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Die
Erfindung betrifft ein Separierungsverfahren, insbesondere ein Verfahren
zum Separieren mindestens eines Phycobilin-Pigments von einer Vielzahl
Phycobilin-Pigmente
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Technischer Hintergrund
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Als
ein Verfahren zum Erfassen eines Objekts mit hoher Empfindlichkeit
unter Anwendung einer Antigen-Antikörper-Reaktion wird
ein heterologer Enzym-Immunassay (ELISA) o. ä. angewendet.
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Ein
solcher heterologer Enzym-Immunassay verwendet ein Reagenz, das
z. B. erhalten wird durch Präparieren eines Antikörpers,
der speziell an einem zu erfassenden Objekt (d. h. einem Antigen)
gebunden werden kann und das Mitführen (Binden) eines fluoreszenten
Materials als Marker an dem Antikörper ermöglicht.
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In
den letzten Jahren hat man sich mit der Verwendung fluoreszenter
Proteine befasst, die in Algen als solche fluoreszenten Stoffe vorkommen.
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Das
Dokument
JP-A-2003-231821 beschreibt
z. B. ein Verfahren zum Extrahieren eines fluoreszenten Proteins
(Phycoerythrin) aus Algen unter Anwendung einer Pufferlösung.
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Es
ist aber bei der Anwendung des in
JP-A-2003-231821 beschriebenen Verfahrens schwierig,
das Auftreten anderer fluoreszenter Proteine als Phycoerythrin oder
anderer Proteine als das fluoreszente Protein in einem Extrakt zu
ausreichend zu verhindern.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Separationsverfahren
anzugeben, mit dem ein spezielles Phycobilin-Pigment mit hoher Reinheit in
einer einfachen Operation separiert werden kann.
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Diese
Aufgabe wird durch die vorliegenden Erfindungen (1) bis (11) gelöst,
die im Folgenden beschrieben werden.
- (1) Verfahren
zum Separieren mindestens eines Phycobilin-Pigments aus einer Probe,
die mehrere Phycobilin-Pigmente enthält, umfassend:
Herstellen
einer Adsorptionsvorrichtung mit einem Füllraum zum Füllen
eines Adsorptionsmittels mit einer Oberfläche, wobei mindestens
die Oberfläche des Adsorptionsmittels aus einer Calciumphosphatverbindung
besteht und mindestens ein Teil des Füllraums mit dem Adsorptionsmittel
gefüllt ist;
Zubereiten einer Probenlösung
durch Mischen der Probe und eines Phosphatpuffers;
Zuführen
der Probenlösung in den Füllraum der Adsorptionsvorrichtung
derart, dass die Vielzahl von Phycobilin-Pigmenten durch das Adsorptionsmittel
adsorbiert werden;
kontinuierliches oder schrittweises Zuführen
von Phosphatelutionspuffern zum Elutieren mindestens eines der Vielzahl
der Phycobilin-Pigmente aus dem Adsorptionsmittel in den Füllraum
der Adsorptionsvorrichtung, um dadurch ein Eluens zu erhalten, das
mindestens ein Phycobilin-Pigment enthält, wobei die Phosphatelutionspuffer unterschiedliche
Salzkonzentrationen haben; und
Fraktionieren des Eluens, das
aus dem Füllraum der Adsorptionsvorrichtung ausgegeben
wird, in unterschiedliche Anteile entsprechend dem jeweiligen Phosphatelutionspuffer,
um dadurch das mindestens eine Phycobilin-Pigment aus den anderen
Phycobilin-Pigmenten zu separieren.
Dies ermöglicht
das Separieren eines speziellen Phycobilin Pigments in hoher Reinheit
in einer einzigen Operation.
- (2) In dem vorstehend unter (1) beschriebenen Verfahren wird
ferner das mindestens eine Phycobilin-Pigment kristallisiert durch
Hinzufügen eines kristallisierten Agens in das Eluens.
- (3) Bei dem vorstehend unter (1) beschriebenen Verfahren besteht
die Calciumphosphatverbindung aus Hydroxylapatit als Hauptkomponente.
Dies
ermöglicht auch das effiziente Separieren der Phycobilin-Pigmente
und das leichte Separieren der Mehrzahl von Phycobilin-Pigmente
voneinander.
- (4) Bei dem vorstehend unter (3) beschriebenen Verfahren, dem
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Mehrzahl Phycobilin-Pigmenten
R-Phycoerythrin enthalten und die Phosphatelutionspuffer einen ersten
Phosphatelutionspuffer enthalten, dessen Salzkonzentration 1 mM
oder höher, jedoch geringer als 25 mM ist, wird bei dem
Zuführschritt der erste Elutionsphosphatpuffer in den Füllraum
eingeführt, und dann wird bei dem Fraktionierschritt das
R-Phycoerythrin aus dem Eluens gewonnen, das dem ersten Elutionsphosphatpuffer
entspricht.
Dies ermöglicht auch das zuverlässige
Separieren des R-Phycoerythrin aus den anderen Phycobilin-Pigmenten.
- (5) Das vorstehend unter (3) beschriebene Verfahren, das Verfahren
nach Anspruch 3, kann ein Prozess sein, bei dem die Vielzahl der
Phycobilin-Pigmente R-Phycoerythrin und Phycocyanin enthält
und die Phosphatelutionspuffer enthalten: einen ersten Phosphatelutionspuffer,
dessen Salzkonzentration 1 mM oder mehr, jedoch weniger als 25 mM
beträgt; und einen zweiten Phosphatelutionspuffer dessen
Salzkonzentration 25 mM oder mehr, jedoch weniger als 75 mM beträgt; wobei
in dem Zuführungsschritt der erste Phosphatelutionspuffer
und der zweite Phosphatelutionspuffer in den Füllraum schrittweise
in dieser Reihenfolge eingeführt werden und dann in dem Fraktionierschritt
das R-Phycoerythrin aus dem Eluens entsprechend dem ersten Phosphatelutionspuffer
und das R-Phycoerythrin und das Phycocyanin aus dem Eluens entsprechend
dem zweiten Phosphatelutionspuffer in dieser Reihenfolge ausgeschieden
wird.
Dies ermöglicht auch das zuverlässige
Separieren des R-Phycoerythrins und des Phycocyanins aus den anderen
Phycobilin-Pigmenten.
- (6) Das vorstehend unter (3) beschriebene Verfahren, das Verfahren
nach Anspruch 3, kann ein Prozess sein, bei dem die Vielzahl Phycobilin-Pigmente
R-Phycoerythrin, Phycocyanin und Allophycocyanin enthalten und die
Phosphatelutionspuffer enthalten: einen ersten Phosphatelutionspuffer,
dessen Salzkonzentration 1 mM oder mehr, jedoch weniger als 25 mM
beträgt; einen zweiten Phosphatelutionspuffer, dessen Salzkonzentration
25 mM oder mehr, jedoch weniger als 75 mM beträgt; und
einen dritten Phosphatelutionspuffer, dessen Salzkonzentration 75
mM oder mehr, jedoch weniger als 250 mM beträgt; wobei in
dem Zuführungsschritt der erste Phosphatelutionspuffer,
der zweite Phosphatelutionspuffer und der dritte Phosphatelutionspuffer
in den Füllraum schrittweise in dieser Reihenfolge eingeführt
werden und dann in dem Fraktionierschritt das R-Phycoerythrin aus
dem Eluens entsprechend dem ersten Phosphatelutionspuffer, das R-Phycoerythrin
und das Phycocyanin aus dem Eluens entsprechend dem zweiten Phosphatelutionspuffer
in dieser Reihenfolge ausgeschieden werden, und das Allophycocyanin
aus dem Eluens entsprechend dem dritten Phosphatelutionspuffer ausgeschieden
wird.
Dies ermöglicht auch das zuverlässige
Separieren des R-Phycoerythrins, des Phycocyanins und des Allophycocyanins
aus den anderen Phycobilin-Pigmenten.
- (7) Das vorstehend unter (3) beschriebene Verfahren, das Verfahren
nach Anspruch 3, kann ein Prozess sein, bei dem die Vielzahl der
Phycobilin-Pigmente R-Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin
und Y-Phycoerythrin enthält und die Phsophatelutionspuffer
enthalten: einen ersten Phosphatelutionspuffer, dessen Salzkonzentration
1 mM oder mehr, jedoch weniger als 25 mM beträgt; einen
zweiten Phosphatelutionspuffer, dessen Salzkonzentration 25 mM oder
mehr, jedoch weniger als 75 mM beträgt; einen dritten Phosphatelutionspuffer,
dessen Salzkonzentration 75 mM oder mehr, jedoch weniger als 250
mM beträgt; und einen vierten Phosphatelutionspuffer, dessen
Salzkonzentration 250 mM oder mehr beträgt;
wobei
in dem Zuführschritt der erste Phosphatelutionspuffer,
der zweite Phosphatelutionspuffer, der dritte Phosphatelutionspuffer
und der vierte Phosphatelutionspuffer in den Füllraum schrittweise
in dieser Reihenfolge eingegeben werden und dann in dem Fraktionierschritt
das R-Phycoerythrin aus dem Eluens entsprechend dem ersten Phosphatelutionspuffer
und das R-Phycoerythrin und das Phycocyanin aus dem Eluens entsprechend
dem zweiten Phosphatelutionspuffer in dieser Reihenfolge ausgeschieden
werden, das Allophycocyanin aus dem Eluens entsprechend dem dritten
Phosphatelutionspuffer ausgeschieden wird und das Y-Phycoerythrin
aus dem Eluens entsprechend dem vierten Phosphatelutionspuffer ausgeschieden
wird.
Dies ermöglicht auch das zuverlässige
Separieren des R-Phycoerythrins, des Phycocyanins, des Allophycocyanins
und des Y-Phycoerythrins aus den anderen Phycobilin-Pigmenten.
- (8) Bei dem vorstehend unter (1) beschriebenen Verfahren enthält
die Probenlösung in dem Schritt der Zubereitung der Probenlösung
mindestens Rotalgen, Blau-Grünalgen oder Cryptophytalgen.
Dies
ermöglicht auch das zuverlässige Separieren eines
speziellen Phycobilin-Pigments aus der Vielzahl der Phycobilin-Pigmente
in der unter Verwendung der Rotalgen, der Blau-Grünalgen
oder der Cryptophytalgen zubereiteten Probe.
- (9) Bei dem vorstehend unter (1) beschriebenen Verfahren liegt
der pH-Wert eines jeden Phosphatelutionspuffers im Bereich von 6
bis 8. Dies ermöglicht auch das Verhindern einer Veränderung und
Verschlechterung der Vielzahl der Phycobilin-Pigmente. Ferner ist
es auch möglich, die Phycobilin-Pigmente in die Phosphatelutionspuffer
zu eluieren (sammeln).
- (10) Bei dem vorstehend unter (1) beschriebenen Verfahren liegt
die Temperatur eines jeden Phosphatelutionspuffer im Bereich von
30 bis 50°C.
Dies ermöglicht auch das zuverlässige
Verhindern der Elution unerwünschter Proteine in die Phosphatelutionspuffer.
Mit anderen Worten: es ist möglich, die Abscheidungsrate
(Reinheit) eines vorgegebenen Phycobilin-Pigments zu verbessern.
- (11) Bei dem vorstehend unter (2) beschriebenen Verfahren besteht
das kristallisierende Agens aus Ammoniumsulfat als Hauptkomponente.
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Dies
ermöglicht auch das zuverlässige Kristallisieren
der Phycobilin-Pigmente.
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Gemäß der
vorstehend beschriebenen vorliegenden Erfindung ist es möglich,
ein spezielles Phycobilin-Pigment (fluoreszentes Protein) mit hoher Reinheit
in einer einfachen Operation zu separieren.
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Ferner
ist es gemäß der vorstehend beschriebenen vorliegenden
Erfindung auch möglich, ein vorgegebenes spezielles Phycobilin-Pigment
aus den anderen Phycobilin-Pigmenten durch geeignetes Zubereiten
der Salzkonzentration der Phosphatelutionspuffer zuverlässig
zu separieren.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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1 ist
eine Schnittansicht eines Beispiels einer bei der vorliegenden Erfindung
zu verwendenden Adsorptionsvorrichtung.
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2 zeigt
Absorptionskurven, die gemessen werden, wenn eine Vielzahl Phycobilin-Pigmente in
einer Probenlösung mit einer Adsorptionsvorrichtung separiert
werden.
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3 ist
eine vergrößerte Teildarstellung eines Bereichs
(0 bis 10 Min.) in den Absorptionskurven nach 2.
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4 ist
eine vergrößerte Teildarstellung eines Bereichs
(15 bis 20 Min.) in den Absorptionskurven nach 2.
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5 ist
eine vergrößerte Teildarstellung eines Bereichs
(31 bis 35 Min.) in den Absorptionskurven nach 2.
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6 ist
eine vergrößerte Teildarstellung eines Bereichs
(46 bis 49 Min.) in den Absorptionskurven nach 2.
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7 ist
eine vergrößerte Teildarstellung eines Bereichs
(61 bis 63 Min.) in den Absorptionskurven nach 2.
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8 ist
eine photographische Darstellung der Farbe einer Probenlösung
und der Farbe eines jeden Anteils.
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9 zeigt
eine Absorptionskurve der in 8 gezeigten
Probenlösung.
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10 zeigt
eine Absorptionskurve des Anteils 2 (F2) aus 8.
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11 zeigt
eine Absorptionskurve des Anteils 7 (F7) aus 8.
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12 zeigt
eine Absorptionskurve des Anteils 17 (F17) aus 8.
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13 zeigt
eine Absorptionskurve des Anteils 18 (F18) aus 8.
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14 zeigt
eine Absorptionskurve des Anteils 32 (F32) aus 8.
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15 zeigt
eine Absorptionskurve des Anteils 33 (F33) aus 8.
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16 zeigt
eine Absorptionskurve des Anteils 33 (F33) (doppelte Verdünnung)
aus 8.
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17 zeigt
eine Absorptionskurve des Anteils 34 (F34) aus 8.
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18 zeigt
eine Absorptionskurve des Anteils 35 (F35) aus 8.
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19 zeigt
eine Absorptionskurve des Anteils 48 (F48) aus 8.
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20 zeigt
eine Absorptionskurve des Anteils 62 (F62) aus 8.
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21 zeigt
photographische Darstellungen von Kristallen, die sich aus einer
Probenlösung und jedem Anteil ergeben.
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Bestmögliches Ausführen
der Erfindung
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Im
Folgenden wird ein Separationsverfahren gemäß der
vorliegenden Erfindung in seinen Einzelheiten als ein vorzugsweises
Ausführungsbeispiel beschrieben, das in den beigefügten
Zeichnungen dargestellt ist.
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Vor
der Beschreibung des Separationsverfahrens nach der vorliegenden
Erfindung wird ein Beispiel einer Adsorptionsvorrichtung (Separationsvorrichtung)
beschrieben, die bei der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist.
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1 zeigt
eine Schnittdarstellung als ein Beispiel einer Adsorptionsvorrichtung,
die bei der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist. Es ist zu bemerken,
dass in der folgenden Beschreibung die Oberseite und die Unterseite
in 1 als "Zuflussseite" bzw. als "Abflussseite" beschrieben
wird.
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Genauer
gesagt, bezeichnet die Zuflussseite eine Seite, von der aus Flüssigkeiten
wie eine Probenlösung (d. h. eine Flüssigkeit,
die eine Probe enthält) und Phosphatelutionspuffer (d.
h. Eluente) in die Adsorptionsvorrichtung eingeführt werden,
um ein vorgegebenes Phycobilin-Pigment zum separieren (reinigen),
und die Abflussseite bezeichnet eine Seite, die der Zuflussseite
gegenüber liegt, d. h. eine Seite, durch die die beschriebenen
Flüssigkeiten aus der Adsorptionsvorrichtung abfließen.
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Die
in 1 gezeigte Adsorptionsvorrichtung enthält
eine Säule 2, ein Adsorptionsmittel (Füller) 3 und
zwei Filterelemente 4 und 5.
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Die
Säule 2 besteht aus einem Säulenhauptkörper 21 und
Kappen 22 und 23, die an dem zuflussseitigen Ende
und dem abflussseitigen Ende des Säulenhauptkörpers 21 jeweils
befestigt sind.
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Der
Säulehauptkörper besteht z. B. aus einem zylindrischen
Element. Beispiele für das Material eines jeden Teils (Elements)
der Säule 2 einschließlich des Säulenhauptkörpers 21 sind
verschiedenen Glase, verschiedene Kunstharze, verschiedene Metalle
und verschiedene Keramiken u. ä..
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Eine Öffnung
an der Zuflussseite des Säulenhauptkörpers 21 ist
mit dem Filterelement 4 abgedeckt, und in diesem Zustand
ist die Kappe 22 an dem zuflussseitigen Ende des Säulenhauptkörpers 21 verschraubt. Ähnlich
ist eine Öffnung an der Abflussseite des Säulenhauptkörpers 21 mit
dem Filterelement 5 abgedeckt, und in diesem Zustand ist
die Kappe 23 an dem abflussseitigen Ende des Säulenhauptkörpers 21 verschraubt.
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Die
so aufgebaute Säule 2 hat einen mit Adsorptionsmittel
zu füllenden Raum 20, der durch den Säulenhauptkörper 21 und
die Filterelemente 4 und 5 definiert ist, und
mindestens ein Teil des mit den Adsorptionsmittel zu füllenden
Raums 20 ist mit dem Adsorptionsmittel 3 gefüllt
(in diesem Beispiel ist fast der gesamte mit Adsorptionsmittel zu
füllende Raum 20 mit dem Adsorptionsmittel 3 gefüllt).
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Die
volumetrische Kapazität des mit Adsorptionsmittel zu füllenden
Raums 20 wird abhängig von dem Volumen einer zu
verwendenden Probenlösung geeignet bemessen und ist nicht
besonders begrenzt, jedoch liegt sie vorzugsweise im Bereich von ca.
0,05 bis 10 mL, besonders vorzugsweise im Bereich von ca. 0,5 bis
2 mL pro 1 mL der Probenlösung.
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Durch
Einstellen der Größe des mit Adsorptionsmittel
zu füllenden Raums 20 auf einen Wert in den vorstehend
genannten Bereich und durch einstellen der Größe
des Adsorptionsmittels 3 (das noch beschrieben wird) auf
einen Wert in einem noch zu beschreibenden Bereich ist es möglich,
eine Vielzahl von Phycobilin-Pigmenten zuverlässig voneinander zu
separieren.
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Ferner
wird die Flüssigkeitsabdichtung zwischen dem Säulenhauptkörper 21 und
den Kappen 22 und 23 durch Befestigen der Kappen 22 und 23 an dem
Säulenhauptkörper 21 gewährleistet.
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Ein
Zuleitungsrohr 24 ist flüssigkeitsdicht an der
Kappe 22 zentral befestigt, und ein Ableitungsrohr 25 ist
flüssigkeitsdicht an der Kappe 23 zentral befestigt.
Die oben beschriebenen Flüssigkeiten werden dem mit Adsorptionsmittel
zu füllenden Raum 20 über das Zuleitungsrohr 24 und
das Filterelement 4 zugeführt. Die dem mit Adsorptionsmittel
zu füllenden Raum 20 zugeführten Flüssigkeiten
laufen durch die Zwischenräume zwischen den Teilchen des
Adsorptionsmittels 3 und treten dann aus der Säule 2 durch
das Filterelement 5 und das Ableitungsrohr 25 aus.
Zu diesem Zeitpunkt werden die Vielzahl Phycobilin-Pigmente in der
Probenlösung (Probe) separiert entsprechend dem Unterscheid
des Adsorptionsgrades eines jeden der Vielzahl Phycobilin-Pigmente
zu dem Adsorptionsmittel 3 und dem Unterschied des Affinitätsgrades
eines jeden der Vielzahl Phycobilin-Pigmente zu den Phosphatelutionspuffern.
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Jedes
Filterelement 4 und 5 hat die Funktion, das Austreten
des Adsorptionsmittels 3 aus dem mit Adsorptionsmittel
zu füllenden Raum 20 zu verhindern. Ferner besteht
jedes Filterelement 4 und 5 aus einem nicht gewebten
Material, einem Schaum (schaumartiger poröser Körper
mit untereinander verbundenen Poren) einem Gewebematerial, einem Maschenmaterial
o. ä., das aus einem Kunstharz wie Polyurethan, Polyvinylalkohol,
Polypropylen, Polyetherpolyamid, Polyethylenterephthalat oder Polybutylenterephthalat
besteht.
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Mindestens
eine Oberfläche des Adsorptionsmittels 3 besteht
aus einer Calciumphosphatverbindung. Die Vielzahl Phycobilin-Pigmente
(fluoreszente Proteine) werden speziell an einem solchen Adsorptionsmittel 3 adsorbiert.
Deshalb werden die Vielzahl Phycobilin-Pigmente abhängig
von dem Unterschied des Adsorptionsgrades eines jeden der Vielzahl
Phycobilin-Pigmente zu dem Adsorptionsmittel 3 und entsprechend
dem Unterschied des Affinitätsgrades eines jeden der Vielzahl
Phycobilin-Pigmente zu den Phosphatelutionspuffern adsorbiert.
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Beispiele
der Calciumphosphatverbindung sind, ohne eine Einschränkung
vorzunehmen, Hydroxylapatit (Ca10(PO4)6(OH)2),
TCP (Ca3(PO4)2), Ca2P2O7, Ca(PO3)2, Ca10(PO4)6F2,
Ca10(PO4)6Cl2, DCPD (CaHPO4·2H2O),
Ca4O(PO4)2 und ähnliche. Diese Calciumphosphatverbindungen
können einzeln oder in Kombination von zwei oder mehr Verbindungen
verwendet werden.
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Unter
diesen Calciumphosphatverbindungen wird vorzugsweise eine solche
verwendet, die das Hydroxylapatit als Hauptkomponente des Adsorptionsmittels 3 enthält.
Durch Verwenden eines solchen Adsorptionsmittels 3 ist
es möglich, die Phycobilin-Pigmente von anderen Proteinen
effizient zu separieren. Zusätzlich ist es auch möglich,
durch Ändern der Konzentration eines Salzes (Phosphat)
in jedem der Phosphatelutionspuffer kontinuierlich oder schrittweise
in noch zu beschreibender Weise ein spezifisches Phycobilin-Pigment
von den anderen Phycobilin-Pigmenten leichter zu separieren.
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Wie 1 zeigt,
hat das Adsorptionsmittel 3 vorzugsweise eine Teilchenform
(körnig), kann jedoch auch eine andere Form haben wie eine
Pelletform (kleine Blöcke) oder eine blockartige Form (d.
h. ein poröser Körper, bei dem benachbarte Poren
miteinander kommunizieren, oder eine Bienenwabenform). Durch Ausbilden
des Adsorptionsmittels 3 mit Teilchenform ist es möglich,
den Oberflächenbereich zu vergrößern
und dadurch die Separationseigenschaften für die Phycobilin-Pigmente
zu verbessern.
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Die
mittlere Teilchengröße des Adsorptionsmittels 3 ist
nicht besonders begrenzt, vorzugsweise liegt sie aber im Bereich
von ca. 0,5 bis 150 μm, insbesondere im Bereich von ca.
10 bis 80 μm. Durch Verwenden des Adsorptionsmittels 3 mit
einer solchen mittleren Teilchengröße ist es möglich,
das Verstopfen des Filterelements 5 zuverlässig
zu verhindern und dabei einen ausreichenden Oberflächenbereich
des Adsorptionsmittels 3 sicher zu stellen.
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Es
ist zu bemerken, dass das Adsorptionsmittel 3 insgesamt
aus der Calciumphosphatverbindung bestehen kann. Alternativ kann
es durch Beschichten der Oberfläche eines Trägers
(Basis) mit der Calciumphosphatverbindung erzeugt werden.
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Wenn
fast der gesamte mit Adsorptionsmittel zu füllende Raum 20 mit
dem Adsorptionsmittel 3 wie bei diesem Ausführungsbeispiel
gefüllt ist, hat das Adsorptionsmittel 3 vorzugsweise
dieselbe Zusammensetzung an jeder Stelle in dem mit Adsorptionsmittel
zu füllenden Raum 20. Dies macht es möglich, die
Adsorptionsvorrichtung 1 mit einer besonders ausgezeichneten
Separationseigenschaft (Reinigungseigenschaft) für die
Phycobilin-Pigmente zu betreiben.
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In
diesem Zusammenhang ist zu bemerken, dass der mit Adsorptionsmittel
zu füllende Raum 20 teilweise mit dem Adsorptionsmittel 3 gefüllt
sein kann (d. h. ein Teil des mit Adsorptionsmittel zu füllenden
Raums 20 auf der Seite des Zuleitungsrohrs 24 kann
mit dem Adsorptionsmittel 3 gefüllt sein). In diesem
Fall kann der verbleibende Teil des mit Adsorptionsmittel zu füllenden
Raums 20 mit einem anderen Adsorptionsmittel gefüllt
sein.
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Im
Folgenden wird ein Verfahren zum Separieren eines Phycobilin-Pigments
unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Adsorptionsvorrichtung 1 erläutert
(d. h. ein Separationsverfahren nach der vorliegenden Erfindung)
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(1) Zubereitungsschritt
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Zunächst
wird eine Probe mit einer Vielzahl Phycobilin-Pigmente und einem
Phosphatpuffer zum Zubereiten einer Probenlösung gemischt.
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Beispiele
der Vielzahl der Phycobilin-Pigmente sind: Phycoerythrin wie R-Phycoerythrin, Y-Phycoerythrin,
und B-Phycoerythrin; Phycocyanin wie C-Phycocyanin und Allophycocyanin;
und ähnliche. In diesem Ausführungsbeispiel wird
eine Probe mit R-Phycoerythrin, Y-Phycoerythrin, Phycocyanin und
Allophycocyanin als ein Beispiel der Probe verwendet, die die Vielzahl
Phycobilin-Pigmente enthält.
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Beispiele
der Probe zum Extrahieren einer solchen Vielzahl Phycobilin-Pigmente
sind Rotalgen, Blau- Grünalgen, Cryptophytalgen o. ä.
diese Proben können einzeln oder in Kombination von zwei
oder mehreren verwendet werden. Durch Anwenden des Separationsverfahrens
nach der vorliegenden Erfindung ist es möglich, ein spezielles
Phycobilin-Pigment zuverlässig von den anderen Phycobilin-Pigmenten
zu trennen.
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Ferner
kann eine solche Probe direkt (als Rohprobe) verwendet werden oder
sie kann z. B. durch Gefriertrocknen getrocknet und, falls erforderlich,
vor der Verwendung außerdem gemahlen werden.
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Beispiele
des Phosphatpuffers sind Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Lithiumphosphat
o. ä..
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Die
Konzentration eines Salzes (Phosphat) in dem Phosphatpuffer für
das Zubereiten der Probenlösung ist vorzugsweise gleich
oder kleiner als die jenige eines ersten Phosphatelutionspuffers
(der noch beschrieben wird). Dies ermöglicht ein zuverlässigeres
Entfernen nicht erforderlicher Proteine aus einer zubereiteten Probenlösung.
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Der
Anteil des Phosphatpuffers zum Zubereiten der Probenlösung
ist nicht besonders eingeschränkt, jedoch liegt er vorzugsweise
im Bereich des ca. 5 bis 300-fachen, besonders vorzugsweise im Bereich
des ca. 50 bis 150-fachen der Masse der verwendeten Probe.
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Der
pH-Wert des Phosphatpuffers ist nicht besonders eingeschränkt,
vorzugsweise liegt er im Bereich von ca. 6 bis 8, besonders vorzugsweise
im Bereich von ca. 6,5 bis 7,5.
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Die
Temperatur des Phosphatpuffers ist gleichfalls nicht besonders eingeschränkt,
sie liegt aber vorzugsweise im Bereich von ca. 30 bis 50°C, besonders
vorzugsweise im Bereich von ca. 35 bis 45°C.
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Durch
Anwenden des Phosphatpuffers mit dem pH-Wert in dem genannten Bereich
und der Temperatur in dem genannten Bereich ist es möglich, die
Phycobilin-Pigmente zuverlässiger in die Phosphatelutionspuffer
zu elutieren (extrahieren) oder die Phycobilin-Pigmente von dem
Adsorptionsmittel 3 in die Phosphatelutionspuffer zuverlässiger
zu desorbieren. Deshalb ist es möglich, die Abscheidungsrate eines
vorgegebenen Phycobilin-Pigments zu verbessern.
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Es
sei bemerkt, dass eventuell vorhandene Feststoffe aus der so zubereiteten
Probenlösung vorzugsweise entfernt werden. Dadurch kann
ein Verstopfen der Säule 2 zuverlässig
verhindert werde. Ein Verfahren zum Entfernen der Feststoffe ist
nicht besonders eingeschränkt. Beispielsweise kann die
Probenlösung zentrifugiert werden, um einen Überstand zu
erhalten. Dieser wird abgeschieden, und dann werden die darin vorhandenen
Feststoffe durch Filtration entfernt.
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(2) Zuführschritt
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Als
nächstes wird die Probenlösung dem mit Adsorptionsmittel
zu füllenden Raum 20 durch das Zuleitungsrohr 24 und
das Filterelement 4 zugeführt, damit sie mit dem
Adsorptionsmittel 3 in Kontakt kommt und durch die Säule 2 (den
Raum 20) läuft.
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Als
Ergebnis werden Anteile mit geringer Adsorptionsfähigkeit
an dem Adsorptionsmittel 3 (d. h. Proteine anders als die
Phycobilin-Pigmente) aus der Säule 2 durch das
Filterelement 5 und das Ableitungsrohr 25 ausgegeben.
Andererseits werden die Phycobilin-Pigmente mit hoher Adsorptionsfähigkeit an
dem Adsorptionsmittel 3 und Proteine, die nicht Phycobilin-Pigmente
sind, aber eine relativ hohe Adsorptionsfähigkeit an dem
Adsorptionsmittel 3 haben, an dem Adsorptionsmittel 3 in
dem Adsorptionsmittel-Füllraum 20 der Säule 2 festgehalten.
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(3) Fraktionierungsschritt
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Dann
werden die Phosphatelutionspuffer in den mit Adsorptionsmittel zu
füllenden Raum 20 (Säule 2)
durch das Zuleitungsrohr 24 und das Filterelement 4 eingeführt,
um die Phycobilin-Pigmente zu elutieren, und dadurch kann man ein
Eluens (Eluat) erhalten, das die Phosphatelutionspuffer und die Phycobilin-Pigmente
enthält. Dann wird das Eluens aus der Säule 2 durch
das Ableitungsrohr 25 und das Filterelement 5 ausgegeben
und fraktioniert (gesammelt), um Fraktionen entsprechend den jeweiligen Phosphatelutionspuffern
zu erhalten, deren jeder einen vorbestimmten Anteil des Eluens hat.
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Entsprechend
der vorliegenden Erfindung wird die Konzentration eines Salzes (Phosphat) (Salzkonzentration)
in jedem der Phosphatelutionspuffer kontinuierlich oder schrittweise
geändert. In dieser Hinsicht ist zu bemerken, dass jeder
der Phosphatelutionspuffer vorzugsweise von derselben Art wie der
Phosphatpuffer in dem oben beschriebenen Zubereitungsschritt ist.
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Wenn
die Phosphatelutionspuffer in Kontakt mit dem Adsorptionsmittel 3 gebracht
werden, an dem die Vielzahl Phycobilin-Pigmente und Proteine anders
als die Vielzahl der Phycobilin-Pigmente adsorbiert werden, werden
die Proteine, die nicht Phycobilin-Pigmente sind und eine geringere
Adsorptionsfähigkeit an dem Adsorptionsmittel 3 als
die Vielzahl der Phycobilin-Pigmente haben, zuerst von dem Adsorptionsmittel 3 desorbiert
und dann durch das Ableitungsrohr 25 ausgegeben. Dann werden
die Vielzahl der Phycobilin-Pigmente, die an dem Adsorptionsmittel 3 adsorbiert
sind, von diesem desorbiert durch Ändern der Salzkonzentration
eines jeden Phosphatelutionspuffers abhängig von der Art
der Phycobilin-Pigmente. Die von dem Adsorptionsmittel 3 desorbierten
Phycobilin-Pigmente werden mit den Phosphatelutionspuffern gemischt,
um ein Eluens zu erhalten, und dann werden die Phycobilin-Pigmente von
dem durch das Ableitungsrohr 25 ausgegebenen Eluens ausgesondert.
Zu diesem Zeitpunkt ist es durch Fraktionieren des aus dem Ableitungsrohr 25 ausgegebenen
Eluens in Anteile mit jeweils vorbestimmter Menge möglich,
ein bestimmtes Phycobilin-Pigment aus der Probenlösung
zu separieren, die die Vielzahl der Pycobilin-Pigmente enthält.
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Dies
bedeutet, dass mindestens R-Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin
oder Y-Phycoerythrin aus der Probenlösung separiert werden kann,
die die Vielzahl von Phycobilin-Pigmenten enthält.
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Wie
vorstehend beschrieben, wird gemäß der vorliegenden
Erfindung die Salzkonzentration eines jeden Phosphatelutionspuffers
kontinuierlich oder schrittweise geändert. Bei diesem Ausführungsbeispiel
werden vorzugsweise ein erster Phosphatelutionspuffer mit einer
Salzkonzentration von 1 mM oder mehr, jedoch von weniger als 25
mM, ein zweiter Phosphatelutionspuffer mit einer Salzkonzentration
von 25 mM oder mehr, jedoch von weniger als 75 mM, ein dritter Phosphatelutionspuffer
mit einer Salzkonzentration von 75 mM oder mehr, jedoch von weniger
als 250 mM, und ein vierter Phosphatelutionspuffer mit einer Salzkonzentration
von 250 mM oder mehr in der angegebenen Reihenfolge in den mit Adsorptionsmittel
zu füllenden Raum 20 der Säule 2 schrittweise
eingeführt.
-
In
diesem Fall werden R-Phycoerythrin aus dem Eluens entsprechend dem
ersten Phosphatelutionspuffer, R-Phycoerythrin und Phycocyanin aus dem
Eluens entsprechend dem zweiten Phosphatelutionspuffer, Allophycocyanin
aus dem Eluens entsprechend dem dritten Phosphatelutionspuffer und Y-Phycoerythrin
aus dem Eluens entsprechend dem vierten Phosphatelutionspuffer ausgeschieden.
-
Es
sei bemerkt, dass die Salzkonzentration des ersten Phosphatelutionspuffers
insbesondere im Bereich von 1 bis 10 mM liegt, die Salzkonzentration des
zweiten Phosphatelutionspuffers insbesondere im Bereich von ca.
35 bis 65 mM liegt, die Salzkonzentration des dritten Phosphatelutionspuffers
insbesondere im Bereich von 85 bis 125 mM liegt, und die Salzkonzentration
des vierten Phosphatelutionspuffers insbesondere im Bereich von
450 bis 650 mM liegt. Ferner liegt die Salzkonzentration des ersten Phosphatelutionspuffers
besonders vorzugsweise im Bereich von ca. 1 bis 5 mM, die Salzkonzentration des
zweiten Phosphatelutionspuffers besonders vorzugsweise im Beriech
von ca. 45 bis 55 mM, die Salzkonzentration des dritten Phosphatelutionspuffers besonders
vorzugsweise im Bereich von ca. 95 bis 105 mM und die Salzkonzentration
des vierten Phosphatelutionspuffers besonders vorzugsweise im Bereich
von ca. 490 bis 510 mM.
-
Durch
schrittweises Zuführen dieser Phosphatelutionspuffer mit
den Salzen der angegebenen Konzentrationen in die Säule 2 ist
es möglich, ein ausgewähltes Phycobilin-Pigment
von den anderen Phycobilin-Pigmenten zuverlässiger zu separieren.
-
Der
pH-Wert eines jeden ersten bis vierten Phosphatelutionspuffers liegt
vorzugsweise im Bereich von ca. 6 bis 8, insbesondere im Bereich
von 6,5 bis 7,5. Durch Einstellen des pH-Wertes eines jeden der
ersten bis vierten Phosphatelutionspuffer auf einen Wert in dem
genannten Bereich ist es möglich, die Phycobilin-Pigmente
zuverlässiger in die Phosphatelutionspuffer zu elutieren
(auszuscheiden), während eine Veränderung oder
Verschlechterung der Phycobilin-Pigmente vermieden wird.
-
Die
Temperatur eines jeden ersten bis vierte Phosphatelutionspuffers
liegt vorzugsweise im Bereich von ca. 30 bis 50°C, insbesondere
im Bereich von ca. 35 bis 45°C. Durch Einstellen der Temperatur eines
jeden ersten bis vierten Phosphatelutionspuffers auf einen Wert
in dem genannten Bereich ist es möglich, die Elution der
unerwünschten Proteine in die Phosphatelutionspuffer zuverlässig
zu verhindern. Deshalb kann die Ausscheidungsrate (Reinheit) eines
vorgegebenen Phycobilin-Pigments weiter verbessert werden.
-
Die
Strömungsgeschwindigkeit, mit der jeder der ersten bis
vierten Phosphatelutionspuffer in den mit Adsorptionsmittel zu füllenden
Raum 20 der Säule 2 eingegeben wird,
ist nicht besonders begrenzt, sie liegt aber vorzugsweise im Bereich
von ca. 1 bis 10 mL/Minute, insbesondere im Bereich von ca. 1 bis 5
mL/Minute.
-
Die
Strömungszeit, mit der jeder der ersten bis vierten Phosphatelutionspuffer
in den mit Adsorptionsmittel zu füllenden Raum 20 der
Säule 2 eingegeben wird, ist nicht besonders begrenzt,
sie liegt aber vorzugsweise im Bereich von ca. 5 bis 60 Minuten
insbesondere im Bereich von ca. 10 bis 30 Minuten.
-
(4) Kristallisationsschritt
-
Als
nächstes wird ein Kristallisationsmittel in das Eluens
der Fraktionen eingeben, um die Phycobilin-Pigmente zu kristallisieren.
Dadurch ist es möglich, ein vorgegebenes Phycobilin-Pigment
mit hoher Reinheit leicht auszuscheiden.
-
Das
Kristallisationsmittel ist nicht besonders beschränkt,
jedoch wird vorzugsweise ein solches verwendet, das hauptsächlich
Ammoniumsulfat enthält. Durch Verwenden eines solchen Kristallisationsmittels
ist es möglich, die Phycobilin-Pigmente zuverlässig
zu kristallisieren, während ihre Veränderung oder
Verschlechterung verhindert wird.
-
Der
Anteil des in das fraktionierte Eluens einzugebenden Kristallisationsmittels
wird in geeigneter Weise so eingestellt, dass die Konzentration
des Kristallisationsmittels in dem fraktionierten Eluens vorzugsweise
im Bereich von ca. 30 bis 90% der Sättigungskonzentration
liegt, insbesondere im Bereich von ca. 40 bis 60% der Sättigungskonzentration.
-
Es
sei bemerkt, dass das Kristallisationsmittel direkt in das fraktionierte
Eluens eingegeben werden kann, oder es wird dem fraktionierten Eluens
in Form einer Lösung in einem geeigneten Lösungsmittel
beigefügt.
-
Wie
oben beschrieben, werden in diesem Ausführungsbeispiel
die vier Phosphatelutionspuffer, d. h. der erste bis vierte Phosphatelutionspuffer,
in der angegebenen Reihenfolge zubereitet und dem mit Adsorptionsmittel
zu füllenden Raum 20 der Säule 2 zugeführt.
Jedoch können, falls das selektive Ausscheiden des R-Phycoerythrins
gewünscht ist, zwei Phosphatelutionspuffer, d. h. der erste
Phosphatelutionspuffer und ein weiterer Phosphatelutionspuffer mit
einem Salz mit höherer Konzentration als diejenige des
ersten Phosphatelutionspuffers zubereitet und in den Raum 20 der
Säule 2 in der angegebenen Reihenfolge eingeführt
werden.
-
In
diesem Fall können der zweite bis vierte Phosphatelutionspuffer
in den Raum 20 der Säule 2 nach den beiden
vorstehend genannten Phosphatelutionspuffern eingeführt
werden.
-
Ferner
können der erste bis vierte Phosphatelutionspuffer in Kombination
von zweien oder mehreren abhängig von der Art des vorgegebenen
Phycobilin-Pigments verwendet werden.
-
Beispielsweise
können der erste Phosphatelutionspuffer und der zweite
Phosphatelutionspuffer in Kombination verwendet werden. In diesem
Fall wird R-Phycoerythrin aus einem Eluens (erster Phosphatelutionspuffer)
ausgeschieden, der aus der Säule 2 während
der Ausgabe des ersten Phosphatelutionspuffer ausgegeben wird, und
R-Phycoerythrin und Phycocyanin werden aus einem Eluens (zweiter Phosphatelutionspuffer)
aus der Säule 2 während der Ausgabe des
zweiten Phosphatelutionspuffers ausgegeben.
-
Ferner
können der erste, der zweite und der dritte Phosphatelutionspuffer
in Kombination verwendet werden. In diesem Fall wird R-Phycoerythrin
aus einem Eluens (erster Phosphatelutionspuffer) während
der Ausgabe des ersten Phosphatelutionspuffers aus der Säule 2 gesammelt.
R-Phycoerythrin und Phycocyanin werden aus einem Eluens (zweiter Phosphatelutionspuffer)
während der Ausgabe des zweiten Phosphatelutionspuffers
aus der Säule 2 gesammelt, und Allophycocyanin
wird aus einem Eluens (dritter Phosphatelutionspuffer) während
der Ausgabe des dritten Phosphatelutionspuffers aus der Säule 2 gesammelt.
-
Wie
oben beschrieben, ist es durch das Separationsverfahren nach der
vorliegenden Erfindung möglich, eine Änderung
der Adsorptionsvorrichtung wie einer Säule abhängig
von der Art des zu separierenden Phycobilin-Pigments zu vermeiden,
um ein vorgegebenes Phycobilin-Pigment von einer Probe zu separieren,
die die Vielzahl der Phycobilin-Pigmente enthält. Außerdem
ist es auch möglich, ein vorgegebenes Phycobilin-Pigment
durch solch eine einfache Operation zu separieren, bei der die Salzkonzentration
eines jeden Phosphatelutionspuffers, der der Adsorptionsvorrichtung
zugeführt wird, kontinuierlich oder schrittweise geändert
wird.
-
Obwohl
das Separationsverfahren nach der vorliegenden Erfindung vorstehend
unter Bezugnahme auf ein vorzugsweises Ausführungsbeispiel
beschrieben wurde, ist die vorliegende Erfindung darauf nicht beschränkt.
Beispielsweise kann das Separationsverfahren nach der vorliegenden
Erfindung ferner einen oder mehrere Schritte für jeglichen
Zweck enthalten.
-
Das
Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wurde für
einen Fall beschrieben, bei dem die Säule mit einem Adsorptions-Füllraum
mit dem Adsorptionsmittel (Füller) gefüllt ist
und als Adsorptionsvorrichtung verwendet wird. Es kann aber auch eine
Adsorptionsvorrichtung verwendet werden, die ein Adsorptionsmittel
in Form einer flachen Platte enthält.
-
Beispiele
-
In
Folgendem wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische
Beispiele erläutert.
-
(Beispiel 1)
-
- 1. Zunächst wurde als Probe 1 Gramm
getrockneter Seetang zubereitet und diese Probe mit einer Mühle
zu Pulver zermahlen.
- 2. Dann wurde ein 1 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) dem Pulver beigefügt,
und der Phosphatpuffer und das Pulver wurden bei 37°C für
24 Stunden zu einer Mischung gerührt.
- 3. Nach dem Rühren wurde die Mischung zentrifugiert
(2000 rpm für 5 Minuten), um einen Überstand zu
erhalten. Dieser wurde durch ein Filter mit einer mittleren Porengröße
von 0,4 μm gefiltert, um eine Probenlösung zu
erhalten.
- 4. Dann wurden 60 mL der Probenlösung (Probe) in eine
Bio-rad Bioscale-Säule MT5 (Adsorptionsvorrichtung) mit
einer Geschwindigkeit von 2 mL/Minute für 30 Minuten eingegeben.
Es ist zu bemerken, dass das Volumen des Adsorptionsmittel-Füllraums
der Säule 5 mL betrug.
-
Als
Füllmaterial zum Füllen des Adsorptionsmittel-Füllraums
der Säule wurden Calciumhydroxylapatitteilchen (Ca-HAP)
(Teilchengröße: 40 μm, Type II, hergestellt
von Pentax Corporation) verwendet. Die Calciumhydroxylapatitteilchen
(Ca-HAP) sind normale Hydroxylapatitteilchen, deren Ca nicht durch
ein weiteres Metallelement substituiert ist.
- 5.
Dann wurden ein 1 mM Phosphatelutionspuffer (Natriumphosphat: pH
7,0) und ein 5 mM Phosphatelutionspuffer (pH 7,0) als erster Phosphatelutionspuffer
zubereitet, ein 50 mM Phosphatelutionspuffer (pH 7,0) wurde als
zweiter Phosphatelutionspuffer zubereitet, ein 100 mM Phosphatelutionspuffer
(pH 7,0) wurde als dritter Phosphatelutionspuffer zubereitet, und
ein 500 mM Phosphatelutionspuffer (pH 7,0) wurde als vierter Phosphatelutionspuffer
zubereitet. Jeder erste bis vierte Phosphatelutionspuffer (60 mL)
wurde in den Adsorptionsmittel-Füllraum der Säule
in der angegebenen Reihenfolge mit 4 mL/Minute für 15 Minuten
eingegeben. Dann wurde ein Eluens aus der Säule ausgegeben
und fraktioniert, um 4 mL-Anteile zu erhalten (jede Minute).
-
Es
sei darauf hingewiesen, dass der zuerst erhaltene 4 mL-Eluensanteil
mit F1 und die weiteren 4 mL-Eluensanteile nacheinander gleichfalls
nummeriert wurden. Ein Eluens, das während der Ausgabe des
1 mM-Phosphatelutionspuffers erhalten wurde, wurde in 15 Anteile
F1 bis F15 fraktioniert, ein Eluens, das bei der Ausgabe des 5 mM-Phosphatelutionspuffers
erhalten wurde, wurde in 15 Anteile F16 bis F30 fraktioniert, ein
Eluens, das während der Ausgabe des 50 mM-Phosphatelutionspuffers
erhalten wurde, wurde in 15 Anteile F31 bis F45 fraktioniert, ein
Eluens, das während der Ausgabe des 100 mM-Phosphatelutionspuffers
erhalten wurde, wurde in 15 Anteile F46 bis F60 fraktioniert, und
ein Eluens, das während der Ausgabe des 500 mM-Phosphatelutionspuffers
erhalten wurde, wurde in 15 Anteile F61 bis F75 fraktioniert. Das
Eluens in jedem der Anteile wurde in ein Spektrophotometer für
sichtbaren bis ultravioletten Bereich eingegeben.
- 6.
Dann wurde eine wässrige Ammoniumsulfatlösung
mit 50 Gewichtsprozent dem Eluens in jedem der Anteile beigegeben,
um Phycobilin-Pigmente zu kristallisieren.
-
2 zeigt
Absorptionskurven, die gemessen wurden, wenn die Vielzahl der Phycobilin-Pigmente
in der Probenlösung unter Anwendung der Adsorptionsvorrichtung
in dem obigen Schritt 5 separiert wurde. 3 bis 7 sind
teilweise vergrößerte Ansichten, die einige Bereiche
in den Absorptionskurven der 2 darstellen,
bei denen eine Änderung der Absorptionsfähigkeit
erfasst wurde.
-
Wie
aus den Absorptionskurven in 2 und in 3 bis 7 hervorgeht,
wurde eine Änderung der Absorptionsfähigkeit mindestens
einer der Absorptionskurven bei Wellenlängen von 565 nm
und 620 nm festgestellt, wenn die Absorptionsfähigkeiten des
Anteils F2 (in jeder Zeichnung, während der Zeit von 1
bis 2 Minuten), des Anteils F7 (in jeder Zeichnung, während
der Zeit von 6 bis 7 Minuten), des Anteils F17 (in jeder Zeichnung,
während der Zeit von 16 bis 17 Minuten), des Anteils F18
(in jeder Zeichnung, während der Zeit von 17 bis 18 Minuten),
des Anteils F32 (in jeder Zeichnung, während der Zeit von 31
bis 32 Minuten), des Anteils F33 (in jeder Zeichnung, während
der Zeit von 32 bis 33 Minuten), des Anteils F34 (in jeder Zeichnung,
während der Zeit von 33 bis 34 Minuten), des Anteils F35
(in jeder Zeichnung, während der Zeit von 34 bis 35 Minuten),
des Anteils F48 (in jeder Zeichnung, während der Zeit von 47
bis 48 Minuten) und des Anteils F62 (in jeder Zeichnung, während
der Zeit von 61 bis 62 Minuten) bei Wellenlängen von 280
nm, 565 nm und 620 nm gemessen wurden.
-
8 ist
eine photographische Darstellung, die die Farbe der Probenlösung
(Probe) und die Farbe eines jeden Anteils zeigt, welcher eine Änderung der
Absorptionsfähigkeit hat.
-
Ferner
zeigen die 9 bis 20 Absorptionskurven
der Probenlösung und der Anteile in 8, gemessen
bei Wellenlängen von 300 bis 700 nm.
-
Außerdem
zeigt 21 photographische Darstellungen
von Kristallen, die durch Beifügen einer wässrigen
Ammoniumsulfatlösung von 50 Gewichtsprozent zu jeder Probenlösung
(Probe) erhalten werden, und einige Anteile aus dem Schritt 5 (d. h.
die Anteile F7, F17, F32, F33, F34, F35 und F48).
-
Wie 8 zeigt,
haben die Anteile F2, F7, F17, und F18 eine rote Farbe, der Anteil
F32 eine leicht bläulich-rote Farbe, die Anteile F33, F34,
F35 und F48 eine bläulich-purpurne Farbe und der Anteil F62
eine rote Farbe.
-
Wie 9 bis 20 zeigen,
treten in jedem Fall der Anteile F2, F7, F17, F18 und F32 Spitzen
bei etwa 495 nm und 565 nm und in jedem der Anteile F33, F34 und
F35 eine Spitze bei etwa 620 nm auf. Ferner tritt bei dem Anteil
F48 eine Spitze bei etwa 650 nm als Hauptspitze und bei dem Anteil
F62 eine Spitze bei etwa 495 nm als Hauptspitze auf.
-
Das
Phycobilin-Pigment mit Adsorptionsspitzen bei etwa 495 nm (zweite
Spitze) und etwa 565 nm (Hauptspitze) war R-Phycoerythrin mit einer
roten Farbe. Das Phycobilin-Pigment mit einer Absorptionsspitze
bei etwa 620 nm war Phycocyanin mit blauer Farbe. Das Phycobilin-Pigment
mit einer Hauptspitze bei etwa 650 nm war Allophycocyanin mit einer blauen
Farbe. Das Phycobilin-Pigment mit einer Hauptspitze bei ca. 495
nm war Y-Phycoerythrin mit einer roten Farbe.
-
Wie
aus den in 8 und 9 bis 20 dargestellten
Ergebnissen hervorgeht, konnte R-Phycoerythrin aus dem Eluens (Anteile
F2, F7, F17 und F18) erhalten werden, das während der Ausgabe des
1 mM-Phosphatelutionspuffers und des 5 mM-Phosphatelutionspuffers
(d. h. der ersten Phosphatelutionspuffer) aus der Adsorptionsvorrichtung ausgegeben
wurde, R-Phycoerythrin und Phycocyanin konnten aus dem Eluens (R-Phycoerythrin:
Anteil F32, Phycocyanin: Anteile F33, F34 und F35) erhalten werden,
das während der Ausgabe des 50 mM Phosphatelutionspuffers
(d. h. des zweiten Phosphatelutionspuffers) aus der Adsorptionsvorrichtung
ausgegeben wurde, Allophycocyanin konnte aus dem Eluens (Anteil
F48) erhalten werden, das während der Ausgabe des 100 mM-Phosphatelutionspuffers (d.
h. des dritten Phosphatelutionspuffers) aus der Adsorptionsvorrichtung
ausgegeben wurde, und Y-Phycoerythrin konnte aus dem Eluens (Anteil
F62) erhalten werden, das während der Ausgabe des 500 mM-Phosphatelutionspuffers
(d. h. des vierten Phosphatelutionspuffers) aus der Adsorptionsvorrichtung ausgegeben
wurde.
-
Ferner
wurden, wie 21 zeigt, alle Phycobilin-Pigmente
als reine Kristalle erhalten, obwohl einige photographische Darstellungen
in 21 durch eine begrenzte absolute Menge der Kristalle
nicht klar sind.
-
(Beispiel 2)
-
Die
Separation von Phycobilin-Pigmenten wurde in derselben Weise wie
in Beispiel 1 durchgeführt, mit dem Unterschied, dass eine
größere Adsorptionsvorrichtung verwendet wurde
(d. h. die Adsorptionsvorrichtung hatte größere
Abmessungen).
-
Als
Ergebnis konnten die Phycobilin-Pigmente wie in Beispiel 1 separiert
werden.
-
Es
ist zu bemerken, dass in Beispiel 2 eine Bio-rad geltec Säule
(Durchmesser: 20 cm, Länge: 10 cm) als Adsorptionsvorrichtung
verwendet wurde, und als Füller (Adsorptionsmittel) wurde
CHT type-2 (mittlere Teilchengröße: 60 μm)
verwendet.
-
Ferner
wurde die Separation der Phycobilin-Pigmente in derselben Weise
wie in Beispiel 1 und in Beispiel 2 ausgeführt, jedoch
mit größerer Länge der Säule.
In beiden Fällen zeigten R-Phycoerythrin und Phycocyanin
eine Neigung zur klareren Separation voneinander in einem 50 mM-Phosphatpuffer
(d. h. einem zweiten Phosphatelutionspuffer).
-
Es
ist außerdem darauf hinzuweisen, dass die vorliegende Beschreibung
auf den Inhalt der
japanischen
Patentanmeldung 2007-194974 (angemeldet am 26. Juli 2007)
Bezug nimmt, der hier ausdrücklich in seiner Gesamtheit
einbezogen ist.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- - JP 2003-231821
A [0005, 0006]
- - JP 2007-194974 [0110]