JPH01162148A - 液体クロマトグラフィー用充填剤およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「利用分野」 本発明は、液体クロマトグラフィー用充填剤に係り、更
に詳しくは例えば蛋白質、・酵素、核酸等の分離・精製
に用いられる液体クロマトグラフィーに使用される充填
剤及びその製法に関する。

「従来技術及びその問題点」 液体クロマトグラフィー用充填剤としては、従来、シリ
カゲル、化学修飾シリカゲル、高分子ゲル等が一般に使
用されてきた。また、ハイドロキシアパタイト（Ｃａｔ
ｅ（Ｐｏ４）６（ＯＨ）ｚ　）は、その優れた生体親和
性から、蛋白質、核酸、糖、配糖体等の生体高分子を分
離する液体クロマトグラフィーに使用する充填剤として
利用されている。

しかしながら、ハイドロキシアパタイト充填剤は、耐溶
解性に問題があり、充分な機能を果たせない場合があっ
た。すなわち、ハイドロキシアパタイト充填剤を充填し
たカラムに酸性の移動相を長時間流すと、粒子表面から
ハイドロキシアパタイトの結晶が溶出し、微結晶粒子と
なって移動相流路を閉塞させ、使用不能の状態に陥った
りするという欠点があった。このように、従来のハイド
ロキシアパタイト充填剤は、酸性領域における分離操作
には適さないものであり、従って分離対象となる物質は
限定されてしまうという問題点があった。

「発明の目的」 本発明の目的は、従来のハイドロキシアパタイト充填剤
の利点をそのまま維持しながら耐酸性を向上させ、広範
囲の物質群に対して高い分離性能を示す液体クロマトグ
ラフィー用充填剤及びその製法を提供することにある。

「発明の構成」 本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、粒子成分
のうち５〜１００モル％が塩素アパタイトであることを
特徴とする。

本発明に使用する塩素アパタイトは、式：％式％ 〔式中Ｘは０．０５〜ｌの数、好ましくは１を表す〕で
表わされるアパタイトであり、合成又はイオン交換法に
より製造することができる。

合成法による場合には、カルシウム及び塩素を含む液中
にリン酸を滴下し、得られる固体物質を造粒し、仮焼す
ることにより塩素アパタイトを得ることができる。この
場合、カルシウム及び塩素は、塩化カルシウムのように
１種類の化合物によって供給してもよく、また、別々の
化合物によって供給してもよい。別々の化合物として供
給する場合には、カルシウム化合物としては、例えば水
酸化カルシウム、酢酸カルシウム等、塩素化合物として
は、例えば塩酸、塩化アンモニウム等を使用することが
できる。

イオン交換法による場合には、クロマトグラフィー用充
填剤として使用しうるハイドロキシアパタイト粒子を塩
素イオンを含む水溶液中に浸漬することによって水酸基
の一部を塩素にイオン交換し、乾燥後、熱処理すること
によって得られる。

ここで、塩素イオンを含む溶液としては、塩酸を使用す
るのが好ましい。

本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、上記のよ
うに、粒子成分のうち５〜１００モル％が塩素アパタイ
トで形成されていればよい。塩素アパタイトが粒子成分
の５モル％未満であると、耐酸性向上効果が不十分とな
る。

本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、例えば下
記の態様で存在しうる： ■　粒子全体が塩素アパタイトで形成されているもの、 ■　アパタイト粒子の表面が塩素アパタイトで形成され
ているもの、 あるいは ■　不活性担体の粒子の表面に塩素アパタイトをコーテ
ィングしたもの。

粒子全体が塩素アパタイトから成る液体クロマトグラフ
ィー用充填剤は、上記のようにして製造した塩素アパタ
イトの粒状凝集体を適切な温度で熱処理することにより
得られる。

また、アパタイトから成る粒子の表面が塩素アパタイト
で形成されている充填剤は、アパタイトの粒状凝集体を
塩素イオンを含む水溶液中に浸漬し、乾燥後、適切な温
度で熱処理することにより得られる。浸漬は、通常酸性
条件下で５〜９０℃の温度で０．５〜１０時間行う。

さらに、例えばアルミナ等の不活性担体の粒子の表面に
塩素アパタイトをコーティングして成るクロマトグラフ
ィー用充填剤は、例えばスパッタリング等により製造す
ることができる。

本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤において、充
填剤の粒径、形状及び多孔性等は、特に限定されるもの
ではなく、液体クロマトグラフィー用充填剤としての一
般的な粒子設計を行うことができ、その都度の使用目的
に応じて適宜選定することができる。例えば、充填剤の
粒径に関しては、平均粒径が１〜１００μｍ、特に分析
用としては１１−１Ｏａ、また、工業用としては１０〜
１００μｍであることが好ましい。これは、平均粒径が
１μｍ未満のものであると、充填剤をカラムに充填し、
通液した際の圧力損失が大きすぎ、一方、平均粒径が１
００μｍを超えるものであると、単位体積当たりの表面
積が少なくなり、分離能が低下するためである。また、
充填剤の形状に関しては、充填剤の割れ、かけ等を起こ
さず、安定した分離特性を得るために、球形及び球形に
近い形状のものが好ましい。

本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、例えば蛋
白質、酵素、核酸、糖、配糖体等の分離に好適に用いら
れ、リン酸、塩酸等の酸性溶液条件下においても安定し
た分離性能を得ることができる。

「実施例」 次に、本発明を実施例及び比較例によりさらに具体的に
説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１ 塩酸によりｐＨ４，５に調整した水溶液２００ｄ中に８
ｇの球状アパタイト粉末を加え、１時間反応させ、この
溶液を蒸発乾燥した後、熱処理し、粉末状充填剤を得た
。これにより塩素アパタイトが生成したことは、Ｘ線回
折パターン、ＩＲ等により確認された。

こうして得られた充填剤を直径７．５　ｍｍ、高さ１０
０ｍｍのステンレスカラムに充填し、リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，８）にウシ血清アルブミン１０．０ｇｇ／μｌ、
リゾチーム１．２５μｇ／μ！及びチトクロムＣ５，０
ｇｇ／μ！を溶解して成る試料溶液を流し、溶離液とし
て０．０１〜０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６
，８）を用いるリニアグラジェント法により流速１．０
ｇｇ／分で３０分溶離を行い、第１Ａ図に示すクロマト
グラムを得た。図面において、１はウシ血清アルブミン
のピーク、２はリゾチームのピーク、３はチトクロムＣ
のピークを示す。

実施例２ 実施例１で得られた充填剤を用いて、ｐｔｒｓ、ｏの０
．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を流速１．０ｄ／分で１
０時間通液した後、実施例１と同じ試料溶液をクロマト
グラフィー分離し、得られたクロマトグラムを第１Ｂ図
に示す。

第１Ａ図及び第１Ｂ図から明らかなとおり、塩素アパタ
イト充填剤を用いると、ｐＨ５，０の０．４　Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液を１０時間通液してもピーク割れが起
こらず、高い分離性能が達成された。

比較例１ 充填剤として従来のハイドロキシアパタイトを使用した
以外は、実施例１と同様にしてクロマトグラフィーを実
施し、得られたクロマトグラムを第２Ａ図に示す。

比較例２ ｐＨ５，０の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を１０時
間通液後、実施例１と同様にしてクロマトグラフィーを
実施し、得られたクロマトグラムを第２Ｂ図に示す。

第２Ｂ図のクロマトグラムにおいては、ｐＨ５，０の０
．４　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を１０時間通液したこ
とによりカラムが劣化したことを示すピーク割れが出現
した。

「発明の効果」 本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、ハイドロ
キシアパタイトの持つ高い分離性能を維持し、しかも優
れた耐酸性を有するので、酸性溶液を長時間通液しても
、カラムは劣化せず、酸性領域においても長時間安定し
て広範な物質、特に蛋白質、酵素、核酸、糖、配糖体等
の物質の分離精製に好適に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図は本発明の実施例１で得られたクロマトグラム
、第１Ｂは本発明の実施例２で得られたクロマトグラム
、第２Ａ図は比較例１で得られたクロマトグラム、第２
Ｂは比較例２で得られたクロマトグラムを示す。 符号の説明 １・・・ウシ血清アルブミンのピーク、２・・・リゾチ
ームのピーク ３・・・チトクロムＣのピーク 特許出願人　　旭光学工業株式会社

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）粒子成分のうち５〜１００モル％が塩素アパタイ
   トであることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充
   填剤。
2. （２）少なくとも粒子表面が塩素アパタイトである特許
   請求の範囲第１項記載の液体クロマトグラフィー用充填
   剤。
3. （３）アパタイト粒子凝集体を塩素イオンを含む水溶液
   中で撹拌し、粒子成分のうち５〜１００モル％を塩素ア
   パタイトに変えることを特徴とする液体クロマトグラフ
   ィー用充填剤の製法