WO2006021367A1 - Nanopartikel und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

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WO2006021367A1
WO2006021367A1 PCT/EP2005/008954 EP2005008954W WO2006021367A1 WO 2006021367 A1 WO2006021367 A1 WO 2006021367A1 EP 2005008954 W EP2005008954 W EP 2005008954W WO 2006021367 A1 WO2006021367 A1 WO 2006021367A1
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WO
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nanoparticles
gelatin
molecular weight
proportion
kda
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PCT/EP2005/008954
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Michael Ahlers
Conrad Coester
Klaus Zwiorek
Jan Zillies
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Gelita Ag
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    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the present patent application relates to nanoparticles, the use of nanoparticles for the production of medicaments and a method for the production of nanoparticles.
  • Nanoparticles as carrier systems for pharmaceutical substances have been known since the 1970s. They allow a targeted transport of the active ingredients in a ge desired area of the body, wherein the release takes place only at the destination (so-called drug delivery systems). At the same time, the active ingredient, which has not yet been released, is effectively shielded against metabolic influences of the body. Thus, side effects can be minimized by the Wirkstoff ⁇ molecules predominantly and targeted arrive at their actual site of action and less burden on the whole organism.
  • Fibronectin various polysaccharides, albumin, collagen and gelatin are known, among other things, as natural, degradable carrier materials.
  • Another difficulty with the known nanoparticles consists in the sometimes wide size distribution, which is disadvantageous in terms of a uniform release and transport behavior.
  • the size distribution of such nanoparticles can be made narrower to a certain extent by complicated centrifugation and other separation methods, this does not lead to a satisfying result.
  • the object underlying the present application is therefore to provide biodegradable nanoparticles which ensure uniform and definable drug delivery.
  • the object is to specify a suitable method for producing this nanoparticle.
  • nanoparticles of the type mentioned consist essentially of an aqueous gelatin gel, wherein the average diameter of the nanoparticles is at most 350 nm and the polydispersity index of the nanoparticles is less than or equal to 0.15.
  • Gelatine has as starting material! for nanoparticles a number of advantages. It is available in defined composition and purity and has a relatively low antigenic potential. Gelatine is also approved for parenteral use, including as a plasma expander.
  • amino acid side chains of gelatin offer the simple possibility of chemically modifying the surface of the nanoparticles, of crosslinking the latins or of covalently binding active ingredient molecules to the particles.
  • aqueous gelatin gel is to be understood as meaning that the gelatin contained in the nanoparticles in hydrated form, ie as hydrocolloid. Since the nanoparticles are always surrounded by an aqueous solution during their preparation and use, all information on the size and polydispersity of the nanoparticles relates to this hydrated form. The determination of these parameters is carried out using the standard method of photon correlation spectroscopy (PCS), which is described in more detail below.
  • PCS photon correlation spectroscopy
  • the expression “consisting essentially of” is to be understood as meaning that the nanoparticles are at least 95% by weight or more, preferably 97% by weight or more, even more preferably up to 98% by weight or more and most preferably 99% by weight or more of the aqueous gelatin gel.
  • the polydispersity index is a measure of the size distribution of the nanoparticles, whereby theoretically values between 1 (maximum scattering) and 0 (identical size of all particles) are possible.
  • the low polydispersity index of the nanoparticles according to the invention of not more than 0.15 ensures targeted and controllable drug delivery as well as the release of the drug at the desired target site, in particular when uptake of the nanoparticles by body cells.
  • nanoparticles having a polydispersity index of less than or equal to 0.1 are particularly preferred.
  • the size of the nanoparticles is a decisive factor for their applicability and may vary depending on the field of application. In many cases, nanoparticles with an average diameter of at most 200 nm are preferred.
  • Another embodiment of the invention relates to nanoparticles having an average diameter of at most 150 nm, preferably from 80 to 150 nm. These can be used by utilizing the so-called EPR effect (enhanced permeability and retention). This effect makes it possible to specifically treat tumor cells which have a higher uptake rate than nanoparticles of the stated size range than healthy cells.
  • Another parameter for the size distribution of the nanoparticles is the band width of the diameter, which is preferably at a maximum of 20 nm above and below the mean value.
  • the bandwidth can also be determined by means of PCS.
  • the properties of the nanoparticles according to the invention can also be influenced by the molecular weight distribution of the gelatin contained.
  • the proportion of low molecular weight gelatin in particular the proportion of gelatin having a molecular weight below 65 kDa, based on the total gelatin contained in the nanoparticles. This proportion is preferably below 40 wt .-%. Particularly advantageous is a proportion of less than 30 wt .-%, preferably 20 wt .-% and Weni ⁇ ger.
  • nanoparticles are usually described which, in addition, contain further structural polymers (for example nanoparticles produced by the coacervation process, as described in WO 01/47501 A1).
  • the nanoparticles made of pure gelatin prepared hitherto are either unstable or do not have the parameters described above with regard to particle diameter and size distribution which are advantageous for selective drug delivery.
  • the gelatin contained in the nanoparticles is crosslinked. Networking will increase the stability of the nanoparticles!
  • the degree of decomposition of the nanoparticles can be deliberately adjusted by the degree of crosslinking selected. This is advantageous since different application areas usually require defined degradation times of the nanoparticles.
  • Non-crosslinked nanoparticles are suitable for extracorporeal, in particular diagnostic, applications in which, below the melting point of gelatin, e.g. can be operated at room temperature.
  • crosslinked nanoparticles are particularly suitable for therapeutic applications.
  • the gelatin may be chemically crosslinked, e.g. by formaldehyde, dialdehyde, isocyanates, diisocyanates, carbodiimides or alkyldihaiogenides.
  • enzymatic crosslinking e.g. by transglutaminase or laccase.
  • the nanoparticles according to the invention are dried, preferably up to a water content of not more than 15% by weight.
  • Another embodiment of the invention relates to nanoparticles, on the surface of which a pharmaceutical active substance is bound.
  • the surface of the nanoparticles is chemically modified, e.g. by the reaction of free amino or carboxyl groups of the gelatin, whereby charged So ⁇ chains or side chains with a new chemical functionality entste ⁇ hen.
  • the binding of the pharmaceutical active substance to the nanoparticles or to the chemically modified nanoparticles can be effected by adsorption forces, by covalent bonds or by ionic bonds.
  • nanoparticles whose surfaces are positively charged by a corresponding chemical modification, DNA or RNA fragments are ionically bound ge ⁇ .
  • the binding of the active ingredient to the nanoparticles takes place via a spacer.
  • the nanoparticles described above can be used according to the invention for the production of medicaments.
  • nanoparticles for intracellular drug delivery systems, in particular as a carrier for nucleic acids or peptides.
  • Medicaments containing nanoparticles according to the invention can preferably be used in gene therapy.
  • the present invention further relates to a process for the preparation of nanoparticles of the type described above.
  • the object underlying the invention with regard to the method is achieved by using a gelatin as the starting material for the preparation process whose maximum amount of gelatin having a molecular weight of less than 65 kDa, based on the total gelatin 40 wt .-% is.
  • nanoparticles having a low polydispersity and bandwidth of the particle diameter can be produced in a simple manner, in particular the nanoparticles according to the invention having a polydispersity index of less than or equal to 0.15.
  • an aqueous solution is first prepared from such a gelatin, the pH of which is then adjusted to a value below 7.0.
  • a suitable precipitating agent By adding a suitable precipitating agent to this solution, the dissolved gelatin is desolvated in the form of nanoparticles, which are then separated from the solution by simple centrifugation. Fractionation of the nanoparticles, e.g. by gradient centrifugation, is not necessary, since its polydispersity is already in a sufficiently low range as a result of the production process according to the invention.
  • Nanoparticles according to the invention are therefore preferably substantially free of the stated additives.
  • the inventive method thus enables the production of Nanoparticles, which essentially consist only of an aqueous gelatin gel.
  • gelatin with the molecular weight distribution described above ensures the formation of stable nanoparticles.
  • Gelatins with a higher low molecular weight fraction in this process increasingly lead to the formation of larger aggregates or unstable particles.
  • the proportion of gelatin having a molecular weight of less than 65 kDa is at most 30% by weight, most preferably at most 20% by weight.
  • the adjusted pH of the gelatin solution is less than or equal to 3.0, preferably in the range of 1.5 to 3.0.
  • the pH can be z.T. an influence on the mean particle size are exerted, with a lower pH tends to result in smaller nanoparticles.
  • acetone In a further preferred embodiment acetone, alcohols, e.g. Ethanol, or mixtures of these precipitants used in succession or with water, acetone is be ⁇ preferred as the precipitating agent.
  • the use of volatile precipitants of this kind largely avoids the fact that fractions of the precipitant are incorporated into the nanoparticles and / or remain so that they consist essentially only of the aqueous gelatin gel.
  • the proportion of gelatin having a molecular weight below 65 kDa is preferably 20% by weight or less in order to counteract agglomeration of the particles upon crosslinking.
  • FIG. 1 shows the gel permeation chromatograms of two gelatins (FIGS. 1A and 1B, respectively) representing the molecular weight distribution of the respective gelatin;
  • FIG. 2 an electron micrograph of nanoparticles according to the invention.
  • FIG. 3 shows a size distribution of nanoparticles produced according to the invention.
  • the molecular weight distribution of the gelatin can be used to influence the properties of the nanoparticles produced therefrom.
  • the molecular weight distribution can be determined by gel permeation chromatography (GPC). The determination is carried out on an HPLC system with the following components:
  • Plasticizer 1% by weight SDS, 100 mmol / l Na 2 SO 4 ,
  • the assignment between elution volume and molecular weight is carried out by calibrating the system with a standard gelatin having a known molecular weight distribution. By dividing the chromatogram into defined ranges and integrating the UV detector signal, the proportion of gelatin which lies in the respective molecular weight range can be calculated.
  • FIG. 1 shows by way of example the gel permeation chromatograms of two different gelatins:
  • FIG. 1A shows the GPC of a commercial pork rind gelatin (Type A gelatin) with a bloom value of 175. Due to the high proportion of gelatin with a molecular weight below 65 kDa, which is above 45% by weight, this gelatin is for the production process according to the invention are not suitable for nanoparticles and leads to particles with too high polydispersity or agglomeration of the particles.
  • FIG. 1B shows the GPC of a pigskin gelatin having a bloom value of 310 and a proportion of gelatin having a molecular weight of less than 65 kDa of about 15% by weight. This gelatin is very well suited for the production process according to the invention.
  • Photon correlation spectroscopy allows the determination of the mean particle diameter of the nanoparticles, the polydispersity index and the bandwidth of the particle diameter above and below the mean value.
  • nanoparticle suspensions were used with a concentration of 10 to 50 ug / ml in de-mineralized water.
  • This example describes the preparation of crosslinked nanoparticles from gelatin, the GPC of which is shown in FIG. 1B (with a proportion of gelatin having a molecular weight below 65 kDa of about 15% by weight).
  • Crosslinked nanoparticles are prepared as described in Example 1, with a pigskin gelatin having a bloom value of 270, whose proportion of gelatin having a molecular weight below 65 kDa being about 19% by weight, being used as starting material.
  • an average particle diameter of about 173 nm and a polydispersity index of about 0.08 were determined by the PCS method described above.
  • the size distribution was comparable to the nanoparticles prepared according to Example 1.

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Abstract

Um bioabbaubare Nanopartikel zur Verfügung zu stellen, die einen einheitlichen und definierbaren Wirkstofftransport gewährleisten, und gleichzeitig ein geeignetes Verfahren zur Herstellung dieser Nanopartikel anzugeben, wird vorgeschlagen, dass die Nanopartikel im Wesentlichen aus einem wässrigen Gelatinegel bestehen, wobei der mittlere Durchmesser der Nanopartikel maximal 350 nm beträgt, der Polydispersitätsindex der Nanopartikel kleiner oder gleich 0,15 ist und wobei als Ausgangsmaterial für das Herstellungsverfahren eine Gelatine verwendet wird, deren Anteil an Gelatine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa, bezogen auf die gesamte Gelatine, maximal 40 Gew.-% beträgt.

Description

Nanopartϊkel und Verfahren zu deren Herstellung
Die vorliegende Patentanmeldung betrifft Nanopartikel, die Verwendung von Nanopartikeln für die Herstellung von Medikamenten sowie ein Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln.
Nanopartikel als Trägersysteme für Arzneistoffe sind seit den 70er Jahren be¬ kannt. Sie ermöglichen einen gezielten Transport der Wirkstoffe in einen ge¬ wünschten Bereich des Körpers, wobei die Freisetzung erst am Zielort erfolgt (sogenannte drug-delivery-Systeme). Gleichzeitig wird der noch nicht freige¬ setzte Wirkstoff effektiv gegenüber metabolischen Einflüssen des Körpers ab¬ geschirmt. So können Nebenwirkungen minimiert werden, indem die Wirkstoff¬ moleküle vorwiegend und gezielt an ihrem eigentlichen Wirkort ankommen und den Gesamtorganismus weniger belasten.
Für die Herstellung von Nanopartikeln werden in der Literatur zahlreiche syn¬ thetische Ausgangsmaterialien wie z.B. Polyacrylate, Polyamide, Polystyrole und Cyanoacrylate beschrieben. Der entscheidende Nachteil dieser Makromo¬ leküle liegt allerdings in ihrer schlechten oder fehlenden Bioabbaubarkeit.
Als natürliche, im Körper abbaubare Trägermaterialien sind unter anderem Fi- bronektin, verschiedene Polysaccharide, Albumin, Collagen und Gelatine be¬ kannt. Eine weitere Schwierigkeit bei den bekannten Nanopartikeln besteht in der z.T. weiten Größenverteilung, die im Hinblick auf ein einheitliches Freisetzungs¬ und Transportverhalten nachteilig ist. Durch aufwendige Zentrifugations- und andere Trennungsverfahren kann die Größenverteilung solcher Nanopartikel zwar in gewissem Umfang enger gemacht werden, was aber zu keinem befrie¬ digenden Ergebnis führt.
Die der vorliegenden Anmeldung zugrunde liegende Aufgabe besteht somit da¬ rin, bioabbaubare Nanopartikel zur Verfügung zu stellen, die einen einheitli¬ chen und definierbaren Wirkstofftransport gewährleisten. Gleichzeitig besteht die Aufgabe darin, ein geeignetes Verfahren zur Herstellung dieser Nanoparti- kei anzugeben.
Diese Aufgabe wird bei den Nanopartikeln der eingangs erwähnten Art dadurch gelöst, dass sie im Wesentlichen aus einem wässrigen Gelatinegel bestehen, wobei der mittlere Durchmesser der Nanopartikel maximal 350 nm beträgt und der Polydispersitätsindex der Nanopartikel kleiner oder gleich 0,15 ist.
Gelatine weist als Ausgangsmateria! für Nanopartikel eine Reihe von Vorteilen auf. Sie ist in definierter Zusammensetzung und Reinheit verfügbar und hat ein relativ geringes antigenes Potenzial. Gelatine ist zudem für die parenterale Anwendung zugelassen, unter anderem als Plasmaexpander.
Darüber hinaus bieten die Aminosäureseitenketten der Gelatine die einfache Möglichkeit, die Oberfläche der Nanopartikel chemisch zu modifizieren, die Ge¬ latine zu vernetzen oder Wirkstoff molekü Ie kovalent an die Partikel zu binden.
Der Begriff "wässriges Gelatinegel" ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung dahingehend zu verstehen, dass die in den Nanopartikeln enthaltene Gelatine in hydratisierter Form, d.h. als Hydrokolloid, vorliegt. Da die Nanopartikel wäh¬ rend ihrer Herstellung und Verwendung stets von einer wässrigen Lösung um¬ geben sind, beziehen sich sämtliche Angaben zur Größe und Polydispersität der Nanopartikel auf diese hydratisierte Form. Die Bestimmung dieser Parame¬ ter erfolgt mit der Standardmethode der Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS), die weiter unten näher beschrieben wird.
Die Formulierung "im Wesentlichen bestehend aus" ist im Sinne der Erfindung so zu verstehen, dass die Nanopartikel zu 95 Gew.-% oder mehr, bevorzugt 97 Gew.-% oder mehr, noch mehr bevorzugt zu 98 Gew.-% oder mehr und am meisten bevorzugt zu 99 Gew.-% oder mehr aus dem wässrigen Gelatine¬ gel bestehen.
Der Polydispersitätsindex ist ein Maß für die Größenverteilung der Nanoparti¬ kel, wobei theoretisch Werte zwischen 1 (maximale Streuung) und 0 (identi¬ sche Größe aller Partikel) möglich sind. Der niedrige Polydispersitätsindex der erfindungsgemäßen Nanopartikel von maximal 0,15 gewährleistet einen geziel¬ ten und kontrollierbaren Wirkstofftransport sowie die Freisetzung des Wirkstof¬ fes am gewünschten Zielort, insbesondere bei der Aufnahme der Nanopartikel durch Körperzellen.
Besonders bevorzugt sind Nanopartikel mit einem Polydispersitätsindex kleiner oder gleich 0,1.
Die Größe der Nanopartikel ist ein entscheidender Faktor für deren Verwend¬ barkeit und kann je nach Anwendungsgebiet variieren. In vielen Fällen sind Nanopartikel mit einem mittleren Durchmesser von maximal 200 nm bevor¬ zugt. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Nanopartikel mit einem mittleren Durchmesser von maximal 150 nm, vorzugsweise von 80 bis 150 nm. Diese können unter Ausnutzung des sogenannten EPR-Effekts (enhanced permeability and retention) eingesetzt werden. Dieser Effekt er¬ möglicht die gezielte Behandlung von Tumorzellen, die gegenüber Nanoparti- keln des genannten Größenbereiches eine höhere Aufnahmerate aufweisen als gesunde Zellen.
Ein weiterer Parameter für die Größenverteilung der Nanopartikel ist die Band¬ breite des Durchmessers, die vorzugsweise bei maximal 20 nm ober- und un¬ terhalb des Mittelwertes liegt. Die Bandbreite kann ebenfalls mittels PCS be¬ stimmt werden.
Die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Nanopartikel können auch durch die Molekulargewichtsverteilung der enthaltenen Gelatine beeinflusst werden. Wichtig ist in diesem Zusammenhang der Anteil an niedermolekularer Gelatine, insbesondere der Anteil an Gelatine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa, bezogen auf die gesamte in den Nanopartikeln enthaltene Gelatine. Dieser Anteil liegt bevorzugt unterhalb von 40 Gew.-%. Besonders vorteilhaft ist ein Anteil von weniger als 30 Gew.-%, vorzugsweise 20 Gew.-% und weni¬ ger.
Im Stand der Technik sind im Zusammenhang mit Gelatine meist Nanopartikel beschrieben, die darüber hinaus noch weitere Strukturpolymere enthalten (z.B. nach dem Koazervationsverfahren hergestellte Nanopartikel, wie sie in der WO 01/47501 Al beschrieben werden). Die bisher hergestellten Nanopar¬ tikel aus reiner Gelatine sind entweder instabil oder weisen die oben beschrie¬ benen, für den selektiven Wirkstofftransport vorteilhaften Parameter in Bezug auf Partikeldurchmesser und Größenverteilung nicht auf. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die in den Nanopartikeln enthaltene Gelatine vernetzt. Durch eine Vernetzung wird die Stabilität der Na- nopartike! wesentlich erhöht, zudem kann durch den gewählten Vernetzungs¬ grad das Abbauverhalten der Nanopartikel gezielt eingestellt werden. Dies ist von Vorteil, da unterschiedliche Anwendungsbereiche in der Regel definierte Abbauzeiten der Nanopartikel erfordern.
Insbesondere bei der Vernetzung ist es von Bedeutung, dass der Anteil an Gelatine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa weniger als 20 Gew.-% beträgt.
Unvernetzte Nanopartikel sind geeignet für extracorporale, insbesondere dia¬ gnostische Anwendungen, bei denen unterhalb des Schmelzpunktes von Gela¬ tine, z.B. bei Raumtemperatur gearbeitet werden kann.
Demgegenüber sind insbesondere für therapeutische Anwendungen die oben beschriebenen vernetzten Nanopartikel geeignet.
Die Gelatine kann chemisch vernetzt sein, z.B. durch Formaldehyd, Dialdehy- de, Isocyanate, Diisocyanate, Carbodiimide oder Alkyldihaiogenide.
Alternativ kann eine enzymatische Vernetzung, z.B. durch Transglutaminase oder Laccase, erfolgen.
Bei einer weiteren Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Nanopar¬ tikel getrocknet, vorzugsweise bis zu einem Wassergehalt von maximal 15 Gew.-%. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Nanopartikel, an deren Oberfläche ein pharmazeutischer Wirkstoff gebunden ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird vor der Bindung des Wirkstoffes die Oberfläche der Nanopartikel chemisch modifiziert, z.B. durch die Reaktion freier Amino- oder Carboxylgruppen der Gelatine, wodurch geladene Seiten¬ ketten oder Seitenketten mit einer neuen chemischen Funktionalität entste¬ hen.
Die Bindung des pharmazeutischen Wirkstoffes an die Nanopartikel oder an die chemisch modifizierten Nanopartikel kann durch Adsorptionskräfte, durch ko- valente Bindungen oder durch ionische Bindungen erfolgen. Beispielsweise können an Nanopartikel, deren Oberflächen durch eine entsprechende chemi¬ sche Modifikation positiv geladen sind, DNA- oder RNA-Fragmente ionisch ge¬ bunden werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Bindung des Wirkstoffes an die Nanopartikel über einen Spacer.
Vorstehend beschriebenen Nanopartikel können, sofern sie vernetzt sind, er¬ findungsgemäß für die Herstellung von Medikamenten verwendet werden.
Besonders vorteilhaft ist die Verwendung der Nanopartikel für intrazelluläre drug-delivery-Systeme, insbesondere als Trägerstoff für Nucleinsäuren oder Peptide.
Medikamente mit erfindungsgemäßen Nanopartikeln können bevorzugt in der Gentherapie eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Na- nopartikeln der eingangs beschriebenen Art.
Die der Erfindung hinsichtlich des Verfahrens zugrunde liegende Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass als Ausgangsmaterial für das Herstel¬ lungsverfahren eine Gelatine verwendet wird, deren Anteil an Gelatine mit ei¬ nem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa, bezogen auf die gesamte Gela¬ tine, maximal 40 Gew.-% beträgt.
Durch Verwendung einer solchen Gelatine können auf einfache Weise Nano- partikel mit einer geringen Polydispersität und Bandbreite des Partikeldurch¬ messers hergestellt werden, insbesondere die erfindungsgemäßen Nanoparti- kel mit einem Polydispersitätsindex kleiner oder gleich 0,15.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird aus einer solchen Gelatine zu¬ nächst eine wässrige Lösung hergestellt, deren pH-Wert dann auf einen Wert unterhalb von 7,0 eingestellt wird. Durch Zugabe eines geeigneten Fällungs¬ mittels zu dieser Lösung erfolgt eine Desolvatation der gelösten Gelatine in Form von Nanopartikeln, die anschließend durch eine einfache Zentrifugation aus der Lösung abgetrennt werden. Eine Fraktionierung der Nanopartikel, z.B. durch eine Gradientenzentrifugation, ist nicht erforderlich, da deren Polydis¬ persität als Ergebnis des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens bereits in einem ausreichend niedrigen Bereich liegt.
Ein Zusatz von Hilfsstoffen zu der wässrigen Gelatinelösung, insbesondere von Salzen oder oberflächenaktiven Substanzen wie Detergenzien, ist im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht erforderlich. Erfindungsgemäße Na¬ nopartikel sind daher bevorzugt im Wesentlichen frei von den genannten Zu¬ sätzen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit die Herstellung von Nanopartikeln, die im Wesentlichen nur aus einem wässrigen Gelatinegel be¬ stehen.
Durch die Verwendung von Gelatine mit der vorstehend beschriebenen Mole¬ kulargewichtsverteilung wird die Entstehung stabiler Nanopartikel gewährlei¬ stet. Gelatinen mit einem höheren niedermolekularen Anteil führen bei diesem Verfahren vermehrt zur Bildung von größeren Aggregaten oder instabilen Par¬ tikeln.
Vorzugsweise liegt der Anteil an Gelatine mit einem Molekulargewicht unter¬ halb von 65 kDa bei maximal 30 Gew.-%, am meisten bevorzugt bei maximal 20 Gew.-%.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist der eingestellte pH-Wert der Gelatinelösung kleiner oder gleich 3,0, vorzugsweise liegt er im Bereich von 1,5 bis 3,0. Innerhalb dieses Intervalls kann über den pH-Wert z.T. ein Einfluss auf die mittlere Partikelgröße ausgeübt werden, wobei ein niedrigerer pH-Wert tendenziell zu kleineren Nanopartikeln führt.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden als Fällungsmittel Aceton, Alkohole, wie z.B. Ethanol, oder Mischungen dieser Fällungsmittel un¬ tereinander oder mit Wasser verwendet, wobei Aceton als Fällungsmittel be¬ vorzugt ist.
Durch die Verwendung derartiger flüchtiger Fällungsmittel wird weitestgehend vermieden, dass Anteile des Fällungsmittels in die Nanopartikel inkorporiert werden und/oder bleiben, so dass diese im Wesentlichen nur aus dem wässri¬ gen Gelatinegel bestehen. Für die Herstellung von vernetzten Nanopartikeln erfolgt nach Zugabe des Fäl¬ lungsmittels und vor dem Zentrifugieren die Zugabe eines Vernetzungsmittels. Bei dieser Ausführungsform beträgt der Anteil an Gelatine mit einem Moleku¬ largewicht unterhalb von 65 kDa bevorzugt 20 Gew.-% oder weniger, um einer Agglomeration der Partikel beim Vernetzen entgegenzuwirken. Mit diesem Ver¬ fahren können sehr einheitliche Nanopartikel mit einer Bandbreite von maximal ±20 nm und einem Polydispersitätsindex von maximal 0,1 hergestellt werden.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand der Beispiele unter Bezugnahme auf die Zeichnung noch näher erläutert. Es zeigen im Einzelnen:
Figur 1: die Gelpermeationschromatogramme zweier Gelatinen (Fig. IA bzw. IB), die die Molekulargewichtsverteilung der jeweiligen Gela¬ tine wiedergeben;
Figur 2: eine elektronenmikroskopische Aufnahme von erfindungsgemäßen Nanopartikeln; und
Figur 3: eine Größenverteilung erfindungsgemäß hergestellter Nanoparti¬ kel.
Bestimmung der Molekularqewichtsverteilung
Über die Molekulargewichtsverteilung der Gelatine kann, wie oben beschrie¬ ben, Einfluss auf die Eigenschaften der daraus hergestellten Nanopartikel ge¬ nommen werden. Die Molekulargewichtsverteilung kann mittels Gelpermeati- onschromatografie (GPC) ermittelt werden. Die Bestimmung wird auf einem HPLC-System mit den folgenden Komponen¬ ten durchgeführt:
HPLC-Pumpe: Pharmacia 2249 UV-Detektor: LKW 2151
Trennsäule: TFK 400 SWXL mit Vorsäule (Fa. Tosoh Biosep GmbH)
Fließmittel: 1 Gew.-% SDS, 100 mmol/l Na2SO4,
10 mmol/l NaH2PO4 / NaOH pH 5,3
Es wird eine 1 Gew.-%ige Gelatinelösung in Wasser durch 30minütiges Quellen der Gelatine und anschließendes Lösen bei ca. 60 0C hergestellt. Nach Filtra¬ tion durch ein 0,2 μl Einmalfilter werden 30 μl der Gelatinelösung mit 600 μl Fließmittel und 30 μl einer 0,01 Gew.-%igen Benzoesäurelösung gemischt. Die GPC wird mit 20 μl dieser Mischung bei einer Flussrate von 0,5 ml/min und UV- Detektion bei 214 nm durchgeführt.
Die Zuordnung zwischen Elutionsvolumen und Molekulargewicht erfolgt durch Kalibration des Systems mit einer Standardgelatine mit bekannter Molekular¬ gewichtsverteilung. Durch Unterteilung des Chromatogramms in definierte Be¬ reiche und Integration des UV-Detektor-Signals kann der Anteil an Gelatine berechnet werden, der in dem jeweiligen Moiekulargewichtsbereich liegt.
In Figur 1 sind beispielhaft die Gelpermeationschromatogramme zweier unter¬ schiedlicher Gelatinen dargestellt:
Figur IA zeigt das GPC einer handelsüblichen Schweineschwartengelatine (Gelatine Typ A) mit einem Bloom-Wert von 175. Auf Grund des hohen Anteils an Gelatine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa, der bei über 45 Gew.-% liegt, ist diese Gelatine für das erfindungsgemäße Herstellungsver- fahren für Nanopartikel nicht geeignet und führt zu Partikeln mit einer zu ho¬ hen Polydispersität oder zu einer Agglomeration der Partikel.
Figur IB zeigt das GPC einer Schweineschwartengelatine mit einem Bloom- Wert von 310 und einem Anteil an Gelatine mit einem Molekulargewicht unter¬ halb von 65 kDa von ca. 15 Gew.-%. Diese Gelatine eignet sich sehr gut für das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren.
Bestimmung des mittleren Partikeldurchmessers und des Polydispersitätsindex
Die Photonenkorrelationsspektroskopie erlaubt die Bestimmung des mittleren Partikeldurchmessers der Nanopartikel, des Polydispersitätsindex und der Bandbreite des Partikeldurchmessers ober- und unterhalb des Mittelwertes.
Die Messungen wurden mit einem BI-200 SM Goniometer Version 2 (Brook- haven Instruments Corp., Holtsville, NY, USA) durchgeführt. Hierfür wurden Nanopartikel-Suspensionen mit einer Konzentration von 10 bis 50 μg/ml in de- mineralisiertem Wasser eingesetzt.
Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von vernetzten Nanopartikeln aus der Gelatine, deren GPC in Fig. IB dargestellt ist (mit einem Anteil an Gelatine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa von ca. 15 Gew.-%).
300 mg der besagten Gelatine werden in Wasser bei 50 0C gelöst. Nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 2,5 mit Salzsäure wird die Desoivatation der Ge¬ latine durch die tropfenweise Zugabe von 45 ml Aceton durchgeführt. Nach 10-minütigem Rühren werden 40 μl einer 8%igen wässrigen Glutaraldehydlö- sung zugegeben und anschließend weitere 30 min gerührt. Die so vernetzten Nanopartikel werden durch 10-minütige Zentrifugation bei 10.000 g von der Lösung abgetrennt und durch dreimaliges Redispergieren in Aceton/Wasser (30/70) gereinigt. Nach dem letzten Redispergieren wird das Aceton bei 50 0C abgedampft.
Dieses einfache Verfahren führt ohne zusätzliche Trennungsschritte zu erfin¬ dungsgemäßen Nanopartikeln, für die mit dem oben beschriebenen PCS-Ver- fahren ein mittlerer Partikeldurchmesser von ca. 160 nm bei einem Polydisper- sitätsindex von ca. 0,08 ermittelt wurde. Die Verteilung der Nanopartikel nach Größenklassen ist in Figur 3 grafisch dargestellt.
Vergleichsversuche an nicht vernetzten Nanopartikeln haben ergeben, dass der Anteil an niedermolekularer Gelatine in den hergestellten Nanopartikeln dem Anteil im Ausgangsmaterial weitgehend entspricht.
Beispiel 2
Es werden vernetzte Nanopartikel wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, wobei als Ausgangsmaterial eine Schweineschwartengelatine mit einem Bloom-Wert von 270, deren Anteil an Gelatine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa bei ca. 19 Gew.-% liegt, eingesetzt wird.
Für die unmittelbar erhaltenen, erfindungsgemäßen Nanopartikel wurde mit dem oben beschriebenen PCS-Verfahren ein mittlerer Partikeldurchmesser von ca. 173 nm bei einem Polydispersitätsindex von ca. 0,08 ermittelt. Die Größen¬ verteilung war vergleichbar mit den gemäß Beispiel 1 hergestellten Nanoparti¬ keln.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Nanopartikel, im Wesentlichen bestehend aus einem wässrigen Gelatine¬ gel,, wobei der mittlere Durchmesser der Nanopartikel maximal 350 nm beträgt und der Polydispersitätsindex der Nanopartikel kleiner oder gleich 0,15 ist.
2. Nanopartikel nach Anspruch 1, wobei der Polydispersitätsindex der Nano¬ partikel kleiner'oder gleich 0,1 ist.
3. Nanopartikel nach Anspruch 1 oder 2, wobei der mittlere Durchmesser der Nanopartikel maximal 200 nm beträgt.
4. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der mittlere Durchmesser der Nanopartikel maximal 150 nm beträgt.
5. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Bandbreite des Durchmessers der Nanopartikel bei maximal 20 nm ober- und unter¬ halb des Mittelwertes liegt.
6. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Anteil an Ge¬ latine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa, bezogen auf die gesamte in den Nanopartikeln enthaltene Gelatine, maximal 40 Gew.-% beträgt.
7. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Anteil an Ge¬ latine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa, bezogen auf die gesamte in den Nanopartikeln enthaltene Gelatine, maximal 30 Gew.-% beträgt.
8. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Anteil an Ge¬ latine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa, bezogen auf die gesamte in den Nanopartikeln enthaltene Gelatine, maximal 20 Gew.-% beträgt.
9. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die in den Nano¬ partikeln enthaltene Gelatine vernetzt ist.
10. Nanopartikel nach Anspruch 9, wobei die Gelatine mittels Formaldehyd, Dialdehyden, Isocyanaten, Diisocyanaten, Carbodiimiden oder Alkyldiha- logeniden vernetzt ist.
11. Nanopartikel nach Anspruch 9, wobei die Gelatine enzymatisch vernetzt ist.
12. Nanopartikel nach Anspruch 11, wobei die Gelatine mittels Transglutami- nase oder Laccase vernetzt ist.
13. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Wasserge¬ halt der Nanopartikel maximal 15 Gew.-% beträgt.
14. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei an der Oberflä¬ che der Nanopartikel ein pharmazeutischer Wirkstoff gebunden ist.
15. Nanopartikel nach Anspruch 14, wobei die Bindung des pharmazeuti¬ schen Wirkstoffes durch eine chemische Modifikation der Oberfläche der Nanopartikel bewirkt wird.
16. Nanopartikel nach Anspruch 14 oder 15, wobei der pharmazeutische Wirkstoff adsorptiv gebunden ist.
17. Nanopartikel nach Anspruch 14 oder 15, wobei der pharmazeutische Wirkstoff kovalent gebunden ist.
18. Nanopartikel nach Anspruch 14 oder 15, wobei der pharmazeutische Wirkstoff ionisch gebunden ist.
19. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei der pharma¬ zeutische Wirkstoff über einen Spacer gebunden ist.
20. Verwendung von Nanopartikeln nach einem der Ansprüche 1 bis 19 als biologisch abbaubarer Trägerstoff zur Herstellung eines Medikaments.
21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Nanopartikel Teil eines intra¬ zellulären drug-delivery-Systems, insbesondere als Trägerstoff für Nucle- insäuren oder Peptide, sind.
22. Verwendung nach Anspruch 20 oder 21, wobei das Medikament ein Me¬ dikament für die Gentherapie ist.
23. Verfahren zur Herstellung von im Wesentlichen aus einem wässrigen Ge¬ latinegel bestehenden Nanopartikeln, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellen einer wässrigen Geiatinelösung, wobei der Anteil an Ge¬ latine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa, bezogen auf die gesamte Gelatine, maximal 40 Gew.-% beträgt;
b) Einstellen des pH-Wert der Gelatinelösung auf einen Wert unterhalb von 7,0;
c) Ausfällen der Gelatine durch Zugabe eines Fällungsmittels; und
d) Abtrennen der Nanopartikel durch Zentrifugieren.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei in Schritt a) der Anteil an Gelatine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa, bezogen auf die ge¬ samte Gelatine, maximal 30 Gew.-% beträgt.
25. Verfahren nach Anspruch 23, wobei in Schritt a) der Anteil an Gelatine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa, bezogen auf die ge¬ samte Gelatine, maximal 20 Gew.-% beträgt.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei in Schritt b) der pH-Wert auf einen Wert kleiner oder gleich 3,0 eingestellt wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei in Schritt b) der pH-Wert auf einen Wert im Bereich von 1,5 bis 3,0 eingestellt wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27, wobei in Schritt c) das Fällungsmittel Aceton, ein Alkohol oder eine Mischung von beiden, gege¬ benenfalls in wässriger Lösung, ist.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 28, wobei zwischen den Schritten c) und d) ein Schritt
c') Zugabe eines Vernetzungsmittels zu der Gelatinelösung
erfolgt.
30. Verfahren nach Ansspruch 29, wobei das Vernetzungsmittel ausgewählt ist aus Formaldehyd, Dialdehyden, Isocyanaten, Diisocyanaten, Carbo- diimiden oder Alkyldihalogeniden.
31. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Vernetzungsmittel ein Enzym ist.
32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Vernetzungsmittel Laccase oder Transglutaminase ist.
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