DE3722102C2

DE3722102C2 -

Info

Publication number: DE3722102C2
Application number: DE19873722102
Authority: DE
Inventors: Takeshi Ichitsuka; Tetsuro Ogawa; Akihiko Yokoo; Katsumi Tokio/Tokyo Jp Kawamura
Original assignee: Asahi Kogaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: Pentax Corp
Priority date: 1986-07-05
Filing date: 1987-07-03
Publication date: 1991-04-25
Also published as: SE8702761L; DE3722102A1; SE8702761D0; SE466791B; JPS6316044A; JPH07104332B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Säulenfüllmaterial, das zum Beispiel bei der Anwendung in der Flüssigchromatographie und bei der Blutbehandlung mittels Säulen geeignet ist.

Säulenfüllmaterialien für die Anwendung zum Beispiel in der Flüssigchromatographie werden üblicherweise aus Kieselgel, chemisch modifiziertem Kieselgel, synthetischen Gelen mit hohem Molekulargewicht, natürlichen Gelen mit hohem Molekulargewicht, Gelen aus Kohle, etc. hergestellt. Es sind auch poröse Füllmaterialien bekannt, die aus porösem Siliziumdioxid, chemisch modifiziertem, porösem Siliziumdioxid, porösen Polymeren, etc. hergestellt werden.

Verbindungen auf der Basis von Kalziumphosphat, insbesondere synthetischer Hydroxyapatit (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) weisen als anorganische Hauptkomponenten die gleiche Zusammensetzung auf wie Zähne und Knochen; unter Nutzung ihrer überlegenen Biokompatibilität wurden künstliche Zahnwurzeln und Knochenprothesematerialien aus synthetischem Hydroxyapatit entwickelt. Jahrelang hat man versucht, Füllmaterialien für die Flüssigchromatographie aus diesem Hydroxyapatit, der in enger Beziehung zum lebenden Körper steht, herzustellen; dieses Füllmaterial hat man dann zur Auftrennung von Substanzen, wie Proteinen und Enzymen, eingesetzt. In den letzten Jahren wurden Füllmaterialien, die entweder durch ihr Herstellungsverfahren oder durch ihre Form charakterisiert sind, vorgeschlagen und zum Beispiel in der nicht geprüften japanischen Patentanmeldung Nr. 14 37 62/1985 beschrieben.

Die üblichen Füllmaterialien aus Verbindungen auf der Basis von Kalziumphosphat liegen in Form von Granalien vor, die durch Agglomerationsmethoden, wie Sprühtrocknen, Walz- und Trommelbehandlung und Pulverisierung gewonnen wurden. Diese Granalien sind in verschiedenen Formen erhältlich, wie zum Beispiel in Kugelform, unregelmäßiger Form oder Tafelform.

Ein wesentliches Problem bei der Herstellung dieser Füllmaterialien aus Verbindungen auf der Basis von Kalziumphosphat besteht darin, daß es außerordentlich schwierig ist, Granalien von einheitlicher Form und Größe herzustellen. Wenn diese Füllmaterialien in der Flüssigchromatographie verwendet werden, so ist die Zahl der erhaltbaren theoretischen Böden gering und es besteht die Tendenz eines Nachlaufs in den Chromatogrammen; außerdem treten Schwierigkeiten bei der Einstellung des Pumpdruckes der mobilen Phase und der Kontrolle der Fließgeschwindigkeit auf.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Füllmaterial zur Verfügung zu stellen, das eine Verbindung auf der Basis von Kalziumphosphat umfaßt und das in Form kugelförmiger bzw. sphärischer Granalien von einheitlicher Größe vorliegt.

Die vorstehende Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch ein Füllmaterial gelöst, welches Partikel umfaßt, die sich aus einem sphärischen bzw. kugelförmigen Substrat zusammensetzen, das auf seiner Oberfläche eine Beschichtung aus einer Verbindung auf der Basis von Kalziumphosphat aufweist.

Da die Partikel des Füllmaterials gemäß der Erfindung durch Beschichten der Oberfläche eines kugelförmigen Substrates mit einer Verbindung auf der Basis von Kalziumphosphat hergestellt werden, kommen sie in ihrer Form wirklichen Kugeln sehr nahe und sind von einheitlicher Größe, wenn ein kugelförmiges Substrat verwendet wird, das aus verschiedenen bekannten Kugelmaterialien ausgewählt wird. Füllmaterial, das aus solchen Partikeln besteht, läßt sich in der Flüssigchromatographie gut einsetzen, da damit vorteilhafte Ergebnisse erzielt werden, wie zum Beispiel eine Erhöhung der Anzahl der erreichbaren theoretischen Böden, ein vermindertes Auftreten eines Nachlaufes und eine leichte Einstellung des Pumpdruckes der mobilen Phase und der Fließgeschwindigkeit.

Beispiele von Verbindungen auf der Basis von Kalziumphosphat, die zur Herstellung des Säulenfüllmaterials gemäß der Erfindung geeignet sind, umfassen Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂, Ca₃(PO₄)₂, Ca₂P₂O₇, Ca(PO₃)₂, Ca₁₀(PO₄)₆F₂ und Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂. Diese Verbindungen auf der Basis von Kalziumphosphat können nach einer Vielzahl bekannter Methoden synthetisiert werden, wie zum Beispiel mit Hilfe des Naßverfahrens, wobei ein wasserlösliches Phosphatsalz mit einem wasserlöslichen Kalziumsalz in wäßriger Lösung umgesetzt wird, oder mit Hilfe des Trockenverfahrens, wobei eine Phosphorsäureverbindung mit einer Kalziumverbindung unter erhöhten Temperaturen umgesetzt wird.

Kügelchen bzw. Perlen aus einem Material, wie Polyester, Polystyrole, Polyacrylsäuren, Kohlenstoff, Siliziumdioxid, Aluminiumoxid und Phosphatglas, können als kugelförmiges Substrat in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Kügelchen aus diesem Material sind allgemein im Handel erhältlich; bekannte Beispiele umfassen: Polystyrolkugeln Polyacrylsäurekugeln, Kohlekügelchen, Siliziumdioxidkügelchen und Aluminiumoxidperlen. Die Größe dieser Kügelchen wird in geeigneter Weise und in Übereinstimmung mit der Größe der Granalien des gewünschten Füllmaterials ausgewählt.

Die Verbindung auf der Basis von Kalziumphosphat kann als Beschichtung auf die Oberfläche des kugelförmigen Substrates nach jeder beliebigen Methode aufgebracht werden, so zum Beispiel durch Versprühen Agglomerierung durch Sprühtrocknen oder Agglomerierung durch Walz- und Trommelbehandlung.

Die Partikel des Füllmaterials gemäß der Erfindung werden vorzugsweise so eingestellt bzw. gewählt, daß sie eine Größe (Durchmesser) im Bereich von 1 bis 100 µm aufweisen. Wenn ihre Größe weniger als ein µm beträgt, so tritt ein erhöhter Fließwiderstand auf, wenn die mobile Phase in die gepackte Säule gepumpt wird. Wenn die Größe der Partikel 100 µm überschreitet, so weisen sie eine derart verminderte Oberfläche auf, daß die Auflösung (Trennleistung) des Füllmaterials wahrscheinlich abnimmt.

Die Dicke der Beschichtung der Kalziumphosphatverbindung liegt vorzugsweise im Bereich von ca. 0,5 bis ca. 50 µm. Wenn die Dicke der Beschichtung weniger als 0,5 µm beträgt, so weist die Beschichtung nicht die gewünschte Festigkeit auf. Wenn die Dicke der Beschichtung 50 µm überschreitet, so ist es schwierig, die kugelförmige Natur der Partikel aufrecht zu erhalten.

Beispiele gemäß der Erfindung: Beispiel 1:

Siliziumdioxidkügelchen (Partikelgröße 30 µm) wurden als kugelförmiges Substrat verwendet. Hydroxyapatit (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) wurde als Verbindung auf der Basis von Kalziumphosphat eingesetzt.

Die Siliziumdioxidkügelchen wurden in den Behälter für das Beschichtungssubstrat gegeben, der mit einem Rotationsmechanismus ausgestattet war, um eine Beschichtung der gesamten Oberfläche der Kügelchen zu ermöglichen. Der Hydroxyapatit wurde in den Target-Behälter gegeben.

Durch eine geeignete Einstellung der Betriebsparameter, wie zum Beispiel der Entfernung zwischen Target und dem Beschichtungssubstrat, Versprühen unter hoher Frequenz und Sprühdruck, erfolgte ein Vorversprühen für eine Zeitdauer von 10 bis 30 Minuten, um die Oberfläche des Targets zu reinigen.

Nach dem Vorversprühen erfolgte 4 Stunden lang ein Versprühen unter den folgenden Bedingungen:

Target-zu-Substrat-Abstand 40 mm; Versprühdruck 5,5 × 10 Pa; Sprühleistung 100 W; Sprühgeschwindigkeit 40 Å/min. Die erhaltene Probe wurde eine Stunde bei 700°C in Argonatmosphäre wärmebehandelt. Die Analyse mit einem Röntgenstrahl-Diffractometer und einem Spektrophotometer zeigte, daß die Beschichtung auf den Substratpartikeln in der Probe aus Hydroxyapatit bestand und eine Dicke von 1,2 µm aufwies.

Das nach dem vorstehenden Verfahren erhaltene Füllmaterial bestand aus nahezu kugelförmigen Partikeln mit einem Durchmesser von 32,4 µm und einer 1,2 µm dicken Hydroxyapatitbeschichtung. Dieses Füllmaterial wurde im nassen (gequollenen) Zustand in eine Säule (7,5 mm Durchmesser, 100 mm Länge) aus rostfreiem Stahl gepackt; unter Verwendung dieser Säule wurden übliche Proteine mittels Hochleistungschromatographie analysiert. Die Bedingungen und die Ergebnisse dieser Analyse sind nachfolgend aufgeführt:

Mobile Phase: Natriumphosphatpuffer-Lösung (pH 6,8) mit einem linearen Gradienten von 0,01 bis 0,4 M über 30 Minuten.
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min.
Druck: 20 bar
Proben: BSA, Lysozym, Cytochrom C
Anzahl der scheinbaren theoretischen Böden: 15 000 (bezogen auf den Lysozym-Peak)
Nachlauf: gering.

Beispiel 2:

Siliziumdioxidkügelchen (Kugelgröße 30 µm) wurden als kugelförmiges Substrat verwendet; Hydroxyapatit wurde als Verbindung auf der Basis von Kalziumphosphat eingesetzt.

Es wurde eine Aufschlämmung hergestellt, indem Hydroxyapatit in einer Konzentration von 1% in Wasser dispergiert wurde. Die Siliziumdioxidkügelchen wurden in die Aufschlämmung gegeben und diese gut gerührt. Unter fortgesetztem Rühren wurde die Aufschlämmung mit Hilfe eines Sprühtrockners bei einer Auslaßtemperatur von 90 bis 110°C unter Bildung von Granalien sprühgetrocknet, die Siliziumdioxidkügelchen mit einer Oberflächenbeschichtung aus Hydroxyapatit umfaßten. Die Granalien wurden eine Stunde in Argonatmosphäre bei 700°C zur Herstellung des Füllmaterials wärmebehandelt; das Füllmaterial bestand aus Partikeln mit einem Durchmesser von 32 µm mit einer 1 µm dicken Hydroxyapatitbeschichtung.

Unter Verwendung dieses Füllmaterials wurden Standard-Proteine wie im Beispiel 1 analysiert. Die Bedingungen und Ergebnisse dieser Analyse sind nachfolgend aufgeführt:

Mobile Phase: Natriumphosphatpuffer-Lösung (pH 6,8) mit einem linearen Gradienten von 0,01 bis 0,4 M über 30 Minuten.
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min.
Druck: 20 bar
Proben: BSA, Lysozym, Cytochrom C
Anzahl der scheinbaren theoretischen Böden: 14 000 (bezogen auf den Lysozym-Peak)
Nachlauf: gering.

Beispiel 3:

Siliziumdioxidkügelchen (Kugelgröße 30 µm) wurden als kugelförmiges Substrat verwendet. Hydroxyapatit diente als Kalziumphosphat-Verbindung.

Ein Gemisch aus Siliziumdioxidkügelchen und Hydroxyapatit wurde in einen Walz-Trommel-Agglomerator gegeben und eine Hydroxyapatitbeschichtung auf der Oberfläche eines jeden Siliziumdioxidkügelchens gebildet. Die beschichteten Silica-Kügelchen wurden eine Stunde in Argonatmosphäre bei 700°C unter Bildung des Füllmaterials wärmebehandelt; das Füllmaterial bestand aus Partikeln mit einem Durchmesser von 35,2 µm mit einer 2,6 µm dicken Hydroxyapatitbeschichtung.

Unter Verwendung dieses Füllmaterials wurden Standard-Proteine wie in Beispiel 1 analysiert. Die Bedingungen und Ergebnisse dieser Analyse sind nachfolgend aufgeführt:

Mobile Phase: Natriumphosphatpuffer-Lösung (pH 6,8) mit einem linearen Gradienten von 0,01 bis 0,4 M über 30 Minuten.
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min.
Druck: 20 bar
Proben: BSA, Lysozym, und Cytochrom C
Anzahl der scheinbaren theoretischen Böden: 13 000 (bezogen auf den Lysozym-Peak)
Nachlauf: gering.

Vergleichsbeispiel:

Eine Aufschlämmung aus 1% Hydroxyapatit, dispergiert in Wasser, wurde mit einem Sprühtrockner bei einer Auslaßtemperatur von 90 bis 110°C unter Bildung von Hydroxyapatitgranalien sprühgetrocknet. Die Granalien wurden dann eine Stunde in Argonatmosphäre bei 700°C unter Herstellung des Füllmaterials wärmebehandelt; das Füllmaterial bestand aus einer Agglomeration von Granalien mit einer Größe von 2 bis 20 µm (durchschnittliche Größe: 3,5 µm).

Unter Verwendung dieses Füllmaterials wurden Standard-Proteine wie in Beispiel 1 analysiert. Die Bedingungen und Ergebnisse der Analyse sind nachfolgend aufgeführt:

Mobile Phase: Natriumphosphatpuffer-Lösung (pH 6,8) mit einem linearen Gradienten von 0,01 bis 0,4 M über 30 min.
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min.
Druck: 80 bar
Proben: BSA, Lysozym, und Cytochrom C
Anzahl der scheinbaren theoretischen Böden: 4000 (bezogen auf den Lysozym-Peak)
Nachlauf: groß.

Wie vorstehend beschrieben, werden die Partikel des Füllmaterials gemäß der Erfindung durch Beschichten der Oberfläche eines kugelförmigen Substrates mit einer Verbindung auf der Basis von Kalziumphosphat gebildet; somit kommen sie in ihrer Form echten Kugeln sehr nahe und weisen eine einheitliche Größe auf. Das Füllmaterial, das diese Partikel umfaßt, eignet sich besonders zur Anwendung in der Flüssigchromatographie, wobei eine Erhöhung der Anzahl der erreichbaren theoretischen Böden, ein vermindertes Auftreten von Nachlauf und eine leichte Einstellung des Druckes zum Pumpen der mobilen Phase und deren Fließgeschwindigkeit erzielt werden.

Claims

1. Säulenfüllmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß es Partikel aus einem kugelförmigen Substrat umfaßt, welches auf seiner Oberfläche eine Beschichtung einer Verbindung auf der Basis von Kalziumphosphat aufweist.

2. Säulenfüllmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Verbindung auf der Basis von Kalziumphosphat mindestens eine Verbindung aus der Gruppe Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂, Ca₃(PO₄)₂, Ca₂P₂O₇, Ca(PO₃)₂, Ca₁₀(PO₄)₆F₂, und Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂ darstellt.

3. Säulenfüllmaterial nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß das kugelförmige Substrat ein Materi al aus der Gruppe Polyester, Polystyrol, Polyacryl säure, Kohlenstoff, Siliziumdioxid, Aluminiumoxid und Phosphatglas ist.