CH668960A5 - Milieu, dispositif et procede pour separation cellulaire. - Google Patents
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Description
DESCRIPTION
La présente invention se rapporte à un milieu, à un dispositif et à un procédé pour la séparation d'une population de cellules présentant un intérêt à partir d'une suspension d'un groupe de cellules animales, en particulier de cellules animales adhésives.
La séparation d'un groupe de cellules présentant un intérêt à partir d'une suspension de cellules est une pratique de routine effectuée dans le milieu médical non seulement pour des tests cliniques, mais également dans le but d'effectuer un immunodiagnostic ou une immunothérapie comprenant l'évaluation basique d'une série de po-tentiateurs biophylactiques. Toutefois, si l'on souhaite séparer des cellules T, des cellules B, des cellules K ou des cellules NK d'une suspension de lymphocytes, il n'y a pas de méthode fiable disponible pour l'isolation d'irne certaine population de cellules dans un état non modifié. Il existe par conséquent une forte demande pour l'établissement d'une technique qui soit capable de séparer une population de cellules présentant un intérêt sous une forme non modifiée à partir d'une suspension cellulaire.
Les demandes de brevet japonais publiées (OPI) Nos 204454/82 et 140886/81 ont proposé des techniques qui sont capables d'obtenir des cellules T par une technique de séparation en une seule étape faisant usage de matériaux en particules ayant des groupes fonctionnels acides ou des matériaux en particules hydrophobes et insolubles dans l'eau présentant des micropores et, plus particulièrement, des homo- et copolymères de l'éthylène, du propylène, du chlorure de vinyle, de l'acétate de vinyle, du styrène, du divinylbenzène, de l'acrylonitrile et du méthacrylate de méthyle, ou bien du nylon, du polycarbonate, du téréphtalate de polyéthylène et des copolymères du polyester, ou encore des dérivés de ceux-ci comprenant un groupe acide sulfonique, un groupe carboxyle, un groupe acide phospho-nique ou un groupe phénol. Des problèmes ont été mis en évidence à l'expérience avec ces techniques de séparation de cellules selon l'art antérieur, en ce que la colonne de matériaux en particules est facilement obturée à cause de leur faible dimension particulaire moyenne et en ce que les polymères chimiques per se, ou les substances résiduelles à faible poids moléculaire, sont toxiques vis-à-vis des activités des cellules à récupérer.
Bien que de nombreux matériaux et méthodes soient autorisés par les sociétés académiques internationales pour être utilisés dans la s séparation des cellules, ils requièrent tous un temps considérable et un traitement rigoureux dans la fabrication des préparations pour ces techniques de séparation, comprennent des opérations compliquées, longues et laborieuses de séparation, et ne permettent pas d'obtenir un degré élevé de reproductibilité, du fait que la résolution io et la forme (le spectre de la population cellulaire présentant un intérêt) obtenues par le milieu de séparation diffèrent considérablement d'un lot de production à un autre.
Le procédé «Sephadex G10», utilisant une cellule dextran réticulée, constitue l'une des méthodes approuvées internationalement 15 pour la séparation cellulaire. Bien que la théorie de l'opération de cette technique de séparation typique de cellules n'ait pas été complètement éclaircie, On pense que le rôle principal est joué par la différence d'adhésion entre deux cellules, de telle sorte que des macrophages ou de grandes cellules accessoires adhésives sont retardées 20 par adhésion, alors que les cellules T ou les cellules B sont exclues de la cellule dextran. Toutefois, dans cette méthode, les petites cellules accessoires non adhérentes sont également exclues de la cellule de dextran. En outre, ime récente étude a révélé que quelques-unes des sous-populations de cellules T sont adhérentes sur la cellule dextran 25 et que la population de cellules T ne peut pas être obtenue sous sa forme complète et intégrale. Ce fait constitue un inconvénient substantiel dans la tentative d'utiliser le procédé «Sephadex G10»
comme technique immunodiagnostique.
Un autre dispositif de séparation cellulaire approuvé internationalement est une colonne remplie de laine de nylon. Cette colonne peut être utilisée comme moyen d'obtenir un abondant groupe de cellules séparées avec des cellules T, mais le rendement substantiel en cellules recherchées obtenu avec cette colonne est généralement faible (12 à 25%). Bien que la pureté des cellules, T obtenues, à partir de cette colonne soit assez élevée, la population de cellules T récupérées diffère de celle dans la suspension de cellules originales. La colonne est utilisée après avoir été remplie avec une quantité prédéterminée de laine de nylon; or„ non seulement la résolution et son modèle varieront d'un lot de production à un autre, mais ils dépendront également de la manière dont les fibres de verre sont désintégrées, chargées dans la colonne ou lavées. Il faut noter que ce problème des variations de caractéristiques est commun aux milieux de séparations organiques.
45 Comme il ressort de la brève explication ci-après, l'application commerciale de la méthode de séparation des cellules faisant usage de leur nature adhésive vient juste de commencer, on attend un procédé avec une efficacité, une vitesse et une précision supérieures, résultant de l'amélioration des méthodes de séparation per se ou du 50 milieu de séparation utilisé, ou encore du développement de nouveaux matériaux appropriés comme milieu de séparation. Des efforts concertés à cet effet sont souhaités non seulement dans le domaine général de la biotechnologie, mais également dans d'importants domaines médicaux, tels que l'immunodiagnostic et l'immunothérapie. 55 Par conséquent, un but de la présente invention est de fournir une technique de séparation de cellules caractérisée par la simplicité de son traitement préliminaire, des différentes étapes et des étapes de séparation subséquentes.
Un autre but de la présente invention est de fournir une sépara-60 tion de cellules améliorée, efficace et avec un modèle de séparation contrôlé.
Un dernier but de la présente invention est de fournir un procédé de séparation cellulaire ayant un degré élevé de reproductibilité,
ainsi qu'un matériau approprié à cette méthode.
65 Comme résultat d'efforts concertés effectués pour atteindre les objectifs mentionnés ci-dessus, les présents inventeurs ont trouvé qu'un corps en apatite hydroxycalcium fritté ayant un domaine spécifique de dimension particulaire présente une activité d'adsorption
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supérieure pour un groupe de cellules immunologiques. La présente invention a été obtenue sur la base de cette constatation.
Selon un premier aspect de la présente invention, un milieu de séparation cellulaire est décrit, constitué d'un corps en apatite de type hydroxycalcium fritté ayant une dimension moyenne des particules de 50-2000 mp.
Selon un autre aspect de la présente invention, un dispositif pour la séparation cellulaire est décrit, qui comporte une colonne remplie avec un milieu de séparation cellulaire réalisé en un corps d'apatite hydroxycalcium fritté ayant une dimension particulaire moyenne de 50-2000 m|i, cette colonne ayant une entrée et une sortie pour une suspension cellulaire, et étant munie d'un filtre pour empêcher la dispersion de ce milieu de séparation cellulaire.
Selon un troisième aspect de la présente invention, un procédé de séparation cellulaire est décrit, qui comprend la mise en contact d'une suspension de cellules avec un milieu de séparation cellulaire réalisé en un corps d'apatite hydroxycalcium fritté ayant une dimension particulaire moyenne de 50-2000 mji, de manière à permettre l'adsorption d'une population de cellules présentant un intérêt sur ledit milieu de séparation cellulaire.
Le corps en apatite hydroxycalcium fritté utilisé dans la présente invention doit donc avoir une dimension particulaire moyenne dans le domaine de 50-2000 m|i. Si la dimension des particules moyennes du corps fritté est inférieure à 50 mji, la possibilité d'écoulement insuffisante produit une incidence élevée sur le problème de l'obstruction, dépendant de la dimension des cellules à séparer et de la forme des cellules soufflées. Si, d'autre part, la dimension moyenne des particules du corps en apatite hydroxycalcium fritté dépasse 2000 m|i, la surface disponible pour l'adsorption est diminuée, ce qui tend à dégrader la résolution.
Le corps en apatite hydroxycalcium fritté utilisé dans la présente invention consiste* de préférence en une composition dans laquelle le rapport Ca à P est compris entre 1,4 et 1,8. Si le rapport Ca à P est inférieur à l„4ou supérieur à 1,8, la capacité d'adsorption de l'apatite est diminuée, produisant ainsi une diminution de la résolution jusqu'à un niveau inacceptablement bas.
Le corps en apatite hydroxycalcium fritté utilisé dans la présente invention est de préférence préparé par chauffage à une température de 600 à 1350° C. Si la température de chauffage est inférieure à 600° C, l'apatite obtenue a une adsorption réduite pour les mono-cytes. Si la température de chauffage dépasse 1350° C, l'apatite est dégradée, et un corps céramique intégral ne peut être produit.
Les cellules présentant un intérêt peuvent être séparées sans être stimulées immunologiquement, et les cellules récupérées et la résolution obtenue sont nettement supérieures à celles possibles avec les techniques connues. Les procédures de séparation sont substantiellement simplifiées, le temps requis pour une complète séparation étant réduit jusqu'à plus de dix fois par rapport au temps requis pour les techniques conventionnelles. A cause de la très faible rétention d'eau du milieu de séparation employé, la méthode selon la présente invention permet l'utilisation du procédé de récupération en une étape, et la suspension cellulaire peut être directement introduite dans le milieu de séparation, qui peut même rester non lavé si le but le permet. Le milieu de séparation (qui peut être stérilisé par chauffage à n'importe quelle température entre 100 et 500° C) peut être combiné avec une colonne stérilisée (qui peut être une seringue si une séparation à faible échelle est effectuée) dans un état prêt à l'usage et d'une manière très simple, cela dans un court laps de temps. Cette caractéristique produit un avantage économique important en termes d'opération préparatoire. Si désiré, le milieu de séparation et les autres composants nécessaires sont chargés dans une colonne et le kit ainsi assemblé peut être mis en vente sur le marché dans des conditions complètement stériles.
La possibilité pour l'apatite hydroxycalcium frittée d'adsorber un groupe de cellules immunologiques est supposée dériver du fait que cette substance est la même que le composant principal des os chez les vertébrés. Cette substance est un matériau bioactif, optimal comme matériau de séparation de cellules adhésives, du fait qu'aucun autre matériau ne peut entrer en compétition avec l'apatite hydroxycalcium en termes d'adsorption spécifique de cellules vivantes, d'adhésion de celle-ci et de caractère contrôlable de cette adsorption et de l'adhésion de cellules.
Selon un exemple de la présente invention, des Polysaccharides et des mucopolysaccharides dérivés de corps vivants, tels que l'acide hyaluronique, le sulfate de chondroïtine, les dérivés de la chitine, de la fibronectine et de l'ostéonectine, ainsi que les dérivés de ceux-ci peuvent être partiellement adsorbés sur les surfaces de granules d'apatite hydroxycalcium frittée, et les propriétés physico-chimiques ou immunologiques de la surface du substrat sont modulées de telle sorte qu'elles acquièrent subtilement les activités modifiées de l'adsorption pour différents groupes de cellules présentant un intérêt. Cela permet aux caractéristiques de résolution de la colonne d'être effectivement modifiées de manière à fournir des modèles d'élution aigus et des spectres de résolution contrôlés. En outre, les propriétés d'adsorption de l'apatite hydroxycalcium pour les sous-populations respectives de groupes de cellules présentant un intérêt sont modulées de telle sorte qu'il devienne possible de sélectionner séparément une sous-population de cellules spécifiques.
Avec une colonne prévue pour le traitement d'une grande quantité de cellules, la vitesse de passage de la suspension de cellules peut être rendue librement ajustable en incorporant une configuration en cascade à multi-étapes, ou une structure produisant une distribution inégale dans les caractéristiques d'adsorption ou encore un système avec tube en forme de U. Afin d'obtenir un modèle de résolution fin, la colonne peut être placée dans un état d'apesanteur, de manière à permettre le passage de la suspension de cellules uniquement par diffusion et sans convection.
La présente invention sera décrite ci-après en détail et en référence à des exemples de mise en œuvre, dans lesquels elle est appliquée à la séparation de cellules lymphoïdes. Il convient de noter que le concept de la présente invention est également applicable ài là séparation d'autres cellules adhésives.
Les exemples suivants de mise en œuvre ont été effectués en utilisant un séparateur de cellules ayant la configuration illustrée dans le dessin annexé. Comme montré, le séparateur de cellules consiste en une colonne 1 qui a été chargée avec un milieu de séparation 2 réalisé en un corps d'apatite hydroxycalcium fritté 2, qui a été équipé d'un filtre 3 et qui présente une entrée 4 et une sortie 5 pour la suspension cellulaire. Le filtre 3 est de manière typique réalisé en un élément poreux perméable au gaz ou en fibres choisies parmi les plastiques, les verres, les céramiques, etc.
Exemple 1:
Une colonne ayant une capacité interne de 5 ml a été remplie de 0,02 g de laine de verre, qui occupe 0,8 ml de la capacité de la colonne. Après tassement par tapotement, la colonne a été remplie d'un corps en apatite hydroxycalcium frittée (température de chauffage: 700° C) ayant un rapport Ca/P de 1,67, et présentant une dimension moyenne des particules de 400 à 500 mu, de telle sorte que l'apatite occupe 5 ml de la capacité de la colonne.
Le séparateur cellulaire ainsi assemblé a été lavé par passages successifs d'une solution saline physiologique, d'un milieu de culture (RPMI 1640) maintenu à 37° C, et finalement d'un milieu de culture (RPMI1640) maintenu également à 37° C et qui contenait 10% de sérum bovin fœtal.
Ensuite, des monocytes séparés du sang périphérique humain normal par centrifugation par gravité spécifique ont été suspendus dans un milieu de culture (RPMI 1640) contenant 10% de sérum bovin fœtal. Une portion prédéterminée (0,4 ml) de la suspension cellulaire a été introduite dans la colonne, et a traversé celle-ci en étant incubée à 37° C pendant une heure. Ces cellules ont été éluées de manière substantielle avec un milieu de culture (RPMI 1640).
La résolution des monocytes par le séparateur cellulaire a été évaluée par les deux méthodes suivantes: dans la première méthode, le nombre de cellules a été compté au moyen d'un hémicytomètre avant et après le passage de la suspension cellulaire à travers la
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colonne. Les données de récupération des cellules obtenues par cette méthode sont présentées dans le tableau 1. La seconde méthode consistait en l'examen de l'état de la séparation cellulaire: les cellules dans l'effluent à partir de la colonne ont été marquées avec des anticorps marqués à la fluorescéine Leu 1, Leu 12 et Leu M3, et la posi- : tivité pour les cellules T, les cellules B et les monocytes a été déterminée avec FACS (fluorescence activated cell sorter). Les résultats de l'estimation par cette méthode sont présentés dans le tableau 2.
Exemple 2: !
Une colonne ayant une capacité interne de 5 ml a été chargée de~^ 0,02 g de laine de verre, qui occupait approximativement 0,8 ml de la capacité de la colonne. Après avoir été tassée par tapotement, la colonne a été remplie d'un corps en apatite hydroxycalcium frittée (température de chauffage: 1200° C), ayant un rapport Ca/P de 1,67, 1 et présentant une dimension particulaire moyenne de 400 à 500 mu, de telle sorte que l'apatite occupe 5 ml de la capacité de la colonne.
En utilisant le séparateur cellulaire ainsi assemblé, des monocytes humains ont été séparés, et leur résolution évaluée comme dans l'exemple 1. Les résultats de l'évaluation de la résolution monocy- 20 tique sont présentés dans les tableaux 1 et 2.
Exemple 3:
Une colonne ayant une capacité interne de 5 ml a été chargée de 0,02 g de laine de verre, qui occupait approximativement 0,8 ml de 25 la capacité de la colonne. Après avoir été tassée par tapotement, la colonne a été remplie d'apatite hydroxycalcium frittée (température de chauffage: 700° C), ayant un rapport moyen Ca/P de 1,67, et présentant une dimension particulaire moyenne de 800 à 1000 m p., de telle sorte que l'apatite occupe 5 ml de la capacité de la colonne. 30
En utilisant le séparateur cellulaire ainsi assemblé, des monocytes humains ont été séparés et leur résolution évaluée comme dans l'exemple 1. Les résultats de l'évaluation delà résolution monocy-tique sont présentés dans les tableaux 1 et 2.
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Exemple 4:
Une colonne ayant une capacité interne de 5 ml a été chargée de 0,02 mg de laine de verre, qui occupait approximativement 0,8 ml de la capacité de la colonne. Après avoir été tassée par tapotement, la colonne a été remplie d'apatite hydroxycalcium frittée (température de chauffage: 700° C) ayant un rapport moyen Ca/P de 1,67, et présentant une dimension particulaire moyenne de 100 à 200 mu, de telle sorte que l'apatite occupe 5 ml de la capacité de la colonne.
En utilisant le séparateur cellulaire ainsi assemblé, des monocytes humains ont été séparés et leur résolution évaluée comme dans l'exemple 1. Les résultats de l'évaluation de la résolution monocyti-que sont présentés dans les tableaux 1 et 2.
Exemple comparatif 1
Une colonne ayant une capacité interne de 5 ml a été chargée de 0,25 g de laine de nylon, qui occupait approximativement 3 ml de la capacité de la colonne. En utilisant le séparateur cellulaire ainsi assemblé, des monocytes humains ont été séparés et leur résolution évaluée comme dans l'exemple 1. Les résultats de l'évaluation de la résolution monocytique sont présentés dans les tableaux 1 et 2.
Exemple 5:
Une colonne ayant une capacité interne de 5 ml a été chargée de 0,02 g de laine de verre, qui occupait approximativement 0,8 ml de la capacité de la colonne. Après avoir été tassée par tapotement, la colonne a été remplie d'apatite hydroxycalcium frittée (température de chauffage: 700° C), ayant un rapport Ca/P de 1,67 et présentant une dimension particulaire moyenne de 400 à 500 m|i, de telle sorte que l'apatite occupe 5 ml de la capacité de la colonne. Après assemblage du séparateur cellulaire par ces techniques, des monocytes humains recueillis comme dans l'exemple 1 ont été passés à travers la colonne de séparation en une quantité de 1 ml (1,8 x 107 cellules)
et, après élution avec un milieu de culture (RPMI 1640), les cellules dans l'effluent ont été récupérées.
La résolution monocytique de la colonne a été évaluée comme dans l'exemple 1 et les résultats obtenus sont présentés dans les tableaux 1 et 2.
Les résultats des exemples 1, 3 et 4 montrent que l'utilisation de l'apatite hydroxycalcium frittée comme milieu de séparation a contribué à une récupération et une résolution élevées. Les données de récupération obtenues dans ces exemples sont remarquables par rapport à l'exemple comparatif 1, dans lequel de la laine de nylon a été utilisée comme moyen de séparation. Le résultat de l'exemple 2 montre qu'en employant une température de chauffage plus élevée pour la fabrication de l'apatite hydroxycalcium, la contamination de l'effluent de la colonne par des monocytes peut être maintenue à un minimum (0,8%). Le résultat de l'exemple 5 démontre que le séparateur cellulaire selon la présente invention permet d'obtenir une récupération et une résolution élevées même en l'absence de traitement tel que le lavage et l'incubation.
Tableau 1: Récupération des cellules
Essai N°
Récupération (%)
Exemple 1
95
Exemple 2
50
Exemple 3
90
Exemple 4
85
Exemple comparatif 1
30
Exemple 5
90
Tableau 2: Positivité
40
Cellule T
Cellule B
Monocyte
Essai N°
(Leu 1)
(Leu 12)
(Leu M)
Exemple 1
94
3,5
2,3
Exemple 2
95
3,5
0,8
Exemple 3
95
3,0
1,0
Exemple 4
95
2,0
0,9
Exemple comparatif 1
95
1,7
1,4
Exemple 5
94
3,0
1,0
Ainsi qu'il ressort de la description précédente, l'apatite hydroxycalcium frittée ayant le domaine spécifié de dimension particulaire, et utilisée comme milieu de séparation des cellules selon la prèso sente invention, péïmet la séparation d'une population cellulaire présentant un intérêt sans stimulation immunologique, la récupération cellulaire et la résolution obtenues étant nettement supérieures à celles possibles avec les techniques connues. En outre, ce milieu de séparation présente une très faible rétention d'eau et permet l'utilisa-55 tion d'un procédé de récupération en une étape dans laquelle la suspension cellulaire est directement introduite dans le milieu de séparation, qui peut même rester non lavé si le but le permet. Par conséquent, la méthode selon la présente invention peut être appliquée avec des étapes de séparation simplifiées de manière substantielle. Si so désiré, une variété de substances peut être partiellement adsorbée sur la surface des granules de l'apatite hydroxycalcium frittée, et des propriétés physico-chimiques ou immunologiques de la surface du substrat sont modulées de telle sorte qu'elle acquiert subtilement des activités modifiées d'adsorption pour différents groupes de cellules 65 présentant un intérêt. Cela permet l'amélioration de l'efficacité de la séparation cellulaire, et la production de modèles de résolution contrôlés.
1 feuille dessin
Claims (7)
1. Milieu de séparation cellulaire constitué d'un corps en apatite hydroxycalcium frittée ayant une dimension particulaire moyenne de 50 à 2000 m|i.
2. Milieu de séparation cellulaire selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le corps en apatite hydroxycalcium frittée a un rapport du calcium au phosphore de 1,4 à 1,8.
2
REVENDICATIONS
3. Dispositif de séparation cellulaire comprenant une colonne remplie avec un milieu de séparation cellulaire constitué d'un corps en apatite hydroxycalcium frittée ayant une dimension particulaire moyenne de 50 à 2000 mjx, cette colonne ayant une entrée et une sortie pour une suspension cellulaire et étant munie d'un filtre pour empêcher la dispersion dudit milieu de séparation cellulaire.
4. Dispositif de séparation cellulaire selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le corps en apatite hydroxycalcium frittée a un rapport du calcium au phosphore de 1,4 à 1,8.
5. Procédé de séparation cellulaire comprenant la mise en contact d'une suspension cellulaire avec un milieu de séparation cellulaire constitué d'un corps en apatite hydroxycalcium frittée ayant une dimension particulaire moyenne de 50 à 2000 mji, de manière à permettre l'adsorption d'une population de cellules présentant un intérêt sur ledit milieu de séparation cellulaire.
6. Procédé de préparation du milieu selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le corps en apatite hydroxycalcium frittée est préparé par chauffage à une température de 600 à 1350° C et par granulation subséquente.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que le corps en apatite hydroxycalcium frittée a un rapport du calcium au phosphore de 1,4 à 1,8.
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