FR2919201A1 - Procede de separation de pigments - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé pour séparer au moins un pigment à base de phycobiline d'un échantillon contenant une pluralité de tels pigments.Il comprend la préparation d'un appareil d'adsorption (1) ayant un espace de remplissage (20) rempli d'un adsorbant (3) à base de phosphate de calcium, la préparation d'une solution d'échantillon en mélangeant l'échantillon et un tampon, l'introduction de ladite solution dans ledit espace, l'introduction de tampons d'élution au phosphate pour éluer au moins l'un de la pluralité de pigments, et le fractionnement de l'éluant qui est déchargé dudit espace en différentes portions correspondant aux tampons respectifs pour séparer ainsi ledit au moins un pigment.Application : séparation d'un pigment spécifique à base de phycobiline, de grande pureté.
Description
La présente invention concerne un procédé de séparation, en particulier un
procédé pour séparer au moins un pigment à base de phycobiline d'une pluralité de pigments à base de phycobiline.
Comme méthode de détection d'un objet à détecter avec une grande sensibilité en utilisant une réaction antigène-anticorps, une analyse par immunosorbant lié à une enzyme (ELISA) ou une analyse similaire est utilisée. Une telle analyse par immunosorbant lié à une enzyme utilise un réactif obtenu, par exemple, en préparant un anticorps qui peut être lié spécifiquement à un objet à détecter (c'est-à-dire un antigène) et en laissant une matière fluorescente servant de marqueur être entraînée sur (liée à) l'anticorps.
Ces dernières années, l'utilisation de protéines fluorescentes présentes dans une algue comme telles matières fluorescentes a été envisagée. Par exemple, le document JP-A-2003-231 821 fait connaître un procédé pour extraire une protéine 20 fluorescente (phycoérythrine) d'une algue en utilisant une solution tampon. Cependant, dans le cas de l'utilisation du procédé décrit dans le document JP-A-2003-231 821, il est difficile d'éviter suffisamment que des protéines 25 fluorescentes autres que la phycoérythrine ou des protéines autres que la protéine fluorescente soient présentes dans un extrait. Un objectif de la présente invention consiste à proposer un procédé de séparation permettant de séparer un 30 pigment spécifique à base de phycobiline, de grande pureté, par une opération simple. Cet objectif est atteint par les présentes inventions (1) à (11) décrites ci-dessous. (1) Un procédé pour séparer au moins un pigment à 35 base de phycobiline d'un échantillon contenant une pluralité de pigments à base de phycobiline, le procédé comprenant : la préparation d'un appareil d'adsorption ayant un espace de remplissage destiné à être rempli d'un adsorbant, ayant une surface, au moins la surface de l'adsorbant étant constituée d'un composé à base de phosphate de calcium et au moins une partie de l'espace de remplissage étant remplie de l'adsorbant ; la préparation d'une solution d'échantillon en mélangeant l'échantillon et un tampon au phosphate ; l'introduction de la solution d'échantillon dans l'espace de remplissage de l'appareil d'adsorption de telle sorte que la pluralité de pigments à base de phycobiline soit adsorbée par l'adsorbant ; l'introduction de tampons d'élution au phosphate pour éluer au moins un pigment de la pluralité de pigments à base de phycobiline de l'adsorbant dans l'espace de remplissage de l'appareil d'adsorption de manière continue ou par étapes pour obtenir ainsi un éluant contenant ledit au moins un pigment à base de phycobiline, les tampons d'élution au phosphate ayant différentes concentrations en sel ; et le fractionnement de l'éluant qui est déchargé de l'espace de remplissage de l'appareil d'adsorption dans différentes parties correspondant aux tampons d'élution au phosphate respectifs pour séparer ainsi ledit au moins un pigment à base de phycobiline des autres pigments à base de phycobiline.
Cela permet de séparer un pigment spécifique à base de phycobiline, de grande pureté, par une opération simple. (2) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (1) mentionné ci-dessus, le procédé comprend en outre la cristallisation dudit au moins un pigment à base de phycobiline en ajoutant un agent de cristallisation à l'éluant. (3) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (1) mentionné ci-dessus, le composé à base de phosphate de calcium est constitué d'hydroxyapatite comme constituant principal de ce composé.
Cela permet également de séparer efficacement les pigments à base de phycobiline des protéines autres que les pigments à base de phycobiline et de séparer aisément les uns des autres les différents pigments à base de phycobiline. (4) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (3) mentionné ci-dessus, le procédé dans lequel la pluralité de pigments à base de phycobiline contient de la R-phycoérythrine, et les tampons d'élution au phosphate comprennent un premier tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 1 mM mais est inférieure à 25 mM, où, dans l'étape d'introduction, le premier tampon au phosphate d'élution est introduit dans l'espace de remplissage et ensuite, dans l'étape de fractionnement, la R-phycoérythrine est recueillie à partir de l'éluant correspondant au premier tampon au phosphate d'élution. Cela permet également de séparer de manière fiable la R-phycoérythrine des autres pigments à base de 20 phycobiline. (5) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (3) mentionné ci-dessus, le procédé dans lequel la pluralité de pigments à base de phycobiline contient de la R-phycoérythrine et de la phycocyanine, et les tampons 25 d'élution au phosphate comprennent : un premier tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 1 mM mais inférieure à 25 mM ; et un second tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 25 mM mais 30 inférieure à 75 mM ; où, dans l'étape d'introduction, le premier tampon d'élution au phosphate et le second tampon d'élution au phosphate sont introduits dans l'espace de remplissage par étapes dans cet ordre et ensuite, dans l'étape de fractionnement, la R-phycoérythrine est 35 recueillie à partir de l'éluant correspondant au premier tampon d'élution au phosphate et la R-phycoérythrine et la phycocyanine sont recueillies à partir de l'éluant correspondant au second tampon d'élution au phosphate, dans cet ordre. Cela permet également de séparer de manière 5 fiable la R-phycoérythrine et la phycocyanine des autres pigments à base de phycobiline. (6) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (3) mentionné ci-dessus, le procédé dans lequel la pluralité de pigments à base de phycobiline contient de la R-phyco- 10 érythrine, de la phycocyanine et de l'allophycocyanine, et les tampons d'élution au phosphate comprennent : un premier tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 1 mM mais inférieure à 25 mM ; un deuxième tampon d'élution au phosphate dont la 15 concentration en sel est égale ou supérieure à 25 mM mais inférieure à 75 mM ; et un troisième tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 75 mM mais inférieure à 250 mM ; où, dans l'étape d'introduction, le premier tampon d'élution au 20 phosphate, le deuxième tampon d'élution au phosphate et le troisième tampon d'élution au phosphate sont introduits dans l'espace de remplissage par étapes dans cet ordre, et ensuite, dans l'étape de fractionnement, la R-phycoérythrine est recueillie à partir de l'éluant correspondant au 25 premier tampon d'élution au phosphate, la R-phycoérythrine et la phycocyanine sont recueillies à partir de l'éluant correspondant au deuxième tampon d'élution au phosphate dans cet ordre, et l'allophycocyanine est recueillie à partir de l'éluant correspondant au troisième tampon 30 d'élution au phosphate. Cela permet également de séparer de manière fiable la R-phycoérythrine, la phycocyanine et l'allophycocyanine des autres pigments à base de phycobiline. (7) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (3) 35 mentionné ci-dessus, le procédé dans lequel la pluralité de pigments à base de phycobiline contient de la R- phycoérythrine, de la phycocyanine, de l'allophycocyanine et de la Y-phycoérythrine, et les tampons d'élution au phosphate comprennent : un premier tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 1 mM mais inférieure à 25 mM ; un deuxième tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 25 mM mais inférieure à 75 mM ; un troisième tampon d'élution du phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 75 mM mais inférieure à 250 mM ; et un quatrième tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 250 mM ; où, dans l'étape d'introduction, le premier tampon d'élution au phosphate, le deuxième tampon d'élution au phosphate, le troisième tampon d'élution au phosphate et le quatrième tampon d'élution au phosphate sont introduits dans l'espace de remplissage par étapes dans cet ordre et ensuite, dans l'étape de fractionnement, la R-phycoérythrine est recueillie à partir de l'éluant correspondant au premier tampon d'élution au phosphate, la R-phycoérythrine et la phycocyanine sont recueillies à partir de l'éluant correspondant au deuxième tampon d'élution au phosphate dans cet ordre, l'allophycocyanine est recueillie à partir de l'éluant correspondant au troisième tampon d'élution au phosphate, et la Y-phyco- érythrine est recueillie à partir de l'éluant correspondant au quatrième tampon d'élution au phosphate. Cela permet également de séparer de manière fiable la R-phycoérythrine, la phycocyanine, l'allophycocyanine et la Y-phycoérythrine des autres pigments à base de phycobiline. (8) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (1) mentionné ci-dessus, dans l'étape de préparation de solution d'échantillon, la solution d'échantillon contient au moins une des algues consistant en des algues rouges, des algues bleues-vertes et des algues faisant partie des cryptophytes.
Cela permet également de séparer de manière fiable un pigment spécifique à base de phycobiline de la pluralité de pigments à base de phycobiline présente dans l'échantillon préparé en utilisant les algues rouges, les algues bleues-vertes et les algues faisant partie des cryptophytes. (9) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (1) mentionné ci-dessus, le pH de chacun des tampons d'élution au phosphate est compris dans la plage de 6 à 8.
Cela permet également d'éviter la modification et la dégradation de la pluralité de pigments à base de phycobiline. En outre, il est également possible d'éluer (recueillir) les pigments à base de phycobiline dans les tampons d'élution au phosphate. (10) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (1) mentionné ci-dessus, la température de chacun des tampons d'élution au phosphate est comprise dans l'intervalle de 30 à 50 C. Cela permet également d'éviter de manière fiable l'élution des protéines indésirables dans les tampons d'élution au phosphate. En d'autres termes, il est possible d'améliorer le taux recueilli (la pureté) d'un pigment cible à base de phycobiline. (11) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (2) mentionné ci-dessus, l'agent de cristallisation est constitué de sulfate d'ammonium comme constituant principal de cet agent. Cela permet également de cristalliser de manière fiable les pigments à base de phycobiline.
Conformément à la présente invention décrite ci-dessus, il est possible de séparer un pigment spécifique à base de phycobiline (une protéine fluorescente), de grande pureté, par une opération simple. En outre, conformément à la présente invention décrite ci-dessus, il est également possible de séparer de manière fiable un pigment spécifique cible à base de phycobiline des autres pigments à base de phycobiline en choisissant de manière appropriée la concentration en sel des tampons d'élution au phosphate. D'autres caractéristiques ressortiront de la 5 description détaillée qui va suivre, faite en regard des dessins annexés sur lesquels : la figure 1 est une vue en coupe qui représente un exemple d'un appareil d'adsorption destiné à être utilisé dans la présente invention. La figure 2 représente des courbes d'absorbance qui sont établies lorsqu'une pluralité de pigments à base de phycobiline présente dans une solution d'échantillon est soumise à une séparation en utilisant un appareil d'adsorption. La figure 3 est une vue partiellement agrandie qui représente une région (0 à 10 min) dans les courbes d'absorbance représentées sur la figure 2. La figure 4 est une vue partiellement agrandie qui représente une région (15 à 20 min) dans les courbes 20 d'absorbance représentées sur la figure 2. La figure 5 est une vue partiellement agrandie qui représente une région (31 à 35 min) dans les courbes d'absorbance représentées sur la figure 2. La figure 6 est une vue partiellement agrandie 25 qui représente une région (46 à 49 min) dans les courbes d'absorbance représentées sur la figure 2. La figure 7 est une vue partiellement agrandie qui représente une région (61 à 63 min) dans les courbes d'absorbance représentées sur la figure 2. La figure 8 est une photographie qui représente la couleur d'une solution d'échantillon et la couleur de chacune des fractions. La figure 9 représente une courbe d'absorbance de la solution d'échantillon représentée sur la figure 8. La figure 10 représente une courbe d'absorbance de la fraction 2 (F2) représentée sur la figure 8. 10 15 30 35 La figure 11 représente une courbe d'absorbance de la fraction 7 (F7) représentée sur la figure 8. La figure 12 représente une courbe d'absorbance de la fraction 17 (F17) représentée sur la figure 8.
La figure 13 représente une courbe d'absorbance de la fraction 18 (F18) représentée sur la figure 8. La figure 14 représente une courbe d'absorbance de la fraction 32 (F32) représentée sur la figure 8. La figure 15 représente une courbe d'absorbance de la fraction 33 (F33) représentée sur la figure 8. La figure 16 représente une courbe d'absorbance de la fraction 33 (F33) (doublement de la dilution) représentée sur la figure 8. La figure 17 représente une courbe d'absorbance de la fraction 34 (F34) représentée sur la figure 8. La figure 18 représente une courbe d'absorbance de la fraction 35 (F35) représentée sur la figure 8. La figure 19 représente une courbe d'absorbance de la fraction 48 (F48) représentée sur la figure 8.
La figure 20 représente une courbe d'absorbance de la fraction 62 (F62) représentée sur la figure 8. La figure 21 représente des photographies de cristaux qui sont obtenus à partir d'une solution d'échantillon et de chacune des fractions.
Un procédé de séparation conforme à la présente invention est décrit ci-dessous en détail sur la base d'une forme de réalisation préférée représentée sur les dessins annexés. Avant la description du procédé de séparation conforme à la présente invention, un exemple d'un appareil d'adsorption (appareil de séparation) destiné à être utilisé dans la présente invention est décrit. La figure 1 est une vue en coupe qui représente un exemple d'un appareil d'adsorption destiné à être utilisé dans la présente invention. Il faut noter que, dans la description suivante, la partie supérieure et la partie inférieure sur la figure 1 seront désignées respectivement sous le nom de côté d'entrée et de côté de sortie . Plus spécifiquement, le côté d'entrée désigne un côté à partir duquel des liquides tels qu'une solution d'échantillon (c'est-à-dire un liquide contenant un échantillon) et des tampons d'élution au phosphate (c'est-à-dire des éluants) sont introduits dans l'appareil d'adsorption pour séparer (purifier) un pigment cible à base de phycobiline, et le côté de sortie désigne un côté situé du côté opposé par rapport au côté d'entrée, c'est-à-dire un côté à travers lequel les liquides décrits ci-dessus sont déchargés de l'appareil d'adsorption. L'appareil d'adsorption représenté sur la figure 1 comprend une colonne 2, un adsorbant (une charge) 3 et 15 deux éléments filtrants 4 et 5. La colonne 2 est constituée d'un corps principal 21 de colonne et de bouchons 22 et 23 destinés à être fixés à l'extrémité du côté d'entrée et à l'extrémité du côté de sortie du corps principal 21 de la colonne, respectivement. 20 Le corps principal 21 de la colonne est formé, par exemple, d'un élément cylindrique. Des exemples de matériaux constitutifs de chacune des parties (éléments) constituant la colonne 2, y compris le corps principal 21 de la colonne, comprennent divers verres, diverses résines, 25 divers matériaux métalliques, divers matériaux céramiques et des matériaux similaires. Un orifice du corps principal 21 de la colonne présent au niveau du côté d'entrée de celle-ci est couvert de l'élément filtrant 4, et, dans cet état, le bouchon 22 30 est monté au moyen de filets sur l'extrémité du côté d'entrée du corps principal 21 de la colonne. De manière similaire, un orifice du corps principal 21 de la colonne présent au niveau du côté de sortie de celle-ci est couvert avec l'élément filtrant 5 et, dans cet état, le bouchon 23 35 est monté par des filets sur l'extrémité du côté de sortie du corps principal 21 de la colonne.
La colonne 2 ayant une structure telle que celle décrite ci-dessus comporte un espace de remplissage d'adsorbant 20 défini par le corps principal 21 de la colonne et les éléments filtrants 4 et 5, et au moins une partie de l'espace de remplissage d'adsorbant 20 est remplie de l'adsorbant 3 (dans cette forme de réalisation, pratiquement la totalité de l'espace de remplissage d'adsorbant 20 est remplie de l'adsorbant 3). La remplissage appropriée capacité volumétrique de l'espace de d'adsorbant 20 est choisie de manière en fonction du volume d'une solution d'échantillon à utiliser et n'est pas particulièrement limitée mais est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,05 à 10 ml et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,5 à 2 ml pour 1 ml de la solution d'échantillon. En fixant le volume de l'espace de remplissage d'adsorbant 20 à une valeur dans l'intervalle précité et en fixant le volume de l'adsorbant 3 (qui sera décrit plus loin) à une valeur dans un intervalle qui sera décrit plus loin, il est possible de séparer de manière fiable les uns des autres plusieurs pigments à base de phycobiline. En outre, l'étanchéité aux liquides entre le corps principal 21 de la colonne et les bouchons 22 et 23 est assurée en fixant les bouchons 22 et 23 au corps principal 21 de la colonne. Un conduit d'admission 24 est fixé, de manière étanche aux liquides, au bouchon 22 pratiquement au centre de celui-ci, et un conduit de sortie 25 est également fixé, de manière étanche aux liquides, au bouchon 23 pratiquement au centre de celui-ci. Les liquides décrits ci-dessus sont amenés à l'espace de remplissage d'adsorbant 20 par le conduit d'admission 24 et l'élément filtrant 4. Les liquides amenés à l'espace de remplissage d'adsorbant 20 passent à travers les intervalles entre les particules de l'adsorbant 3 et sont ensuite déchargés hors de la colonne 2 à travers l'élément filtrant 5 et le conduit de sortie 25. A ce moment, les différents pigments à base de phycobiline présents dans la solution d'échantillon (l'échantillon) sont séparés sur la base d'une différence de degré d'adsorption de chaque pigment de la pluralité de pigments à base de phycobiline à l'adsorbant 3 et une différence de degré d'affinité de chaque pigment de la pluralité de pigments à base de phycobiline pour les tampons d'élution au phosphate.
Chacun des éléments filtrants 4 et 5 a pour fonction d'empêcher l'adsorbant 3 d'être déchargé de l'espace de remplissage d'adsorbant 20. En outre, chacun des éléments filtrants 4 et 5 est formé d'une étoffe non tissée, d'une mousse (un corps poreux analogue à une éponge, comportant des pores communicants), d'une étoffe tissée, d'une toile ou d'une manière similaire, qui est constituée d'une résine synthétique telle que le polyuréthane, le poly-(alcool vinylique), le polypropylène, le polyétherpolyamide, le poly-(téréphtalate d'éthylène) ou le poly-(téréphtalate de butylène). Au moins une surface de l'adsorbant 3 est constituée d'un composé à base de phosphate de calcium. La pluralité de pigments à base de phycobiline (protéines fluorescentes) est adsorbée spécifiquement à un tel adsorbant 3. En conséquence, les différents pigments à base de phycobiline sont séparés les uns des autres sur la base de la différence de degré d'adsorption de chaque pigment de la pluralité de pigments à base de phycobiline à l'adsorbant 3 et de la différence de degré d'affinité de chaque pigment de la pluralité de pigments à base de phycobiline pour les tampons d'élution au phosphate. Des exemples du composé à base de phosphate de calcium comprennent, mais à titre non limitatif, l'hydroxyapatite (Calo (PO4) 6 (OH) 2) , le TCP (Ca3 (PO4) 2) , Ca2P2O7 , Ca (PO3)2, Calo (PO4) 6F2, Calo (PO4) 6C121 le DCPD (CaHPO4.2H2O) , Ca4O (PO4) 2 et des composés similaires. Ces composés à base de phosphate de calcium peuvent être utilisés isolément ou sous forme d'une association de deux ou plus de deux d'entre eux. Parmi les composés à base de phosphate de calcium mentionnés ci-dessus, un composé contenant l'hydroxyapatite comme constituant principal de l'adsorbant 3 est préféré. En utilisant un tel adsorbant 3, il est possible de séparer efficacement les pigments à base de phycobiline des autres protéines. En outre, en modifiant la concentration d'un sel (phosphate) présent dans chacun des tampons d'élution au phosphate de manière continue ou par étapes d'une manière qui sera décrite plus loin, il est également possible de séparer plus aisément un pigment spécifique à base de phycobiline des autres pigments à base de phycobiline.
De la manière représentée sur la figure 1, l'adsorbant 3 a de préférence une forme de particules (forme granulaire), mais peut avoir une autre forme telle qu'une forme de pastilles (petits blocs) ou une forme de blocs (par exemple un corps poreux dans lequel des pores adjacents communiquent les uns avec les autres ou une forme en nid d'abeilles). En formant l'adsorbant 3 ayant la forme de particules, il est possible d'augmenter sa surface et d'améliorer ainsi ses caractéristiques de séparation en rapport avec les pigments à base de phycobiline.
Le diamètre moyen de particules de l'adsorbant 3 n'est pas particulièrement limité, mais est compris avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,5 à 150 pm, et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 10 à 80 pm. En utilisant l'adsorbant 3 ayant un tel diamètre moyen de particules, il est possible d'éviter de manière fiable le colmatage de l'élément filtrant 5 tout en garantissant une surface suffisante de l'adsorbant 3. Il faut noter que l'adsorbant 3 peut être constitué intégralement du composé à base de phosphate de calcium. En variante, l'adsorbant 3 peut être formé en revêtant la surface d'un support (d'une base) avec le composé à base de phosphate de calcium. Dans le cas où pratiquement la totalité de l'espace de remplissage d'adsorbant 20 est remplie de l'adsorbant 3 comme dans le cas de cette forme de réalisation, l'adsorbant 3 a de préférence pratiquement la même composition à chaque point dans l'espace de remplissage d'adsorbant 20. Cela permet à l'appareil d'adsorption 1 d'avoir une capacité particulièrement excellente de séparation (purification) des pigments à base de phycobiline. A cet égard, il faut noter que l'espace de remplissage d'adsorbant 20 peut être rempli partiellement de l'adsorbant 3 (par exemple une partie de l'espace de remplissage d'adsorbant 20 située du côté où est présent le conduit d'admission 20 peut être remplie d'adsorbant 3). Dans ce cas, la partie restante de l'espace de remplissage d'adsorbant 20 peut être remplie d'un autre adsorbant. Un procédé pour séparer un pigment à base de phycobiline en utilisant l'appareil d'adsorption 1 décrit ci-dessus (c'est-à-dire un procédé de séparation conforme à la présente invention) est décrit ci-dessous. (1) Etape de préparation Tout d'abord, un échantillon contenant une 25 pluralité de pigments à base de phycobiline et un tampon au phosphate sont mélangés pour préparer une solution d'échantillon. Des exemples de la pluralité de pigments à base de phycobiline comprennent : une phycoérythrine telle que 30 la R-phycoérythrine, la Y-phycoérythrine et la B- phycoérythrine ; une phycocyanine telle que la C- phycocyanine et l'allophycocyanine ; et des pigments similaires. Dans cette forme de réalisation, un échantillon contenant de la R-phycoérythrine, de la Y-phycoérythrine, 35 de la phycocyanine et de l'allophycocyanine est utilisé à titre d'exemple d'échantillon contenant la pluralité de pigments à base de phycobiline. Des exemples d'échantillon pour l'extraction de cette pluralité de pigments à base de phycobiline comprennent une algue rouge, une algue bleue-verte et une algue faisant partie des cryptophytes et des échantillons similaires. Ces échantillons peuvent être utilisés isolément ou sous forme d'une association de deux ou plus de deux d'entre eux. En utilisant le procédé de séparation conforme à la présente invention, il est possible de séparer de manière fiable un pigment spécifique à base de phycobiline des autres pigments à base de phycobiline. En outre, un tel échantillon peut être utilisé directement (comme échantillon brut) ou peut être séché, par exemple par lyophilisation et, si nécessaire, peut être en outre broyé avant utilisation. Des exemples de tampon au phosphate comprennent des tampons au phosphate de sodium, au phosphate de potassium, au phosphate de lithium et avec des composés similaires. La concentration en sel (phosphate) présente dans le tampon au phosphate à utiliser pour la préparation de la solution d'échantillon est de préférence égale ou inférieure à celle d'un premier tampon d'élution au phosphate (qui sera décrit plus loin). Cela rend possible d'éliminer de manière plus fiable les protéines inutiles d'une solution d'échantillon préparée. La quantité du tampon au phosphate à utiliser pour la préparation de la solution d'échantillon n'est pas particulièrement limitée, mais est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 5 à 300 fois, et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 50 à 150 fois la masse de l'échantillon utilisé. Le pH du tampon au phosphate n'est pas 35 particulièrement limité, mais est compris avantageusement dans la plage d'environ 6 à 8, et plus avantageusement dans la plage d'environ 6,5 à 7,5. La température du tampon au phosphate n'est pas particulièrement limitée mais est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 30 à 50 C, et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 35 à 45 C. En utilisant le tampon au phosphate ayant un pH compris dans la plage précitée et une température dans l'intervalle précité, il est possible d'éluer (d'extraire) de manière plus fiable les pigments à base de phycobiline dans les tampons d'élution au phosphate ou de désorber de manière plus fiable les pigments à base de phycobiline de l'absorbant 3 par passage aux tampons d'élution au phosphate. En conséquence, il est possible d'améliorer le taux de récupération d'un pigment cible à base de phycobiline. Il faut noter que, dans le cas où la solution d'échantillon ainsi préparée contient des matières solides, les matières solides sont de préférence éliminées de la solution d'échantillon. De cette manière, il est possible d'éviter de manière fiable le colmatage de la colonne 2. Le procédé d'élimination des matières solides n'est pas particulièrement limité. Par exemple, la solution d'échantillon peut être centrifugée pour obtenir un surnageant. Dans ce cas, le surnageant obtenu est recueilli, puis les matières solides restant dans le surnageant sont en outre éliminées par filtration en utilisant un filtre. (2) Etape d'introduction Puis, la solution d'échantillon est introduite dans l'espace de remplissage d'adsorbant 20 par le conduit d'admission 24 et l'élément filtrant 4 pour la mise en contact avec l'adsorbant 3 et pour le passage à travers la colonne 2 (espace de remplissage d'adsorbant 20).
En résultat, les constituants ayant une faible capacité d'adsorption àl'adsorbant 3 (par exemple les protéines autres que les pigments à base de phycobiline) sont déchargés de la colonne 2 à travers l'élément filtrant 5 et le conduit de sortie 25. D'autre part, les pigments à base de phycobiline ayant une grande capacité d'adsorption à l'adsorbant 3 et les protéines qui ne sont pas des pigments à base de phycobiline mais qui ont une capacité d'adsorption relativement forte à l'adsorbant 3 sont retenus au niveau de l'adsorbant 3 dans l'espace de remplissage d'adsorbant 20 de la colonne 2. (3) Etape de fractionnement Puis, des tampons d'élution au phosphate sont introduits dans l'espace de remplissage d'adsorbant 20 (colonne 2) à travers le conduit d'admission 24 et l'élément filtrant 4 pour l'élution des pigments à base de phycobiline et, ainsi, un éluant (éluat) contenant les tampons d'élution au phosphate et les pigments à base de phycobiline peut être obtenu. Puis l'éluant déchargé de la colonne 2 à travers le conduit de sortie 25 et l'élément filtrant 5 est fractionné (recueilli) pour obtenir des fractions correspondant aux tampons d'élution au phosphate respectifs, chacun correspondant à une quantité prédéterminée de l'éluant. Conformément à la présente invention, la concentration d'un sel (phosphate) (concentration en sel) présente dans chacun des tampons d'élution au phosphate est modifiée de manière continue ou par étapes. A cet égard, il faut noter que chacun des tampons d'élution au phosphate est de préférence du même type que le tampon au phosphate utilisé dans l'étape de préparation décrite ci-dessus.
Lorsque les tampons d'élution au phosphate sont mis en contact avec l'adsorbant 3, auquel sont adsorbés la pluralité de pigments à base de phycobiline et les protéines autres que la pluralité de pigments à base de phycobiline, les protéines qui ne sont pas des pigments à base de phycobiline et qui ont une capacité d'adsorption à l'adsorbant 3 inférieure à celle de la pluralité de pigments à base de phycobiline sont tout d'abord désorbées de l'adsorbant 3 et sont ensuite déchargées par le conduit de sortie 25. Puis la pluralité de pigments à base de phycobiline adsorbés à l'adsorbant 3 est désorbée de l'adsorbant 3 en modifiant la concentration en sel de chacun des tampons d'élution au phosphate en fonction du type de pigments à base de phycobiline. Les pigments à base de phycobiline désorbés de l'adsorbant 3 sont mélangés aux tampons d'élution au phosphate pour obtenir un éluant, puis les pigments à base de phycobiline sont recueillis à partir de l'éluant déchargé par le conduit de sortie 25. A ce moment, en fractionnant l'éluant déchargé à travers le conduit de sortie 25 en des fractions comprenant chacune une quantité prédéterminée, il est possible de séparer un pigment spécifique à base de phycobiline de la solution d'échantillon contenant la pluralité de pigments à base de phycobiline. A ce propos, au moins un des composés consistant en R-phycoérythrine, phycocyanine, allophycocyanine et Y-phytoérythrine peut être séparé de la solution d'échantillon contenant la pluralité de pigments à base de phycobiline. De la manière décrite ci-dessus, conformément à la présente invention, la concentration en sel de chacun des tampons d'élution au phosphate est modifiée de manière continue ou par étapes. Dans cette forme de réalisation, il est préféré qu'un premier tampon d'élution au phosphate contenant un sel à une concentration égale ou supérieure à 1 mM mais inférieure à 25 mM, un deuxième tampon d'élution au phosphate contenant un sel à une concentration égale ou supérieure à 25 mM mais inférieure à 75 mM, un troisième tampon d'élution au phosphate contenant un sel à une concentration égale ou supérieure à 75 mM mais inférieure à 250 mM et un quatrième tampon d'élution au phosphate contenant un sel à une concentration égale ou supérieure à 250 mM soient introduits dans l'ordre indiqué dans l'espace de remplissage d'adsorbant 20 de la colonne 2 par étapes. Dans ce cas, la R-phycoérythrine est recueillie à partir de l'éluant correspondant au premier tampon d'élution au phosphate, la R-phycoérythrine et la phycocyanine sont recueillies à partir de l'éluant correspondant au deuxième tampon d'élution au phosphate, l'allophycocyanine est recueillie à partir de l'éluant correspondant au troisième tampon d'élution au phosphate et la Y-phycoérythrine est recueillie à partir de l'éluant correspondant au quatrième tampon d'élution au phosphate. Il faut noter que la concentration en sel du premier tampon d'élution au phosphate est comprise plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 1 à 10 mM, la concentration en sel du deuxième tampon d'élution au phosphate est comprise plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 35 à 65 mM, la concentration en sel du troisième tampon d'élution au phosphate est comprise plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 85 à 125 mM, et la concentration en sel du quatrième tampon d'élution au phosphate est comprise plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 450 à 650 mM. En outre, la concentration en sel du premier tampon d'élution au phosphate est comprise encore plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 1 à 5 mM, la concentration en sel du deuxième tampon d'élution au phosphate est comprise encore plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 45 à 55 mM, la concentration en sel du troisième tampon d'élution au phosphate est comprise encore plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 95 à 105 mM, et la concentration en sel du quatrième tampon d'élution au phosphate est comprise encore plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 490 à 510 mM. En introduisant ces tampons d'élution au phosphate contenant les sels à ces concentrations dans la colonne 2 par étapes, il est possible de séparer de manière plus fiable un pigment cible à base de phycobiline des autres pigments à base de phycobiline. Le pH de chacun des premier à quatrième tampons d'élution au phosphate est compris avantageusement dans la plage d'environ 6 à 8, et plus avantageusement dans la plage d'environ 6,5 à 7,5. En fixant le pH de chacun des premier à quatrième tampons d'élution au phosphate à une valeur dans l'intervalle précité, il est possible d'éluer (recueillir) de manière plus fiable les pigments à base de phycobiline dans les tampons d'élution au phosphate tout en évitant la modification ou la dégradation des pigments à base de phycobiline. La température de chacun des premier à quatrième tampons d'élution au phosphate est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 30 à 50 C, et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 35 à 45 C. En fixant la température de chacun des premier à quatrième tampons d'élution au phosphate à une valeur dans l'intervalle précité, il est possible d'éviter de manière plus fiable l'élution des protéines inutiles dans les tampons d'élution au phosphate. En conséquence, il est possible d'améliorer davantage le taux de récupération (la pureté) d'un pigment cible à base de phycobiline. Le débit auquel chacun des premier à quatrième tampons d'élution au phosphate s'écoule dans l'espace de remplissage d'adsorbant 20 de la colonne 2 n'est pas particulièrement limité mais est compris avantageusement dans l'intervalle d'environ 1 à 10 ml/min, et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 1 à 5 ml/min.
Le temps d'écoulement pendant lequel chacun des premier à quatrième tampons d'élution au phosphate s'écoule dans l'espace de remplissage d'adsorbant 20 de la colonne 2 n'est pas particulièrement limité mais est compris avantageusement dans l'intervalle d'environ 5 à 60 minutes et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 10 à 30 minutes. (4) Etape de cristallisation Puis un agent de cristallisation est ajouté à l'éluant des fractions pour la cristallisation des pigments à base de phycobiline. De cette manière, il est possible de recueillir aisément un pigment cible à base de phycobiline, ayant une grande pureté. L'agent de cristallisation n'est pas particulièrement limité, mais un agent de cristallisation contenant principalement du sulfate d'ammonium est utilisé de préférence. En utilisant un tel agent de cristallisation, il est possible de cristalliser de manière fiable les pigments à base de phycobiline tout en évitant la modification ou la dégradation des pigments à base de phycobiline.
La quantité d'agent de cristallisation à ajouter à l'éluant fractionné est choisie de manière appropriée de telle sorte que la concentration de l'agent de cristallisation dans l'éluant fractionné soit comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 30 à 90 % de sa concentration à saturation et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 40 à 60 % de sa concentration à saturation. Il faut noter que l'agent de cristallisation peut être ajouté directement à l'éluant fractionné, ou bien peut être ajouté à l'éluant fractionné sous forme d'une solution dans un solvant approprié. De la manière décrite ci-dessus, dans cette forme de réalisation, les quatre tampons d'élution au phosphate, c'est-à-dire les premier à quatrième tampons d'élution au phosphate, sont préparés et introduits dans l'espace de remplissage d'adsorbant 20 de la colonne 2 dans l'ordre indiqué. Cependant, par exemple, dans le cas où il est désiré de recueillir sélectivement de la R-phycoérythrine, deux tampons d'élution au phosphate, c'est-à-dire le premier tampon d'élution au phosphate et un autre tampon d'élution au phosphate contenant un sel ayant une concentration supérieure à la concentration en sel du premier tampon d'élution au phosphate, peuvent être préparés et introduits dans l'espace de remplissage d'adsorbant 20 de la colonne 2 dans l'ordre indiqué. Dans ce cas, les deuxième à quatrième tampons d'élution au phosphate peuvent être introduits dans l'espace de remplissage d'adsorbant 20 de la colonne 2 après avoir introduit les deux tampons d'élution au phosphate décrits ci-dessus dans l'espace de remplissage d'adsorbant 20 de la colonne 2. En outre, les premier à quatrième tampons d'élution au phosphate peuvent être utilisés sous forme d'une association de deux ou plus de deux d'entre eux en fonction du type de pigment cible à base de phycobiline à recueillir. Par exemple, le premier tampon d'élution au phosphate et le second tampon d'élution au phosphate peuvent être utilisés en association. Dans ce cas, la R-phycoérythrine est recueillie à partir d'un éluant (premier tampon d'élution au phosphate) déchargé de la colonne 2 au cours du déchargement du premier tampon d'élution au phosphate de la colonne 2, et la R-phycoérythrine et la phycocyanine sont recueillies à partir d'un éluant (second tampon d'élution au phosphate) déchargé de la colonne 2 au cours du déchargement du second tampon d'élution au phosphate de la colonne 2. En outre, les premier, deuxième et troisième tampons d'élution au phosphate peuvent être utilisés en association. Dans ce cas, la R-phycoérythrine est recueillie à partir d'un éluant (premier tampon d'élution au phosphate) déchargé de la colonne 2 au cours du déchargement du premier tampon d'élution au phosphate de la colonne 2, la R-phycoérythrine et la phycocyanine sont recueillies à partir d'un éluant (deuxième tampon d'élution au phosphate) déchargé de la colonne 2 au cours du déchargement du deuxième tampon d'élution au phosphate de la colonne 2, et l'allophycocyanine est recueillie à partir d'un éluant (troisième tampon d'élution au phosphate) déchargé de la colonne 2 au cours du déchargement du troisième tampon d'élution au phosphate de la colonne 2.
De la manière décrite ci-dessus, en utilisant le procédé de séparation conforme à la présente invention, il est possible de supprimer la nécessité de modifier l'appareil d'adsorption tel qu'une colonne en fonction du type de pigment à base de phycobiline à séparer afin de séparer un pigment spécifique à base de phycobiline d'un échantillon contenant la pluralité de pigments à base de phycobiline. En outre, il est également possible de séparer un pigment spécifique à base de phycobiline par une opération simple telle que la concentration en sel de chacun des tampons d'élution au phosphate amenés à l'appareil d'adsorption soit modifiée de manière continue ou par étapes. Bien que le procédé de séparation conforme à la présente invention ait été décrit ci-dessus par référence à une forme préférée de réalisation de ce procédé, la présente invention n'y est pas limitée. Par exemple, le procédé de séparation conforme à la présente invention peut comprendre en outre une ou plusieurs étapes, à n'importe quelles fins.
De plus, la forme de réalisation de la présente invention a été décrite sur la base du cas où la colonne comprenant l'espace de remplissage d'adsorbant rempli de l'adsorbant (de la charge) est utilisée comme appareil d'adsorption, mais un appareil d'adsorption comprenant, par exemple, un adsorbant en forme de plaque plate logé dans celui-ci peut également être utilisé. Exemples La présente invention est décrite ci-dessous par référence à des exemples spécifiques. (Exemple 1) 1 Tout d'abord, 1 g d'algues déshydratées a été préparé comme échantillon et l'échantillon a été transformé en poudre par broyage en utilisant un broyeur. 2 Puis un tampon au phosphate 1 mM (pH 7,0) a été ajouté à la poudre et le tampon au phosphate et la poudre ont été agités à 37 C pendant 24 heures pour obtenir un mélange. 3 Après achèvement de l'agitation, le mélange a été centrifugé (2000 tr/min x 5 min) pour recueillir un surnageant. On a laissé le surnageant passer à travers un filtre ayant un diamètre moyen des pores de 0,4 pm pour obtenir une solution d'échantillon. 4 Puis, 60 ml de la solution d'échantillon (Echantillon) ont été introduits dans une colonne Bio-rad Bio-scale MT5 (un appareil d'adsorption) à une vitesse de 2 ml/min pendant 30 minutes. Il faut noter que la capacité volumétrique de l'espace de remplissage d'adsorbant de la colonne était égale à 5 ml.
Comme matière de remplissage pour remplir l'espace de remplissage d'adsorbant de la colonne, des billes d'hydroxyapatite calcique (Ca-HAP) (diamètre de particules : 40 pm, type II, produites par Pentax Corporation) ont été utilisées. Il faut noter que les billes d'hydroxyapatite calcique (Ca-HAP) sont des billes d'hydroxyapatite ordinaires dans lesquelles le Ca n'est pas remplacé par un autre élément métallique. 5 Puis, un tampon d'élution au phosphate 1 mM (phosphate de sodium : pH 7,0) et un tampon d'élution au phosphate 5 mM (pH 7,0) ont été préparés comme premier tampon d'élution au phosphate, un tampon d'élution au phosphate 50 mM (pH 7,0) a été préparé comme deuxième tampon d'élution au phosphate, un tampon d'élution au phosphate 100 mM (pH 7,0) a été préparé comme troisième tampon d'élution au phosphate et un tampon d'élution au phosphate 500 mM (pH 7,0) a été préparé comme quatrième tampon d'élution au phosphate. Chacun des premier à quatrième tampons d'élution au phosphate (60 ml) a été introduit dans l'espace de remplissage d'adsorbant de la colonne dans l'ordre indiqué à 4 ml/min pendant 15 minutes.
Puis, un éluant déchargé de la colonne a été fractionné pour recueillir des fractions de 4 ml (toutes les 1 minute). Il faut noter qu'une fraction d'éluant de 4 ml recueillie initialement a été désignée par le numéro F1 et les autres fractions d'éluant de 4 ml recueillies de manière séquentielle ont été également numérotées. Plus spécifiquement, un éluant recueilli au cours du déchargement du tampon d'élution au phosphate 1 mM a été fractionné en 15 fractions numérotées F1 à F15, un éluant recueilli au cours du déchargement du tampon d'élution au phosphate 5 mM a été fractionné en 15 fractions numérotées F16 à F30, un éluant recueilli au cours du déchargement du tampon d'élution au phosphate 50 mM a été fractionné en 15 fractions numérotées F31 à F45, un éluant recueilli au cours du déchargement du tampon d'élution au phosphate 100 mM a été fractionné en 15 fractions numérotées F46 à F60, et un éluant recueilli au cours du déchargement du tampon d'élution au phosphate 500 mM a été fractionné en 15 fractions numérotées F61 à F75. L'éluant dans chacune des fractions a été soumis à l'analyse dans un spectrophotomètre à lumière visible - ultraviolette. 6 Puis, une solution aqueuse à 50 96 en poids de sulfate d'ammonium a été ajoutée à l'éluant dans chacune des fractions pour la cristallisation des pigments à base de phycobiline. La figure 2 représente des courbes d'absorbance qui ont été établies lorsque la pluralité de pigments à base de phycobiline présents dans la solution d'échantillon a été soumise à une séparation en utilisant l'appareil d'adsorption dans l'étape 5 ci-dessus. Les figures 3 à 7 sont des vues partiellement agrandies qui représentent certaines régions dans les courbes d'absorbance représentées sur la figure 2 où une variation d'absorbance a été détectée. Comme permettent de le constater les courbes d'absorbance représentées sur la figure 2 et les figures 3 à 7, une variation d'absorbance a été détectée dans au moins une des courbes d'absorbance établies à des longueurs d'ondes de 565 nm et 620 nm lorsque les absorbances de la fraction F2 (sur chaque dessin, pendant la période de temps de 1 à 2 min), de la fraction F7 (sur chaque dessin, pendant la période de temps de 6 à 7 min), de la fraction F17 (sur chaque dessin, au cours de la période de temps de 16 à 17 min), de la fraction F18 (sur chaque dessin, au cours de la période de temps de 17 à 18 min), de la fraction F32 (sur chaque dessin, au cours de la période de temps de 31 à 32 min), de la fraction F33 (sur chaque dessin, au cours de la période de temps de 32 à 33 min), de la fraction F34 (sur chaque dessin, au cours de la période de temps de 33 à 34 min), de la fraction F35 (sur chaque dessin, au cours de la période de temps de 34 à 35 min), de la fraction F48 (sur chaque dessin, au cours de la période de temps de 47 à 48 min), et de la fraction F62 (sur chaque dessin, au cours de la période de temps de 61 à 62 min) ont été mesurées aux longueurs d'ondes de 280 nm, 565 nm et 620 nm. La figure 8 est une photographie qui représente la couleur de la solution d'échantillon (Echantillon) et la couleur de chacune des fractions présentant une variation d'absorbance.
En outre, les figures 9 à 20 représentent les courbes d'absorbance de la solution d'échantillon et des fractions représentées sur la figure 8, établies aux longueurs d'ondes de 300 à 700 nm. En outre, la figure 21 représente des photographies de cristaux qui ont été obtenus en ajoutant une solution aqueuse à 50 en poids de sulfate d'ammonium à chacune des solutions consistant en la solution d'échantillon (Echantillon) et certaines fractions obtenues par fractionnement dans l'étape 5 (c'est-à-dire les fractions F7, F17, F32, F33, F34, F35 et F48).
De la manière représentée sur la figure 8, les fractions F2, F7, F17 et F18 ont présenté une couleur rouge, la fraction F32 a présenté une couleur légèrement bleuâtre-rouge, les fractions F33, F34, F35 et F48 ont présenté une couleur bleuâtre-pourpre, et la fraction F62 a présenté une couleur rouge. De la manière représentée sur les figures 9 à 20, dans chacun des cas des fractions F2, F7, F17, F18 et F32, des pics ont été détectés à environ 495 nm et 565 nm, et, dans chacun des cas des fractions F33, F34 et F35, un pic a été détecté à environ 620 nm. En outre, dans le cas de la fraction F48, un pic détecté à environ 650 nm était un pic principal et, dans le cas de la fraction F62, un pic détecté à environ 495 nm était un pic principal. Le pigment à base de phycobiline présentant des pics d'absorption à environ 495 nm (deuxième pic) et à environ 565 nm (pic principal) était de la R-phycoérythrine présentant une couleur rouge. Le pigment à base de phycobiline présentant un pic d'absorption à environ 620 nm était de la phycocyanine présentant une couleur bleue. Le pigment à base de phycobiline présentant un pic principal à environ 650 nm était de l'allophycocyanine présentant une couleur bleue. Le pigment à base de phycobiline présentant un pic principal à environ 495 nm était de la Y-phycoérythrine présentant une couleur rouge.
Comme permettent de le constater les résultats représentés sur la figure 8 et les figures 9 à 20, la R-phycoérythrine a pu être recueillie à partir de l'éluant (fractions F2, F7, F17 et F18) déchargé de l'appareil d'adsorption au cours du déchargement du tampon d'élution au phosphate 1 mM et du tampon d'élution au phosphate 5 mM (c'est-à-dire les premiers tampons d'élution au phosphate) de l'appareil d'adsorption, la R-phycoérythrine et la phycocyanine ont pu être recueillies à partir de l'éluant (R-phycoérythrine : fraction F32, phycocyanine : fractions F33, F34 et F35) déchargé de l'appareil d'adsorption au cours du déchargement du tampon d'élution au phosphate 50 mM (c'est-à-dire le deuxième tampon d'élution au phosphate) de l'appareil d'adsorption, l'allophycocyanine a pu être recueillie à partir de l'éluant (fraction F48) déchargé de l'appareil d'adsorption au cours du déchargement du tampon d'élution au phosphate 100 mM (c'est-à-dire le troisième tampon d'élution au phosphate) de l'appareil d'adsorption, et la Y-phycoérythrine a pu être recueillie à partir de l'éluant (fraction F62) déchargé de l'appareil d'adsorption au cours du déchargement du tampon d'élution au phosphate 500 mM (c'est-à-dire le quatrième tampon d'élution au phosphate) de l'appareil d'adsorption. De plus, de la manière représentée sur la figure 21, tous les pigments à base de phycobiline ont été obtenus sous forme de cristaux purs, bien que certaines photographies représentées sur la figure 21 ne soient pas nettes en raison d'une quantité absolue limitée de cristaux. (Exemple 2) La séparation des pigments à base de phycobiline a été effectuée de la même manière que dans l'Exemple 1, sauf que les dimensions de l'appareil d'adsorption ont été augmentées (c'est-à-dire sauf que l'appareil d'adsorption était de plus grand volume).
En résultat, les pigments à base de phycobiline ont pu être séparés comme dans le cas de l'Exemple 1. Il faut noter que, dans l'Exemple 2, une colonne Bio-Rad Geltec (diamètre : 20 cm, longueur : 10 cm) a été utilisée comme appareil d'adsorption, et une charge CHT de type 2 (diamètre moyen de particules : 60 p.m) a été utilisée comme charge (adsorbant).
En outre, la séparation des pigments à base de phycobiline a été effectuée de la même manière que dans l'Exemple 1 et l'Exemple 2, sauf que la longueur de la colonne a été augmentée. Dans les deux cas, la R-phycoérythrine et la phycocyanine tendaient à être plus nettement séparées l'une de l'autre dans un tampon au phosphate 50 mM (c'est-à-dire un deuxième tampon d'élution au phosphate). Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre.
Claims (11)
1. Procédé pour séparer au moins un pigment à base de phycobiline d'un échantillon contenant une pluralité de pigments à base de phycobiline, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à préparer un appareil d'adsorption (1) comportant un espace de remplissage (20) destiné à être rempli d'un adsorbant (3), ayant une surface, au moins la surface de l'adsorbant (3) étant constituée d'un composé à base de phosphate de calcium et au moins une partie de l'espace de remplissage (20) étant remplie de l'adsorbant (3) ; à préparer une solution d'échantillon en mélangeant l'échantillon et un tampon au phosphate ; à introduire la solution d'échantillon dans l'espace de remplissage (20) de l'appareil d'adsorption (1) de telle sorte que la pluralité de pigments à base de phycobiline soit adsorbée par l'adsorbant (3) ; à introduire des tampons d'élution au phosphate pour éluer au moins un pigment de la pluralité de pigments à base de phycobiline de l'adsorbant (3) dans l'espace de remplissage {20) de l'appareil d'adsorption (1) de manière continue ou par étapes pour obtenir ainsi un éluant contenant ledit au moins un pigment à base de phycobiline, les tampons d'élution au phosphate ayant différentes concentrations en sel ; et à fractionner l'éluant qui est déchargé de l'espace de remplissage {20) de l'appareil d'adsorption (1) en différentes portions correspondant aux tampons d'élution au phosphate respectifs pour séparer ainsi ledit au moins un pigment à base de phycobiline des autres pigments à base de phycobiline.
2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la 35 cristallisation dudit au moins un pigment à base dephycobiline en ajoutant un agent de cristallisation à l'éluant.
3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le composé à base de phosphate de calcium est constitué d'hydroxyapatite comme constituant principal de celui-ci.
4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la pluralité de pigments à base de phycobiline contient de la R-phycoérythrine, et les tampons d'élution au phosphate comprennent un premier tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 1 mM mais inférieure à 25 mM, et en ce que, dans l'étape d'introduction, le premier tampon d'élution au phosphate est introduit dans l'espace de remplissage et ensuite, dans l'étape de fractionnement, la R-phycoérythrine est recueillie à partir de l'éluant correspondant au premier tampon d'élution au phosphate.
5. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la pluralité de pigments à base de phycobiline contient de la R-phycoérythrine et de la phycocyanine, et les tampons d'élution au phosphate comprennent : un premier tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 1 mM mais inférieure à 25 mM et un second tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 25 mM mais inférieure à 75 mM, et en ce que, dans l'étape d'introduction, le premier tampon d'élution au phosphate et le second tampon d'élution au phosphate sont introduits dans l'espace de remplissage par étapes dans cet ordre et ensuite, dans l'étape de fractionnement, la R-phycoérythrine est recueillie à partir de l'éluant correspondant au premier tampon d'élution au phosphate et la R-phycoérythrine et la phycocyanine sont recueillies à partir de l'éluant correspondant au second tampon d'élution au phosphate dans cet ordre.
6. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la pluralité de pigments à base de phycobiline contient de la R-phycoérythrine, de la phycocyanine et de l'allophycocyanine, et les tampons d'élution au phosphate comprennent : un premier tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 1 mM mais inférieure à 25 mM ; un deuxième tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 25 mM mais inférieure à 75 mM ; et un troisième tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 75 mM mais inférieure à 250 mM ; et en ce que, dans l'étape d'introduction, le premier tampon d'élution au phosphate, le deuxième tampon d'élution au phosphate et le troisième tampon d'élution au phosphate sont introduits dans l'espace de remplissage par étapes dans cet ordre et ensuite, dans l'étape de fractionnement, la R-phycoérythrine est recueillie à partir de l'éluant correspondant au premier tampon d'élution au phosphate, la R-phycoérythrine et la phycocyanine sont recueillies à partir de l'éluant correspondant au deuxième tampon d'élution au phosphate dans cet ordre et l'allophycocyanine est recueillie à partir de l'éluant correspondant au troisième tampon d'élution au phosphate.
7. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la pluralité de pigments à base de phycobiline contient de la R-phycoérythrine, de la phycocyanine, de l'allophycocyanine et de la Y-phycoérythrine, et les tampons d'élution au phosphate comprennent : un premier tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 1 mM mais inférieure à 25 mM ; un deuxième tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 25 mM mais inférieure à 75 mM ; un troisième tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 75 mM mais inférieure à 250 mM ; et unquatrième tampon d'élution au phosphate dont la concentration en sel est égale ou supérieure à 250 mM ; et en ce que, dans l'étape d'introduction, le premier tampon d'élution au phosphate, le deuxième tampon d'élution au phosphate, le troisième tampon d'élution au phosphate et le quatrième tampon d'élution au phosphate sont introduits dans l'espace de remplissage par étapes dans cet ordre et ensuite, dans l'étape de fractionnement, la R-phycoérythrine est recueillie à partir de l'éluant correspondant au premier tampon d'élution au phosphate, la R-phycoérythrine et la phycocyanine sont recueillies à partir de l'éluant correspondant au deuxième tampon d'élution au phosphate dans cet ordre, l'allophycocyanine est recueillie à partir de l'éluant correspondant au troisième tampon d'élution au phosphate et la Y-phycoérythrine est recueillie à partir de l'éluant correspondant au quatrième tampon d'élution au phosphate.
8. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que, dans l'étape de préparation de solution d'échantillon, la solution d'échantillon contient au moins une des algues consistant en des algues rouges, des algues bleues-vertes et des algues faisant partie des cryptophytes.
9. Procédé suivant la revendication 1, 25 caractérisé en ce que le pH de chacun des tampons d'élution au phosphate est compris dans la plage de 6 à 8.
10. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la température de chacun des tampons d'élution au phosphate est comprise dans l'intervalle de 30 30 à 50 C.
11. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent de cristallisation est constitué de sulfate d'ammonium comme constituant principal de cet agent.
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