen
mit einer Phosphorsäurelösung gewaschen, bevor
die porösen
Mineraloxidkügelchen
mit einem Maximum von einem Porenvolumen einer Lösung von entweder (i) Calciumchlorid
oder (ii) Kalium- oder Natriumphosphat in Kontakt gebracht werden.
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Sowohl
die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die nachfolgende
Detailbeschreibung sind beispielhaft und erläuternd und dienen der weiteren
Erläuterung
der Erfindung wie beansprucht. Weitere Aufgaben, Vorteile und neuartige Merkmale
werden für
den Fachmann ohne weiteres aus der nachfolgenden Detailbeschreibung
der Erfindung erkennbar sein.
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Detailbeschreibung
von bevorzugten Ausführungsformen
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Das
erfindungsgemäße Komposit-Chromatographiesorbens
verwendet Mineraloxid-Kügelchen oder
-Beads, um einem Apatit-Sorbens mechanische Stabilität zu vermitteln.
Die Mineraloxidkügelchen weisen
ein Porenvolumen von mindestens 10% des Kügelchenvolumens und einen mittleren
Porendurchmesser von mindestens 500 Å auf.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
werden Mineraloxidkügelchen
mit einem höheren
Porenvolumen, vorzugsweise mindestens 30%, mehr bevorzugt mindestens
40%, am meisten bevorzugt mindestens 50%, verwendet. Die Herstellung
von Mineraloxidkügelchen
mit hohen Porenvolumina ist in WO 99/51335 beschrieben.
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Die
Kügelchen
können
kleine diskrete, zu Kügelchen
geformte Partikel sowie Partikel von irregulärer Gestalt sein, die ein hohes
Porenvolumen und hohe mechanische und chemische Stabilität zeigen.
Wegen ihrer Stabilität
und hohen Porosität
sind sie besonders geeignet für
Festbett-, Fließbett-
oder gerührte
Batch-Adsorptionsprozesse oder für
die chromatographische Trennung von großen Makromolekülen.
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Die
Mineraloxidkügelchen
werden hergestellt durch Kombinieren eines vierwertigen Metalloxids
mit einem dreiwertigen Metallsalz oder -oxid als poreninduzierendes
Agens. Die Kombination resultiert in der Bildung von instabilen
Suspensionen, die – nach
Agglomeration unter Bildung von sphärischen oder irregulären Partikeln – sowohl
Makroporosität als
auch große
Porengrößen zeigen.
Die Porosität und
die Porengröße sind
größer als
diejenigen, welche in der Abwesenheit des dreiwertigen Metallsalzes
oder -oxids erhalten werden können.
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Das
Mineraloxid ist vorzugsweise ein Oxid von Titanoxid, Zirconoxid,
Siliciumoxid oder Hafniumoxid, bevorzugt Siliciumoxid oder Zirconoxid,
am meisten bevorzugt Zirconoxid. Das Mineraloxid kann auch eine
Mischung von zwei oder mehr vierwertigen Metalloxiden sein. Vorzugsweise
liegen die Mineraloxidpulver in der Form eines Pulvers vor, am meisten bevorzugt
als ein Pulver mit einer Partikelgröße von ca. 0,1 bis ca. 10 μm.
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Das
dreiwertige Metall kann in Form eines Oxids, eines Salzes oder Mischungen
von einem Oxid und einem Salz verwendet werden. Ein besonders bevorzugtes
Salz ist Nitrat. Das Metall kann ein beliebiges Metall mit Valenz
+3 sein, z.B. Metalle der Gruppe IIIB, Seltenerdmetalle und dergleichen.
Bevorzugte dreiwertige Metalle sind Aluminium, Gallium, Indium,
Scandium, Yttrium, Lanthan, Cer, Neodym, Erbium, Ytterbium und Actinium.
Ferner umfasst sind Zusammensetzungen, bei denen das dreiwertige
Metalloxid oder -salz eine Mischung ist von zwei oder mehr derartiger
Oxide oder Salze. Derartige Mischungen umfassen Salz/Oxid-, Salz/Salz-
und Oxid/Oxid-Mischungen aus den gleichen oder aus verschiedenen
dreiwertigen Metallen.
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Nur
eine begrenzte Porenvolumenverminderung wird beobachtet, wenn die
Zusammensetzungen bei sehr hohen Temperaturen gebrannt werden. Demgegenüber zeigen
Metalloxidkügelchen,
welche ohne die Verwendung des dreiwertigen Metallsalzes oder -oxids
erhalten werden, niedrigere Porenvolumina, wenn sie bei sehr hohen
Temperaturen gebrannt werden, infolge einer starken Verminderung
des Porenvolumens, die aus dem Brennprozess resultiert. Ferner stabilisiert
das dreiwertige Metallsalz oder -oxid eine Kristallform des Mineraloxids
und verhindert Kornwachstum und Rissbildung des finalen Materials.
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Optional
kann ein Agens, welches Partikelagglomeration induziert, um ein
zu Kügelchen
geformtes finales Material herzustellen, beinhaltet sein, z.B. ein
agglomerationsförderndes
Material oder ein Bindemittel. Hierbei kann es sich um Salze von
dreiwertigen oder vierwertigen Metallen handeln, welche die gleichen
vierwertigen oder dreiwertigen Metalle enthalten können, wie
sie soeben beschrieben worden sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst
das Bindemittel eine Mischung von Nitraten, einschließlich eines
vierwertigen Metallnitrats und eines dreiwertigen Metallnitrats.
So ist es zum Beispiel in dem Falle, dass Zirconoxid als ein Mineraloxidkügelchen-Bestandteil
verwendet wird und Ceroxid als das dreiwertige poreninduzierende
Agens verwendet wird, günstig,
eine Mischung von Zirconnitrat und Cernitrat als Bindemittel zu
verwenden. Andere geeignete Bindemittel umfassen Materialien, die
Mineralhydrogele bilden, welche Mineraloxid-Elementarteilchen einkapseln
können,
z.B. Siliciumoxid-Gele. Ferner kann ein Mineralhydrogel in Kombination
mit einem oder mehreren zusätzlichen
Bindemitteln verwendet werden.
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Komposit-Mineraloxide
mit verbessertem Porenvolumen werden hergestellt durch Herstellen einer
Flüssigsuspension
von einem vierwertigen Mineraloxid. Der Flüssiganteil der Suspension kann Wasser
oder ein beliebiges anderes geeignetes Lösemittel sein. Das Mineraloxid
sollte in der Form eines Pulvers vorliegen, mit einer Partikelgröße zwischen
ca. 0,1 und ca. 10 μm,
wobei die jeweils gewählte
Partikelgröße von der
gewünschten
Porengröße der porösen Partikel
abhängt.
Diese Suspension wird mit einem oder mehreren poreninduzierenden
dreiwertigen Agenzien gemischt. Optional enthält die Suspension ferner ein
oder mehrere Bindemittel.
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In
einer typischen Zusammensetzung, welche ein oder mehrere Metalloxid- oder Metallsalz-Bindemittel
umfasst, werden die Bindemittel zuerst in einer Flüssigkeit
wie Wasser gemischt, dann werden das Mineraloxid und das poreninduzierende Agens
unter Rühren
hinzugegeben, um eine Suspension zu erzeugen. Es sollte nur leicht
gerührt
werden, um den Eintrag von Luftblasen in die Mischung zu vermeiden.
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Die
Menge an poreninduzierendem Agens, welche in der Anfangssuspension
verwendet wird, ist ungefähr
proportional zu der Menge an eingesetztem Mineraloxid. Im Finalprodukt
wird das Oxid des vierwertigen Metalls ca. 50 bis ca. 99% der finalen
Partikel ausmachen, wobei die restlichen ca. 1 bis ca. 50% von Poreninduktoren
und optionalen Bindemitteln gebildet werden. In der Anfangssuspension
jedoch liegen die Mineraloxidpartikel, der Hauptbestandteil der
porösen
Kügelchen,
in einer Konzentration von 10 bis ca. 95 Gew.-%, basierend auf dem Gesamtgewicht
der eingesetzten Komponenten, vor. Noch bevorzugter sollte das Mineraloxid
ca. 20 bis ca. 60 Gew.-% betragen. Die Konzentration des poreninduzierenden
Agens liegt zwischen ca. 5 und ca. 50 Gew.-%. Die optimale Konzentration
variiert in Abhängigkeit
von der Natur der spezifischen Verbindungen, die zur Verwendung
kommen. Die Konzentration des Agglomerations-fördernden Materials oder Bindemittels
liegt zwischen ca. 0 und ca. 20 Gew.-% und hängt auch von der Natur der
Bindemittel ab. Optional können
ferner organische Verbindungen zu der Anfangssuspension hinzugegeben
werden, um die Viskosität
der Lösung
zu verändern.
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Die
alle gewünschten
Komponenten enthaltende Suspension wird dann verwendet, um Kügelchen
zu bilden. Es können
vielfältige,
auf dem Fachgebiet wohlbekannte Techniken verwendet werden, z.B.
Sprühtrocknungs-,
Emulsions-Polykondensations- und Sol-Gel-Prozesse, um die Agglomeration der
Zusammensetzungen zu bewirken. Nach erfolgter Agglomeration der
Elementarteilchen zu einer Kügelchengestalt,
werden sie bei hohen Temperaturen erhitzt, um die Architektur der
porösen
Mineralkügelchen
durch partielle Fusion der Elementarteilchen zu stabilisieren. Die
Aufheizrate, die Calcinierungstemperatur und die Durchwärmzeit,
die verwendet werden, hängen
von der Natur der Mineraloxide und der Mineralporeninduktoren ab.
Ein kontrolliertes Sintern ist wünschenswert,
um stärkere
Partikel zu erhalten, ohne die Porosität zu eliminieren. Typisch werden Temperaturen
zwischen ca. 800 und ca. 1400°C
für eine
Dauer von ca. 1 bis ca. 10 Stunden und mit einer Aufheizrate im
Bereich zwischen ca. 1 und ca. 100°C/h verwendet. Ferner kann eine
sequentielle Calcinierbehandlung verwendet werden, um zuerst flüchtige Komponenten,
wie Wasser, organische Materialien, Nitrate und dergleichen zu entfernen,
und dann die Elementarteilchen zu sintern.
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Die
gebrannten Kügelchen
werden dann auf Raumtemperatur gekühlt und anschließend gewaschen,
z.B. mit sauren, alkalischen, neutralen oder verdünnten hydroorganischen
Lösungen.
Die Partikel können
optional einem Siebungsschritt unterworfen werden, um die Partikelgrößenverteilung
wie gewünscht
einzustellen. Typische Porenvolumina von mindestens ca. 30%, ca.
40% oder ca. 50% können gemäß der Erfindung
erhalten werden. Die obere Grenze für das Porenvolumen liegt bei
ca. 70%.
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Die
Kügelchen
mit größeren Porenvolumina und/oder
mittleren Porendurchmessern sind besonders geeignet für die Einführung von
Apatit-Kristallen, vorzugsweise Hydroxyapatit, um ein Komposit-Chromatographiesorbens
bereitzustellen. Das Porenvolumen variiert basierend auf dem Kügelchenmaterial.
Wenn z.B. das Mineraloxid ausgewählt ist
aus der Gruppe, welche aus Zirconoxid, Titanoxid und Hafniumoxid
besteht, dann beträgt
das Porenvolumen zwischen ca. 30% und ca. 60% des Kügelchenvolumens.
Wenn das Mineral Siliciumoxid ist, dann beträgt das Porenvolumen zwischen
ca. 40% und ca. 70% des Kügelchenvolumens.
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Die
Porengröße variiert
ebenfalls in Abhängigkeit
von dem Kügelchenmaterial
und kann ausgewählt
sein basierend auf dem Material, welches durch das Kompositsorbens
getrennt werden soll. Ein größerer mittlerer
Porendurchmesser wird für
Anwendungen gewählt,
wo größere Biomoleküle, z.B. Plasmide,
getrennt werden sollen, wobei ein mittlerer Porendurchmesser von
mehr als 2000 Å erforderlich sein
kann. Der mittlere Porendurchmesser beträgt allgemein zwischen 1000 Å und 4000 Å. Wenn
das Mineral ausgewählt
ist aus der Gruppe, welche aus Zirconoxid, Titanoxid und Hafniumoxid
besteht, beträgt
der mittlere Porendurchmesser vorzugsweise zwischen 1000 Å und 3000 Å; wenn
das Mineral dagegen Siliciumoxid ist, beträgt der mittlere Porendurchmesser
zwischen 2000 Å und
5000 Å.
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Um
die Poren mit Hydroxyapatit zu füllen, werden
die Mineraloxidkügelchen
optional, aber bevorzugt, zuerst mit einer Phosphorsäurelösung gewaschen,
um Verunreinigungen zu eliminieren, und dann mit Monokaliumphosphat
inkubiert. Die Kügelchen
werden sodann gewaschen und getrocknet. Falls gewünscht, kann
das Porenvolumen nach bekannten Verfahren bestimmt werden. Als nächstes werden
die Kügelchen
mit einer Lösung
von entweder (i) Calciumchlorid oder (ii) Kalium- oder Natriumphosphat
in Kontakt gebracht und der Lösung
erlaubt, die Poren zu penetrieren. Sodann werden die Kügelchen
getrocknet und dann mit einer Lösung
von entweder (i) Calciumchlorid oder (ii) Kalium- oder Natriumphosphat
in Kontakt gebracht. Wenn die Kügelchen
in dem ersten Schritt mit Calciumchlorid in Kontakt gebracht wurden,
so werden sie in dem zweiten Schritt mit Kalium- oder Natriumphosphat
in Kontakt gebracht und umgekehrt. Der Lösung wird erlaubt, die Poren
zu penetrieren, und nachdem man ausreichend Zeit gelassen hat, damit
sich die Calciumphosphat-Kristallstruktur innerhalb der Poren bilden
kann, werden die Kügelchen
gewaschen, um überschüssige Calcium-
oder Phosphationen zu eliminieren. Sodann werden die Kügelchen
mit einer Lösung
von Natriumhydroxid in Kontakt gebracht und erneut gewaschen. Schließlich werden
die Kügelchen
mit einer Lösung
von Dinatriumphosphat in Kontakt gebracht, um Hydroxyapatit-Kristalle
in den Poren der Kügelchen
zu bilden.
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Wenn
die Mineralkügelchen
mit den Calciumchlorid- und Kalium- oder Natriumphosphatlösungen in
Kontakt gebracht werden, ist es bevorzugt, ein Maxi mum von einem
Porenvolumen der Lösung
zu verwenden, vorzugsweise genau ein Porenvolumen. Die Verwendung
von genau einem Porenvolumen erzeugt die maximale Menge an Hydroxyapatit-Kristallen
in den Poren der Mineraloxidkügelchen,
ohne dass es zu Kristallwachstum außerhalb der Poren der Kügelchen
kommt.
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Bei
einer alternativen Ausführungsform
kann der mit Phosphationen hergestellte Hydroxyapatit mit kleinen
Mengen anderer Metallionen dotiert werden. Die dotierten Metallionen
können
verwendet werden, um die Adsorptionseigenschaften des Kompositsorbens
zu variieren.
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Es
können
Apatite, welche von Hydroxyapatit verschieden sind, in den Poren
wachsen gelassen werden. In diesem Fall könnte Calcium durch Strontium,
Barium oder andere Elemente ersetzt werden. Die resultierenden Apatite
würden
Adsorptionseigenschaften aufweisen, die von denen des Hydroxyapatits
verschieden sind. Es ist bekannt, dass kristalline Apatite, welche
von Hydroxyapatit verschieden sind, z.B. Apatit-Derivate mit F,
Cl oder CO3, in den Poren der Mineraloxidkügelchen
wachsen gelassen werden können.
So ist z.B. die Herstellung von Fluorapatit bei Matsumoto et al.,
Caries Res., 34(1): 26-32 (2000); Okazaki et al., Biomaterials,
20(15): 1421-6 (1999); Okazaki et al., Biomaterials, 19(10): 919-23
(1998); Okazaki et al., Biomaterials, 19(7-9): 611-6 (Apr-May, 1998),
beschrieben.
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Die
Apatit-Kristalle, mehr bevorzugt die Hydroxyapatit-Kristalle, umfassen
Calciumionen und ein Metallion oder ein Metalloidion. Bei Ausführungsformen,
welche ein Metall- oder Metalloidion verwenden, sind bevorzugte
Metallionen oder Metalloidionen Strontium, Barium oder Fluorid.
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Vor
der Bildung von Apatit-Kristallen in den Poren der Mineraloxidkügelchen
können
die Kügelchen
zuerst mit einer Lage von hydrophilem Polymer beschichtet werden.
Vorzugsweise ist das hydrophile Polymer ausgewählt aus der Gruppe, welche
aus Polyoxyethylen, Polyoxypropylen, vernetzten Polysacchariden
und Vinylpolymeren besteht. Die Beschichtung vermindert die nichtspezifische
Bindung für
Biomoleküle.
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Es
können
verschiedene chromatographische Techniken zum Trennen von Biomolekülen mittels
des erfindungsgemäßen Kompositsorbens
verwendet werden. Diese Techniken umfassen das Inkontaktbringen
einer Lösung,
welche die biologischen Makromoleküle enthält, mit dem Kompositsorbens,
was zu der selektiven Adsorption von Molekülen in der Lösung durch
das Sorbens führt.
In dem Falle, dass das oder die gewünschten Makromoleküle an dem
Harz fixiert werden, erlaubt die Elution des Letzteren ihre Trennung
und Gewinnung in einer gereinigten und konzentrierten Form. Wenn
das gewünschte
Makromolekül
in der behandelten Lösung verbleibt
(wobei die anderen Makromoleküle
an dem Sorbens fixiert werden), dann wird die gewünschte Trennung
direkt erhalten.
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Bei
der Verwendung von Batch-Chromatographie wird das Kompositsorbens
direkt zu der Lösung
von Biomolekülen
hinzugegeben, und die Sorbens-Biomolekül-Mischung wird leicht bewegt
für eine
Zeit, die ausreichend ist, um die Biomoleküle an das Sorbens zu binden.
Das Biomolekül-gebundene Sorbens
kann dann durch Zentrifugation oder Filtration entfernt werden,
und die Biomoleküle
können nachfolgend
in einem separaten Schritt eluiert werden.
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Alternativ
kann Säulenchromatographie
verwendet werden. Bei der Festbettsäulenchromatographie wird das
Kompositsorbens in eine Säule
gepackt, und die Lösung,
welche die zu trennenden Biomoleküle enthält, wird auf das Sorbens gegeben,
indem sie bei einer Rate durch das Sorbens gegossen wird, die es
den Biomolekülen
erlaubt, an das Sorbens zu binden. Vorteile der Festbettchromatographie
umfassen minimales Säulenvolumen
und Wasserverbrauch. Der Nachteil der Säulenchromatographiemethode
liegt darin, dass die Fließrate
von Flüssigkeiten
durch die Säule
niedrig und daher zeitaufwändig
ist. Diese Fließrate
kann sich sogar noch weiter vermindern, wenn das auf die Säule gegebene Material
partikuläres
Material enthält,
weil ein derartiges partikuläres
Material das Sorbens bis zu einem gewissen Grad "verstopfen" kann.
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Die
Fließbettsäulenchromatographie
verwendet eine Aufwärtsfiltrationsströmung und
mehr große
als dichte Partikel, um ein Gleichgewicht gegenüber den Aufwärtskräften zu
wahren. Eine im Wesentlichen vertikale Säule, bestehend aus übereinander
angeordneten Stufen, deren Zahl zwischen 2 und 5 beträgt, wird
verwendet, und die Lösung
passiert nacheinander die Stufen und wird durch einen Überlauf
im oberen Teil der oberen Stufe abgezogen. Jede Stufe mit Ausnahme
der obersten ist durch zwei perforierte Verteilsysteme getrennt,
von denen eines die Lösung
an der Basis der betreffenden Stufe verteilt, das andere die Lösung in
Richtung zu der unmittelbar darüber
liegenden Stufe verteilt.
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Die
Vorteile eines Fließbettes
sind höhere Fließraten bei
niedrigeren Drücken
im Vergleich mit der Festbettchromatographie. Obgleich die höheren Fließraten gewisse
Vorteile für
die chromatographische Trennung bieten, hat das Verfahren mehrere Nachteile.
Das Verfahren verlangt Harze größeren Durchmessers,
die gegenüber
Schwerkraft oder Auftrieb neutral sind. Diese Sorbentien größeren Durchmessers
weisen eine kleinere Oberfläche
pro Volumeneinheit auf als kleinere, in Festbettsäulen verwendete
Sorbentien, und haben dementsprechend eine kleinere Oberflächenbindungskapazität. Das bedeutsamste
Problem des Fließbetts
ist das Mischen. Weil die Säule
keine statischen Mischmittel enthält, wird das Mischen des Betts
konventionellerweise mittels Luftstrahlen oder durch Rezirkulieren
der zu trennenden Flüssigkeit
durch die Säule
bei einer hohen Fließrate
durchgeführt.
Die hohe Fließrate
und das begrenzte Mischen hemmen die gleichmäßige Phasenänderung, die während der
Elution des Produktes von dem Harz erforderlich ist.
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Andererseits
vermeidet die Fließbettchromatographie
viele der schwerwiegenden Nachteile von Festbetten, zu denen Verstopfung,
Reinigungsbedarf, kompressions- und reinigungsinduzierte Harzverschlechterung
gehören.
Tatsächlich
erlaubt das Fließbett
freie Passage von Verunreinigungen in der Lösung ohne Verstopfungsgefahr;
es ist keine Reinigung notwendig, was die Lebensdauer der Harze
beträchtlich
erhöht.
Jedoch sind die chromatographischen Sorbentien für biologische Makromoleküle typischerweise
nicht geeignet für
die Fließbettchromatographie,
weil sie in ihrer Granulometrie zu klein sind oder eine Dichte aufweisen,
die zu nahe bei der von Wasser liegt. Dies macht es unmöglich, sie
zu fluidisieren, ohne Partikel in den Fluss hineinzuziehen. Ein weiteres
Problem bei der Fließbettchromatographie von
biologischen Makromolekülen
betrifft den großen Raum
zwischen Molekülen,
der sich effizienzmindernd in einer Fließbettumgebung auswirkt.
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Basierend
auf diesen Faktoren sind die Batch- und die Festbettchromatographie
die Verfahren der Wahl in konventionellen Trenntechniken für biologische
Makromoleküle
gewesen. Das vorliegende Kompositsorbens hingegen kann in der Batch-, Festbett-
oder Fließbettchromatographie
verwendet werden.
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Das
erfindungsgemäße Kompositsorbens wird
verwendet zur Trennung von Biomolekülen, welche in einer "Ausgangsflüssigkeit" enthalten sind,
bei der es sich um eine Flüssigkeit
handelt, welche mindestens eine und möglicherweise zwei oder mehr
biologische Substanzen oder Produkte von Wert enthält, die
von anderen, ebenfalls anwesenden Substanzen gereinigt werden sollen.
Bei der Umsetzung der Erfindung können die Ausgangsflüssigkeiten
z.B. wässrige
Lösungen,
organische Lösemittelsysteme oder
wässrige/organische
Lösemittelmischungen oder
Lösungen
sein. Die Ausgangsflüssigkeiten
sind häufig
Komplexmischungen oder -lösungen,
welche viele biologische Moleküle
enthalten, z.B. Proteine, Antikörper,
Hormone und Viren sowie kleine Moleküle wie Salze, Zucker, Lipide
etc. Obschon eine typische Ausgangsflüssigkeit biologischen Ursprungs
als eine wässrige
Lösung
oder Suspension beginnen kann, kann sie auch organische Lösemittel
enthalten, die in früheren
Trennschritten, z.B. Lösemittelausfällungen,
-extraktionen und dergleichen, verwendet wurden. Beispiele für Ausgangsflüssigkeiten,
die wertvolle biologische Substanzen enthalten können, welche dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren
zugänglich
sind, umfassen, ohne jedoch darauf begrenzt zu sein, einen Kulturüberstand
aus einem Bioreaktor, eine homogenisierte Zellsuspension, Plasma,
Plasmafraktionen, Milch, Kolostralmilch und Käsemolke.
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Die
Ausgangsflüssigkeit
enthält
mindestens ein "Biomolekül", welches von der
Ausgangsflüssigkeit
zu reinigen ist. Biomoleküle
sind biologische Produkte und umfassen z.B. Nucleinsäuren, Immunoglobuline,
Gerinnungsfaktoren, Vakzinen, Antigene, Antikörper, ausgewählte Proteine
oder Glycoproteine, Peptide, Enzyme etc. Das Biomolekül kann in
der Ausgangsflüssigkeit
als Suspension oder in Lösung vorliegen.
Der Einfachheit halber wird der Terminus "Biomolekül" hierin im Singular verwendet; es versteht
sich jedoch, dass er sich auf mehr als eine Substanz, die zu reinigen
ist, entweder gemeinsam als Copro dukte oder separat (z.B. sequentiell)
als diskrete rückgewonnene
Komponenten, beziehen kann.
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Eine "Elutionsflüssigkeit" oder ein "Elutionspuffer" wird verwendet,
um die Biomoleküle,
z.B. Glyco-Iso-Formen, von dem Kompositsorbens wegzudissoziieren.
Die Elutionsflüssigkeit
bewirkt die Dissoziation der Biomoleküle, ohne sie irreversibel zu denaturieren.
Typische Elutionsflüssigkeiten
sind auf dem Fachgebiet der Chromatographie wohlbekannt und können höhere Konzentrationen
an Salzen, freien Affinitätsliganden
oder Analoga oder andere Substanzen, welche die Dissoziation der
Zielsubstanz von dem Chromatographiesorbens begünstigen, aufweisen. "Elutionsbedingungen" bezieht sich auf
Prozessbedingungen, welchen das Biomolekül-gebundene Chromatographiesorbens
ausgesetzt wird und welche die undenaturierten Biomoleküle von dem Chromatographiesorbens
dissoziieren, z.B. das Inkontaktbringen des Biomolekülgebundenen
Chromatographiesorbens mit einer Elutionsflüssigkeit oder einem Elutionspuffer,
um eine derartige Dissoziation herbeizuführen.
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Eine "Reinigungsflüssigkeit" oder ein "Reinigungspuffer" wird verwendet,
um das Chromatographiesorbens nach Beendigung des Trennprozesses zu
waschen. Die Reinigungsflüssigkeit
kann ein Detergens, ein Virus-deaktivierendes Agens oder relativ hohe
Konzentrationen an Salzen enthalten und kann einen höheren oder
niedrigeren pH-Wert als die während
des Reinigungsprozesses verwendeten Flüssigkeiten aufweisen. Ihr Zweck
ist die vollständige
Dekontaminierung des Chromatographiesorbens, um es wiedergebrauchsfertig
zu machen. Typische Reinigungsflüssigkeiten
sind auf dem Fachgebiet der Chromatographie wohlbekannt. Zwischen
Einsätzen wird
das Kompositsorbens in einer "Aufbewahrungsflüssigkeit" oder einem "Aufbewahrungspuffer" gelagert. Aufbewahrungsflüssigkeiten
können,
neben Pufferionen, auch mikrobizide Mittel oder andere Konservierungsmittel
enthalten. Derartige Aufbewahrungsflüssigkeiten sind auf dem Fachgebiet
der Chromatographie wohlbekannt.
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Das
Kompositsorbens kann in Batch-Trennungen verwendet werden, oder
es kann in eine Chromatographiesäule,
entweder eine Festbett- oder eine Fließbettsäule, gepackt werden. Die Säule umfasst
ein röhrenförmiges Element
mit einem Einlassende und einem Auslassende und ein erstes und ein zweites poröses Element,
z.B. Glasfritte, angeordnet innerhalb des röhrenförmigen Elementes. Das Komposit-Chromatographiesorbens
wird innerhalb des röhrenförmigen Elementes
zwischen dem ersten und dem zweiten porösen Element gepackt. Bei einer Fließbettsäule gibt
es typischerweise multiple Stufen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
beträgt
das Säulenvolumen
zwischen ca. 50 l und ca. 5000 l. Für die Fließbettchromatographie umfasst
die Säule
ferner ein Mittel zum aufwärtsgerichteten
Fließenlassen einer
Flüssigprobe
durch das Komposit-Chromatographiesorbens.
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Batch-Chromatographietrennungen
umfassen das Mischen des Kompositsorbens mit der Ausgangsflüssigkeit
in einem geeigneten Behälter
und leichtes Rühren.
Chromatographische Trennungen mittels Säulenchromatographie umfassen
die Schritte des Fließenlassens
einer ersten Lösung,
welche Biomoleküle
umfasst, durch die Säule,
derart, dass die Biomoleküle
in der Lösung
die Poren der Mineraloxidkügelchen
permeieren und an die Apatit-Kristalle darin gebunden werden; und
dann Fließenlassen
einer zweiten Lösung
durch die Säule,
um die an die Apatit-Kristalle gebundenen Biomoleküle zu eluieren.
In einer Festbettsäule
strömt
die Ausgangsflüssigkeit
abwärts
infolge Schwerkraft, während
in einer Fließbettsäule die
Ausgangsflüssigkeit
aufwärts
durch die Säule
getrieben wird. Die zu trennenden Biomoleküle sind üblicherweise Polypeptide oder
Nucleinsäuren.
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Das
Kompositsorbens ist besonders geeignet für schwierige Proteintrennungen,
einschließlich der
Antikörpertrennung.
Es eignet sich ferner hervorragend für Plasmide zur Eliminierung
von RNA und offen-zirkulären
Formen.
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Die
folgenden Beispiele beziehen sich auf spezifische Ausführungsformen
innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung, sind jedoch nicht limitierend.
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Beispiel 1: Herstellung
von Zirconoxid-Partikel durch einen Sol-Gel-Prozess
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Ein
Siliciumoxid-Sol wird hergestellt durch sequentielles und progressives
Mischen von 150 ml Natriumsilicat 35% mit 200 ml Wasser und 100
ml Wasser und 100 ml Eisessigsäure.
In dieser Suspension wird trockenes, festes, irreguläres Zirconoxidpulver
(350 mg, Größe 0,3 bis
3 μm) dispergiert.
Ceroxid (10 g) und Cernitrat (10 g) werden sodann unter kräftigem Rühren hin zugegeben.
Unter den obigen Bedingungen tritt der Gelierungsprozess bei Umgebungstemperatur
binnen 15 bis 60 Minuten auf.
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Nach
vollständiger
Gelierung – was
ein paar Stunden dauert – wird
das Gel durch Pressfiltration durch ein 200 μm-Sieb in kleine Stücke geteilt.
Die Partikel werden in klarem Wasser suspendiert und durch Filtration
zurückgewonnen,
gewaschen und dann bei 80°C
unter einem Luftstrom getrocknet.
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Das
Siliciumoxid-Gel, welches die festen Zirconoxid- und Ceroxid-Komposit-Mikropartikel einschließt, wird
progressiv dehydratisiert. Zu diesem Zeitpunkt sind die Partikel
weich und zeigen eine nur sehr mäßige Porosität. Sodann
werden die Partikel bei 1300°C
für 2 Stunden
gebrannt. Unter diesen Bedingungen wird das Siliciumoxid-Gel vollständig dehydratisiert
und schrumpft in einem Ausmaß,
dass es eine kontinuierliche Schicht um die festen Subpartikel bildet.
Der Hohlraum zwischen Subpartikeln bildet die Makroporosität.
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Nach
dieser Behandlung repräsentiert
das finale Porenvolumen mehr als 50% des gesamten Volumens der porösen Partikel.
Die Dichte der trockenen irregulären
Partikel beträgt
ca. 2,1 g/cm3. Nach dem Kühlen zeigen
die Kügelchen
keine Risse infolge Volumenänderung
von Mineralkristallformen.
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Beispiel 2: Herstellung
von Zirconoxid-Partikeln durch Suspensions-Polymerisation
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Es
wird ein Siliciumoxid-Sol hergestellt durch sequentielles und progressives
Mischen von 150 ml Natriumsilicat 35% mit 200 ml Wasser und 100
ml Wasser und 100 ml Eisessigsäure.
In dieser Suspension wird trockenes, festes, irreguläres Zirconoxidpulver
(350 mg, Größe 0,3 bis
3 μm) dispergiert.
Ceroxid (10 g) und Cernitrat (10 g) werden sodann unter kräftigem Rühren hinzugegeben.
Die resultierende homogene Suspension wird langsam in ein bewegtes Paraffinölbad, welches
2% Sorbitansesquioleat enthält,
gegossen und als kleine Tröpfchen
dispergiert. Die Suspension wird bei 80°C unter Rühren erhitzt. Unter diesen
Bedingungen tritt der Gelierungsprozess bei Umgebungstemperatur
innerhalb von 15 bis 30 Minuten auf.
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Die
Kügelchen
mit einem Durchmesser im Bereich von 10 bis 500 μm umfassen ein Siliciumoxid-Hydrogel
mit innerhalb seines Netzwerkes eingeschlosse nen festen Mikropartikeln
von vorgeformtem Zirconoxid und Ceroxid. Sie werden durch Filtration zurückgewonnen,
gewaschen und bei 80°C
unter einem Luftstrom getrocknet. Das Gel wird progressiv dehydratisiert
und wirkt als Bindemittel für
feste Zirconoxid- und Ceroxid-Komposit-Mikropartikel. Die Kügelchen
werden dann bei 1300°C
für 2 Stunden gebrannt
zum Sintern von Kügelchen-Subpartikeln mit
minimaler Porenvolumenverminderung. Nach dieser Behandlung repräsentiert
das finale Porenvolumen mehr als 50% des gesamten Kügelchenvolumens.
Die Dichte der trockenen Kügelchen
beträgt ca.
2,1 g/cm3. Nach dem Kühlen zeigen die Kügelchen
keine Risse infolge Volumenänderung
von Mineralkristallformen.
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Beispiel 3: Herstellung
von Zirconoxid-Kügelchen durch
Sprühtrocknen
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Es
wird eine Lösung
hergestellt durch Mischen von 231 g Zirconnitrat und 143,6 g Yttriumnitrat
in 1000 ml destilliertem Wasser. Yttriumoxid (144 g) und Zirconoxidpulver
(752 g mit einer Größe von 0,3
bis 3 μm)
werden sodann unter leichtem Rühren hinzugegeben,
um den Eintrag von Luftblasen zu verhindern.
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Die
Suspension wird dann in eine vertikale Trocknungskammer durch eine
Zerstäubungsvorrichtung,
z.B. durch eine rotierende Scheibe, eine Sprühdüse oder einen Ultraschallzerstäuber, zusammen
mit einem Heißgasstrom,
bevorzugt Luft oder Stickstoff, eingeblasen. Der Heißgasstrom
verursacht eine rasche Verdampfung von Wasser aus den Mikrotröpfchen.
Das Gas wird typisch bei einer Temperatur von ca. 300-350°C eingeblasen
und verlässt den
Trockner bei einer Temperatur geringfügig oberhalb 100°C. Mikropartikel
von Ausgangsmineraloxiden werden zu individuellen Aggregaten von
sphärischer
Gestalt konsolidiert. Trockene Mikrokügelchen werden dann bei einer
Temperatur gebrannt, die nahe der Schmelztemperatur des Zirconoxids
liegt, um das Netzwerk irreversibel zu konsolidieren. Nach dem Kühlen zeigen
die Kügelchen
keine Risse infolge Volumenänderung
von Mineralkristallformen. Dieses Verfahren resultiert in der Bildung
von stabilen Kügelchen
mit einem großen
Porenvolumen, das 50% des Kügelchenvolumens überschreitet.
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Beispiel 4: Herstellung
von Hydroxyapatit-gefüllten Zireonoxid-Kügelchen
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Die
Kügelchen
von Beispiel 3 werden mit einer 1M Lösung von Phosphorsäure gewaschen,
um Verunreinigungen zu eliminieren und dann mit zwei Volumen 1M
Monokaliumphosphat über
Nacht bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schütteln inkubiert.
Die behandelten Kügelchen
werden dann bis zum neutralen pH-Wert mit Wasser gewaschen und unter
Vakuum bei 60-80°C
getrocknet, um alles Restwasser zu eliminieren. Das Porenvolumen
der trockenen Kügelchen
wird nach wohlbekannten Verfahren bestimmt.
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Eine
Lösung
von Calciumchlorid wird hergestellt durch Solubilisieren von 74
g CaCl22H2O in 500 ml
destilliertem Wasser (Endvolumen). Die trockenen Kügelchen
von behandeltem Zirconoxid werden mit einem Porenvolumen der Lösung von
Calciumchlorid gemischt. Nach 30- bis 60minütigem Mischen zur Sicherstellung
einer guten Penetration der Lösung
in die Poren des Mineralmaterials werden die Kügelchen erneut getrocknet,
wie oben beschrieben.
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Eine
Lösung
von Dinatriumphosphat wird hergestellt durch Solubilisieren von
180 g Na2HPO412H2O in 500 ml Wasser (Endvolumen). Die getrockneten
Kügelchen
werden mit einem Porenvolumen der Lösung gemischt, und die Mischung
wird erneut gründlich
geschüttelt
für 30
bis 60 Minuten, um gute Penetration sicherzustellen. Die Temperatur wird
bei 25-40°C
gehalten, und das Material wird über
Nacht stehen gelassen. Sodann wird das Material mit einem großen Volumen
an Wasser gemischt und mehrere Male mit Wasser gewaschen bis zur
Eliminierung der überschüssigen Calciumionen
(es sollte keine Präzipitation
von Ca(OH)2 mit NaOH auftreten). Das gewaschene
Material wird zu mehreren Volumen (mindestens 10) von Natriumhydroxid
bei einer Konzentration von 0,5M hinzugegeben. Die Suspension wird
dann für
eine Stunde auf 95-100°C
gebracht und über
Nacht stehen gelassen; während dieser
Zeit sinkt die Temperatur auf Raumtemperatur.
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Das
behandelte Material wird erneut extensiv mit Wasser gewaschen und
mit einer Lösung
von 3 g/l Dinatriumphosphat gemischt. Der pH-Wert wird auf 6,8 eingestellt
und die Suspension auf 95-100°C für ca. 20
Minuten erhitzt. Das resultierende Material wird schließlich mit
Wasser gewaschen und in einem Phosphatpuffer bei neutralem pH-Wert
mit 1M Natriumchlorid und 20% Ethanol gelagert.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges Komposit-Adsorbens,
Verfahren zu seiner Verwendung und zu seiner Herstellung bereit.
Es wurden spezifische Beispiele vorgestellt; die obige Beschreibung
ist jedoch als erläuternd
und nicht restriktiv anzusehen. Ein oder mehrere beliebige Merkmale
der zuvor beschriebenen Ausführungsformen
kann in beliebiger Weise mit einem oder mehreren Merkmalen jeder
anderen Ausführungsform
in der vorliegenden Erfindung kombiniert werden. Ferner werden zahlreiche
Variationen der Erfindung für
den Fachmann nach Durchsicht der Beschreibung erkennbar sein. Der
Bereich der Erfindung sollte deshalb nicht in Bezug auf die obige
Beschreibung bestimmt werden, sondern vielmehr in Bezug auf die
beigefügten
Ansprüche
in Verbindung mit deren vollem Bereich von Äquivalenten.