DE102009010194A1

DE102009010194A1 - Separationsverfahren

Info

Publication number: DE102009010194A1
Application number: DE102009010194A
Authority: DE
Inventors: Ken Sugo; Tomohiko Yoshitake; Tsuneo Yokohama Okuyama
Original assignee: Okuyama Tsuneo Yokohama-shi; Hoya Corp
Current assignee: Okuyama Tsuneo Yokohama-shi; Hoya Corp
Priority date: 2008-02-22
Filing date: 2009-02-23
Publication date: 2009-09-17
Also published as: FR2927820A1; SG155139A1; GB2461358A; GB0902997D0; JP2009196950A; JP5463537B2; US20090215997A1

Abstract

Ein Verfahren zum Separieren eines fluoreszierenden Proteins aus einer Probe, die eine Vielzahl von Proteinen mit dem fluoreszierenden Protein enthält, wird angegeben. Das Verfahren umfasst: das Herstellen einer Probenlösung durch Zugeben der Probe zu einer Flüssigkeit, das Herstellen einer Adsorptionsvorrichtung mit einem Füllraum zum Einfüllen eines Adsorptionsmittels, das eine Oberfläche hat, wobei mindestens die Oberfläche des Adsorptionsmittels aus einer calciumphosphatbasierten Verbindung besteht und mindestens ein Teil des Füllraums mit dem Adsorptionsmittel gefüllt ist, das Zuführen der Probenlösung in den Füllraum der Adsorptionsvorrichtung derart, dass die Vielzahl der Proteine durch das Adsorptionsmittel adsorbiert wird, das Zuführen eines Phosphatelutionspuffers zum Eluieren des in der Vielzahl von Proteinen enthaltenen fluoreszierenden Proteins aus dem Adsorptionsmittel in den Füllraum der Adsorptionsvorrichtung, um dadurch ein Eluens zu erhalten, das das fluoreszierende Protein enthält, und das Fraktionieren des Eluens, das aus dem Füllraum der Adsorptionsvorrichtung ausgegeben wird, in einen Teil des Phosphatelutionspuffers, der das fluoreszierende Protein enthält, und andere Teile desselben, um so das fluoreszierende Protein aus der Vielzahl von Proteinen zu separieren. Die vorliegende Erfindung ermöglicht das Separieren einer großen Menge des fluoreszierenden Proteins aus der Probe, die die Vielzahl der Proteine mit dem fluoreszierenden Protein enthält, ...

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Separationsverfahren, insbesondere ein Verfahren zum Separieren eines fluoreszierenden Proteins aus einer eine Vielzahl Proteine enthaltenden Probe.
Technischer Hintergrund
Als ein Verfahren zum Erfassen eines Objekts mit hoher Empfindlichkeit unter Anwendung einer Antigen-Antikörper-Reaktion wird ein heterologer Enzymimmunoassay (ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay) oder dergleichen angewendet.
Ein solcher Enzymimmunoassay verwendet ein Reagens, das z. B. erhalten wird durch Präparieren eines Antikörpers, der speziell an einem zu erfassenden Objekt (d. h. einem Antigen) gebunden werden kann und das Mitführen (Binden) eines fluoreszierenden Materials als Marker an dem Antikörper ermöglicht.
In den letzten Jahren hat man sich mit der Verwendung fluoreszierender Proteine (grün fluoreszierendes Protein GFP), die aus Aequorea coerulescens, einer Nesseltier-Art gewonnen werden, als solche fluoreszierenden Stoffe befasst.
Ein Verfahren zum Separieren eines fluoreszierenden Proteins aus einen Seidenraupenkokon bildenden Fäden unter Verwendung einer Ni-Affinitätssäule ist in M. Tomita et al., Transgenic Res., 16, 449–465, 2007 offenbart. Das Verfahren wird ausgeführt, indem eine Nukleinsäure, die ein dem fluoreszierenden Protein entsprechendes Gen enthält, in eine Nukleinsäure der Seidenraupe überführt wird, um dadurch das fluoreszierende Protein in den den Seidenraupenkokon bildenden Fäden auszudrücken.
Da jedoch ein in der Ni-Affinitätssäule eingesetztes Adsorptionsmittel (Separationsmittel) aus Harzmaterialien als Hauptbestandteil besteht, wird das in einen unteren Abschnitt eines Füllraums der Ni-Affinitätssäule gefüllte Adsorptionsmittel durch wiederholtes Verwenden des Adsorptionsmittels unter seinem eigenen Gewicht verformt oder zerstört. Daher besteht ein Problem darin, dass in dem unteren Abschnitt des Füllraums der Ni-Affinitätssäule eine Verstopfung auftritt.
Ein derartiges Problem wird dann deutlich, wenn die Größe der Säule heraufgesetzt wird, um eine große Menge eines fluoreszierenden Proteins auf ein Mal zu separieren.
Da ferner in den Füllraum der Ni-Affinitätssäule Ni, ein gefährliches Metall, gefüllt wird, sollte unter Gesichtspunkten der Umwelt zum Separieren des fluoreszierenden Proteins Ni-Affinitätssäule vorzugsweise nicht verwendet werden.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Separationsverfahren anzugeben, mit dem eine große Menge eines fluoreszierenden Proteins aus einer Probe (Probenlösung), die eine Vielzahl von das fluoreszierende Protein enthaltenden Proteinen enthält, mit hoher Reinheit in einer einfachen Operation separiert werden kann.
Diese Aufgabe lösen die unten beschriebenen vorliegenden Erfindungen (1) bis (14).

(1) Es wird ein Verfahren zum Separieren eines fluoreszierenden Proteins aus einer Probe angegeben, die eine Vielzahl von das fluoreszierende Protein enthaltenden Proteinen enthält. Das Verfahren umfasst: Zubereiten einer Probenlösung durch Hinzufügen der Probe zu einer Flüssigkeit; Herstellen einer Adsorptionsvorrichtung mit einem Füllraum zum Einfüllen eines Adsorptionsmittels, das eine Oberfläche hat, wobei zumindest die Oberfläche des Adsorptionsmittels aus einer calciumphosphatbasierten Verbindung besteht und zumindest ein Teil des Füllraums mit dem Adsorptionsmittel gefüllt ist; Zuführen der Probenlösung in den Füllraum der Adsorptionsvorrichtung, so dass die Vielzahl Proteine von dem Adsorptionsmittel adsorbiert wird; Zuführen eines Phosphatelutionspuffers zum Eluieren des in der Vielzahl Proteine enthaltenen fluoreszierenden Proteins aus dem Adsorptionsmittel in den Füllraum der Adsorptionsvorrichtung, um so ein das fluoreszierende Protein enthaltendes Eluens zu gewinnen; und Fraktionieren des aus dem Füllraum der Adsorptionsvorrichtung ausgegebenen Eluens in einen Teil des Phosphatelutionspuffers, der das fluoreszierende Protein enthält, und in andere Teile desselben, um so das fluoreszierende Protein aus der Vielzahl von Proteinen zu separieren. Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren kann eine große Menge des fluoreszierenden Proteins aus der Probe (Probenlösung), die eine Vielzahl von das fluoreszierende Protein enthaltenden Proteinen enthält, mit hoher Reinheit in einer einfachen Operation separiert werden.
(2) Bei dem unter obigem Punkt (1) beschriebenen Verfahren liegt während des Schritts, in dem der Phosphatelutionspuffer zugeführt wird, der pH-Wert des Phosphatelutionspuffers im Bereich von 6 bis 8. Dadurch kann verhindert werden, dass das zu separierende fluoreszierende Protein verändert wird und dass sich seine fluoreszierende Eigenschaft ändert. Außerdem ist es möglich, verlässlich zu verhindern, dass das Adsorptionsmittel verändert wird (Auflösung und dergleichen), so dass verhindert werden kann, dass das Separationsvermögen des Adsorptionsmittels in der Adsorptionsvorrichtung verändert wird.
(3) Bei dem unter obigem Punkt (1) beschriebenen Verfahren liegt bei dem Schritt, in dem der Phosphatelutionspuffer zugeführt wird, die Temperatur des Phosphatelutionspuffers im Bereich von 30 bis 50°C. Dadurch kann verhindert werden, dass das fluoreszierende Protein separiert oder verändert wird.
(4) Bei dem unter obigem Punkt (1) beschriebenen Verfahren beträgt bei dem Schritt, in dem der Phosphatelutionspuffer zugeführt wird, die Salzkonzentration des Phosphatelutionspuffers 500 mM oder darunter. Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren kann verhindert werden, dass in dem Phosphatelutionspuffer enthaltene Metallionen nachteilige Auswirkungen auf das fluoreszierende Protein haben.
(5) Bei dem unter obigem Punkt (1) beschriebenen Verfahren liegt bei dem Schritt, in dem der Phosphatelutionspuffer zugeführt wird, und dem Schritt, in dem das Eluens fraktioniert wird, die Strömungsgeschwindigkeit des in dem Füllraum der Adsorptionsvorrichtung strömenden Phosphatelutionspuffers im Bereich von 0,1 bis 10 mL/min. Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren ist es möglich, ein vorgegebenes fluoreszierendes Protein verlässlich zu separieren, ohne dass lange Zeit für Separationsoperationen notwendig ist. Das heißt, das fluoreszierende Protein mit hoher Reinheit kann gewonnen werden.
(6) Bei dem unter obigem Punkt (1) beschriebenen Verfahren ist das fluoreszierende Protein zumindest ein aus einem Nesseltier gewonnenes fluoreszierendes Protein oder ein veränderter Körper desselben. Das oben beschriebene Verfahren kann auf ein Verfahren zum Separieren verschiedener Arten von fluoreszierenden Proteinen aus einer Probe angewendet werden. Insbesondere kann das oben beschriebene Verfahren auf ein Verfahren zum Separieren des aus dem Nesseltier gewonnenen Proteins und/oder dem veränderten Körper desselben aus einer Probe angewendet werden.
(7) Bei dem unter obigem Punkt (1) beschriebenen Verfahren wird der veränderte Körper durch Hinzufügen von zumindest Histidin, Lysin oder Arginin zu dem aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Protein erzeugt. Von verschiedenen Arten von Aminosäuren haben Histidin, Lysin und Arginin eine hohe Affinität gegenüber Metallionen. Wenn der veränderte Körper des fluoreszierenden Proteins durch Hinzufügen von zumindest Histidin, Lysin oder Arginin zu einem natürlichen fluoreszierenden Protein erzeugt wird, wird es daher möglich, das fluoreszierende Protein mit hohem Ertrag zu sammeln.
(8) Bei dem unter obigem Punkt (1) beschriebenen Verfahren wird das fluoreszierende Protein in einen Seidenraupenkokon bildenden Fäden ausgedrückt, indem eine Nukleinsäure, die ein dem fluoreszierenden Protein entsprechendes Gen enthält, in eine Nukleinsäure der Seidenraupe überführt wird. Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren kann ein fluoreszierendes Protein mit einfacher Struktur gewonnen werden. Daher kann verhindert werden, dass das Adsorptionsvermögen des fluoreszierenden Proteins an dem Adsorptionsmittel verändert wird. Das heißt, das oben beschriebene Verfahren nach vorliegender Erfindung ist zum Separieren eines derartigen fluoreszierenden Proteins aus der Probenlösung optimal geeignet.
(9) Bei dem unter obigem Punkt (1) beschriebenen Verfahren besteht die calciumphosphatbasierte Verbindung aus Hydroxylapatit als Hauptbestandteil. Da Hydroxylapatit eine Substanz ist, die Bestandteilen des lebenden Körpers ähnlich ist, kann verlässlich verhindert werden, dass ein derartiges fluoreszierendes Protein verändert (deaktiviert) wird, wenn das fluoreszierende Protein aus der Probe separiert wird. Durch Ändern der Salzkonzentration des Phosphatelutionspuffers als Elutionsmittel, hat das oben beschriebene Verfahren ferner den Vorteil, dass das fluoreszierende Protein leicht aus dem Adsorptionsmittel zu dem Phosphatelutionspuffer desorbiert wird, um das Eluens zu gewinnen.
(10) Bei dem unter obigem Punkt (9) beschriebenen Verfahren hat der Hydroxylapatit Hydroxylgruppen, und der Hydroxylapatit wird mit Hydrogenfluoridmolekülen mit Fluoratomen reagiert, um einen Fluorapatit zu erzeugen, wobei zumindest eine der Hydroxylgruppen des Hydroxylapatits durch die Fluoratome der Hydrogenfluoridmoleküle substituiert wird. Hydroxylapatit, bei dem Hydroxylgruppen durch die Fluoratome der Hydrogenfluoridmoleküle substituiert sind, d. h. Fluorapatit hat die Fluoratome (Fluorionen) in einer chemischen Struktur desselben. Daher kann verhindert werden, dass Calciumatome (Calciumionen) aus Fluorapatit eliminiert werden.
(11) Bei dem unter obigem Punkt (10) beschriebenen Verfahren wird der Fluorapatit folgendermaßen hergestellt: Bereiten einer den Hydroxylapatit enthaltenden Schlämme, Bereiten einer Hydrogenfluorid enthaltenden Lösung, die die Hydrogenfluoridmoleküle enthält, Mischen der Schlämme und der Hydrogenfluorid enthaltenden Lösung, um ein Gemisch daraus zu gewinnen, und Reagieren des in der Schlämme enthaltenen Hydroxylapatits und der in der Hydrogenfluorid enthaltenden Lösung vorhandenen Hydrogenfluoridmoleküle in dem Gemisch, um so die zumindest eine der Hydroxylgruppen des Hydroxylapatits durch die Fluoratome der Hydrogenfluoridmoleküle zu substituieren. Da die Hydrogenfluoridmoleküle als Fluorquelle verwendet werden, kann gemäß dem oben beschriebenen Verfahren Fluorapatit mit hoher Kristallinität erzeugt werden, in dem keine Verunreinigungen enthalten sind, bzw. in dem nur ein sehr geringer Grad einer Verunreinigung enthalten ist.
(12) Bei dem unter obigem Punkt (11) beschriebenen Verfahren liegt der pH-Wert des Gemischs im Bereich von 2,5 bis 5,0. Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren kann Hydroxylapatit gewonnen werden, bei dem Hydroxylgruppen durch die Fluoratome der Hydrogenfluoridmoleküle substituiert sind, d. h. Fluorapatit mit hoher Kristallinität.
(13) Bei dem unter obigem Punkt (10) beschriebenen Verfahren wird der Fluorapatit folgendermaßen erzeugt: Bereiten einer ersten Flüssigkeit, die eine Calcium enthaltende calciumbasierte Verbindung enthält, einer zweiten Flüssigkeit, die das Hydrogenfluorid enthält, und einer dritten Flüssigkeit, die Phosphorsäure enthält, und nachfolgendes Erzeugen eines ersten Gemischs durch Mischen der ersten Flüssigkeit, der zweiten Flüssigkeit und der dritten Flüssigkeit und nachfolgendes Reagieren der calciumbasierten Verbindung, des Hydrogenfluorids und der Phosphorsäure in dem ersten Gemisch. Da die Hydrogenfluoridmoleküle als Fluorquelle verwendet werden, kann gemäß dem oben beschriebenen Verfahren Hydroxylapatit gewonnen werden, bei dem Hydroxylgruppen durch die Fluoratome der Hydrogenfluoridmoleküle substituiert sind, d. h. Fluorapatit mit hoher Kristallinität erzeugt werden, in dem keine Verunreinigungen enthalten sind, bzw. in dem nur ein sehr geringer Grad einer Verunreinigung enthalten ist.
(14) Bei dem unter obigem Punkt (13) beschriebenen Verfahren wird der Schritt des Herstellens des ersten Gemischs durch Mischen der zweiten Flüssigkeit und der dritten Flüssigkeit zum Gewinnen eines zweiten Gemischs und nachfolgendes Mischen des zweiten Gemischs mit der ersten Flüssigkeit ausgeführt. Dies ermöglicht das gleichmäßige Mischen der zweiten Flüssigkeit und der dritten Flüssigkeit mit der ersten Flüssigkeit, um so Fluorapatit zu erzeugen. Ferner können die Hydroxylgruppen von Hydroxylapatit gleichmäßig durch die Fluoratome der Hydrogenfluoridmoleküle substituiert werden. Außerdem kann verlässlich verhindert werden, dass ein Nebenprodukt wie Calciumfluorid in dem zweiten Gemisch erzeugt wird.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine große Menge des fluoreszierenden Proteins aus der Probe (Probenlösung), die die Vielzahl an Proteinen mit dem fluoreszierenden Protein enthält, mit hoher Reinheit in einer einfachen Operation separiert werden.
Durch geeignetes Einstellen der Separationsbedingungen, wie die Salzkonzentration oder die Strömungsgeschwindigkeit des Phosphatelutionspuffers, die zwar von der Art des zu separierenden Proteins abhängen, ist es möglich, die Reinheit des zu separierenden und zu reinigenden fluoreszierenden Proteins zu verbessern.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Schnittansicht eines Beispiels einer bei der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Adsorptionsvorrichtung.
2 zeigt eine Adsorptionskurve, die gemessen werden, wenn ein fluoreszierendes Protein in einer Probenlösung unter Verwendung der Adsorptionsvorrichtung separiert wird.
BESTMÖGLICHES AUSFÜHREN DER ERFINDUNG
Im Folgenden wird ein Separationsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung in seinen Einzelheiten anhand eines vorzugsweisen Ausführungsbeispiels beschrieben, das in den beigefügten Zeichnungen dargestellt ist.
Vor der Beschreibung des Separationsverfahrens nach vorliegender Erfindung wird zunächst ein Beispiel einer Adsorptionsvorrichtung (Separationsvorrichtung) beschrieben, die bei der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist.
1 ist eine Schnittansicht, die ein Beispiel für eine bei der vorliegenden Erfindung zu verwendende Adsorptionsvorrichtung zeigt. Es sei darauf hingewiesen, dass bei der folgenden Beschreibung die Oberseite und die Unterseite in 1 als „Zuflussseite” bzw. als ”Abflussseite” beschrieben werden.
Genauer gesagt, bezeichnet die Zuflussseite eine Seite, von der aus Flüssigkeiten wie eine Probenlösung (d. h. eine Flüssigkeit, die eine Probe enthält) und ein Phosphatelutionspuffer (d. h. ein Elutionsmittel) in die Adsorptionsvorrichtung eingeführt werden, um ein vorgegebenes fluoreszierendes Protein zu separieren (reinigen), und die Abflussseite bezeichnet eine Seite, die der Zuflussseite gegenüber liegt, d. h. eine Seite, durch die die oben beschriebenen Flüssigkeiten aus der Adsorptionsvorrichtung abfließen.
Es folgt die Beschreibung ausgehend von dem Fall, dass ein aus einem Nesseltier gewonnenes fluoreszierendes Protein und/oder ein veränderter Körper desselben als das/die fluoreszierende/n Protein/e verwendet wird/werden, das/die unter Verwendung der Adsorptionsvorrichtung als repräsentatives Beispiel zu separieren ist/sind. Die Beschreibung erfolgt ferner ausgehend von dem Fall, dass das fluoreszierende Protein unter Verwendung der Adsorptionsvorrichtung als repräsentatives Beispiel aus der eine Vielzahl von Proteinen enthaltenden Probenlösung separiert wird.
Dabei ist der veränderte Körper des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins ein Protein mit Fluoresenzvermögen (anhaltende Fluoreszenz) und mit einer Aminosäurenkette, bei der eine oder mehrere Aminosäuren, die in einer Aminosäurekette eines aus einem natürlichen Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins enthalten sind, verloren sind und/oder durch eine andere Aminosäure substituiert sind, und/oder bei der die andere Aminosäure zu der einen oder den mehreren Aminosäuren hinzugefügt worden ist.
Ein fluoreszierendes Protein (grün fluoreszierendes Protein: GFP), das Aequorea coerulescens, einer Nesseltier-Art gehört, leuchtet ein fluoreszierendes Grün. Durch Ändern eines Teils von Aminosäuren in der Aminosäurekette des fluoreszierenden Proteins erhält man bekanntlich ein fluoreszierende Proteine, die z. B. ein fluoreszierendes Rot, ein fluoreszierendes Gelb, fluoreszierendes Cyan und dergleichen leuchten. Zu den Beispielen für derartige fluoreszierende Proteine gehören rot fluoreszierendes Protein (RFP), gelb fluoreszierendes Protein (YFP) und cyan fluoreszierendes Protein (CFP).
Dabei ist zu bemerken, dass das aus Aequorea coerulescens gewonnene fluoreszierende Protein unter Anwendung eines genetischen Rekombinationsverfahrens extrahiert werden kann, wie es in der US-A-2008-0301823 offenbart ist. Das heißt, das fluoreszierende Protein wird unter Anwendung des genetischen Rekombinationsverfahrens in Fäden erzeugt, die einen Seidenraupenkokon darstellen, und kann dann extrahiert werden, indem die Fäden in eine wässrige Lösung getaucht werden. Ferner ist zu bemerken, dass ein veränderter Körper des fluoreszierenden Proteins aus Aequorea coerulescens auch durch Anwendung in Kombination mit dem in der US-A-2008-0301823 offenbarten genetischen Rekombinationsverfahren und einem allgemeinen genetischen Rekombinationsverfahren gewonnen werden kann.
Im Folgenden werden das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein und dessen veränderter Körper einfach und zusammenfassend als „aus dem Nesseltier gewonnenes fluoreszierendes Protein” bezeichnet.
Die in 1 gezeigte Adsorptionsvorrichtung, die zum Separieren des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins aus der Probenlösung verwendet wird, enthält eine Säule 2, ein granulares Adsorptionsmittel (Füller) 3 und zwei Filterelemente 4 und 5.
Die Säule 2 besteht aus einem Säulenhauptkörper 21 und Kappen 22 und 23, die an dem zuflussseitigen Ende und dem abflussseitigen Ende des Säulenhauptkörpers 21 jeweils zu befestigen sind.
Der Säulenhauptkörper 21 besteht z. B. aus einem zylindrischen Element. Beispiele für das Material eines jeden Teils (Elements) der Säule 2 einschließlich des Säulenhauptkörpers 21 sind verschiedene Glase, verschiedene Kunstharze, verschiedene Metalle und verschiedene keramische Materialien und dergleichen.
Eine Öffnung an der Zuflussseite des Säulenhauptkörpers 21 ist mit dem Filterelement 4 abgedeckt, und in diesem Zustand ist die Kappe 22 an dem zuflussseitigen Ende des Säulenhauptkörpers 21 verschraubt. Ähnlich ist eine Öffnung an der Abflussseite des Säulenhauptkörpers 21 mit dem Filterelement 5 abgedeckt, und in diesem Zustand ist die Kappe 23 an dem abflussseitigen Ende des Säulenhauptkörpers 21 verschraubt.
Die so aufgebaute Säule 2 hat einen mit Adsorptionsmittel zu füllenden Raum 20, der durch den Säulenhauptkörper 21 und die Filterelemente 4 und 5 definiert ist, und mindestens ein Teil des mit den Adsorptionsmittel zu füllenden Raums 20 ist mit dem Adsorptionsmittel 3 gefüllt (in diesem Beispiel ist fast der gesamte mit Adsorptionsmittel zu füllende Raum 20 mit dem Adsorptionsmittel 3 gefüllt).
Die volumetrische Kapazität des mit Adsorptionsmittel zu füllenden Raums 20 wird abhängig von dem Volumen einer zu verwendenden Probenlösung geeignet bemessen. Diese volumetrische Kapazität ist nicht besonders begrenzt, jedoch liegt sie vorzugsweise im Bereich von ungefähr 0,1 bis 100 mL, besonders vorzugsweise im Bereich von ungefähr 1 bis 50 mL pro 1 mL der Probenlösung.
Durch Einstellen der Größe des mit Adsorptionsmittel zu füllenden Raums 20 auf einen Wert in dem vorstehend genannten Bereich und durch Einstellen der Größe des Adsorptionsmittels 3 (das noch beschrieben wird) auf einen Wert in einem noch zu beschreibenden Bereich, ist es möglich, das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein und in der Probenlösung enthaltene verunreinigende Proteine (Fremdstoffe), bei denen es sich nicht um das fluoreszierende Protein aus dem Nesseltier handelt, verlässlich voneinander zu separieren.
Was dies betrifft, so sei darauf hingewiesen, dass zu den Beispielen für verunreinigende Proteine in der Probenlösung die folgenden Proteine gehören.
Zuerst wird ein fluoreszierendes Protein in Fäden ausgedrückt, die einen Seidenraupenkokon bilden, indem eine Nukleinsäure, die ein dem fluoreszierenden Protein entsprechendes Gen enthält, in eine Nukleinsäure der Seidenraupe überführt wird. Danach wird das ausgedrückte fluoreszierende Protein in einer wässrigen Lösung extrahiert (gelöst), um eine Extraktionslösung zu erhalten, die als Probenlösung verwendet wird. In diesem Fall gehören zu den Beispielen für die verunreinigenden Proteine solche Proteine, bei denen es sich nicht um das aus den den Seidenraupenkokon bildenden Fäden gewonnene fluoreszierende Protein handelt und die in der Probenlösung auf die gleiche Weise wie oben beschrieben extrahiert werden.
Ferner wird die Flüssigkeitsabdichtung zwischen dem Säulenhauptkörper 21 und den Kappen 22 und 23 durch Befestigen der Kappen 22 und 23 an dem Säulenhauptkörper 21 gewährleistet.
Ein Zuleitungsrohr 24 ist flüssigkeitsdicht an der Kappe 22 zentral befestigt, und ein Ableitungsrohr 25 ist ebenfalls flüssigkeitsdicht an der Kappe 23 zentral befestigt. Die oben beschriebenen Flüssigkeiten werden dem mit Adsorptionsmittel zu füllenden Raum 20 über das Zuleitungsrohr 24 und das Filterelement 4 zugeführt. Die dem mit Adsorptionsmittel zu füllenden Raum 20 zugeführten Flüssigkeiten laufen durch Zwischenräume zwischen Teilchen des Adsorptionsmittels 3 und treten dann aus der Säule 2 durch das Filterelement 5 und das Ableitungsrohr 25 aus. Zu diesem Zeitpunkt werden das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierenden Protein und die in der Probenlösung (Probe) enthaltenen verunreinigenden Proteine voneinander separiert entsprechend der Differenz des Adsorptionsgrades des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins und der verunreinigenden Proteine zu dem Adsorptionsmittel 3 und der Differenz des Affinitätsgrades des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins und der verunreinigenden Proteine zu einem Phosphatelutionspuffer.
Jedes Filterelement 4 und 5 hat die Funktion, das Austreten des Adsorptionsmittels 3 aus dem mit Adsorptionsmittel zu füllenden Raum 20 zu verhindern. Ferner besteht jedes Filterelement 4 und 5 aus einem nicht gewebten Material, einem Schaum (schwammartiger poröser Körper mit untereinander verbundenen Poren), einem Gewebematerial, einem Maschenmaterial oder dergleichen, das aus einem Kunstharz wie Polyurethan, Polyvinylalkohol, Polypropylen, Polyetherpolyamid, Polyethylenterephthalat oder Polybutylenterephthalat besteht.
Mindestens die Oberfläche des Adsorptionsmittels 3 besteht aus einer calciumphosphatbasierten Verbindung. Das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein und die sich von dem aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Protein unterscheidenden Proteine werden jeweils mit der ihnen eigenen Adsorbierbarkeit (Haltefähigkeit) speziell an einem solchen Adsorptionsmittel 3 adsorbiert. Deshalb werden das fluoreszierende Protein und die Proteine, d. h. die verunreinigenden Proteine abhängig von dem Unterschied zwischen der Adsorbierbarkeit des fluoreszierenden Proteins an dem Adsorptionsmittel 3 und der Adsorbierbarkeit der Proteine an dem Adsorptionsmittel 3 voneinander separiert und gereinigt.
Beispiele für die calciumphosphatbasierte Verbindung sind, ohne eine Einschränkung vorzunehmen, Hydroxylapatit (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂), TCP (Ca₃(PO₄)₂), Ca₂P₂O₇, Ca(PO₃)₂, DCPD (CaHPO₄·2H₂O), Ca₄O(PO₄)₂, Materialien, bei denen ein Teil dieser Materialien durch die anderen Atome oder die anderen Atomgruppen substituiert sind, und dergleichen. Diese calciumphosphatbasierten Verbindungen können einzeln oder in Kombination von zwei oder mehr Verbindungen verwendet werden.
Was dies betrifft, sei darauf hingewiesen, dass das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein im Allgemeinen ein saures Protein ist, das einen relativ großen Anteil einer sauren Aminosäure als Aminosäurebestandteil enthält.
Die calciumphosphatbasierte Verbindung enthält eine große Anzahl von Calciumatomen in ihrer Kristallstruktur. In der Kristallstruktur ist eine Ca-Seite ausgebildet, die in der Lage ist, sich positiv aufzuladen.
In dem aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Protein sind Ionenbindungen zwischen der in der calciumphosphatbasierten Verbindung enthaltenen Ca-Seite und der in dem aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Protein enthaltenen sauren Aminosäure gebildet. Daher kann das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein, verglichen mit den verunreinigenden Proteinen, an der phosphatcalciumbasierten Verbindung fest gebunden (adsorbiert) werden.
Wenn das Adsorptionsmittel 3 verwendet wird, bei dem zumindest die Oberfläche aus der calciumphosphatbasierten Verbindung besteht, kann das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein (saures Protein) leicht und verlässlich von den verunreinigenden Proteinen separiert werden, indem die Differenz zwischen der Adsorbierbarkeit des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins an dem Adsorptionsmittel 3 und der Adsorbierbarkeit der verunreinigenden Proteine an dem Adsorptionsmittel 3 ausgenutzt wird.
Ferner ermöglicht es das Adsorptionsmittel 3, bei dem zumindest die Oberfläche aus der calciumphosphatbasierten Verbindung besteht, hohe Festigkeit zu erhalten. Daher kann über einen langen Zeitraum verlässlich verhindert werden, dass das Adsorptionsmittel 3 unter seinem Eigengewicht leicht verformt und zerstört wird. Das heißt, ein derartiges Adsorptionsmittel 3 ermöglicht es, das Auftreten des folgenden Phänomens zu verhindern. Das in den unteren Abschnitt des mit Adsorptionsmittel zu füllenden Raums 20 der Adsorptionsvorrichtung 1 gefüllte Adsorptionsmittel 3 wird zerstört, wodurch eine Verstopfung an ihm auftritt.
Als Ergebnis ist es möglich, eine große Menge Probenlösung verlässlich zu behandeln. Mit anderen Worten: Eine große Menge des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins kann verlässlich aus der Probenlösung separiert werden.
Von diesen calciumphosphatbasierten Verbindungen wird vorzugsweise eine solche verwendet, die den Hydroxylapatit als Hauptkomponente des Adsorptionsmittels 3 enthält. Insbesondere ist der Hydroxylapatit eine Substanz ähnlich Bestandteilen eines lebenden Körpers. Wenn das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein an dem Adsorptionsmittel 3 adsorbiert und von diesem separiert (desorbiert) wird, ist es daher möglich, verlässlich zu verhindern, dass ein derartiges fluoreszierendes Protein verändert (denaturiert) wird. Wenn ferner die Salzkonzentration des Phosphatelutionspuffers als Elutionsmittel verändert wird, hat das Verfahren nach vorliegender Erfindung den Vorteil, dass das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein speziell von dem Adsorptionsmittel 3 desorbiert wird.
Vorzugsweise ist zumindest ein Teil der Hydroxylgruppen von Hydroxylapatit durch Fluoratome von Hydrogenfluoridmolekülen substituiert, um Fluorapatit zu erhalten. Die Fluoratome liegen in einer Kristallstruktur von Fluorapatit vor. Dadurch kann verlässlich verhindert werden, dass Calciumatome (Calciumionen) aus Fluorapatit separiert oder eliminiert werden. Durch ein Adsorptionsmittel 3, bei dem zumindest die Oberfläche aus Fluorapatit besteht, kann ferner die Festigkeit des Adsorptionsmittels 3 weiter verbessert werden.
Im Folgenden werden Hydroxylapatit und Fluorapatit kollektiv als „Apatit” bezeichnet.
Inzwischen wird bei einem fluoreszierenden Protein, das aus der zu den Nesseltieren gehörenden Aequorea coerulescens gewonnen ist, ein Chromophor (Fluorophor) gebildet, indem drei Aminosäuren, nämlich Serin, Tyrosin und Glycin aneinander gebunden werden. Wie in der folgenden Formel (1) gezeigt, hat der Chromophor eine Struktur, bei der zwei Stickstoffatome aneinander grenzen. Wenn Metallionen (Calciumionen) der Struktur (zwei Stickstoffatome) des Chromophors nahe sind, wird daher eine Chelatbindung zwischen den Metallionen und dem Chromophor gebildet. Man befürchtet, dass das Fluoreszenzvermögen des aus Aequorea coerulescens gewonnenen fluoreszierenden Proteins aufgrund der Chelatbindung verändert wird.
Formel (1)
Daher ist es notwendig, die Metallatome fest an dem Adsorptionsmittel 3 zu halten. Durch das Adsorptionsmittel 3, bei dem zumindest die Umgebung der Oberfläche aus Fluorapatit besteht, kann jedoch verlässlich verhindert werden, dass Calciumionen zu dem als Elutionsmittel verwendeten Phosphatelutionspuffer oder zu der Probenlösung eluiert werden. Als Ergebnis kann verlässlich verhindert werden, dass das Fluoreszenzvermögen des aus Aequorea coerulescens gewonnenen separierten Proteins aufgrund der Calciumionen verändert wird.
In diesem Zusammenhang, wird ein Verfahren zum Herstellen von Fluorapatit später ausführlich beschrieben.
Wie 1 zeigt, hat ferner das Adsorptionsmittel 3 vorzugsweise eine Teilchenform (körnig), kann jedoch auch eine andere Form haben wie eine Pelletform (kleine Blöcke) oder eine blockartige Form (d. h. ein poröser Körper, bei dem benachbarte Poren miteinander kommunizieren, oder eine Bienenwabenform). Durch Ausbilden des Adsorptionsmittels 3 mit Teilchenform ist es möglich, den Oberflächenbereich zu vergrößern und dadurch die Separationseigenschaften für das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein zu dem Adsorptionsmittel 3 zu verbessern.
Die mittlere Teilchengröße des Adsorptionsmittels 3 ist nicht besonders begrenzt, vorzugsweise liegt sie aber im Bereich von ungefähr 0,5 bis 150 μm, insbesondere im Bereich von ungefähr 10 bis 80 μm. Durch Verwenden des Adsorptionsmittels 3 mit einer solchen mittleren Teilchengröße ist es möglich, das Verstopfen des Filterelements 5 zuverlässig zu verhindern und dabei einen ausreichenden Oberflächenbereich des Adsorptionsmittels 3 sicher zu stellen.
Es ist zu bemerken, dass das Adsorptionsmittel 3 insgesamt aus der calciumphosphatbasierte Verbindung bestehen kann. Alternativ kann das Adsorptionsmittel 3 durch Beschichten der Oberfläche eines Trägers (Basis) mit der calciumphosphatbasierten Verbindung erzeugt werden. Vorzugsweise kann das Adsorptionsmittel 3 insgesamt aus der calciumphosphatbasierten Verbindung bestehen. Dies ermöglicht es, die Festigkeit des Adsorptionsmittels 3 weiter zu verbessern und dadurch eine geeignete Säule zu erhalten, die zum Separieren einer großen Menge des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins geeignet ist.
Das insgesamt aus der calciumphosphatbasierten Verbindung bestehende Adsorptionsmittel 3 kann folgendermaßen hergestellt werden. Teilchen der phosphatcalciumbasierten Verbindung (primäre Teilchen) werden unter Anwendung eines Nass-Syntheseverfahrens oder eines Trocken-Syntheseverfahrens erzeugt, eine Schlämme, die derartige Teilchen der phosphatcalciumbasierten Verbindung enthält, wird zubereitet, und dann wird die Schlämme getrocknet oder granuliert, um getrocknete Teilchen zu erzeugen. Danach werden die getrockneten Teilchen gesintert, um das vollständig aus der calciumphosphatbasierten Verbindung bestehende Adsorptionsmittel 3 zu erzeugen.
Andererseits kann das Adsorptionsmittel 3, das durch Beschichten der Oberfläche eines Trägers mit der calciumphosphatbasierten Verbindung gebildet ist, durch Anwenden eines Verfahrens erzeugt werden, bei dem die getrockneten Teilchen mit dem aus einem Kunstharz oder dergleichen bestehenden Träger kollidiert (gekreuzt) sind.
Wenn fast der gesamte mit Adsorptionsmittel zu füllende Raum 20 mit dem Adsorptionsmittel 3 wie bei diesem Ausführungsbeispiel gefüllt ist, hat das Adsorptionsmittel 3 vorzugsweise dieselbe Zusammensetzung an jeder Stelle in dem mit Adsorptionsmittel zu füllenden Raum 20. Dies verleiht der Adsorptionsvorrichtung 1 eine besonders hervorragende Eigenschaft, das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein zu separieren (reinigen).
In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, dass der mit Adsorptionsmittel zu füllende Raum 20 teilweise mit dem Adsorptionsmittel 3 gefüllt sein kann (d. h. ein Teil des mit Adsorptionsmittel zu füllenden Raums 20 auf der Seite des Zuleitungsrohrs 24 kann mit dem Adsorptionsmittel 3 gefüllt sein). In diesem Fall kann der verbleibende Teil des mit Adsorptionsmittel zu füllenden Raums 20 mit einem anderen Adsorptionsmittel gefüllt sein.
Im Folgenden wird ein Verfahren zum Separieren des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Adsorptionsvorrichtung 1 (d. h. ein Separationsverfahren nach der vorliegenden Erfindung) beschrieben.
(1) Zubereitungsschritt
Zunächst wird eine Vielzahl von Proteinen, die ein aus einem Nesseltier gewonnenes fluoreszierendes Protein enthalten, aus einer Probe extrahiert, um eine Probenlösung zuzubereiten.
Zu den Beispielen für die Probe, die zum Extrahieren des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins zu verwenden ist, gehören Nesseltiere wie Aequorea victoria und Obelia, die zur Klasse der Hydrozoa gehören, sowie Porifera und Renilla, die zur Klasse der Anthozoa gehören.
Zu den Beispielen für die anderen Proben, die zum Extrahieren des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins zu verwenden sind, gehören: Säuger wie Ovis aries, Leporidae und Gallus gallus domesticus; Insekten wie die Seidenraupe; Tierzellen wie z. B. die aus einer Ovarzelle des chinesischen Hamsters gewonnene CHO-Zelle; von Mikroben als Sekret abgegebene Materialien wie z. B. Colibakterien; zytoplasmische Bestandteile derselben, und dergleichen. Bei diesen anderen Proben wird eine Nukleinsäure, die ein dem von dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Protein entsprechendes Gen enthält, in Nukleinsäuren derselben überführt.
Von diesen oben erwähnten Proben sind die anderen Proben vorzuziehen. Diese anderen Proben können eine große Menge des aus dem Nesseltier gewonnenen Proteins erzeugen (erzeugtes Protein). Nach Extrahieren des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins aus den anderen Proben zu einer Probenlösung wird daher das fluoreszierende Protein aus der Probenlösung separiert und gereinigt. Dadurch ist es möglich, die große Menge des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins verlässlich und leicht zu gewinnen.
Genauer gesagt wird die Nukleinsäure, die das dem aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Protein entsprechende Gen enthält, in eine Nukleinsäure der Seidenraupe überführt, um den Kokon zu bilden. Daher ist der von der Seidenraupe gebildete Kokon als Probe zu bevorzugen.
Wenn der von der Seidenraupe erzeugte Kokon als Probe verwendet wird, ist es möglich, eine Extraktionslösung zu erzeugen, in der das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein extrahiert (gelöst) ist, wobei relativ einfache Operationen angewendet werden, indem der Kokon (Fäden desselben) in einen neutralen Puffer, wie beispielsweise Wasser und eine physiologische Kochsalzlösung getaucht werden. Als Ergebnis kann die Extraktionslösung als Probenlösung verwendet werden, die bei dem Separationsverfahren nach vorliegender Erfindung eingesetzt wird.
Es ist schwierig, das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein, das von der Seidenraupe erzeugt worden ist, durch Zuckerketten zu modifizieren. Daher ist es möglich, relativ einfach ein fluoreszierendes Protein mit einer einfachen chemischen Struktur zu erzeugen (nicht modifiziertes Protein). Dadurch kann verhindert werden, dass die Adsorbierbarkeit des fluoreszierenden Proteins an dem oben beschriebenen Adsorptionsmittel 3 verändert wird. Das bedeutet, dass das Separationsverfahren nach vorliegender Erfindung zum Separieren des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins optimal angewendet wird.
Wenn die Nukleinsäure, die das dem aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Protein entsprechende Gen enthält, in eine Nukleinsäure der Seidenraupe überführt wird, um einen Kokon zu erhalten, und das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein dann unter Anwendung des Separationsverfahrens nach vorliegender Erfindung aus dem durch die Seidenraupe erzeugten Kokon separiert wird, wird es möglich, ein aus einem Nesseltier gewonnenes reines Protein auf kommerzieller Basis zu produzieren.
(2) Zuführschritt
Als nächstes wird die zubereitete Probenlösung dem mit Adsorptionsmittel zu füllenden Raum 20 durch das Zuleitungsrohr 24 und das Filterelement 4 zugeführt, damit sie mit dem Adsorptionsmittel 3 in Kontakt kommt und durch die Säule 2 (den mit dem Adsorptionsmittel zu füllenden Raum 20) läuft.
Das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein hat eine hohe Adsorbierbarkeit an dem Adsorptionsmittel 3. Außerdem hat ein Teil der verunreinigenden Proteine, die nicht das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein sind, eine relativ hohe Adsorbierbarkeit an dem Adsorptionsmittel 3. Daher werden das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein und verunreinigende Proteine, die die relativ hohe Adsorbierbarkeit aufweisen, an dem Adsorptionsmittel 3 in dem Adsorptionsmittel-Füllraum 20 festgehalten. Die verunreinigenden Proteine mit geringer Adsorbierbarkeit an dem Adsorptionsmittel 3 und Fremdstoffe, die nicht die verunreinigenden Proteine und das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein sind, werden durch das Filterelement 5 und das Ableitungsrohr 25 aus der Säule 2 ausgegeben.
(3) Fraktionierungsschritt
Dann wird ein Phosphatelutionspuffer als Elutionsmittel in den Adsorptionsmittel-Füllraum 20 (Säule 2) durch das Zuleitungsrohr 24 und das Filterelement 4 eingeführt, um das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein zu eluieren, und dadurch kann man ein Eluens (Eluat) erhalten, das den Phosphatelutionspuffer und das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein enthält. Danach wird das durch das Ableitungsrohr 25 und das Filterelement 5 ausgegebene Eluat in einen Teil des Phosphatelutionspuffers, der das fluoreszierende Protein enthält, und andere Teile desselben fraktioniert (gesammelt), um Fraktionen entsprechend dem Phosphatelutionspuffer mit einem vorbestimmten Anteil des Eluens zu erhalten.
Auf diese Weise werden das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein und die verunreinigenden Proteine, die an dem Adsorptionsmittel 3 adsorbiert sind, in die Fraktionen gesammelt (voneinander separiert), in denen sie in Abhängigkeit der Differenz zwischen der Adsorbierbarkeit des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins an dem Adsorptionsmittel 3 und der Adsorbierbarkeit der verunreinigenden Proteine an dem Adsorptionsmittel 3 eluiert sind.
Zu den Beispielen für den Phosphatelutionspuffer gehören Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Lithiumphosphat und dergleichen.
Der pH-Wert des Phosphatelutionspuffers ist nicht speziell eingeschränkt, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von ungefähr 6 bis 8, und besonders vorzugsweise im Bereich von ungefähr 6,5 bis 7,5. Dadurch kann verhindert werden, dass das aus dem Nesseltier gewonnene zu separierende fluoreszierende Protein verändert wird, wodurch verhindert wird, dass das Fluoreszenzvermögen verändert wird. Außerdem ist es möglich, verlässlich zu verhindern, dass das Adsorptionsmittel 3 verändert (aufgelöst) wird, wodurch verhindert wird, dass die Separationsfähigkeit des Adsorptionsmittels 3 in der Adsorptionsvorrichtung 1 verändert wird.
Die Temperatur des Phosphatelutionspuffers ist ebenfalls nicht speziell eingeschränkt, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von ungefähr 30 bis 50°C, insbesondere im Bereich von ungefähr 35 bis 45°C. Dadurch kann verhindert werden, dass das aus dem Nesseltier gewonnene zu separierende fluoreszierende Protein verändert wird.
Durch Verwenden des Phosphatelutionspuffers, dessen pH-Wert und Temperatur jeweils in die oben genannten Bereiche fallen, ist es möglich, die Ausscheidungsrate eines aus dem Nesseltier gewonnenen vorgegebenen fluoreszierenden Proteins zu verbessern.
Die Salzkonzentration des Phosphatelutionspuffers beträgt vorzugsweise 500 mM oder darunter, insbesondere 400 mM oder darunter. Das Separieren des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins unter Verwendung des Phosphatelutionspuffers mit einer derartigen Salzkonzentration ermöglicht es, zu verhindern, dass sich Metallionen, die in dem Phosphatelutionspuffer vorhanden sind, nachteilig auf das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein auswirken.
Die Salzkonzentration des Phosphatelutionspuffers liegt vorzugsweise in dem Bereich von ungefähr 1 bis 400 mM. Ferner wird vorzugsweise die Salzkonzentration des Phosphatelutionspuffers kontinuierlich oder schrittweise verändert, wenn eine Separationsoperation des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins stattfindet. Dadurch kann die Separieroperation des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins effizient verbessert werden.
Die Strömungsgeschwindigkeit, mit dem der Phosphatelutionspuffer in den Adsorptionsmittel-Füllraum 20 strömt, liegt vorzugsweise im Bereich von ungefähr 0,1 bis 10 mL/min und insbesondere im Bereich von ungefähr 1 bis 5 mL/min. Durch Separieren des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins aus der Probenlösung mit einer derartigen Strömungsgeschwindigkeit ist es möglich, ein aus dem Nesseltier gewonnenes vorgegebenes fluoreszierendes Protein aus der Probenlösung zu separieren, ohne dass die Separieroperation lange Zeit in Anspruch nimmt. Das heißt, es ist möglich, eine große Menge des aus dem Nesseltier gewonnenen Proteins zu gewinnen oder das aus dem Nesseltier gewonnene Protein mit hoher Reinheit zu gewinnen.
Durch die oben beschriebenen Operationen wird das aus dem Nesseltier gewonnene Protein in eine vorbestimmte Fraktion gesammelt.
Bei verschiedenen Arten von Aminosäuren hat eine basische Aminosäure wie Histidin, Lysin oder Arginin eine hohe Affinität zu den Metallionen. Wenn der veränderte Körper des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins durch Zufügen von zumindest Histidin, Lysin oder Arginin zu einem aus einem natürlichen Nesseltier gewonnenen Protein gewonnen wird, kann daher das aus dem natürlichen Nesseltier gewonnene Protein durch Anwenden des Separationsverfahrens nach vorliegender Erfindung mit einer höheren Ausscheidungsrate (Ertrag) gesammelt werden.
Ferner hat die basische Aminosäure eine hohe Affinität zu einem Zinkatom (Zinkion), einem Nickelatom (Nickelion), Cobaltatom (Cobaltion) und Kupferatom (Kupferion). Daher kann zumindest ein Teil der Calciumatome von Apatit, wie Hydroxylapatit und Fluorapatit gemäß obiger Beschreibung durch diese Atome (Ione) substituiert werden. Dadurch kann die Affinität des aus dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Proteins zu dem Adsorptionsmittel 3 verbessert werden.
Zu den Beispielen für ein Verfahren zum Substituieren zumindest eines Teils der Calciumatome von Apatit durch die Atome (Ione) gehört ein Verfahren, bei dem eine ein Halid, ein Hydroxid, ein sulfatiertes Material ein carbonisiertes Material und dergleichen enthaltende Flüssigkeit, in der die Atome enthalten sind, mit dem Apatit in Kontakt gebracht wird. Gemäß einem derartigen Verfahren können die Atome relativ leicht an den Calciumatomen substituiert werden.
Bei der vorstehenden Beschreibung wurde das aus dem Nesseltier gewonnene fluoreszierende Protein (oder der veränderte Körper desselben) als ein Beispiel für ein fluoreszierendes Protein beschrieben. Das Separationsverfahren nach vorliegender Erfindung ist jedoch auch in der Lage, ein fluoreszierendes Protein, das in Fisch wie z. B. Anguilla japonica enthalten ist, mit Leichtigkeit und hoher Reinheit zu separieren.
Fluorapatit wie oben beschrieben kann inzwischen unter Anwendung jeder Art von Verfahren hergestellt werden. Vorzugsweise wird Fluorapatit unter Verwendung der folgenden Verfahren (I) oder (II) hergestellt.
Das Verfahren (I) ist ein Verfahren, bei dem zumindest ein Teil von Hydroxylgruppen von Hydroxylapatit durch Fluoratome von Hydrogenfluoridmolekülen substituiert wird. Ein derartiges Verfahren wird ausführt, indem man Hydroxylapatit und die Hydrogenfluoridmoleküle in einem Gemisch reagieren lässt, dass durch Mischen einer Hydroxylapatit enthaltenden Schlämme und einer Hydrogenfluorid enthaltenden Lösung mit den Hydrogenfluoridmolekülen gewonnen wird, um dadurch Fluorapatit zu erzeugen.
Das Verfahren (II) wird folgendermaßen ausgeführt. Eine erste Flüssigkeit, die eine Calcium enthaltende calciumbasierte Verbindung enthält, eine zweite Flüssigkeit, die die Hydrogenfluoridmoleküle enthält, und eine dritte Flüssigkeit, die Phosphorsäure enthält, werden jeweils zubereitet. Danach werden die erste Flüssigkeit, die zweite Flüssigkeit und die dritte Flüssigkeit gemischt, um ein erstes Gemisch zu erhalten. Dann werden die calciumbasierte Verbindung, die Hydrogenfluoridmoleküle und die Phosphorsäure in dem ersten Gemisch zur Reaktion gebracht, um so Fluorapatit zu erzeugen.
Bei einem herkömmlichen Verfahren zum Synthetisieren von Fluorapatit wird Fluorapatit synthetisiert, indem einer Hydroxylapatit enthaltenden Schlämme Ammoniumhydrogenfluorid als Fluorquelle zugefügt wird. Gemäß den Verfahren (I) und (II) ist es jedoch möglich, Fluorapatit zu erzeugen, bei dem keine Verunreinigung enthalten ist oder eine Verunreinigung nur in sehr geringem Maße enthalten ist, da als Fluorquelle die Hydrogenfluoridmoleküle verwendet werden.
Daher ist es möglich, Fluorapatit mit hoher Kristallinität zu erzeugen. Ferner ist es möglich die Säurebeständigkeit des erzeugten Fluorapatits aufgrund der hohen Kristallinität zu verbessern. Daher kann das aus derartigem Fluorapatit bestehende Adsorptionsmittel 3 zum Separieren eines fluoreszierenden Proteins aus einer Probenlösung mit einem Elutionsmittel mit einem relativ niedrigen pH-Wert verwendet werden. In diesem Fall kann der Separationsprozess ohne Auflösen des Adsorptionsmittels 3 ausgeführt werden. Daher wird es möglich, ein solches fluoreszierendes Protein verlässlich aus der Probenlösung zu separieren.
Da der erzeugte Fluorapatit eine große spezifische Oberfläche hat, ermöglicht es die Verwendung des aus solchem Fluorapatit bestehenden Adsorptionsmittels 3 ferner, die Ausscheidungsrate des fluoreszierenden Proteins zu verbessern.
Es folgt eine Beschreibung der Verfahren (I) und (II).
<Verfahren 1>

A1: Zunächst wird eine Schlämme zubereitet, die Hydroxylapatit enthält.

Nachfolgend wird ein Verfahren zum Zubereiten von primären Hydroxylapatitteilchen und zum Zubereiten einer Schlämme beschrieben, in der Aggregate der primären Hydroxylapatitteilchen dispergiert sind.
Die primären Hydroxylapatitteilchen können durch verschiedene Synthetisierverfahren erzeugt werden, sie werden jedoch vorzugsweise in einem Nass-Syntheseferfahren synthetisiert, bei dem zumindest eine Calciumquelle (Calciumverbindung) oder eine Phosphorsäurequelle (Phosphorsäureverbindung) in Form einer Lösung verwendet wird.
Die so hergestellten primären Hydroxylapatitteilchen sind ferner klein und haben daher eine hohe Reaktionsfähigkeit mit Hydrogenfluorid.
Zu den Beispielen für die bei der Nass-Synthese der vorliegenden Erfindung zu verwendende Calciumquelle gehören Calciumhydroxid, Calciumoxid, Calciumnitrat und dergleichen. Zu den Beispielen für die bei der Nass-Synthese der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Phosphorsäurequelle gehören Phosphorsäure, Ammoniumphosphat und dergleichen. Dabei wird als Calciumquelle eine solche bevorzugt, die hauptsächlich das Calciumhydroxid oder das Calciumoxid enthält, und als Phosphorsäurequelle wird eine solche bevorzugt, die hauptsächlich die Phosphorsäure enthält.
Insbesondere können derartige primäre Hydroxylapatitteilchen und eine derartige Schlämme erzeugt werden, indem eine Phosphorsäure-(H₃PO₄)Lösung in eine Suspension aus Calciumhydroxid (Ca(OH)₂) oder Calciumoxid (CaO) in einem Behälter getropft wird und diese durch Rühren gemischt werden.
Der Anteil der in der Schlämme enthaltenen primären Hydroxylapatitteilchen liegt vorzugsweise im Bereich von ungefähr 1 bis 20 Gewichtsprozent und insbesondere im Bereich von ungefähr 5 bis 12 Gewichtsprozent.

A2: Andererseits wird eine Hydrogenfluorid enthaltende Lösung separat von der den Hydroxylapatit enthaltenden Schlämme zubereitet.

Ein Lösungsmittel zum Lösen von Hydrogenfluorid ist nicht speziell eingeschränkt, und es kann jedes beliebige Lösungsmittel verwendet werden, solange es eine Reaktion zwischen Hydroxylapatit und Hydrogenfluorid nicht behindert.
Zu den Beispielen für ein derartiges Lösungsmittel gehören Wasser, ein Alkohol wie Methanol oder Ethanol und dergleichen. Diese Lösungsmittel können in Kombination aus zweien oder mehreren verwendet werden. Jedoch ist dabei Wasser besonders bevorzugt.
Der Anteil des in der Hydrogenfluorid enthaltenden Lösung enthaltenen Hydrogenfluorids liegt vorzugsweise im Bereich von ungefähr 1 bis 60 Gewichtsprozent, insbesondere im Bereich von ungefähr 2,5 bis 10 Gewichtsprozent.

A3: Als nächstes werden die zubereitete Schlämme und die zubereitete Lösung mit Hydrogenfluorid miteinander gemischt, um die primären Hydroxylapatitteilchen mit dem Hydrogenfluorid in dem die Lösung mit Hydrogenfluorid enthaltenden Gemisch (Reaktionsflüssigkeit) zur Reaktion zu bringen, um primäre Fluorapatitteilchen zu erzeugen.

Wie in der folgenden Formel gezeigt, ist es dadurch, dass die primären Hydroxylapatitteilchen mit Hydrogenfluorid in Kontakt gebracht werden, möglich, zumindest einen Teil der Hydroxylgruppen von Hydroxylapatit durch die Fluoratome von Hydrogenfluoridmolekülen zu substituieren, um den Hydroxylapatit in Fluorapatit umzuwandeln und dadurch die primären Fluorapatitteilchen zu erzeugen. Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ → Ca₁₀(PO₄)₆(OH)_2-2xF_2x (wobei 0 < x ≤ 1)
Durch Reagieren der primären Hydroxylapatitteilchen mit Hydrogenfluorid in der die primären Hydroxyapatitteilchen enthaltenden Schlämme können die primären Fluorapatitteilchen leicht hergestellt werden, wie oben beschrieben.
Da die Hydroxylgruppen von Hydroxylapatit während der Stufe der primären Hydroxylapatitteilchen durch die Fluoratome der Hydrogenfluoridmoleküle substituiert werden, haben die erzeugten primären Fluorapatitteilchen ferner eine besonders hohe Substitutionsrate von Hydroxylgruppen durch die Fluoratome.
Da Hydrogenfluorid (HF) als Fluorquelle verwendet wird, wird außerdem kein Nebenprodukt erzeugt bzw. die Menge eines erzeugten Nebenprodukts ist extrem klein gegenüber einem Fall, bei dem Ammoniumhydrogenfluorid (NH₄F), Lithiumfluorid (LiF), Natriumfluorid (NaF), Kaliumfluorid (KF), Magnesiumfluorid (MgF₂) Calciumfluorid (CaF₂) oder dergleichen als Fluorquelle verwendet wird.
Genauer gesagt ist der Verunreinigungsgehalt von Fluorapatit vorzugsweise so gering wie möglich. Beispielsweise beträgt er vorzugsweise 300 ppm oder darunter, insbesondere 100 ppm oder darunter. So kann verhindert oder unterdrückt werden, dass die Fluoratome aus Fluorapatit eliminiert werden, da ihr Verunreinigungsgehalt gering ist, wodurch die Säurebeständigkeit der primären Fluorapatitteilchen verbessert wird.
Gemäß vorliegender Erfindung kann durch Einstellen der Reaktionsbedingungen (z. B. pH-Wert, Temperatur, Zeit) der Reaktion zwischen dem Hydroxylapatit (primäre Teilchen) und Hydrogenfluorid der Verunreinigungsgehalt in den primären Fluorapatitteilchen verlässlich innerhalb des obigen Bereichs gehalten werden. Ferner ist es möglich, die Konzentration eines Fluorions in einem Überstand verlässlich innerhalb eines vorbestimmten Bereichs zu halten.
Insbesondere wird nach vorliegender Erfindung der pH-Wert der Schlämme so eingestellt, dass er innerhalb des Bereichs von 2,5 bis 5 liegt, indem die Hydrogenfluorid enthaltenden Lösung mit der Schlämme gemischt wird, und der Hydroxylapatit (primäre Teilchen) in diesem Zustand mit Hydrogenfluorid reagiert. Dadurch können die Konzentration des Fluorions und der Verunreinigungsgehalt verlässlich innerhalb des obigen Bereichs gehalten werden. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, dass in dieser Beschreibung der pH-Wert der Schlämme einen pH-Wert zu einem Zeitpunkt bedeutet, zu dem die Gesamtmenge der Hydrogenfluorid enthaltenden Lösung mit der Schlämme vermischt ist.
Wird der pH-Wert der Schlämme auf unter 2,5 eingestellt, besteht die Tendenz, dass Hydroxylapatit sich selbst auflöst, und daher wird es schwierig, Hydroxylapatit in Fluorapatit umzuwandeln, um primäre Fluorapatitteilchen zu erzeugen. In diesem Fall besteht ferner ein Problem darin, dass Bestandteile einer Vorrichtung zur Verwendung beim Mischen der primären Hydroxylapatitteilchen mit der Hydrogenfluorid enthaltenden Lösung in die Schlämme eluiert werden, so dass primäre Fluorapatitteilchen mit geringer Reinheit erzeugt werden. Außerdem ist es technisch sehr schwierig, den pH-Wert der Schlämme unter Verwendung der Hydrogenfluorid enthaltenden Lösung auf einen niedrigen Wert unter 2,5 einzustellen.
Andererseits muss zum Einstellen des pH-Werts der Schlämme unter Verwendung der Hydrogenfluorid enthaltenden Lösung auf einen Wert über 5 der Schlämme eine große Menge Wasser beigemischt werden. In diesem Fall wird die Gesamtmenge der Schlämme extrem groß, und als Folge wird der Ertrag der primären Fluorapatitteilchen ausgehend von der Gesamtmenge der Schlämme verringert. Dies ist wirtschaftlich nachteilig.
Im Gegensatz zu den beiden obigen Fällen neigt in einem Fall, in dem der pH-Wert der Schlämme auf einen Wert innerhalb des Bereichs von 2,5 bis 5 eingestellt wird, der durch die Reaktion erzeugte Fluorapatit (primäre Teilchen) einmal dazu, sich aufzulösen und wird dann rekristallisiert. Daher können die primären Fluorapatitteilchen mit hoher Kristallinität erzeugt werden.
Die Schlämme und die Hydrogenfluorid enthaltende Lösung können auf ein Mal vermischt werden, vorzugsweise werden sie jedoch durch tropfenweises Zugeben (Tropfen) der Hydrogenfluorid enthaltenden Lösung in die Schlämme gemischt.
Die Geschwindigkeit, mit der die Hydrogenfluorid enthaltende Lösung in die Schlämme getropft wird, liegt vorzugsweise im Bereich von ungefähr 1 bis 100 L/h, insbesondere im Bereich von ungefähr 3 bis 100 L/h.
Ferner wird die Reaktion zwischen den primären Hydroxylapatitteilchen und Hydrogenfluorid vorzugsweise ausgeführt, während das Gemisch gerührt wird. Durch Rühren des Gemisches ist es möglich, die primären Hydroxylapatitteilchen in gleichmäßigen Kontakt mit Hydrogenfluorid zu bringen und dadurch ein effizientes Fortschreiten der Reaktion zwischen den primären Hydroxylapatitteilchen und dem Hydrogenfluorid zu erlauben. Außerdem ist es möglich, primäre Fluorapatitteilchen zu gewinnen, bei denen die Substitutionsrate der Hydroxylgruppen von Hydroxylapatit durch die Fluoratome der Hydrogenfluoridmoleküle gleichmäßiger ist. Durch Verwenden solcher primären Fluorapatitteilchen kann z. B. ein Adsorptionsmittel (getrocknete Teilchen oder gesinterte Teilchen) hergestellt werden, das weniger Eigenschaftsschwankungen und hohe Verlässlichkeit aufweist.
In diesem Fall liegt die Leistung zum Rühren der Schlämme vorzugsweise im Bereich von ungefähr 0,1 bis 3 W und insbesondere im Bereich von ,5 bis 1,8 W pro 1 Liter der Schlämme.
Die Menge des zu mischenden Hydrogenfluorids wird so bestimmt, dass die Menge der Fluoratome vorzugsweise im Bereich von ungefähr dem 0,65-fachen bis 1,25-fachen, und insbesondere in den Bereich von ungefähr dem 0,75-fachen bis 1,15-fachen bezogen auf die Menge der Hydroxylgruppen von Hydroxylapatit liegt.
Die Temperatur der Reaktion zwischen den primären Hydroxylapatitteilchen und Hydrogenfluorid ist nicht speziell eingeschränkt, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von ungefähr 5 bis 50°C, und insbesondere im Bereich von ungefähr 20 bis 40°C.
In diesem Fall wird Hydrogenfluorid vorzugsweise für eine Zeitdauer von ungefähr 30 Minuten bis 16 Stunden, und insbesondere für eine Zeitdauer von ungefähr 1 bis 8 Stunden in die die primären Hydroxylteilchen enthaltende Schlämme getropft (zugegeben).
Verfahren II

B1: Zunächst wird eine erste Flüssigkeit zubereitet, die eine calciumbasierte Verbindung mit Calcium als Calciumquelle enthält.

Zu den Beispielen für die calciumbasierte Verbindung (Calciumquelle), die in der ersten Flüssigkeit enthalten sein soll, gehören Calciumhydroxid, Calciumoxid, Calciumnitrat und dergleichen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Diese Verbindungen können einzeln oder als Kombination von zwei oder mehreren derselben verwendet werden. Von ihnen ist Calciumhydroxid besonders als Calciumquelle bevorzugt.
Eine Lösung oder Suspension, die die calciumbasierte Verbindung als Calciumquelle enthält, kann als erste Flüssigkeit eingesetzt werden. Wenn es sich bei der Calciumverbindung um Calciumhydroxid handelt, wird vorzugsweise eine Calciumhydroxidsuspension verwendet, bei der Calciumhydroxid in Wasser suspendiert ist.
Der in der ersten Flüssigkeit enthaltene Anteil der calciumbasierten Verbindung als Calciumquelle liegt vorzugsweise im Bereich von ungefähr 1 bis 20 Gewichtsprozent, insbesondere im Bereich von ungefähr 5 bis 12 Gewichtsprozent.

B2: Als nächstes wird eine zweite Flüssigkeit zubereitet, die Hydrogenfluorid enthält (Hydrogenfluorid enthaltende Lösung).

Ein Lösungsmittel zum Lösen von Hydrogenfluorid unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, und es kann jedes Lösungsmittel verwendet werden, das die in dem später zu beschreibenden Schritt B5 ausgeführte Reaktion nicht behindert.
Zu den Beispielen für ein derartiges Lösungsmittel gehören Wasser, ein Alkohol wie Methanol oder Ethanol und dergleichen. Diese Lösungsmittel können als Kombination aus zweien oder mehreren derselben verwendet werden. Wasser ist jedoch besonders bevorzugt.

B3: Als nächstes wird eine dritte Flüssigkeit zubereitet, die Phosphorsäure enthält (Phosphorsäure enthaltende Lösung).

Ein Lösungsmittel zum Lösen von Phosphorsäure unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, und es kann jedes Lösungsmittel verwendet werden, das die in dem später zu beschreibenden Schritt B5 ausgeführte Reaktion nicht behindert. Es kann das gleiche Lösungsmittel verwendet werden, wie das in dem oben beschriebenen Schritt B2 zum Lösen von Hydrogenfluorid verwendete Lösungsmittel.
Es sei darauf hingewiesen, dass das Lösungsmittel zum Lösen von Hydrogenfluorid und das Lösungsmittel zum Lösen von Phosphorsäure vorzugsweise die gleiche Art von Lösungsmittel oder das gleiche Lösungsmittel sind.
Ein erstes Gemisch wird erzeugt, indem die erste, die zweite und die dritte Flüssigkeit, die jeweils wie oben beschrieben zubereitet wurden, miteinander gemischt werden. Die Reihenfolge des Mischens ist nicht eingeschränkt, so lange die calciumbasierte Verbindung, das Hydrogenfluorid und die Phosphorsäure in dem später beschriebenen Schritt S5 gleichzeitig in dem ersten Gemisch bestehen können. Es ist jedoch vorzuziehen, dass nach Mischen der zweiten Flüssigkeit mit der dritten Flüssigkeit zum Erzeugen eines zweiten Gemischs dann das zweite Gemisch der ersten Flüssigkeit zugegeben wird, um das erste Gemisch herzustellen.
Durch Mischen der ersten, der zweiten und der dritten Flüssigkeit in dieser Reihenfolge können die zweite Flüssigkeit und die dritte Flüssigkeit gleichmäßig mit der ersten Flüssigkeit gemischt werden. Ferner können die Hydroxylgruppen des Hydroxylapatits gleichmäßig durch die Fluoratome der Hydrogenfluoridmoleküle substituiert werden. Ferner kann das Erzeugen eines Nebenprodukts wie Calciumfluorid verlässlich verhindert oder unterdrückt werden.
In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, dass zu den Beispielen für ein Verfahren zum Herstellen des ersten Gemischs außer dem oben beschriebenen Verfahren gehören: ein Verfahren, bei dem die zweite Flüssigkeit und die dritte Flüssigkeit der ersten Flüssigkeit im Wesentlichen gleichzeitig beigemischt werden; ein Verfahren, bei dem die erste Flüssigkeit und die dritte Flüssigkeit der zweiten Flüssigkeit im Wesentlichen gleichzeitig beigemischt werden; und ein Verfahren, bei dem die erste Flüssigkeit und die zweite Flüssigkeit der dritten Flüssigkeit im Wesentlichen gleichzeitig beigemischt werden.
Die folgende repräsentative Beschreibung bezieht sich auf den Fall, bei dem nach Herstellen des zweiten Gemischs das zweite Gemisch mit der ersten Flüssigkeit gemischt wird, um das erste Gemisch zu erhalten und dadurch Fluorapatit herzustellen.

B4: Als nächstes werden die zweite Flüssigkeit und die dritte Flüssigkeit, die in Schritt B2 bzw. B3 zubereitet wurden, miteinander gemischt, um das zweite Gemisch zu erhalten.

Der Anteil des in dem zweiten Gemisch enthaltenen Hydrogenfluorids liegt vorzugsweise im Bereich von ungefähr 0,5 bis 60 Gewichtsprozent und insbesondere im Bereich von ungefähr 1,0 bis 10 Gewichtsprozent.
Der Anteil der in dem zweiten Gemisch enthaltenen Phosphorsäure liegt vorzugsweise in dem Bereich von ungefähr 1,0 bis 90 Gewichtsprozent und insbesondere im Bereich von ungefähr 5,0 bis 20 Gewichtsprozent.
Die Menge der in dem zweiten Gemisch enthaltenen Phosphorsäure liegt vorzugsweise im Bereich des ungefähr 2,0- bis 4,5-fachen und insbesondere im Bereich des 2,8- bis 4,0-fachen der Molmenge bezogen auf das in dem zweiten Gemisch enthaltenen Hydrogenfluorid.

B5: Als nächstes wird die erste Flüssigkeit (Lösung mit der calciumbasierten Verbindung), die im oben beschriebenen Schritt B1 zubereitet wurde, mit dem im oben beschriebenen Schritt B4 gewonnenen zweiten Gemisch gemischt, um das erste Gemisch zu erhalten. Dann wird die als Calciumquelle dienende calciumbasierte Verbindung mit Hydrogenfluorid und Phosphorsäure in dem ersten Gemisch zur Reaktion gebracht, um so primäre Fluorapatitteilchen zu erzeugen.

Insbesondere können in dem Fall, in dem Calciumhydroxid als Calciumquelle verwendet wird, dadurch dass Calciumhydroxid mit Hydrogenfluorid und Phosphorsäure in Kontakt gebracht wird, primäre Fluorapatitteilchen wie in der folgenden Formel gezeigt erzeugt werden. 10Ca(OH)₂ + 6H₃(PO₄) + 2HF → Ca₁₀(PO₄)₆(OH)_2-2xF_2x + 18H₂O + 2(H₂O)x + 2HF_1-x (wobei 0 < x ≤ 1)
Wie oben beschrieben, können die primären Fluorapatitteilchen verlässlich erzeugt werden, indem Hydrogenfluorid und Phosphorsäure mit der calciumbasierten Verbindung (Calciumhydroxid) als Calciumquelle in Kontakt gebracht werden, und dann Hydrogenfluorid, Phosphorsäure und die calciumbasierte Verbindung mit der einfachen Vorgehensweise zur Reaktion gebracht werden, dass die erste Flüssigkeit mit dem zweiten Gemisch vermischt wird.
Fluorapatit, der durch die Reaktion nach obiger Formel hergestellt wird, hat eine große spezifische Oberfläche.
Wie in obiger Formel gezeigt, geht man davon aus, dass Fluorapatit hergestellt wird, indem gleichzeitig mit dem Erzeugen der primären Hydroxylapatitteilchen die Hydroxylgruppen von Hydroxylapatit durch die Fluoratome der Hydrogenfluoridmoleküle substituiert werden. Daher ist es möglich, eine hohe Substitutionsrate der Hydroxylgruppen von Hydroxylapatit durch die Fluoratome der Hydrogenfluoridmoleküle zu erhalten.
Da bei der vorliegenden Erfindung Hydrogenfluorid (HF) als Fluorquelle verwendet wird, wird außerdem kein Nebenprodukt erzeugt bzw. die Menge eines erzeugten Nebenprodukts ist extrem klein gegenüber einem Fall, bei dem Ammoniumfluorid (NH₄F), Lithiumfluorid (LiF), Natriumfluorid (NaF), Kaliumfluorid (KF), Magnesiumfluorid (MgF₂) Calciumfluorid (CaF₂) oder dergleichen als Fluorquelle verwendet wird. Daher kann die Menge des in den primären Fluorapatitteilchen enthaltenen Nebenprodukts klein gehalten werden, so dass die Säurebeständigkeit der primären Fluorapatitteilchen verbessert wird. In diesem Zusammenhang wird der Begriff „Verunreinigung” hier für Ammonium, Lithium oder ähnliches verwendet, das aus dem Rohstoff des Fluorapatits erhalten wurde.
Genauer gesagt ist der Verunreinigungsgehalt von Fluorapatit vorzugsweise so gering wie möglich. Beispielsweise beträgt er vorzugsweise 300 ppm oder darunter, insbesondere 100 ppm oder darunter. Dadurch kann die Säurebeständigkeit der primären Fluorapatitteilchen dank ihres geringen Verunreinigungsgehalts weiter verbessert werden.
Gemäß vorliegender Erfindung kann durch Einstellen der Bedingungen (z. B. pH-Wert, Temperatur, Zeit) der Reaktion zwischen der calciumbasierten Verbindung (Calciumquelle), dem Hydrogenfluorid und der Phosphorsäure der Verunreinigungsgehalt in den primären Fluorapatitteilchen verlässlich innerhalb des obigen Bereichs gehalten werden.
Die erste Flüssigkeit und das zweite Gemisch können zum Gewinnen des ersten Gemischs auf ein Mal miteinander gemischt werden, sie werden jedoch vorzugsweise gemischt, indem das zweite Gemisch tropfenweise in die erste Flüssigkeit gegeben wird (getropft wird). Durch Tropfen des zweiten Gemischs in die erste Flüssigkeit ist es möglich, die calciumbasierte Verbindung, das Hydrogenfluorid und die Phosphorsäure relativ leicht zur Reaktion zu bringen.
Es ist möglich, den pH-Wert des zweiten Gemischs leichter und verlässlicher auf einen Wert innerhalb eines geeigneten Bereichs einzustellen. Daher kann das Zersetzen oder Auflösen des hergestellten Fluorapatits verhindert werden. Folglich ist es möglich, Fluorapatit (primäre Fluorapatitteilchen) mit hoher Reinheit und großer spezifischer Oberfläche mit einem hohen Ertrag zu erzeugen.
Die Geschwindigkeit, mit der das zweite Gemisch in die erste Flüssigkeit getropft wird, liegt vorzugsweise im Bereich von ungefähr 1 bis 100 L/h und insbesondere im Bereich von ungefähr 10 bis 100 L/h. Durch Mischen (Zugeben) des zweiten Gemischs mit (zu) der ersten Flüssigkeit mit einer derartigen Tropfgeschwindigkeit ist es möglich, die calciumbasierte Verbindung, das Hydrogenfluorid und die Phosphorsäure unter milderen Bedingungen zur Reaktion zu bringen.
Ferner wird die Reaktion zwischen der calciumbasierten Verbindung, dem Hydrogenfluorid und der Phosphorsäure vorzugsweise ausgeführt, während das erste Gemisch gerührt wird. Durch Rühren des ersten Gemischs ist es möglich, die calciumbasierte Verbindung in gleichmäßigen Kontakt mit dem Hydrogenfluorid und der Phosphorsäure zu bringen und so ein effizientes Fortschreiten der Reaktion zwischen der calciumbasierten Verbindung, dem Hydrogenfluorid und der Phosphorsäure zu ermöglichen. Außerdem werden die Hydroxylgruppen des Hydroxylapatits gleichmäßig durch die Fluoratome der Hydrogenfluoridmoleküle substituiert. Durch Verwenden derartiger primärer Fluorapatitteilchen kann z. B. ein Adsorptionsmittel (getrocknete Teilchen oder gesinterte Teilchen) 3 mit weniger Eigenschaftsschwankungen und hoher Verlässlichkeit hergestellt werden.
In diesem Fall liegt die Leistung, mit der das erste Gemisch (Schlämme) gerührt wird, vorzugsweise im Bereich von ungefähr 0,5 bis 3 W und insbesondere im Bereich von ungefähr 0,9 bis 1,9 W pro 1 Liter der Schlämme.
Die Temperatur der Reaktion zwischen der calciumbasierten Verbindung als Calciumquelle, dem Hydrogenfluorid und der Phosphorsäure ist nicht speziell eingeschränkt, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von ungefähr 5 bis 50°C und insbesondere im Bereich von ungefähr 20 bis 40°C.
Zwar wurde das Separationsverfahren gemäß vorliegender Erfindung unter Bezugnahme auf ihre bevorzugten Ausführungsbeispiele beschrieben, doch ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt. Beispielsweise kann das Separationsverfahren nach vorliegender Erfindung zusätzlich einen oder mehrere Schritt/e für beliebige Zwecke enthalten.
Beispiele
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Beispiele erläutert.
(Beispiel 1)

– 1 – Zunächst wurde ein Seidenraupenkokon (Kokonfäden), der ein rekombinantes GFP (aus Aequorea Victoria gewonnenes fluoreszierendes Protein) enthielt, unter Verwendung einer Mühle zu Pulver gemahlen, um ein Pulver des Seidenraupenkokons zu gewinnen. Hierbei war das rekombinante GFP ein veränderter Körper, in dem sechs Histidine an das aus natürlicher Aequorea Victoria gewonnene fluoreszierende Protein (GFP) gebunden waren. Der das rekombinante GFP enthaltende Seidenraupenkokon wurde von NEO SILK Co., Ltd. bezogen.
– 2 – Dann wurden 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 7,5), die 150 mM NaCl enthielt, zu 120 mg Pulver hinzugefügt, um ein Gemisch zu erhalten, danach wurde das erzeugte Gemisch gerührt. Dabei ist zu bemerken, dass die Rührbedingungen derart eingestellt waren, dass die Rührgeschwindigkeit 30 Umdrehungen pro Minute betrug, die Temperatur der Tris-HCl-Pufferlösung 4°C betrug und die Rührzeit 48 Stunden betrug.
– 3 – Dann wurde das gerührte Gemisch einer Zentrifugaltrennungsbehandlung unterzogen (15000 Umdrehungen pro Minute für 5 Minuten bei einer Temperatur von 4°C), um einen Überstand zu gewinnen, und der Überstand wurde dann unter Anwendung eines Ultrafiltrationsverfahrens konzentriert. Der so konzentrierte Überstand wurde als eine Probenlösung verwendet, die das rekombinante GFP und verunreinigende Proteine aus dem Seidenraupenkokon enthielt.
– 4 – Dann wurden 50 μL der Probenlösung in einen Adsorptionsmittel-Füllraum einer Adsorptionsvorrichtung zugeführt (eingebracht), um das rekombinante GFP und verunreinigende Proteine an einem Adsorptionsmittel zu adsorbieren. Danach wurde ein Elutionsmittel A für 5 Minuten mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min in den Adsorptionsmittel-Füllraum zugeführt. Danach wurde ein Gemisch des Elutionsmittels A und eines Elutionsmittels B für 15 Minuten mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min in den Adsorptionsmittel-Füllraum eingeführt, so dass das Mengenverhältnis zwischen dem Elutionsmittel A und dem Elutionsmittel B kontinuierlich im Bereich von 0 bis 100% verändert wurde. Dann wurde das Elutionsmittel B für 5 Minuten mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ML/min in den Adsorptionsmittel-Füllraum eingeführt. Durch den oben beschriebenen Einführprozesss wurden das rekombinante GFP und verunreinigende Proteine von dem Adsorptionsmittel zu dem Elutionsmittel A, dem Gemisch oder dem Elutionsmittel B desorbiert, um so ein Eluens zu erhalten, das das rekombinante GFP und/oder die verunreinigenden Proteine enthielt. Dann wurde das das rekombinante GFP und/oder die verunreinigenden Proteine enthaltende Eluens aus dem Adsorptionsmittel-Füllraum nach außerhalb der Adsorptionsvorrichtung abgegeben. Das abgegebene Eluens wurde in Gefäße von 2 mL fraktioniert.

In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, dass in der Adsorptionsvorrichtung eine Säule (Größe 4 mm × 100 mm) verwendet wurde, in der 0,9 g Hydroxylapatit-Kügelchen („CHT Typell” mit einem mittleren Durchmesser von 40 μm wurde von Pentax (HOYA Corporation) hergestellt.) als Adsorptionsmittel in den Adsorptionsmittel-Füllraum gefüllt waren.
Ferner sei darauf hingewiesen, dass 1 mM Phosphatelutionspuffer (pH-Wert 6,8) als Elutionsmittel A und 400 mM Phosphatelutionspuffer (pH-Wert 6,8) als Elutionsmittel B verwendet wurden.
Als Ergebnis konnte das aus Aequorea Victoria gewonnene fluoreszierende Protein von den in der Probenlösung enthaltenen verunreinigenden Proteinen, die aus dem Seidenkokon gewonnen wurden, separiert werden. Dieses Ergebnis wurde als Spitzen dargestellt, von denen eine Spitze bei ungefähr 11 Minuten der Laufzeit in 2 eine Spitze des rekombinanten GFP darstellte und die anderen Spitzen im Bereich von ungefähr 8 bis 10 Minuten der Laufzeit in 2 Spitzen der verunreinigenden Proteine darstellten. Das heißt, das aus Aequorea Victoria gewonnene fluoreszierende Protein konnte in Fraktionen (den Gefäßen) gesammelt werden, die das Eluens enthielten, das im Bereich von 10 bis 12 Minuten aus dem Adsorptionsmittel-Füllraum nach außerhalb der Adsorptionsvorrichtung abgegeben wurde.
Ebenso wurden die obigen Prozesse 50 Mal wiederholt ausgeführt. Die Ergebnisse waren die gleichen wie die obigen Ergebnisse.
Vergleichsbeispiel
Gemäß einem Verfahren, das in M. Tomita et al., Transgenic Res., 16, 449–465, 2007 beschrieben ist, wurde ein rekombinates GFP, das das gleiche wie das bei Beispiel 1 verwendete war, unter Verwendung einer Ni-Affinitätssäule von aus einem Seidenraupenkokon gewonnenen verunreinigenden Proteinen separiert.
Als Ergebnis waren die Separation und das Sammeln des rekombinanten GFP möglich. Zu einem Zeitpunkt, zu dem die gleichen Prozesse wie die des Beispiels 1 30 Mal wiederholt waren, trat jedoch Verstopfen an der Ni-Affinitätssäule auf.
Beispiel 2
Ein aus Aequorea Victoria extrahiertes natürliches GFP wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 von aus einem Seidenraupenkokon gewonnenen verunreinigenden Proteinen separiert und in Fraktionen gesammelt. Die Ergebnisse waren die gleichen wie die des Beispiels 1. Ferner wurde nach einem Verfahren, das in US-A-2008-0301823 beschrieben ist, ein natürliches Protein in einen Seidenraupenkokon bildenden Fäden erzeugt, und dann wurde das natürliche GFP auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 von aus dem Seidenraupenkokon gewonnenen verunreinigenden Proteinen separiert und in Fraktionen gesammelt. Die Ergebnisse waren die gleichen wie die des Beispiels 1. Hierbei war die Zahl von in dem natürlichen GFP enthaltenem Histidin kleiner als bei dem rekombinanten GFP. Daher gab es eine Tendenz dahingehend, dass die Retentionszeit des natürlichen GFP in einer Absorptionskurve aufgrund der Menge des darin enthaltenen Histidin etwas früher war als die des rekombinanten GFP.
Außerdem wurde das natürliche GFP von den aus dem Seidenraupenkokon gewonnenen verunreinigenden Proteinen auf die gleiche Weise wie bei Beispiel 1 separiert und in Fraktionen gesammelt, wobei als Adsorptionsmittel die wie oben beschrieben hergestellten Fluorapatitkügelchen verwendet wurden. Die Ergebnisse waren die gleichen wie die des Beispiels 1. Dabei gab es eine Tendenz dahingehend, dass es durch die Verwendung eines derartigen Adsorptionsmittels möglich ist, die Zahl der wiederholt auszuführenden Separationsoperationen zu verbessern.
Außerdem wurde zumindest eines von Calciumatomen von Hydroxylapatit durch zumindest eines von Zinkatomen (Zinkionen), Nickelatomen (Nickelionen), Cobaltatomen (Cobaltionen) und Kupferatomen (Kupferionen) substituiert, um Hydroxylapatitkügelchen als Adsorptionsmittel zu erhalten. Ein natürliches GFP wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 von aus einem Seidenraupenkokon gewonnenen verunreinigenden Proteinen separiert und in Fraktionen gesammelt. Die Ergebnisse waren die gleichen wie die des Beispiels 1.
Dabei gab es eine Tendenz dahingehend, dass die Retentionszeit des natürlichen GFP und der verunreinigenden Proteine, die unter Verwendung derartiger Hydroxylapatitkügelchen als Adsorptionsmittel, separiert wurden, jeweils später lag als die des natürlichen GFP und der verunreinigenden Proteine, die unter Verwendung des Adsorptionsmittels in Beispiels 1 separiert wurden, da die Affinität zwischen dem natürlichen Protein und dem Adsorptionsmittel verbessert war. Diese Tendenz zeigte sich besonders deutlich im Fall der Verwendung des rekombinanten GFP.
Außerdem wurde ein rekombinantes GFP auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 von aus einem Seidenraupenkokon gewonnenen verunreinigenden Proteinen separiert, außer dass das rekombinante GFP zu einem fluoreszierenden Protein aus Anguilla japonica geändert wurde. Die Ergebnisse waren die gleichen wie die des Beispiels 1.
Es ist außerdem darauf hinzuweisen, dass die vorliegende Beschreibung auf den Inhalt der japanischen Patentanmeldung 2008-042209 (angemeldet am 22. Februar 2008) Bezug nimmt, der hier ausdrücklich in seiner Gesamtheit einbezogen ist.
Falls nicht anders erwähnt, umfasst ein Hinweis auf eine Verbindung oder einen Bestandteil die Verbindung oder den Bestandteil allein sowie in Kombination mit anderen Verbindungen oder Bestandteilen, wie z. B. Gemische von Verbindungen.
Die Singularformen „ein/eine” und „der, die das”, wie sie hier verwendet werden, schließen die jeweilige Pluralform mit ein, sofern der Kontext nichts anderes ergibt.
Außer dort, wo es anders beschrieben ist, können alle Zahlen, die Mengen von Inhaltstoffen bezeichnen, die Reaktionsbedingungen usw. bezeichnen, welche in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet werden, mit dem Begriff „ungefähr” versehen werden. Solange nichts Gegenteiliges angegeben ist, sind die in der folgenden Beschreibung und den angefügten Ansprüchen angegebenen numerischen Parameter also Näherungen, die in Abhängigkeit der gewünschten Eigenschaften variieren können, die durch die vorliegende Erfindung erhalten werden sollen. Schließlich, und dies sei nicht als Versuch verstanden, die Anwendung der Äquivalenzlehre auf den Umfang der Ansprüche zu begrenzen, ist jeder numerische Parameter angesichts der Zahl der maßgeblichen Stellen und gewöhnlicher Rundungsregeln auszulegen.
Zudem ist die Angabe von Zahlenbereichen innerhalb dieser Beschreibung als Offenbarung aller numerischen Werte und Bereiche innerhalb dieses Bereichs zu verstehen. Ist beispielsweise ein Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 50 angegeben, so soll er z. B. 1, 7, 34, 46.1, 23.7 oder jeglichen anderen Wert oder Bereich innerhalb des Bereichs einschließen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- US 2008-0301823 A [0022, 0022, 0150]
- JP 2008-042209 [0155]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- M. Tomita et al., Transgenic Res., 16, 449–465, 2007 [0005]
- M. Tomita et al., Transgenic Res., 16, 449–465, 2007 [0148]

Claims

Verfahren zum Separieren eines fluoreszierenden Proteins aus einer Probe mit einer Vielzahl von Proteinen, die das fluoreszierende Protein enthält, wobei das Verfahren umfasst: Herstellen einer Probenlösung durch Zugeben der Probe zu einer Flüssigkeit, Herstellen einer Adsorptionsvorrichtung mit einem Füllraum zum Füllen eines Adsorptionsmittels, das eine Oberfläche hat, wobei zumindest die Oberfläche des Adsorptionsmittels aus einer calciumphosphatbasierten Verbindung besteht und zumindest ein Teil des Füllraums mit dem Adsorptionsmittel gefüllt ist, Zuführen der Probenlösung in den Füllraum der Adsorptionsvorrichtung, so dass die Vielzahl von Proteinen von dem Adsorptionsmittel adsorbiert wird, Zuführen eines Phosphatelutionspuffers zum Eluieren des in der Vielzahl von Proteinen enthaltenen fluoreszierenden Proteins aus dem Adsorptionsmittel in den Füllraum der Adsorptionsvorrichtung, um dadurch ein Eluens zu gewinnen, das das fluoreszierende Protein enthält, und Fraktionieren des aus dem Füllraum der Adsorptionsvorrichtung abgegebenen Eluens in einen Teil des Phosphatelutionspuffers, der das fluoreszierende Protein enthält, und andere Teile desselben, um dadurch das fluoreszierende Protein aus der Vielzahl von Proteinen zu separieren.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem bei dem Schritt des Zuführens des Phosphatelutionspuffers der pH-Wert des Phosphatelutionspuffers im Bereich von 6 bis 8 liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem bei dem Schritt des Zuführens des Phosphatelutionspuffers die Temperatur des Phosphatelutionspuffers im Bereich von 30 bis 50°C liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem bei dem Schritt des Zuführens des Phosphatelutionspuffers die Salzkonzentration des Phosphatelutionspuffers 500 mM oder darunter beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem bei dem Schritt des Zuführens des Phosphatelutionspuffers und bei dem Schritt des Fraktionierens des Eluens die Strömungsgeschwindigkeit des Phosphatelutionspuffers in dem Füllraum der Adsorptionsvorrichtung im Bereich von 0,1 bis 10 mL/min liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das fluoreszierende Protein zumindest ein aus einem Nesseltier gewonnenes fluoreszierendes Protein oder ein veränderter Körper desselben ist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der veränderte Körper durch Zufügen von zumindest Histidin, Lysin oder Arginin zu dem von dem Nesseltier gewonnenen fluoreszierenden Protein.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das fluoreszierende Protein in einen Seidenraupenkokon darstellenden Fäden ausgedrückt ist, indem eine Nukleinsäure, die ein dem fluoreszierenden Protein entsprechendes Gen enthält, in eine Nukleinsäure der Seidenraupe überführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Calciumphosphatverbindung aus Hydroxylapatit als Hauptbestandteil besteht.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem der Hydroxylapatit Hydroxylgruppen enthält und der Hydroxylapatit mit Fluoratome enthaltenden Hydrogenfluoridmolekülen reagiert wird, um einen Fluorapatit zu gewinnen, wobei zumindest eine der Hydroxylgruppen des Hydroxylapatits durch die Fluoratome der Hydrogenfluoridmoleküle substituiert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem der Fluorapatit folgendermaßen erzeugt wird: Bereiten einer den Hydroxylapatit enthaltenden Schlämme, Bereiten einer Hydrogenfluorid enthaltenden Lösung, die die Hydrogenfluoridatome enthält, Mischen der Schlämme und der Hydrogenfluorid enthaltenden Lösung, um ein Gemisch daraus zu gewinnen, und Reagieren des in der Schlämme enthaltenen Hydroxylapatits und der in der Hydrogenfluorid enthaltenden Lösung enthaltenen Hydrogenfluoridmoleküle in dem Gemisch, um dadurch die zumindest eine der Hydroxylgruppen des Hydroxylapatits durch die Fluoratome der Hydrogenfluoridmoleküle zu substituieren.
Verfahren nach Anspruch 11, bei der pH-Wert des Gemischs im Bereich von 2,5 bis 5,0 liegt.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem der Fluorapatit folgendermaßen erzeugt wird: Bereiten einer ersten Flüssigkeit, das eine Calcium enthaltende calciumbasierte Verbindung enthält, einer das Hydrogenfluorid enthaltenden zweiten Flüssigkeit und einer Phosphorsäure enthaltenden dritten Flüssigkeit und nachfolgendes Herstellen eines ersten Gemischs durch Mischen der ersten Flüssigkeit, der zweiten Flüssigkeit und der dritten Flüssigkeit und nachfolgendes Reagieren der calciumbasierten Verbindung, des Hydrogenfluorids und der Phosphorsäure in dem ersten Gemisch.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem der Schritt zum Gewinnen des ersten Gemischs durch Mischen der zweiten Flüssigkeit und der dritten Flüssigkeit zum Gewinnen eines zweiten Gemischs und nachfolgendes Mischen des zweiten Gemischs mit der ersten Flüssigkeit ausgeführt wird.