DE3722103C2

DE3722103C2 -

Info

Publication number: DE3722103C2
Application number: DE19873722103
Authority: DE
Inventors: Takeshi Ichitsuka; Tetsuro Ogawa; Masaya Sumita; Akihiko Yokoo; Katsumi Tokio/Tokyo Jp Kawamura
Original assignee: Asahi Kogaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: Pentax Corp
Priority date: 1986-07-05
Filing date: 1987-07-03
Publication date: 1991-10-17
Also published as: DE3722103A1; JPS6316046A; SE466836B; SE8702760D0; SE8702760L; JPH0781997B2

Description

Die Erfindung betrifft ein kugelförmiges Füllmaterial, welches sich in besonderer Weise eignet zur Auftrennung von Materialien, wie Monosacchariden und Oligosacchariden, durch Flüssigchromatografie.

Füllmaterialien für die Flüssigchromatografie werden üblicherweise aus Silicagel, chemisch modifiziertem Silicagel, synthetischen Gelen mit hohem Molekulargewicht, natürlichen Gelen mit hohem Molekulargewicht, Kohlenstoffgelen, etc. hergestellt. Es sind auch poröse Füllmaterialien bekannt, die aus porösem Siliciumdioxid, chemisch modifiziertem, porösem Siliciumdioxid, porösen Polymeren, etc. hergestellt werden.

Verbindungen auf der Basis von Calciumphosphat, insbesondere synthetischer Hydroxyapatit (Ca₁₀[PO₄]₆[OH]₂), weisen die gleiche Zusammensetzung auf, wie die wesentlichen anorganischen Komponenten von Zähnen und Knochen; unter Nutzung der überlegenen Biokompatibilität wurden künstliche Zahnwurzeln und Knochenprothesematerialien aus synthetischem Hydroxyapatit entwickelt. Über viele Jahre wurden Versuche durchgeführt, um Füllmaterialien für die Flüssigchromatografie aus diesem Hydroxyapatit, der die genannte nahe Beziehung zum lebenden Körper besitzt, herzustellen; die Ergebnisse hat man zur Auftrennung von Substanzen, wie Proteinen und Enzymen angewendet. In den letzten Jahren wurden Füllmaterialien vorgeschlagen, die entweder chrakterisiert sind durch ihr Herstellungsverfahren oder durch ihre Form; diese werden z. B. in der nicht geprüften, offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 1 43 762/1985 beschrieben.

Die konventionellen Verbindungen auf der Basis von Calciumphosphat werden in der Hauptsache eingesetzt zur Auftrennung von Materialien, wie Proteinen und Enzymen; um eine höhere Auflösung der Trennverfahren zu erzielen, werden die meisten Verbindungen im porösen Zustand mit einer großen Oberfläche eingesetzt.

Poröse Füllmaterialien werden auch in der Gel-Permeations-Chromatografie verwendet (siehe z. B. nicht geprüfte, offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 1 55 290/1975). In der Gel-Permeations-Chromatografie werden Materialien ähnlicher chemischer Zusammensetzung in Abhängigkeit von ihrem Molekulargewicht aufgetrennt, wobei die Komponenten mit dem höheren Molekulargewicht zuerst eluiert werden.

Die Erfinder haben nun festgestellt, daß, wenn ein poröses Füllmaterial, das aus einer Verbindung auf der Basis von Calciumphosphat besteht, für die Auftrennung von Sacchariden verwendet wird, die Trennleistung des Füllmaterials durch dessen Porosität nachteilig beeinflußt wird, wobei eine Auftrennung der Komponenten in abnehmender Reihenfolge von ihrem Molekulargewicht erfolgt, wie dies bei der Gel-Permeations-Chromatografie der Fall ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Füllmaterial zur Verfügung zu stellen, das aus einer Verbindung auf der Basis von Calciumphosphat hergestellt ist, und das sich für die Auftrennung von Sacchariden eignet.

Die Erfinder haben weitere Untersuchungen zur Auftrennung von Komponenten, die sich von Proteinen oder Enzymen unterscheiden, mit Füllmaterialien aus Verbindungen auf der Basis von Calciumphosphat, wie z. B. Hydroxyapatit, durchgeführt. Als Ergebnis wurde gefunden, daß bestimmte dichte Verbindungen auf der Basis von Calciumphosphat für die Auftrennung von Sacchariden geeignet sind, wobei ein Auftrennmuster entsteht, bei dem die Komponenten mit niedrigerem Molekulargewicht zuerst eluiert werden.

Das kugelförmige Füllmaterial zur Flüssigchromatografie gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt kugelförmige Partikel, die aus mindestens einem Material, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂,
Ca₃(PO₄)₂, Ca₂P₂O₇, Ca(PO₃)₂,
Ca₁₀(PO₄)₆F₂, und Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂ bestehen,
wobei das genannte Füllmaterial bzw. Packungsmaterial eine dichte Struktur mit einer Porosität von nicht mehr als 5% aufweist.

Fig. 1 stellt eine elektronenmikroskopische Aufnahme (× 15 000) dar, die die Struktur eines Partikels in dem Füllmaterial, wie es in dem Beispiel gemäß der Erfindung hergestellt wurde, wiedergibt, und

Fig. 2 ist ein Chromatogramm, das die Ergebnisse bei der Abtrennung von Glucose von Saccharose durch Flüssigchromatografie zeigt, wobei das in dem Beispiel gemäß der Erfindung hergestellte Füllmaterial verwendet wurde.

Da sich das Füllmaterial gemäß der Erfindung aus dichten kugelförmigen bzw. sphärischen Partikeln mit einer Porosität von nicht mehr als 5% zusammensetzt, weist es eine geringere Fähigkeit zum Auftrennen von Komponenten gemäß dem Eluierungsprofil der Gel-Permeations-Chromatografie auf, und ist daher zur Anwendung der Auftrennung von Sacchariden in zunehmender Reihenfolge ihres Molekulargewichtes geeignet.

Das Füllmaterial gemäß der Erfindung besteht aus mindestens einem Material ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂, Ca₃(PO₄)₂,
Ca₂P₂O₇, Ca(PO₃)₂, Ca₁₀(PO₄)₆F₂ und
Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂. Diese Verbindungen auf der Basis von Calciumphosphat können nach verschiedenen bekannten Methoden synthetisiert werden, so z. B. nach dem Naßverfahren, bei welchem ein wasserlösliches Phosphatsalz mit einem wasserlöslichen Calciumsalz in wäßriger Lösung umgesetzt wird, und nach dem Trockenverfahren, bei welchem eine Phosphorsäureverbindung mit einer Calciumverbindung unter erhöhten Temperaturen umgesetzt wird.

Die Verbindungen auf der Basis von Calciumphosphat, wie sie vorstehend aufgeführt sind, werden nach verschiedenen Methoden, wie z. B. durch Sprühtrocknen und durch eine Walz-Trommel-Kombination zu sphärischen bzw. kugelförmigen Teilchen granuliert. Bei dem Granulierungsverfahren durch Sprühtrocknen wird eine Verbindung auf der Basis von Calciumphosphat in Wasser dispergiert; die erhaltene Aufschlämmung wird bei einer Temperatur von ca. 100 bis 250°C unter Bildung kugelförmiger Granalien sprühgetrocknet. Bei dem Granulierungsverfahren durch Walz- und Trommelbehandlung werden Partikel aus einer Verbindung auf der Basis von Calciumphosphat von oben her auf einen zentralen Teil einer geneigten Rotationsscheibe zugegeben und unter der Rotationswirkung der Scheibe agglomeriert.

Die Granalien werden dann bei einer Temperatur von 900 bis 1400°C unter Bildung eines Füllmaterials gebrannt, wobei letzteres kugelförmige Partikel mit einer Porosität von nicht mehr als 5% umfaßt. Wenn die Brenntemperatur weniger als 900°C beträgt, ergibt sich häufig ein Füllmaterial mit einer Porosität von mehr als 5%; die Porosität eines solchen Füllmaterials führt zu einer Auftrennung der Komponenten in abnehmender Reihenfolge ihres Molekulargewichtes, wie dies bei der Gel-Permeations-Chromatografie der Fall ist; dieser Umstand ist für die Auftrennung von Sacchariden ungeeignet. Wenn die Brenntemperatur 1400°C übersteigt, so erfährt die Verbindung auf der Basis von Calciumphosphat eine Zersetzungsreaktion und es ergibt sich ein Füllmaterial mit einer geringen Auflösung.

Die Partikel des Füllmaterials gemäß der Erfindung müssen nicht vollständig und perfekt kugelförmig in ihrer Form sein, vorausgesetzt, daß sie im allgemeinen eine kugelförmige bzw. sphärische Gestalt aufweisen, und eierförmige Gebilde oder solche mit der Form eines Rugby-Balles ebenfalls von der Bezeichnung "kugelförmig bzw. sphärisch", wie sie hier verwendet wird, mit eingeschlossen sind.

Die durchschnittliche Größe (durchschnittlicher Durchmesser) der Partikel gemäß der Erfindung ist nicht auf einen bestimmten Wert begrenzt; es ist jedoch vorteilhaft, daß dieser im Bereich von ca. 1 bis ca. 100 µm liegt. Wenn die durchschnittliche Größe weniger als 1 µm beträgt, so weist das Füllmaterial einen zunehmenden Widerstand gegenüber dem Durchgang der mobilen Phase durch eine Säule auf. Wenn andererseits die durchschnittliche Größe 100 µm übersteigt, so besitzt das Füllmaterial eine verminderte Auflösung.

Das Füllmaterial gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt sich besonders wirksam bei der Auftrennung von Monosacchariden, wie Glucose, oder Oligosacchariden, wie Sucrose, Lactose und Raffinose, wobei ein Separationsmuster entsteht, in welchem die Komponenten mit dem niedrigeren Molekulargewicht zuerst eluieren.

Beispiel

Eine Lösung aus einem Phosphatsalz und eine Lösung aus einem Calciumsalz wurden nach einem bekannten Verfahren unter Bildung einer Hydroxyapatit-Aufschlämmung umgesetzt. Die Aufschlämmung wurde durch Sprühtrocknen mit einem Mobile Minor-Typ Sprühtrockner granuliert. Die erhaltenen Granalien, die eine nahezu kugelförmige Form aufwiesen, wurden 4 h bei 1100°C gebrannt, um ein Füllmaterial des Typs, wie es gemäß der Erfindung erwünscht ist, zu erhalten. Die Partikel dieses Füllmaterials wiesen eine durchschnittliche Größe von 5 µm und eine durchschnittliche Porosität von 1% auf. Eine elektronenmikroskopische Aufnahme (× 15 000) eines einzelnen Teilchens dieses Füllmaterials ist in Fig. 1 wiedergegeben.

Das Füllmaterial wurde in eine Säule (Durchmesser 7,5 mm, L 100 mm) aus rostfreiem Stahl zur Hochleistungs-Flüssigchromatografie gepackt. Es wurde eine Auftrennung von Glucose und Saccharose auf dieser Säule mit einer flüssigen Lösung aus 80% Acetonitril, das als Eluierungsmittel mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/Min. aufgebracht wurde, durchgeführt. Das erhaltene Chromatogramm ist in Fig. 2 wiedergegeben, wobei die vertikale Achse die Extinktion bei 195 nm, die horizontale Achse die Zahl der Minuten wiedergibt. In Fig. 2 bedeutet G den Glucose-Peak, S den Saccharose-Peak. Wie aus Fig. 2 hervorgeht, eignet sich das Füllmaterial gemäß der Erfindung zum Auftrennen von Sacchariden mit hoher Auflösung.

Wie vorstehend beschrieben, setzt sich das Füllmaterial gemäß der Erfindung im allgemeinen aus nahezu kugelförmigen Partikeln einer Verbindung auf der Basis von Calciumphosphat zusammen, wobei dieselben eine dichte Struktur mit einer Porosität von nicht mehr als 5% aufweisen. Dieses Füllmaterial weist eine verminderte Tendenz auf, eine Auftrennung der Komponenten in abnehmender Reihenfolge ihres Molekulargewichtes herbeizuführen wie dies im Falle der Gel-Permeations-Chromatografie der Fall ist. Daher ist das genannte Material bei Auftrennung von Sacchariden nach der Größenordnung ihres Molekulargewichtes geeignet, wobei die Komponenten mit niedrigerem Molekulargewicht zuerst eluieren.

Claims

1. Kugelförmiges Füllmaterial für die Flüssigchromatografie, gekennzeichnet durch kugelförmige Partikel aus mindestens einem Material, ausgewählt aus der Gruppe
Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂, Ca₃(PO₄)₂,
Ca₂P₂O₇, Ca(PO₃)₂, Ca₁₀(PO₄)₆F₂, und
Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂, wobei das genannte Füllmaterial eine dichte Struktur mit einer Porosität von nicht mehr als 5% aufweist.

2. Kugelförmiges Füllmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die durchschnittliche Größe der genannten Partikel im Bereich von ca. 1 bis 100 µm liegt.

3. Verfahren zur Herstellung eines kugelförmigen Füllmaterials, nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
Dispergieren einer Verbindung auf der Basis von Calciumphosphat in Wasser unter Herstellung einer Aufschlämmung;
Trocknen der genannten Aufschlämmung bei einer Temperatur von ca. 100 bis 250°C unter Bildung kugelförmiger Granalien; und
Brennen der genannten kugelförmigen Granalien bei einer Temperatur von 900 bis 1400°C zur Herstellung des genannten Füllmaterials, welches kugelförmige Partikel mit einer Porosität von nicht mehr als 5% umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte kugelförmige Füllmaterial mindestens ein Material, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂, Ca₃(PO₄)₂,
Ca₂P₂O₇, Ca(PO₃)₂, Ca₁₀(PO₄)₆F₂ und
Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂, umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die durchschnittliche Größe der genannten Partikel im Bereich von 1 bis 100 µm liegt.