DE102010038034A1 - Reinigungsverfahren und Verfahren zum Herstellen von Impfstoff - Google Patents

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Abstract

Angegeben wird ein Verfahren zum Reinigen eines Virus oder eines viralen Antigens aus einer das Virus oder das virale Antigen enthaltenden Probenlösung. Das Verfahren umfasst: Herstellen von gesintertern Hydroxylapatit-Pulver, wobei eine spezifische Oberfläche der Teilchen des gesinterten Pulvers im Bereich von 2,0 bis 11,0 m2/g liegt; Inkontaktbringen der Probenlösung mit dem gesinterten Pulver, um dadurch das Virus oder das virale Antigen an den Teilchen des gesinterten Pulver zu adsorbieren; und Zuführen eines Elutionsmittels zu dem gesinterten Pulver, um dadurch das adsorbierte Virus oder virale Antigen aus den Teilchen des gesinterten Pulvers zu eluieren. Das Verfahren ist in der Lage, das Virus mit einem gleichmäßigen Ausbeuteverhältnis und guter Wiederholbarkeit aus der Probenlösung zu reinigen. Ferner wird ein Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffs des Virus oder des viralen Antigens unter Verwendung des Verfahrens zum Reinigen des Virus oder des viralen Antigens angegeben.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reinigen eines Virus oder eines viralen Antigens aus einer Probenlösung und ein Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffes unter Verwendung eines derartigen Reinigungsverfahrens.
  • TECHNISCHER HINTERGRUND
  • Ein Virus oder ein virales Antigen (nachfolgend als „Viren” bezeichnet) werden aus einer Probenlösung separiert und gereinigt, die eine Kulturlösung mit den Viren und Wirtszellen enthält. Derartige Separations- und Reinigungsprozesse sind wichtige Prozesse auf dem Gebiet der Biogenetik, der klinischen Diagnose und der Herstellung von Impfstoffen.
  • Im Allgemeinen liegen die Viren in der oben beschriebenen Probenlösung nicht alleine vor, sondern die Viren liegen zusammen mit kultivierten Zellen, verunreinigenden Proteinen und dergleichen in der Probenlösung vor. Daher ist es notwendig die Viren aus der Probenlösung zu separieren und zu reinigen.
  • Bisher sind Separations- und Reinigungsprozesse für derartige Viren durch Ultrazentrifugation, Dichtegradientenzentrifugation und dergleichen ausgeführt worden. Diese Verfahren erfordern jedoch nicht nur komplizierte Vorgänge, sondern auch teure und große Apparaturen. Daher waren Arbeiten im Rahmen der Separations- und Reinigungsprozesse sehr kompliziert.
  • Um derartige Probleme zu lösen, ist vorgeschlagen worden, als ein Verfahren zum leichten Separieren und Reinigen von Viren aus einer die Viren enthaltenden Probenlösung in einer kurzen Zeitspanne, ohne die Aktivität der Viren zu reduzieren, gesintertes Pulver von Hydroxylapatit als Adsorptionsmittel in einer Separationsvorrichtung zu verwenden (die JP-A 2000-262280 ist ein Beispiels der verwandten Technik).
  • Bei einem derartigen Verfahren kann jedoch kein gleichmäßiges Ausbeute-(Auffang-)verhältnis der zu reinigenden Viren erreicht werden, und das Adsorptionsmittel hat außerdem keine hohe Lebensdauer. Daher besteht ein Problem darin, dass die Viren nicht mit guter Wiederholbarkeit gereinigt werden.
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Reinigen von Viren aus einer die Viren enthaltenden Probenlösung mit gleichmäßigem Ausbeuteverhältnis und guter Wiederholbarkeit (im Folgenden einfach als ein „Separationsverfahren” bezeichnet) anzugeben. Ferner ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffes unter Verwendung eines derartigen Separationsverfahrens anzugeben.
  • Diese Aufgaben werden durch die vorliegenden Erfindungen (1) bis (7) gelöst, die nachfolgend beschrieben werden.
    • (1) Ein Verfahren zum Reinigen eines Virus oder eines viralen Antigens aus einer das Virus oder das virale Antigen enthaltenden Probenlösung, wobei das Verfahren umfasst: das Herstellen eines gesinterten Pulvers von Hydroxylapatit und von Teilchen enthaltendem gesinterten Pulver, wobei eine spezifische Oberfläche der Teilchen des gesinterten Pulvers im Bereich von 2,0 bis 11,0 m2/g liegt; die Probenlösung mit dem gesinterten Pulver in Kontakt bringen, um dadurch das Virus oder das virale Antigen an den Teilchen des gesinterten Pulvers zu adsorbieren; und Zuführen eines Elutionsmittels zu dem gesinterten Pulver, um dadurch das adsorbierte Virus oder das adsorbierte virale Antigen von den Teilchen des gesinterten Pulvers zu eluieren.
    • Dies ermöglicht es, Viren aus einer die Viren enthaltenden Probenlösung mit einem gleichmäßigen Ausbeuteverhältnis und guter Wiederholbarkeit zu separieren und zu reinigen.
    • Bei dem unter obigem Punkt (1) beschriebenen Verfahren liegt eine Oberflächenporosität der Oberflächen der Teilchen des gesinterten Pulvers im Bereich von 0,1 bis 0,14 μm.
    • Gemäß dem Verfahren ist es möglich, die Viren, die mit dem gesinterten Pulver in Kontakt stehen, selektiv zu adsorbieren, ohne andere Substanzen als die Viren zu adsorbieren. Daher ist es möglich, Viren aus der Probenlösung mit höchster Genauigkeit zu separieren und zu reinigen.
    • Bei dem unter obigem Punkt (1) beschriebenen Verfahren liegt ein Lückengrad in den Oberflächen der Teilchen des gesinterten Pulvers im Bereich von 10 bis 35%.
    • Gemäß dem Verfahren ist es möglich, die Viren, die mit dem gesinterten Pulver in Kontakt stehen, selektiv zu adsorbieren, ohne andere Substanzen als die Viren zu adsorbieren. Daher ist es möglich, Viren aus der Probenlösung mit höchster Genauigkeit zu separieren und zu reinigen.
    • (2) Bei dem unter obigem Punkt (1) beschriebenen Verfahren liegt ein mittlerer Teilchendurchmesser der Teilchen des gesinterten Pulvers im Bereich von 10 bis 100 μm. Gemäß dem Verfahren ist es möglich, ein Verhältnis zu verbessern, mit dem gesintertes Pulver in einen Adsorptionsmittelfüllraum gefüllt wird, der in einer Separationsvorrichtung zum Separieren der Viren vorhanden ist. Daher gibt es viele Gelegenheiten, die Viren mit dem gesinterten Pulver in Kontakt zu bringen, so dass es möglich ist, die Viren verlässlich aus der Probenlösung zu separieren und zu reinigen.
    • (3) Bei dem unter obigem Punkt (1) beschriebenen Verfahren umfasst das Herstellen des gesinterten Pulvers: das Mischen von Rohmaterialien zum Erzeugen einer breiigen Masse, die Primärteilchen des Hydroxylapatit und Aggregate der Primärteilchen enthält; das Trocknen der breiigen Masse, um Sekundärteilchen des Hydroxylapatit zu erzeugen; und das Sintern der Sekundärteilchen des Hydroxylapatit, um das gesinterte Pulver zu erzeugen. Die Verwendung eines derartigen gesinterten Pulvers ermöglicht es, dass eine spezifische Oberfläche desselben mit Leichtigkeit in den oben genannten Bereich fällt.
    • (4) Bei dem unter obigem Punkt (3) beschriebenen Verfahren werden die Sekundärteilchen durch Granulieren der Primärteilchen des Hydroxylapatits und der Aggregate der Primärteilchen erzeugt. Die Verwendung eines derartigen gesinterten Pulvers ermöglicht es, dass eine spezifische Oberfläche desselben mit Leichtigkeit in den oben genannten Bereich fällt.
    • (5) Bei unter obigem Punkt (1) beschriebenen Verfahren ist das Elutionsmittel eine Phosphat-basierte Pufferlösung. Dadurch kann verhindert werden, dass die zu separierenden Viren verändert werden.
    • (6) Bei dem unter obigem Punkt (1) beschriebenen Verfahren umfassen die Viren ein zu der Familie der Flaviviridae gehöriges Virus. Wenn das Virus, das zu einer derartigen Familie gehört, separiert und gereinigt wird, wird vorzugsweise das Separationsverfahren nach vorliegender Erfindung angewendet.
    • (7) Ein Verfahren zum Erzeugen eines Impfstoffes des Virus oder des viralen Antigens unter Verwendung des in (1) beschriebenen Verfahrens zum Reinigen des Virus oder des viralen Antigens.
  • Dadurch ist es möglich, die Viren ohne Reduktion ihres Infektiositätstiters zu reinigen.
  • Gemäß dem Separationsverfahren nach vorliegender Erfindung ist es möglich, Viren aus einer die Viren enthaltenden Probenlösung mit einem gleichmäßigen Ausbeuteverhältnis und guter Wiederholbarkeit zu separieren und zu reinigen. Da die Viren, die durch das Separationsverfahren nach vorliegender Erfindung separiert und gereinigt worden sind, eine gute Bioaktivität behalten, ist es ferner möglich, das Verfahren auf ein Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffs mit exzellenter Sicherheit und Verfügbarkeit anzuwenden.
  • 1 ist eine vertikale Schnittansicht, die ein Beispiel einer Separationsvorrichtung zeigt, die für ein Separationsverfahren nach vorliegender Erfindung zu verwenden ist.
  • 2 zeigt ein Elutionsmuster des Dengue-Virus, das in Beispiel 1 gewonnen wird.
  • 3 zeigt ein Ausbeuteverhältnis des Dengue-Virus, das aufgefangen wird, wenn die Separationsverfahren in Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 wiederholt ausgeführt werden.
  • Nachfolgend werden ein Separationsverfahren und ein Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffs nach vorliegender Erfindung basierend auf einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ausführlich beschrieben.
  • Bevor das Separationsverfahren und das Verfahren zum Herstellen von Impfstoff nach vorliegender Erfindung beschrieben werden, wird zunächst ein Beispiel für eine Separationsvorrichtung (Adsorptionsvorrichtung) beschrieben, die für das Separationsverfahren nach vorliegender Erfindung einzusetzen ist.
  • 1 ist eine vertikale Schnittansicht, die ein Beispiel für eine Separationsvorrichtung zeigt, die für ein Separationsverfahren nach vorliegender Erfindung einzusetzen ist. Es sei darauf hingewiesen, dass bei der folgenden Beschreibung die obere Seite und die untere Seite in 1 als „Zuflussseite” bzw. „Abflussseite” bezeichnet werden.
  • Genauer gesagt bezeichnet Zuflussseite eine Seite, von der aus Flüssigkeiten, wie z. B. eine Probenlösung (d. h. eine Flüssigkeit, die ein Virus oder ein virales Antigen enthält) und eine Elutionsflüssigkeit in die Separationsvorrichtung geleitet werden, um ein Zielvirus oder ein virales Antigen (nachfolgend einfach als „Viren” bezeichnet) zu separieren (zu reinigen), und die Abflussseite bezeichnet eine Seite, die auf der der Zuflussseite abgewandten Seite liegt, d. h. eine Seite, durch die die oben beschriebenen Flüssigkeiten als Abgabeflüssigkeit aus der Separationsvorrichtung abfließen.
  • Die in 1 gezeigte Separationsvorrichtung, die ein Zielvirus (Isolationsmaterial) aus der Probenlösung separiert (isoliert), umfasst eine Säule 2, ein körniges Adsorptionsmaterial (Füllmaterial) 3 und zwei Filterelemente 4 und 5.
  • Die Säule 2 beseht aus einem Säulenhauptkörper 21 und Deckeln 22 und 23, die am Zuflussseitenende bzw. am Abflussseitenende des Säulenhauptkörpers 21 anzubringen sind.
  • Der Säulenhauptkörper 21 ist beispielsweise aus einem zylindrischen Element ausgebildet. Beispiele für ein Material der jeweiligen Teile (Elemente), die die Säule 2 einschließlich des Säulenhauptkörpers 21 bilden, umfassen verschiedene Glasmaterialien, verschiedene Kunstharzmaterialien, verschiedene Metalle und verschiedene keramische Materialien und dergleichen.
  • Eine an der Zuflussseite vorgesehene Öffnung des Säulenhauptkörpers 21 ist mit dem Filterelement 4 abgedeckt, und in diesem Zustand ist der Deckel 22 auf das Zuflussseitenende des Säulenhauptkörpers 21 geschraubt. Entsprechend ist eine an der Abflussseite vorgesehene Öffnung des Säulenhauptkörpers mit dem Filterelement 5 abgedeckt, und in diesem Zustand ist der Deckel 23 auf das Abflussseitenende des Säulenhauptkörpers 21 geschraubt.
  • Die Säule 2 mit der oben beschriebenen Struktur hat einen Adsorptionsmittelfüllraum 20, der durch den Säulenhauptkörper 21 und die Filterelemente 4 und 5 begrenzt ist, und zumindest ein Teil des Adsorptionsmittelfüllraums 20 ist mit dem Adsorptionsmittel 3 gefüllt (bei diesem Ausführungsbeispiel ist nahezu der gesamte Adsorptionsmittelfüllraum 20 mit dem Adsorptionsmittel 3 gefüllt).
  • Das Fassungsvermögen des Adsorptionsmittelfüllraums 20 wird in Abhängigkeit des Volumens einer zu verwendenden Probenlösung passend eingestellt und ist nicht besonders eingeschränkt, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von etwa 0,1 bis 100 mL, und insbesondere im Bereich von etwa 1 bis 50 mL pro 1 mL der Probenlösung.
  • Durch Einstellen der Größe des Adsorptionsmittelfüllraums 20 auf einen Wert innerhalb des obigen Bereichs und durch Einstellen einer Größe des Adsorptionsmittels 3 (das später beschrieben wird) auf einen Wert innerhalb eines später zu beschreibenden Bereichs ist es möglich, ein Zielvirus selektiv aus der Probenlösung zu isolieren (zu reinigen), d. h. das Virus von Fremdstoffen in der Probenlösung, bei denen es sich nicht um die Viren handelt, verlässlich zu separieren.
  • In der Säule 2 ist ferner Flüssigkeitsdichtigkeit zwischen dem Säulenhauptkörper 21 und den Deckeln 22 und 23 durch Anbringen der Deckel 22 und 23 an dem Säulenhauptkörper gewährleistet.
  • Ein Zuflussrohr 24 ist im Wesentlichen in der Mitte des Deckels an dem Deckel 22 flüssigkeitsdicht befestigt, und ein Abflussrohr 25 ist im Wesentlichen in der Mitte des Deckels an dem Deckel 23 ebenfalls flüssigkeitsdicht befestigt. Die oben beschriebene Probenlösung (Flüssigkeit) wird durch das Zuflussrohr 24 und das Filterelement 4 dem Adsorptionsmittel 3 zugeführt. Die dem Adsorptionsmittel 3 zugeführte Probenlösung tritt durch die Lücken zwischen Teilchen des Adsorptionsmittels 3 und fließt dann durch das Filterelement 5 und das Abflussrohr 25 aus der Säule 2 ab. Zu diesem Zeitpunkt werden das Virus und die Fremdstoffe, bei denen es sich nicht um das Virus handelt, in der Probenlösung (Probe) basierend auf einer Differenz zwischen dem Virus und den Fremdstoffen im Adsorptionsgrad bezüglich dem Adsorptionsmittel 3 und einer Differenz zwischen dem Virus und den Fremdstoffen im Affinitätsgrad bezüglich der Elutionsflüssigkeit separiert.
  • Jedes der Filterelemente 4 und 5 hat die Funktion zu verhindern, dass das Adsorptionsmittel 3 aus dem Adsorptionsmittelfüllraum 20 austritt. Ferner besteht jedes der Filterelemente 4 und 5 aus einem Faserstoff bestehend aus einen Kunstharz wie z. B. Polyurethan, Polyvinylalkohol, Polypropylen, Polyether-Polyamid, Polyethylenterephthalat und Polybutylenterephthalat; einem Schaum (eine schwammartigen porösen Körper mit kommunizierenden Poren); einem Gewebe; einem Netz; einem Sinterglasfilter; oder dergleichen.
  • Bei dem Separationsverfahren nach vorliegender Erfindung liegen Merkmale in der Konfiguration des oben beschriebenen Adsorptionsmittels 3. Nachfolgend wird das Adsorptionsmittel 3 ausführlich beschrieben.
  • Bei dem Adsorptionsmittel 3 handelt es sich um gesintertes Pulver von Hydroxylapatit. Eine spezifische Oberfläche des Adsorptionsmittels 3 liegt im Bereich von 2,0 bis 11,0 m2/g.
  • Zum selektiven Separieren und Reinigen des Zielvirus von Proteinen und Fremdstoffen aus den Wirtszellen, die in der Probenlösung enthalten sind, die die Kulturlösung und die Wirtszellen enthält, ist es notwendig, die Viren selektiv an dem Adsorptionsmittel (dem gesinterten Pulver) 3 zu adsorbieren. In dieser Hinsicht ergab sich aus den Studien der vorliegenden Erfinder, dass die spezifische Oberfläche des Adsorptionsmittels (des gesinterten Pulvers) 3 stark in der Adsorption der Viren involviert ist. Mit anderen Worten: Es hat sich ergeben, dass die Viren an dem Adsorptionsmittel 3 selektiv adsorbiert werden können, indem die spezifische Oberfläche desselben auf einen Wert innerhalb eines vorbestimmten Bereichs eingestellt wird. Dies ist der Fall, weil die spezifische Oberfläche die Größe der Fläche bedeutet, an der das Adsorptionsmittel 3 mit den Viren in Kontakt tritt, also eine Gelegenheit für das Adsorptionsmittel 3, mit den Viren in Kontakt zu treten.
  • Die vorliegenden Erfinder haben diese Punkte weiter untersucht, so dass festgestellt wurde, dass die Viren an dem Adsorptionsmittel 3 selektiv adsorbiert werden, indem die spezifische Oberfläche des Adsorptionsmittel 3 auf einen Wert innerhalb des Bereichs von 2,0 bis 11,0 m2/g eingestellt wird. Außerdem wurde festgestellt, dass das Virus aus der die Viren enthaltenden Probenlösung mit einem gleichmäßigen Ausbeute-(Auffang-)verhältnis und guter Wiederholbarkeit separiert und gereinigt wird. Folglich haben die vorliegenden Erfinder die vorliegende Erfindung vollendet.
  • Bei dieser vorliegenden Erfindung wird das gesinterte Pulver von Hydroxylapatit (Ca10(PO4)6(OH)2) durch Sintern von Sekundärteilchen des Hydroxylapatit gewonnen. Die Sekundärteilchen von Hydroxylapatit sind getrocknetes Pulver, das gewonnen wird, indem eine breiige Masse, die Primärteilchen von Hydroxylapatit und Aggregate derselben enthält, getrocknet und granuliert wird. Ein Ca/P-Verhältnis von Hydroxylapatit sollte im Bereich von etwa 1,64 bis 1,70 liegen. Da ein derartiges gesintertes Pulver und Sekundärteilchen von Hydroxylapatit chemisch eine stabile Apatitstruktur aufweisen, kann das gesinterte Pulver, das durch Sintern der Sekundärteilchen erzeugt wird, verlässlich als das Adsorptionsmittel 3 verwendet werden, das bei der Separationsvorrichtung vorgesehen ist.
  • Wenn die Probenlösung, die die Kulturlösung und die Wirtszellen enthält, dem Adsorptionsmittel 3 mit dieser Konfiguration zugeführt wird, adsorbiert das in der Probenlösung enthaltene Virus insbesondere an dem Adsorptionsmittel 3 mit der spezifischen Oberfläche im Bereich von 2,0 bis 11,0 m2/g mit inhärenter Adsorbierbarkeit (Tragevermögen). Das Virus wird von den Fremdstoffen in der Probenlösung, bei denen es sich nicht um die Viren handelt, entsprechend einer Differenz zwischen den Adsorbierbarkeiten des Virus und der Fremdstoffe separiert und gereinigt.
  • Die spezifische Oberfläche des Adsorptionsmittels (gesintertes Pulver von Hydroxylapatit) 3 kann im Bereich von 2,0 bis 11,0 m2/g liegen, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von etwa 6,0 bis 11,0 m2/g. Liegt die spezifische Oberfläche innerhalb des oben genannten Bereichs, können die Viren selektiv an dem Adsorptionsmittel 3 adsorbieren. Daher ist es möglich, die Viren mit hervorragender Genauigkeit aus der Probenlösung zu separieren und zu reinigen. Allgemein gilt: Wenn die spezifische Oberfläche des Adsorptionsmittel 3 groß wird, werden adsorbierte Mengen nicht nur des Virus, sondern auch der Fremdstoffe verbessert. Folglich ist es schwierig, nur das Virus mit der hervorragenden Genauigkeit zu separieren und zu reinigen. Die vorliegende Erfindung jedoch stellt die spezifische Oberfläche des Absorptionsmittels 3, an der die Fremdstoffe kaum adsorbieren, so groß wie möglich ein, während ausreichend Adsorptionsvermögen des Hydroxylapatits bezüglich des Virus vorhanden ist.
  • Ferner liegt die Porosität (mittlere Porengröße) in einer Fläche des Adsorptionsmittels (des gesinterten Pulvers) 3 vorzugsweise im Bereich von etwa 0,1 bis 0,14 μm, insbesondere im Bereich von etwa 0,11 bis 0,14 μm und noch besser im Bereich von etwa 0,12 bis 0,13 μm. Hierzu sei darauf hingewiesen, dass die Porosität (Porengröße) des Adsorptionsmittels 3 eine Flächenform des Adsorptionsmittels anzeigt, nämlich die Unregelmäßigkeit der Fläche des Adsorptionsmittels. Durch Einstellen der Porosität des Adsorptionsmittels 3 auf einen Wert innerhalb des obigen Bereichs, fällt das Virus in Poren, sodass die Elution des Virus spät stattfindet. Dies ermöglicht es, das Virus von verunreinigenden Proteinen, bei denen es sich nicht um das Virus handelt, mit guter Genauigkeit zu separieren. Folglich ist es möglich, das Virus mit noch höherer Genauigkeit aus der Probenlösung zu separieren und zu reinigen.
  • Ferner liegt ein Lückengrad in der Oberfläche des Adsorptionsmittels (des gesinterten Pulvers) 3 vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis 35% und insbesondere im Bereich von etwa 25 bis 35%. Der Lückengrad ist ein weiterer Index, der sich von der Porosität unterscheidet, der die Flächenform des Adsorptionsmittels 3 anzeigt. Durch Einstellen des Lückengrads des Adsorptionsmittels 3 auf einen Wert innerhalb des obigen Bereichs wird die Häufigkeit, mit der das Virus in die Poren fällt, verbessert, wodurch die Elution des Virus verzögert wird. Dies ermöglicht es, das Virus mit exzellenter Genauigkeit aus der Probenlösung zu separieren und zu reinigen. In dieser Hinsicht besteht für den Fall, in dem der Lückengrad den oben genannten oberen Grenzwert überschreitet, eine Gefahr, dass die mechanische Festigkeit des Adsorptionsmittels ungenügend wird.
  • Ferner liegt ein mittlerer Teilchendurchmesser des Adsorptionsmittels 3 vorzugweise im Bereich von etwa 10 bis 100 μm und insbesondere im Bereich von etwa 40 bis 80 μm. Durch Verwenden des gesinterten Pulvers mit einem solchen mittleren Teilchendurchmesser als Adsorptionsmittel 3 ist es möglich, das Verhältnis zu verbessern, mit dem das Adsorptionsmittel 3 in den Adsorptionsmittelfüllraum 20 gefüllt ist. Da so die Möglichkeiten, dass das Virus mit dem Adsorptionsmittel 3 in Kontakt tritt, vermehrt sind, ist es möglich, das Virus verlässlich aus der Probenlösung zu separieren und zu reinigen.
  • Was dies betrifft, so ist die Separationsvorrichtung 1 für den Fall beschrieben, dass nahezu der gesamte Adsorptionsmittelfüllraum 20 mit dem Adsorptionsmittel 3 gefüllt ist, wie im Fall dieses Ausführungsbeispiels. Alternativ kann die Separationsvorrichtung 1 für einen Fall beschrieben sein, in dem der Adsorptionsmittelfüllraum 20 teilweise mit dem Adsorptionsmittel 3 gefüllt sein kann (z. B. kann ein Teil des Adsorptionsmittelfüllraums 20, der auf seiner einen Seite gelegen ist, an der das Zuflussrohr 24 vorgesehen ist, mit dem Adsorptionsmittel 3 gefüllt sein). In diesem Fall kann der übrige Teil des Adsorptionsmittelfüllraums 20 mit einem anderen Adsorptionsmittel gefüllt sein.
  • Das Adsorptionsmittel 3 (das gesinterte Pulver), wie es oben beschrieben ist, kann z. B. durch das folgende Verfahren hergestellt werden.
  • Ein Verfahren zum Herstellen des gesinterten Pulvers gemäß vorliegendem Ausführungsbeispiel umfasst drei Schritte. Ein erster Schritt [S1] ist ein Schritt, bei dem eine Calciumverbindung und eine Phosphatverbindung zur Reaktion gebracht werden, während ein Gemisch aus einer die Calciumverbindung (Calciumquelle), wie z. B. Calciumhydroxid, enthaltenden ersten Flüssigkeit und einer die Phosphatverbindung (Phosphatquelle), wie z. B. Phosphorsäure, enthaltenden zweiten Lösung gerührt wird, um eine breiige Masse zu gewinnen, die Primärteilchen von Hydroxylapatit und Aggregate derselben enthält. Ein zweiter Schritt [S2] ist ein Schritt, bei dem die die Primärteilchen und Aggregate derselben enthaltende breiige Masse getrocknet und granuliert wird, um getrocknetes Pulver zu gewinnen, das aus Sekundärteilchen des Hydroxylapatit als Hauptkomponente besteht. Ein dritter Schritt ist ein Schritt, bei dem das getrocknete Pulver gesintert wird, um gesintertes Pulver zu gewinnen, das aus Hydroxylapatit besteht.
  • Nachstehend folgt eine Beschreibung dieser Schritte der Reihe nach.
  • [S1: Schritt des Herstellens der breiigen Masse die Aggregate von Hydroxylapatit enthält (Erster Schritt)]
  • Zunächst wird eine erste Flüssigkeit zubereitet, die eine Calcium-basierte Verbindung mit Calcium als Calciumquelle enthält.
  • Die Calcium-basierte Verbindung (Calciumquelle) ist nicht speziell auf eine bestimmte Verbindung beschränkt. Zu den Beispielen für die Calcium-basierte Verbindung gehören Calciumhydroxid, Calciumoxid, Calciumnitrat und dergleichen. Diese Verbindungen können einzeln oder in Kombination aus zweien oder mehreren davon eingesetzt werden. Von diesen Verbindungen ist Calciumhydroxid als Calciumquelle besonders bevorzugt. Dies ermöglicht es, Hydroxylapatit mit Verunreinigungen in geringer Menge verlässlich zu gewinnen, der bei diesem Schritt synthetisiert wird. In dieser Hinsicht ist im Folgenden zu beachten, dass eine beispielhafte Beschreibung anhand eines Falles erfolgt, bei dem Calciumhydroxid als Calciumquelle verwendet wird.
  • Eine Lösung und eine Suspension mit Calciumhydroxid als Calciumquelle können als die erste Flüssigkeit eingesetzt werden. Insbesondere wird eine Calciumhydroxid-Suspension, in der das Calciumhydroxid in Wasser suspendiert ist, vorzugsweise verwendet. Wenn Hydroxylapatit unter Verwendung einer derartigen Suspension synthetisiert wird, können feine Primärteilchen des Hydroxylapatit gewonnen werden.
  • Als nächstes wird eine zweite Flüssigkeit (Phosphorsäure enthaltende Flüssigkeit) zubereitet, die Phosphorsäure als Phosphatquelle enthält.
  • Ein Lösungsmittel zum Lösen von Phosphorsäure unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, und es kann jedes beliebige Lösungsmittel verwendet werden, solange es die Reaktion zwischen Calciumhydroxid und Phosphorsäure in diesem Schritt S1 nicht hemmt. Zu den Beispielen für ein derartiges Lösungsmittel gehören Wasser, ein Alkohol wie Methanol und Ethanol und dergleichen. Diese Lösungsmittel können in Kombination aus zweien oder mehreren davon verwendet werden. Wasser jedoch ist von diesen besonders bevorzugt. Wenn Wasser als Lösungsmittel verwendet wird, kann verlässlich verhindert werden, dass die Reaktion zwischen Calciumhydroxid und Phosphorsäure gestört wird.
  • Als nächstes werden die zubereitete erste Flüssigkeit und die zubereitete zweite Flüssigkeit miteinander vermischt, um ein Gemisch zu gewinnen. Dann werden Calciumhydroxid und Phosphorsäure unter Rühren des Gemischs zur Reaktion gebracht, um eine breiige Masse zu gewinnen, die die Primärteilchen des Hydroxylapatit und deren Aggregate enthält.
  • Genauer gesagt, wird die zweite Flüssigkeit in eine Calciumhydroxid enthaltende Dispersionsflüssigkeit (erste Flüssigkeit) getropft, die durch Rühren der ersten Flüssigkeit in einem (nicht dargestellten) Gefäß gewonnen wurde. Durch diese Vorgehensweise werden die erste Flüssigkeit (Dispersionsflüssigkeit) und die zweite Flüssigkeit miteinander gemischt, um ein Gemisch zu erhalten. Danach wird Calciumhydroxid mit Phosphorsäure in dem Gemisch zur Reaktion gebracht, um die breiige Masse zu gewinnen, die die Primärteilchen des Hydroxylapatits und deren Aggregate enthält.
  • Bei diesem Verfahren wird ein Nass-Syntheseverfahren eingesetzt, das Phosphorsäure als eine wässrige Lösung wie oben beschrieben verwendet. Dies ermöglicht es, Hydroxylapatit (synthetisches Material) effizient und leicht zu synthetisieren, ohne eine teure Produktionseinrichtung einzusetzen. Bei der Reaktion zwischen Calciumhydroxid und Phosphorsäure wird außer Hydroxylapatit nur Wasser erzeugt. Daher verbleiben keine Nebenprodukte in den erzeugten Sekundärteilchen (dem getrockneten Pulver) und in dem erzeugten gesinterten Pulver. Da diese Reaktion eine Säure-Base-Reaktion ist, besteht außerdem ein Vorteil darin, dass diese Reaktion durch Einstellen des pH-Wertes einer Calciumhydroxid-Dispersionsflüssigkeit und einer wässrigen Phosphorsäurelösung leicht gesteuert werden kann.
  • Durch Durchführen dieser Reaktion unter Rühren ist es ferner möglich, die Reaktion zwischen Calciumhydroxid und Phosphorsäure effizient auszuführen. Mit anderen Worten: Die Effizienz der Reaktion zwischen diesen Substanzen kann verbessert werden.
  • Ferner ist die Leistung, mit der das die erste und die zweite Flüssigkeit enthaltende Gemisch gerührt wird, (Rührleistung) nicht speziell auf eine besondere Leistung beschränkt, sondern liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 0,75 bis 2,0 W und insbesondere im Bereich von etwa 0,925 bis 1,85 W pro 1 Liter des Gemischs (der breiigen Masse). Durch Festsetzen der Rührleistung auf einen Wert innerhalb des vorstehenden Bereichs ist es möglich, die Effizienz der Reaktion zwischen Calciumhydroxid und Phosphorsäure weiter zu verbessern.
  • Der Gehalt von Calciumhydroxid in der ersten Flüssigkeit liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 5 bis 15 Gew.-% und insbesondere im Bereich von etwa 10 bis 12 Gew.-%. Der Gehalt von Phosphorsäure in der zweiten Flüssigkeit liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis 25 Gew.-% und insbesondere im Bereich von etwa 15 bis 20 Gew.-%. Durch Festsetzen des jeweiligen Gehalts von Calciumhydroxid und Phosphorsäure auf einen Wert innerhalb des vorstehenden Bereichs ist es möglich, Calciumhydroxid und Phosphorsäure effizient zu reagieren. Folglich ist es möglich, Hydroxylapatit zuverlässig zu synthetisieren. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Gelegenheit eines Kontakts zwischen Calciumhydroxid und Phosphorsäure sich erhöht, wenn die zweite Flüssigkeit in die zweite Flüssigkeit getropft wird, während diese gerührt wird.
  • Eine Geschwindigkeit, mit der die zweite Flüssigkeit in die erste Flüssigkeit getropft wird, liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 1 bis 40 L/h und insbesondere im Bereich von etwa 3 bis 30 L/h. Durch Mischen (Zugeben) der zweiten Flüssigkeit mit (zu) der ersten Flüssigkeit mit einer derartigen Tropfgeschwindigkeit ist es möglich, Calciumhydroxid mit Phosphorsäure unter schonenderen Bedingungen zu reagieren.
  • In diesem Fall wird die zweite Flüssigkeit vorzugsweise über eine Zeitspanne von etwa 5 bis 32 Stunden in die (zu der) erste(n) Flüssigkeit getropft (zugegeben), und insbesondere über eine Zeitspanne von etwa 6 bis 32 Stunden. Durch Tropfen der zweiten Flüssigkeit in die erste Flüssigkeit in einer derartigen Zeitspanne zum Reagieren von Calciumhydroxid mit Phosphorsäure ist es möglich, Hydroxylapatit ausreichend zu synthetisieren. Es sei darauf hingewiesen, dass selbst wenn die Zeit zum Tropfen der zweiten Flüssigkeit in die erste Flüssigkeit so verlängert wird, dass sie den oberen Grenzwert übersteigt, nicht zu erwarten ist, dass die Reaktion zwischen Calciumhydroxid und Phosphorsäure weiter fortschreitet.
  • Wenn die Reaktion zwischen Calciumhydroxid und Phosphorsäure allmählich fortschreitet, werden die Primärteilchen von Hydroxylapatit (synthetisches Material) in der breiigen Masse erzeugt (nachfolgend einfach als „Primärteilchen” bezeichnet). Eine chemische Struktur derartiger Primärteilchen umfasst positiv geladene Teile und negativ geladene Teile. Daher werden Van-der-Waals-Kräfte (intermolekulare Kräfte) zwischen den positiv geladenen Teilen in der chemischen Struktur eines Primärteilchens der Primärteilchen und den negativ geladenen Teilchen in der chemischen Struktur des anderen Primärteilchens der Primärteilchen hergestellt. Durch diese Van-der-Waals-Kräfte binden sich das eine Primärteilchen und das andere Primärteilchen aneinander, um eine Vorform eines Aggregats zu bilden. In der breiigen Masse werden dann die Vorformen der Aggregate agglutiniert, um Aggregate von Hydroxylapatit (synthetisches Material) zu gewinnen (nachfolgend einfach als „Aggregate” bezeichnet). Durch die Aggregate nimmt die Viskosität der breiigen Masse allmählich zu.
  • [S2: Schritt des Herstellens von Sekundärteilchen von Hydroxylapatit durch Trocknen der breiigen Masse (Zweiter Schritt)]
  • Bei diesem zweiten Schritt wird durch Trocknen der breiigen Masse, die die in Schritt [S1] erzeugten Primärteilchen von Hydroxylapatit und die Aggregate derselben enthält, und durch Granulieren derselben getrocknetes Pulver erzeugt, das aus den Sekundärteilchen von Hydroxylapatit als Hauptkomponente besteht.
  • Ein Verfahren zum Trocknen der breiigen Masse ist nicht speziell auf ein besonderes Verfahren beschränkt, jedoch wird vorzugsweise in Sprühtrockenverfahren eingesetzt. Gemäß einem derartigen Verfahren werden die Primärteilchen von Hydroxylapatit und ihre Aggregate granuliert, sodass es möglich ist, Pulver mit einem vorgegebenen Teilchendurchmesser in kurzer Zeit zu erhalten.
  • Ferner liegt eine Trockentemperatur der breiigen Masse vorzugsweise im Bereich von etwa 75 bis 250°C und insbesondere im Bereich von etwa 95 bis 220°C. Durch Einstellen der Trockentemperatur auf einen Wert innerhalb des obigen Bereichs ist es möglich, die Sekundärteilchen (getrocknetes Pulver) mit einer gleichmäßigen Teilchengröße zuverlässig zu erzeugen.
  • [S3: Schritt des Sinterns der Sekundärteilchen, um gesintertes Pulver von Hydroxylapatit zu gewinnen (Dritter Schritt)]
  • Bei diesem dritten Schritt wird durch Sintern des getrockneten Pulvers des in Schritt [S2] erzeugten Hydroxylapatits gesintertes Pulver erzeugt, dessen Hauptkomponente Hydroxylapatit ist. Die Teilchen-Druckfestigkeit (Bruchfestigkeit) eines derartigen gesinterten Pulvers ist besser als die des getrockneten Pulvers.
  • In diesem Fall liegt eine Sintertemperatur des Pulvers vorzugsweise im Bereich von etwa 800 bis 1100°C und insbesondere im Bereich von etwa 900 bis 1000°C.
  • In dieser Hinsicht ist das Verfahren zum Herstellen des gesinterten Pulver nach vorliegender Erfindung besonders geeignet zum Herstellen von gesinterten Pulver mit einem Soll-Teilchendurchmesser im Bereich von 10 bis 100 μm.
  • Durch Ausführen der Schritte wie oben beschrieben ist es möglich, das gesinterte Pulver von Hydroxylapatit zu erzeugen. Hierbei liegt die spezifische Oberfläche des Adsorptionsmittels (des gesinterten Pulvers) 3, das für das Reinigungsverfahren nach vorliegender Erfindung eingesetzt wird, im Bereich von 2,0 bis 11,0 m2/g, wie oben beschrieben. Bei dem oben beschriebenen Verfahren zum Herstellen des gesinterten Pulvers kann die spezifische Oberfläche des Adsorptionsmittels 3 leicht auf einen Wert innerhalb des obigen Bereichs eingestellt werden, indem die Sintertemperatur in Schritt [S3], die Dispergierbarkeiten der Primärteilchen und ihrer Aggregate in Schritt [S1] (ihre Teilchenverteilung) und dergleichen geeignet eingestellt werden.
  • Ferner liegt die Porosität des Adsorptionsmittels (des gesinterten Pulvers) 3 vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 0,14 μm, und sein Lückengrad liegt vorzugsweise im Bereich von 10 bis 35%. Bei denn oben beschriebenen Verfahren zum Herstellen des gesinterten Pulvers können sowohl Porosität als auch Lückengrad des Adsorptionsmittels 3 leicht auf einen Wert innerhalb des obigen Bereich eingestellt werden, indem die Sintertemperatur in Schritt [S3], die Dispergierbarkeiten der Primärteilchen und ihrer Aggregate in Schritt [S1] (ihre Teilchenverteilung), die Trockentemperatur in Schritt [S2] und dergleichen geeignet festgesetzt werden.
  • Hierbei kann das Einstellen der Dispergierbarkeiten (Teilchenverteilung) der Primärteilchen und ihrer Aggregate in Schritt [S1] durchgeführt werden, indem z. B. eine Leistung, mit der das Gemisch aus der ersten und der zweiten Flüssigkeit gerührt wird, und eine Temperatur des Gemischs geeignet festgesetzt werden. Alternativ kann das Einstellen auch dadurch durchgeführt werden, dass die erzeugten Aggregate der Primärteilchen physikalisch pulversiert werden und die pulverisierten Aggregate dann in die breiige Masse dispergiert werden.
  • Ein Verfahren zum physikalischen Pulverisieren der Aggregate der Primärteilchen von Hydroxylapatit ist ferner nicht besonders auf ein spezielles Verfahren beschränkt. Zu den Beispielen für das Verfahren gehören: ein nasses Strahlmühlenverfahren, bei dem Tropfen der gesprühten breiigen Masse unter einen hohen Druck zerkleinert werden; ein Kugelmühlenverfahren, bei dem die breiige Masse und Kugeln aus Keramik, wie z. B. Zirkoniumoxid, in einen geschlossenen Behälter gebracht werden und der geschlossene Behälter gedreht wird, und dergleichen.
  • Nachfolgend wird ein Verfahren zum Reinigen eines Virus oder eines viralen Antigens unter Verwendung der Separationsvorrichtung 1 wie oben beschrieben (d. h. das Reinigungsverfahren nach vorliegender Erfindung) beschrieben.
  • (1) Zubereitungsschritt
  • Zunächst wird eine Probenlösung zubereitet, die eine Kulturlösung und Wirtszellen enthält.
  • Hier werden Viren gewonnen, indem man sie in einer Kulturzelle neben einer tierischen Säuger-Gehirnzelle und einer tierischen Säuger-Nervenzelle und einem Hühnerei wachsen lässt. Daher wird als die die Viren enthaltende Probenlösung eine solche verwendet, die die Kulturlösung, in der sie wachsen konnten, und die Wirtszellen enthält.
  • Die Viren sind nicht besonders auf ein spezielles Virus beschränkt, sondern umfassen Viren mit Hüllen, ohne Hülle und dergleichen. Zu den Beispielen für eine Virenfamilie mit Hülle zählen: Flaviviridae, zu denen das Dengue-Virus und das Japanische-Enzephalitis-Virus gehören; Orthomyxoviridae, zu denen das Influenzavirus gehört; Togaviridae, zu denen das Röteln-Virus gehört; Paramyxoviridae, zu denen das Masernvirus und das Mumpsvirus gehören. Zu den Beispielen für eine Virenfamilie ohne Hülle zählen: Papillomaviridae, zu denen das Papilloma-Virus gehört; Reoviridae, zu denen das Reovirus und das Rotavirus gehören. Von diesen Viren ist eines, das zu den Flaviviridae gehört, vorzuziehen. Ein Durchmesser (eine Größe) des Dengue-Virus und des Japanische-Enzephalitis-Virus, die zu den Flaviviridae gehören, liegt im Bereich von etwa 40 bis 50 nm. Wenn das Virus mit einer derartigen Größe, separiert und gereinigt wird, ist es möglich, das Virus und andere Fremdstoffe in der Probenlösung unter Verwendung des oben beschriebenen Adsorptionsmittels 3 mit höherer Genauigkeit zuverlässig zu separieren.
  • Zu den Beispielen für das virale Antigen zählen: solche, die keine Toxizität oder geringere Toxizität als ein Virus aufweisen; solche, bei denen Antigenität aufweisende Teile selektiv von Viren abgetrennt wurden; und dergleichen.
  • (2) Zuführschritt (Erster Schritt)
  • Dann wird die zubereitete Probenlösung durch das Zuflussrohr 24 und das Filterelement 4 dem Adsorptionsmittel 3 so zugeführt, dass es mit dem Adsorptionsmittel 3 in Kontakt steht und durch die Säule 2 (die Separationsvorrichtung 1) tritt.
  • Daher werden die Viren, die eine hohe Adsorptionsfähigkeit gegenüber dem Adsorptionsmittel 3 haben, und solche Fremdstoffe, die von den Fremdstoffen, bei denen es sich nicht um die Viren handelt, die relativ hohe Adsorptionsfähigkeit gegenüber dem Adsorptionsmittel 3 haben, an dem Adsorptionsmittel 3 in der Säule 2 getragen. Die Fremdstoffe, die eine geringe Adsorptionsfähigkeit gegenüber dem Adsorptionsmittel 3 haben, werden durch das Filterelement 25 und das Abflussrohr 25 aus der Säule abgelassen.
  • (3) Fraktionierschritt (Zweiter Schritt)
  • Dann wird ein Phosphat-Elutionspuffer als Elutionsmittel durch das Zuflussrohr 42 und das Filterelement 4 in die Säule 2 zugeführt, um die adsorbierten Viren zu eluieren.
  • Danach wird das durch das Abflussrohr 25 und das Filterelement 5 aus der Säule 2 abgegebene Eluat fraktioniert (aufgefangen), um Fraktionen mit einer vorgegebenen Menge des Eluats zu gewinnen. Auf diese Weise werden die Viren, die an dem Adsorptionsmittel 3 adsorbiert sind, und andere Fremdstoffe in dem Zustand, in dem sie eluiert sind, in Abhängigkeit der Differenz zwischen der Adsorbierbarkeit der Viren gegenüber dem Adsorptionsmittel 3 und der Adsorbierbarkeit ihrer Fremdstoffe gegenüber dem Adsorptionsmittel 3 in die Fraktionen aufgefangen (voneinander separiert),.
  • Zu den Beispielen für den Phosphat-Elutionspuffer gehören Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Lithiumphosphat und dergleichen.
  • Der pH-Wert des Phosphat-Elutionspuffers ist nicht besonders eingeschränkt, liegt jedoch vorzugsweise in einem neutralen Gereicht, konkret liegt er vorzugsweise im Bereich von etwa 6 bis 8 und insbesondere im Bereich von etwa 6,5 bis 7,5. Dadurch kann verhindert werden, dass das zu separierende Virus verändert wird, wodurch verhindert wird, dass die biologische Aktivität des Virus nachlässt. Ferner kann auch zuverlässig verhindert werden, dass das Adsorptionsmittel 3 verändert wird, sodass auch verhindert wird, dass die Separationsfähigkeit der Separationsvorrichtung 1 verändert wird.
  • Daher ist es durch Verwenden des Phosphat-Elutionspuffers, dessen pH-Wert innerhalb der obigen Bereiche liegt, möglich, ein Ausbeuteverhältnis eines Zielvirus zu verbessern.
  • Außerdem beträgt die Salzkonzentration des Phosphat-Elutionspuffers vorzugsweise etwa 600 mM. Durch die Separation des Virus unter Verwendung des Phosphat-Elutionspuffers mit einer derartigen Salzkonzentration kann verhindert werden, dass sich das Vorhandensein von Metallionen in dem Phosphat-Elutionspuffer nachteilig auf das Virus auswirkt.
  • Insbesondere liegt die Salzkonzentration des Phosphat-Elutionspuffers vorzugsweise im Bereich von 1 bis 600 mM. Ferner wird die Salzkonzentration des Phosphat-Elutionspuffers vorzugsweise kontinuierlich oder schrittweise beim Separieren des Virus geändert.
  • Dadurch kann die Separationsoperation des Virus effizient verbessert werden.
  • Die Strömungsgeschwindigkeit, mit der der Phosphat-Elutionspuffer in den Adsorptionsmittelfüllraum 20 strömt, liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 0,1 bis 10 mL/min, und insbesondere im Bereich von etwa 1 bis 5 mL/min. Durch Separieren des Virus mit einer derartigen Strömungsgeschwindigkeit ist es möglich, ein Zielvirus zuverlässig aus der Probenlösung zu separieren, ohne dass lange Zeit für die Separationsoperation benötigt wird. Das heißt, es ist möglich, das Virus mit hoher Reinheit zu gewinnen. Durch die oben beschriebenen Operationen wird das Virus in eine vorgegebene Fraktion aufgefangen.
  • Weiterhin wird das Zielvirus unter Anwendung des Reinigungsverfahren nach vorliegender Erfindung gereinigt (Reinigungsschritt), und danach kann ein Impfstoff hergestellt werden, indem das gereinigte Virus inaktiviert wird (Inaktivierungsschritt). Gemäß einem derartigen Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffs ist es möglich, das Risiko der Verunreinigung aufgrund anderer Mikroben stark zu reduzieren, da das Virus mit hoher Reinheit gereinigt wird. Folglich ist es möglich, einen Impfstoff mit hoher Sicherheit herzustellen.
  • Bei diesem Inaktivierungsschritt können verschiedene Arten von Verfahren als Verfahren zum Inaktivieren des Virus eingesetzt werden, was jedoch auf der Art von herzustellendem Impfstoff abhängt.
  • Zwar wurden das Reinigungsverfahren und das Verfahren zum Herstellen des Impfstoffes nach vorliegender Erfindung vorstehend beschrieben, doch ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt.
  • Beispielsweise kann das Reinigungsverfahren nach vorliegender Erfindung ferner für beliebige Zwecke einen Vorschritt vor Schritt [S1], einen Zwischenschritt zwischen Schritt [S1] und Schritt [S2] oder zwischen Schritt [S2] und Schritt [S3] und einen Folge-Schritt nach Schritt [S3] enthalten.
  • Beispiele
  • Nun wird die Erfindung unter Bezugnahme auf spezielle Beispiele beschrieben.
  • 1. Reinigung des Dengue-Virus
  • (Beispiel 1)
    • -1- Zunächst wurde eine Probenlösung wie folgt zubereitet: Man ließ das Dengue-Virus mit einer C6/36-Zelle von einer Mücke wachsen, um einen Kulturüberstand zu gewinnen, und danach wurde der Kulturüberstand extrahiert. Der extrahierte Kulturüberstand wurde durch einen Filter mit einer Filtergröße von 0,22 μm gefiltert, um die Probenlösung zu gewinnen.
    • -2- Dann wurden 10 mL der Probenlösung (Probe) in eine Separationsvorrichtung geleitet (eingebracht), um das Virus und die Fremdstoffe an einem Adsorptionsmittel zu adsorbieren. Dann wurden ein Elutionsmittel A und ein Elutionsmittel B mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 15 Minuten in die Separationsvorrichtung so eingebracht, dass ein Mengenverhältnis des Elutionsmittels B im Bereich von 0 bis 100% kontinuierlich verändert wurde. Danach wurde das Elutionsmittel B mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min in die Separationsvorrichtung eingebracht. Dann wurde ein das Virus und die Fremdstoffe enthaltendes Eluat aus der Säule abgegeben. Das abgegebene Eluat wurde in Fraktionen einer Fraktionszahl 1 bis 10 von 2 mL und in Fraktionen der Fraktionszahl 11 bis 30 von 1 mL fraktioniert.
  • Als Ergebnis konnte das in der Probenlösung enthaltene Dengue-Virus von den Fremdstoffen separiert werden, wie in 2 gezeigt ist. Insbesondere konnte das Dengue-Virus von den Fremdstoffen separiert werden, die in den Fraktionen vor 20 Minuten der Retentionszeit in 2 abgegeben wurden, und von den Fremdstoffen mit geringer Adsorbierbarkeit, die in den Fraktionen ab 20 Minuten der Retentionszeit in 2 abgegeben wurden. Das heißt, das Dengue-Virus konnte in den Fraktionen aufgefangen (gereinigt) werden, die das Eluat enthalten, das nach etwa 30 Minuten der Retentionszeit abgegeben wurde.
  • Es sei darauf hingewiesen, dass ein 10 mM-Phosphat-Elutionspuffer (pH-Wert 7,2) als Elutionsmittel A verwendet wurde und ein 600 mM-Phosphat-Elutionspuffer (pH-Wert 7,2) als Elutionsmittel B verwendet wurde.
  • In dieser Hinsicht sei darauf hingewiesen, dass eine Säule (Größe 4,6 mm × 35 mm), bei der etwa 0,6 g Hydroxylapatitkügelchen (gesintertes Pulver mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 40 μm), die wie unten beschrieben erzeugt wurden, als Adsorptionsmittel in den Adsorptionsfüllmittelraum gefüllt waren, in der Separationsvorrichtung benutzt wurde.
    • -2A- Zunächst wurde Calciumhydroxid in reinem Wasser suspendiert, um eine Calciumhydroxidsuspension zu erhalten, und dann wurde eine wässrige Phosphorsäurelösung in die Calciumhydroxidsuspension getropft, um ein Gemisch zu erzeugen. Das Gemisch wurde mit einer Rührleistung von 1 kW bei einer Temperatur von 30°C für 24 Stunden gerührt. Auf diese Weise wurden 500 L einer breiigen Masse erzeugt, die 10 Gew.-% an Primärteilchen von Hydroxylapatit enthielt. Es sei darauf hingewiesen, dass eine Pulver-Röntgendiffraktometrie ergab, dass es sich bei dem so gewonnenen Synthesematerial um Hydroxylapatit handelte.
    • -2B- Dann wurde die die Hydroxylapatit-Primärteilchen enthaltende breiige Masse unter Verwendung eines Sprühtrockners (hergestellt von OHKAWAEA KAKOHIKI Co., Ltd. unter dem Handelsnamen „OC-20”) bei 150°C sprühgetrocknet, um dadurch partikelförmiges getrocknetes Pulver zu gewinnen.
    • -2C- Außerdem wurden Teile des getrockneten Pulvers klassifiziert, um Teilchen mit einem mittleren Teilchendurchmesser von etwa 40 μm zu erhalten. Danach wurden die Teilchen in einem Elektroofen bei einer Temperatur von 950°C für 4 Stunden gesintert, um gesintertes Pulver zu erzeugen.
  • Hierbei betrugen der mittlere Teilchendurchmesser, die spezifische Oberfläche, die Porosität und der Lückengrad von Teilchen des so gewonnenen gesinterten Pulvers von Hydroxylapatit etwa 40 μm, 6,6 m2/g, 0,13 μm bzw. 32%.
  • (Beispiele 2 bis 5 und Vergleichsbeispiele 1 und 2)
  • Ein in einer Probenlösung enthaltenes Dengue-Virus wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 aufgefangen (separiert und/oder gereinigt), außer dass gesintertes Pulver, das unter den in Tabelle 1 gezeigten Bedingungen hergestellt war, als das gesinterte Hydroxylapatit-Pulver eingesetzt wurde, das als Adsorptionsmittel benutzt wurde.
  • Hierbei wurden die Reinigungen des Dengue-Virus in Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 fünf Mal bzw. acht Mal wiederholt durchgeführt, wobei jeweils die gleiche Separationsvorrichtung verwendet wurde.
  • Figure 00310001
  • 2. Auswertung
  • 2-1. Ausbeuteverhältnis (Reinigungsverhältnis) des Dengue-Virus
  • Bei jedem der Beispiele 1 bis 5 und der Vergleichsbeispiele 1 und 2 wurde das Dengue-Virus, das in den Fraktionen enthalten war, in die das Eluat nach etwa 30 Minuten der Retentionszeit aus der Säule abgeben wurde, einem Hämagglutionations-Test (HA-Test) unterzogen, um ein Ausbeuteverhältnis des Dengue-Virus zu erhalten.
  • Das so gewonnene Ausbeuteverhältnis des Dengue-Virus in jedem der Beispiele 1 bis 5 und der Vergleichsbeispiele 1 und 2 ist in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
    Gesintertes Pulver Ausbeuteverhältnis [%]
    Mittlerer Teilchendurchmesser [μm] Spezifische Oberfläche [m2/g] Porosität [μm] Lückengrad [%]
    Bsp. 1 40 6,6 0,13 32 94
    Bsp. 2 40 3,3 0,14 19 78
    Bsp. 3 40 10,5 0,12 35 90
    Bsp. 4 40 7,5 0,09 30 60
    Bsp. 5 40 6,1 0,16 35 60
    Vergl.Bsp. 1 40 21,0 0,1 50 50
    Vergl.Bsp. 2 40 1,2 0,14 8 59
  • Wenn das Dengue-Virus durch das Reinigungsverfahren in jedem der Beispiele gereinigt wurde, d. h. wenn das Dengue-Virus unter Verwendung des gesinterten Hydroxylapatit-Pulvers mit der spezifischen Oberfläche im Bereich von 2,0 bis 11,0 m2/g als das in der Separationsvorrichtung vorgesehene Adsorptionsmittel gereinigt wurde, betrug das Ausbeuteverhältnis des Dengue-Virus 60% oder darüber, wie in Tabelle 2 gezeigt. Dies zeigt, dass das Dengue-Virus mit einem exzellenten Ausbeuteverhältnis gereinigt werden konnte. Ferner betrug bei jedem der Beispiele 1 bis 3 die Porosität des gesinterten Pulvers 0,12 bis 0,14 μm, was ein noch besseres Ausbeuteverhältnis des Dengue-Virus ergab.
  • Im Gegensatz dazu lag das Ausbeuteverhältnis des Dengue-Virus bei jedem der Vergleichsbeispiele 1 und 2 unter 60%. Der Grund dafür war, dass die spezifische Oberfläche des gesinterten Hydroxylapatit-Pulvers nicht in dem Bereich von 2,0 bis 11,0 m2/g lag.
  • 2-2. Wiederholbarkeit des Ausbeuteverhältnisses des Dengue-Virus
  • Die Reinigungen des Dengue-Virus in Beispiel 1 und in Vergleichsbeispiel 1 wurden fünf Mal bzw. acht Mal wiederholt durchgeführt. Bei dem so gewonnenen Dengue-Virus in den Fraktionen, in die das Eluat nach etwa 30 Minuten der Retentionszeit aus der Säule abgegeben wurde, wurde das Ausbeuteverhältnis des Dengue-Virus unter Anwendung des gleichen Verfahrens, wie es bei 2-1 beschrieben wurde, gewonnen.
  • Die Ausbeuteverhältnisse des so gewonnenen Dengue-Virus in Beispiel 1 und in Vergleichsbeispiel 1 sind für jedes Mal in 3 dargestellt.
  • Wie in 3 dargestellt, wurde bei dem Reinigungsverfahren des Beispiels 1 das Dengue-Virus wiederholt gereinigt, wobei jeweils die gleiche Separationsvorrichtung verwendet wurde. Es ergab sich keine große Differenz zwischen den Ausbeuteverhältnisses des Dengue-Virus in allen Durchgängen. Dies zeigt, dass das Dengue-Virus mit einem gleichmäßigen Ausbeuteverhältnis und guter Wiederholbarkeit aufgefangen werden konnte.
  • Bei dem Reinigungsverfahren des Vergleichsbeispiels 1 dagegen, wurde das Dengue-Virus wiederholt unter Verwendung der jeweils gleichen Separationsvorrichtung gereinigt. Als Ergebnis neigte das Ausbeuteverhältnis des Dengue-Virus jedes Mal dazu zu sinken. Dies zeigt, dass es nicht möglich war, das Dengue-Virus mit guter Wiederholbarkeit aufzufangen.
  • Sofern nicht anders angegeben, umfasst eine Bezugnahme auf eine Verbindung oder einen Bestandteil sowohl die Verbindung oder den Bestandteil selbst als auch in Kombination mit anderen Verbindungen oder Bestandteilen wie Gemischen von Verbindungen.
  • Die Singularformen „ein”, „eine” und „der”, „die”, „das”, wie sie hier verwendet werden, umfassen auch die Pluralformen, sofern aus dem Kontext nicht eindeutig etwas anderes hervorgeht.
  • Sofern nicht anders angegeben, sind alle in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendeten Zahlen, Mengen von Bestandteilen, Reaktionsbedingungen etc. in allen Fällen so zu verstehen, dass sie durch den Begriff „etwa” modifiziert sind. Sofern nichts Gegenteiliges angegeben ist, sind demzufolge die in der folgenden Spezifizierung und den angehängten Ansprüchen angegebenen numerischen Parameter Approximationen, die abhängig von den gewünschten Eigenschaften, die durch die vorliegende Erfindung erhalten werden sollen, variieren können. Schließlich sollte jeder numerische Parameter im Hinblick auf die Zahl signifikanter Stellen und im Hinblick auf die üblichen Rundungskonventionen ausgelegt werden, wobei dies nicht als Versuch anzusehen ist, die Anwendung der Äquivalenzlehre auf den Schutzbereich der Ansprüche zu beschränken.
  • Zusätzlich gilt die Angabe von numerischen Bereichen in dieser Beschreibung als Offenbarung aller Zahlenwerte und Bereiche innerhalb dieses Bereichs. Wenn zum Beispiel ein Bereich von etwa 1 bis etwa 50 reicht, dann soll er zum Beispiel 1, 7, 34, 46.1, 23.7 oder jeden anderen Wert oder Bereich innerhalb des Bereichs umfassen.
  • Ferner sei auch darauf hingewiesen, dass die vorliegende Erfindung mit Gegenständen in Zusammenhang steht, die in den japanischen Patentanmeldungen Nr. 2009-233759 (eingereicht am 7. Oktober 2009) und Nr. 2010-153160 (eingereicht am 5. Juli 2010) enthalten sind, die hier durch Querverweis ausdrücklich in ihrer Gesamtheit eingeschlossen sind.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • JP 2000-262280 A [0005]
    • JP 2009-233759 [0105]
    • JP 2010-153160 [0105]

Claims (7)

  1. Verfahren zum Reinigen eines Virus oder eines viralen Antigens aus einer das Virus oder das virale Antigen enthaltenden Probenlösung, wobei das Verfahren umfasst: Herstellen von gesintertem Hydroxylapatit-Pulver und von Teilchen enthaltendem gesinterten Pulver, wobei eine spezifische Oberfläche der Teilchen des gesinterten Pulvers im Bereich von 2,0 bis 11,0 m2/g liegt; Inkontaktbringen der Probenlösung mit dem gesinterten Pulver, um dadurch das Virus oder das virale Antigen an den Teilchen des gesinterten Pulver zu adsorbieren; und Zuführen eines Elutionsmittels zu dem gesinterten Pulver, um dadurch das adsorbierte Virus oder virale Antigen aus den Teilchen des gesinterten Pulvers zu eluieren.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem ein mittlerer Teilchendurchmesser der Teilchen des gesinterten Pulvers im Bereich von 10 bis 100 μm liegt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Herstellen von gesintertem Pulver umfasst: Mischen von Rohmaterialien zum Erzeugen einer breiigen Masse, die Primärteilchen des Hydroxylapatits und Aggregate der Primärteilchen enthält; Trocknen der breiigen Masse, um Sekundärteilchen des Hydroxylapatits zu gewinnen; und Sintern der Sekundärteilchen des Hydroxylapatits, um das gesinterte Pulver zu gewinnen.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Sekundärteilchen durch Granulieren der Primärteilchen des Hydroxylapatits und der Aggregate der Primärteilchen erzeugt werden.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Elutionsmittel eine Phoshpat-basierte Pufferlösung ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Viren ein zu den Flaviviridae gehörendes Virus umfassen.
  7. Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffs des Virus oder des viralen Antigens unter Verwendung des in Anspruch 1 definierten Verfahrens zum Reinigen des Virus oder des viralen Antigens.
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