JP2001500753A

JP2001500753A - 腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物から腫瘍細胞を除去する方法

Info

Publication number: JP2001500753A
Application number: JP10511745A
Authority: JP
Inventors: カスチノフランコ; アール．ウイクラマシングスーミス
Original assignee: ヘマシュア，インク．
Priority date: 1996-08-26
Filing date: 1997-08-22
Publication date: 2001-01-23
Also published as: EP0929328A4; WO1998008556A1; AU4157197A; US6177019B1; AU741438B2; US20010000204A1; CA2261612A1; CN1228713A; EP0929328A1

Abstract

(57)【要約】腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物から腫瘍細胞を除去する方法が開示される。この方法の一つの態様は、好ましくは一つ以上の腫瘍細胞低減フィルターパッドからなる腫瘍細胞低減フィルター手段を含む直列の濾過装置に依存する。この腫瘍細胞低減フィルター手段は、濾過された幹細胞産物において少なくとも３０％の幹細胞の回収を可能としつつ少なくとも１０倍の腫瘍細胞の減少をもたらす。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物から腫瘍細胞を除去する方法発明の分野本発明は血液細胞の濾過に関する。より具体的には、腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物から腫瘍細胞を選択的に除去する方法に関する。本発明の好ましい態様は一つ以上の腫瘍細胞低減用フィルターパッドを含む直列の濾過装置に基づく方法を提供する。発明の背景造血細胞は血液細胞のすべての血統を生ずる能力を有する稀な多分化能細胞である。拘束（commitment）と呼ばれるプロセスにより、自己再生する幹細胞は、赤芽球、骨髄芽球および単球／マクロファージを含む幾つかの異なる血液細胞型の前駆体である前駆細胞に変質する。その自己再生能により、幹細胞は輸血用薬において、特に癌患者の自己由来のサポート（輸血）において、広範囲の潜在的適用性を持っている。供与者から幹細胞を得、貯蔵し、そしてその後、高投与量化学療法あるいは全身放射線照射の後などの免疫抑制状態にある患者に移植することができる手順が開発されてきた。過去には、幹細胞は入院および全身麻酔を必要とする費用のかかる苦痛に満ちた手順で骨髄から採取された。しかしながら、現在では、新しい技術の発展により、末梢血から幹細胞および拘束を受けた前駆細胞を採取することが可能となっている。幹細胞産物（ＳＣ産物）の収集は、この用語は真の幹細胞と拘束を受けた前駆細胞（すなわち、ＣＤ３４⁺細胞が含まれる）の両者を含んでいるが、外来患者を中心に行うことができ、入院の必要性はなくなった。さらに、幹細胞産物は本人の希望による外科手術の間に末梢血から採取することもできる。いったん収集されると、ＳＣ産物は骨髄からのものであろうと末梢血からのものであろうと将来の使用に備えて貯蔵することができる。使用の最も重要なものの一つは化学療法などの免疫抑制的方法の後の血液学的回復を増強するための移植である。しかしながら、この極めて有益な再注入手順の使用には一つの重要な欠点がある。ＳＣ産物が癌患者から採取されるとき、かなりの数の腫瘍細胞も収集され、これによりこのＳＣ産物を汚染することが避けられないことである。その後に、このＳＣ産物がその患者に再注入されると、この腫瘍細胞も再注入され、患者の血流中の腫瘍細胞の濃度を増加させる。環流する腫瘍細胞は特定の癌の再発に直接結びつくものではなかったが、例えば、リンパ腫の場合は再注入された細胞は疾患再発の部位に至ったことが追跡された。腺癌に係るケースでは、５０キログラムの成人に対し、約１５０，０００の腫瘍細胞が１回の幹細胞移植の間に再注入され得ると推計された。さらに、ＳＣ産物中に存在する腫瘍細胞は生きておりイン・ビトロでのクローン原性の成長をすることができることが示され、こうしてそれらが再注入後の再発に実際に寄与しうるであろうことが示唆された。卵巣癌細胞、精巣癌細胞、乳癌細胞、多発性骨髄腫細胞、非ホジキンスリンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、慢性リンパ性白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、および急性リンパ性白血病細胞が移植可能であることが知られている。ＳＣ産物の腫瘍細胞汚染の程度は患者毎に大きく変動するようにみえ、１１から７８パーセントの範囲までの数値が記録された。従って、環流する腫瘍細胞の再注入が攻撃的な化学療法の後の幹細胞移植により与えられる利益を覆すことは十分にありうるから、ＳＣ産物から腫瘍細胞を効果的に除去する技術を開発することは極めて有益でかつ価値のある臨床手順の広範囲の使用を大きく促進することになる。望ましくない腫瘍細胞汚染産物から価値のある幹細胞を分離するために現在使用されている方法はＣＤ３４⁺抗原に対するマーカーを発現する幹細胞および前駆細胞を同定し、それを汚染した産物から分離する積極的選択法に基づいている。これらの方法は極めて労働集約的であり、特殊な装置の使用を必要とする。従って患者ケアの費用が大きく増加しそして移植手順におけるＳＣ産物の使用を厳しく制限することになる。血液から腫瘍細胞を除去するための積極的選択に対する代替法がギュードマンらにより提供された。氏は手術中の機械的自動輸血（ＩＡＴ）手順の間に自己由来の血液から泌尿器科腫瘍細胞を除去するため特殊な白血球除去膜フィルター（これは荷電粒子を吸着することにより機能する）を用いる濾過について記述した（Gudemann，C.，Wiesel，M．and Staehler，G.，膜フィルターの使用による泌尿器科癌手術中の手術中の自動輸血、ISBT第23回会議、要旨集、in．Vox Sang. ，67(S2)，22.）。ギュードマンらが用いた膜フィルターの短所は、これらの膜が腫瘍細胞を「選択的に」保持しないことである。幹細胞を含む白血球も保持されるのである。従って、腫瘍細胞は幹細胞から除去されない。ミラーらの研究も標準的血液注入フィルターが自己由来の血液から腫瘍細胞を除去する点で無効であることを教示する。（Miller,G.V.，Ramsden，C.W．a nd Primrose,J.N.,自己由来の輸血：癌手術の間における血液銀行からの血液を用いる輸血の代替法、B．J．Surg．1991，Vol.78，June，713-715)。従って、既に採取された幹細胞産物の移植により達成される価値ある利益、生存率の増加を最終的にもたらすという利益に照らすと、腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物から腫瘍細胞を選択的に除去する低コストで臨床的に有効な方法を提供することが望まれる。発明の概要本発明は、造血幹細胞および拘束を受けた前駆細胞の最適回収を可能としながら、腫瘍細胞に汚染された幹細胞（ＴＣＣＳＣ）から腫瘍細胞を選択的に除去するための低コストで臨床的に有効な方法を提供する。こうして、本発明の一つの側面は、（ａ）次のものを含む直列の濾過装置を提供する工程、その中に一つの入口孔と一つの出口孔を有する容器、および入口孔を経て濾過装置内に流入する腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物を濾過するため上記容器内の入口孔と出口孔の間に配置された腫瘍細胞低減フィルター手段であって、上記容器を第１室と第２室とに分割しているものである上記腫瘍細胞低減フィルター手段、（ｂ）腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物を提供する工程、（ｃ）腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物を濾過装置に通す工程、ここで、腫瘍細胞が濾過装置内の腫瘍細胞低減フィルター手段により保持され、幹細胞産物は腫瘍細胞低減フィルター手段を通過してこの濾過装置の外へでる、および（ｄ）腫瘍細胞を激減させた幹細胞産物を回収する工程、を含んで成る、腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物から腫瘍細胞を除去する方法である。この腫瘍細胞低減フィルター手段は、腫瘍細胞を激減させた幹細胞産物において少なくとも１０倍単位の腫瘍細胞の低減および少なくとも３０％の幹細胞の回収（より好ましくは５０％の回収）を与えるものであり、そしてフィルター手段を通過する幹細胞産物の流速が少なくとも毎時５０ｍｌであることが好ましい。最適な腫瘍細胞保持および幹細胞回収を達成するためには、フィルター手段は少なくとも約７５０リットル／分から約１×１０⁴リットル／分までの空気透過性を有するべきである。こうして、本発明の一つの態様は、直列の濾過装置中における腫瘍細胞低減フィルター手段としての使用に適する装置を提供する。上記腫瘍細胞低減フィルター手段は濾過された幹細胞産物において少なくとも１０倍の腫瘍細胞の低減と少なくとも３０％の幹細胞の回収を与えるものである。この腫瘍細胞低減フィルター手段は少なくとも毎時５０ｍｌの幹細胞産物の流速を与え、そして少なくとも約７５０リットル／分から約１×１０⁴リットル／分までの、好ましくは約３．３×１０³リットル／分の空気透過性を有することが好ましい。腫瘍細胞低減フィルター手段は流体環境の中の微粒子体が通過するか保持されるかを区別する根拠としてサイズを用いるどのような種類の装置または機械的に安定な基層をも包含する。このフィルター手段は通過と保持の間の区別を容易にするために適応させられた界面化学を付加的に持つことができる。フィルター手段の幾つかのタイプの例としては、規定されたポアサイズを持つ高分子膜、不織布パッド、線維パッド、エーロゲルおよび同種のものが挙げられるが、これらに限定されない。ある種のクラスのヒドロゲル、特に機械的安定性のため複合物質に結合させたものも適当なフィルター手段とみることができる。本発明の別の態様は、腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物から腫瘍細胞を除去するための濾過装置として使用するのに適する装置であって、その中に一つの入口孔および一つの出口孔を有する容器、および入口孔を経て上記容器内に流入する腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物を濾過するためこの容器内の入口孔と出口孔の間に配置された腫瘍細胞低減フィルター手段であって、上記容器を第１室と第２室に分割するものである上記腫瘍細胞低減フィルター手段、を含む装置である。本発明の多くの側面および態様の原理に従って、腫瘍細胞低減フィルター手段は、多数の線維および微小線維からなる形状を支えるクモの巣状のマトリックス構成を持つ一つ以上の腫瘍細胞低減フィルター（ＴＣＲＦ）であることができる。この線維は約１．５ｍｍのデニールをもつポリエステルからなりそして微小線維はセルロースからなるものが最適である。腫瘍細胞は幹細胞よりも大きいから、腫瘍細胞低減フィルターパッドは腫瘍細胞を選択的に保持し、一方、より小さな幹細胞は通過させ、回収を可能とする。本発明の方法は、卵巣癌細胞、精巣癌細胞、乳癌細胞、多発性骨髄腫細胞、非ホジキンスリンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、慢性リンパ性白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、および急性リンパ性白血病細胞などの腫瘍細胞で汚染された腫瘍細胞汚染幹細胞産物から腫瘍細胞を除去するのに適している。特に、腫瘍細胞汚染幹細胞産物は腺管癌細胞または腺癌細胞で汚染された幹細胞産物であることができる。本発明はこうして治療上および診断上両方の利益を提供する。汚染された産物から腫瘍細胞を除去することにより、この方法は移植のために腫瘍細胞を激減させた幹細胞を供給するだけでなく、環流する血液中の腫瘍細胞の濃度を測定するための診断の道具をも提供する。環流する血液中の腫瘍細胞の濃度は極端に低い（１．６×１０⁸ 個の単核細胞当たり４〜５６００個）のが典型的である。従って、正確な計測をすることは極めて困難である。本発明の原理によれば、既知の容量の血液産物の濾過の後、腫瘍細胞はＴＣＲＦパッド内に保持されることになる。これらの細胞を次にそのままの状態で計測するかまたはＴＣＲＦパッドを食塩水の逆流で洗うなどの方法により回収しそしてフローサイトメトリーまたは分光法などの手段により計測することができる。血液産物の元の容量が分かっているから、その容量中の腫瘍細胞の濃度は、ＴＣＲＦパッドにより保持された腫瘍細胞の容量に基づいて、計算することができる。細胞懸濁液の深部濾過（depth filtration）は赤血球濃縮物中の白血球除去のための良く知られた分離技術であり、二つの機作、篩および接着の働きである。ふるい分けはフィルターパッドのマトリックス内でのより大きな細胞の機械的捕捉により惹き起こされ、一方接着は血液細胞表面とフィルターパッド物質の相互作用により惹き起こされる。白血球の濾過では、篩によるよりも接着の効果によってより多くの白血球が保持されると信じられている。一般に、深部濾過用フィルターパッドは、粒子の付着を増加させるクモの巣状マトリックス中にからませられている多数の線維および微小線維から成る。こうして、深部濾過は表面濾過とは区別される。表面濾過では、粒子付着が全面的にフィルターパッドの表面で起こるのである。汚染された幹細胞産物から腫瘍細胞を除去する現行法は積極的選択技法に依存しており、非常に高価な特殊な装置および相当な操作時間を必要とする。これに反して、本発明の原理は低コストで、使用の容易な、直列の、腫瘍細胞低減フィルター手段を含む深部濾過装置を必要とする。それは重力駆動またはポンプ駆動をすることができる。この直列の濾過装置はその中に入口孔と出口孔を一つづつ持つ容器、入口孔を経て濾過装置内に流入するＴＣＣＳＣ産物を濾過するためこの容器内で入口孔と出口孔の間に配置されたＴＣＲＦ手段を含んで成る。このＴＣＲＦ手段は容器中の濾過されていない液体を集めそしてその流れを方向付けることができる第１室および第１室と液流でつながっており濾過された液体を集めそしてその流れを方向付けることができる第２室とに容器を分割する。この濾過装置は空気などの気体を濾過の間に濾過装置から出口孔を通して排気させるための手段を濾過装置内に含むことが好ましい。濾過装置は、ＴＣＲＦ手段と入口孔の間の距離が第１室内の気体の蓄積を防止するようにそのサイズを定めることができる。同様に、濾過装置はＴＣＲＦ手段と出口孔の間の距離が濾過の間に第２室内の気体を強制的に出口孔に追い出すようにそのサイズを定めることができる。瀘過の間に濾過装置を通し出口孔を通して気体を排気させるため装置内に配置される手段は、第２室内にあってＴＣＲＦ手段と出口孔の間に配置される偏流装置（flow deflector）を含むことが好ましい。この偏流装置は円板などの比較的平らなものを含むことができそしてこの円板は少なくとも１本の放射状に延びるリブ（あばら骨）を含むことができる。この濾過装置は濾過手段として一つ以上のＴＣＲＦパッドを含むことができ、そして２枚のＴＣＲＦパッドの間には密閉用リングを置くことができる。濾過装置の入口孔と出口孔は同軸状に配向させることができる。上記の容器は入口部分とそれに結合した出口部分とを含む。入口孔は入口部分の中に配置され、出口孔は出口部分の中に配置される。一つ以上のＴＣＲＦパッドは入口部分と出口部分かまたは密閉用リングとの間で密着される。この装置が複数のＴＣＲＦパッドを含むときは、パッドは他方の上部の上に一方を重ね、密閉用リングでそれらの周辺付近を分離することができる。本発明は多くの異なる形式の態様に変更することができるが、本発明の好ましい態様について示すことにする。しかしながら、本明細書での開示は本発明の原理の例示であり、例示された態様に本発明を限定する意図ではないと考えるべきであることが理解されるべきである。図面の簡単な説明本発明の他の多くの長所および特徴は下記の好ましい態様の詳細な説明、添付された請求の範囲および下記の図面から容易に明らかになる。図１は、本発明の原理に従って構成されたその第２室に偏流装置を有する濾過装置の一部を除去した等角投影図を示す。図２は、本発明の原理に従って構成されそして使用されうる、その中の流体の流れを図示する、図１の濾過装置の図式的断面図を示す。図３Ａは、図１および図２の濾過装置内で使用される偏流装置の上部の等角投影図を示す。図３Ｂは、図１および図２の濾過装置内で使用される偏流装置の底部の等角投影図を示す。図４は配管、供給用袋および回収用袋と機能的に組立てられたアセンブリ中の図１および図２の濾過装置を示す。好ましい態様の詳細な説明本発明の好ましい態様は、最も好ましくは一つ以上の腫瘍細胞低減フィルター（ＴＣＲＦ）パッドからなるＴＣＲＦ手段を含む直列の重力駆動濾過装置に依存する。ＴＣＲＦパッドは多数の線維および微小線維から形成される形状を維持するクモの巣状マトリックス構成を有しており、腫瘍細胞汚染幹細胞（ＴＣＣＳＣ）産物から腫瘍細胞（ＴＣ）、例えば肺癌細胞、リンパ系癌細胞、卵巣癌細胞、精巣癌細胞、腺管癌細胞、哺乳類癌細胞および腺癌細胞などの選択的除去に特に良く適合している。本出願で言及するとき、上流、上部または上方という用語は濾過装置の中のＴＣＲＦ手段を通る濾過前のＴＣＣＳＣ産物の流れの位置を指す。逆に、本出願で使用するとき、下流、底部または下方という用語は濾過装置内のＴＣＲＦ手段を通り抜けた濾過の後の、濾過された幹細胞（ＦＳＣ）産物の流れの位置を指す。さらに、本出願で用いるとき、放射状におよび軸方向にという用語は、濾過装置の中心を通って縦に走る図２のＡ−Ａ軸に関してそれぞれ放射状の方向および軸の方向を指す。濾過装置の様々な態様が本発明の方法を実施するために使用されうるが、それぞれの態様は典型的には入口部分、出口部分、ＴＣＲＦ手段、および濾過装置から出口孔を通って気体を排出させる手段により形成される容器を含んでいる。この装置は種々の構成要素の操作、排気フィルターの使用または他の外付け手段を操作することなく濾過装置内の空気を下流に排出することを可能とする手段を含むことが好ましい。この装置は下流の偏流装置を含むことが好ましい。これから図面を具体的に参照すれば、図１および図２は２３と一般的に名づける濾過装置を図示する。それは入口部分１、ＴＣＲＦパッド３、４、５および６、密閉リング７、８、９を含んで構成されるＴＣＲＦ手段および偏流装置１０を含む。入口部分１は出口部分にそれらの間の接合部３２で密着される。この接合部は超音波熔接、加熱熔接、溶媒熔接、貼り合わせ継ぎ手または洩れのない密閉を作りだす他の何らかの手段によって密着することが好ましい。ＴＣＲＦパッド６は圧縮により出口部分２に密着され、これにより圧縮密着を形成させる。ＴＣＲＦパッド６の外周付近は出口部分２の棚３３と密閉リング９の間で圧縮される。ＴＣＲＦパッド５は、ＴＣＲΓパッド６の上部に置かれ、圧縮密着を用いて出口部分２中に密着される。ＴＣＲＦパッド５の外周付近は密閉リング８と密閉リング９の間で圧縮される。ＴＣＲＦパッド４は、ＴＣＲＦパッド５の上部に置かれ、これも圧縮密着を用いて出口部分２中に密着される。ＴＣＲＦパッド４の外周付近は密閉リング７と密閉リング８の間で圧縮される。ＴＣＲＦパッド３は、ＴＣＲＦパッド４の上部に置かれ、これも圧縮密着を用いて出口半分２中に密着される。ＴＣＲＦパッド３の外周付近は密閉リング７と入口部分１の外周に沿って軸方向に突き出している密閉リブ２４の間で圧縮される。密閉リング７、８および９は出口部分２の壁４５とプレス嵌めすることが好ましい。しかしながら、密閉リング７、８および９は超音波熔接、加熱熔接、溶媒熔接、貼り合わせ継ぎ手または洩れのない密閉を作りだす他の密着手段を用いることによって出口部分２にまたはその中に結合させることができる。密閉リングが出口部分２中にプレス嵌めされていないときは、密閉リング９は出口部分２に結合させ、密閉リング８の低部表面は密閉リング９の上部表面に結合させ、そして密閉リング７の低部表面は密閉リング８の上部表面に結合させることができよう。図１および図２に例示した装置は４個のＴＣＲＦパッド３、４、５および６を含んでいるが、本発明はこれらに限定されず、一つ以上のＴＣＲＦパッドを含むことができる。入口部分１と出口部分２の内壁により装置２３の内部に形成される空洞２１はＴＣＲＦパッド３、４、５および６により二つの部屋に分割される。上流の、上方のまたは第１の室３０は入口部分１の壁３５、入口部分１の壁３６およびＴＣＲＦパッド３の上部表面３７により形成される。下流の、下方のまたは第２の室は出口部分２の壁３８、出口部分２の壁３９およびＴＣＲＦパッド６の下方表面４３により形成される。この下方の室２９はその内部にある偏流装置１０により二つの部分に分割されている。下方の室２９の第１の部分はＴＣＲＦパッド６の低部表面４３および偏流装置１０の上部表面４２により境界が定められている。下方の室２９の第２の部分は偏流装置１０の低部表面４１と出口部分２の表面３９とにより境界が定められている。図３Ａおよび図３Ｂを参照すると、偏流装置はその第１の面上にある放射状のフィルター支持リブ１２、外側周辺上の芯合わせタブ３１およびその第２の面上の支持ピン１１を含む薄い円板から形成されている。このフィルター支持リブ１２は偏流装置の第１の面に沿ってＦＳＣ産物の放射状の流れを可能とさせる手段として機能する。しかしながら、このような流れを可能とする他の手段、一連の支持ピンまたは編んだスクリーンなども支持リブ１２の代わりに用いることができる。支持ピン１１は出口部分２の壁３９の上方に偏流装置１０を支持するための手段として機能する。芯合わせタブは下方室２９内の偏流装置１０を位置決めするための手段として機能する。図４では、図１および図２に図示した濾過装置２３は入口用管１７、出口用管１８、供給用袋２５および回収用袋２６との機能的な集合体の中にある。使用者は供給用袋を付けず、システムの滅菌性を維持するため密閉された入口用管１７の入口末端を付けた、滅菌された図４の集合体を入手することが好ましい。濾過を行うためには、入口部分１の中心にある管用ソケット１５に接続された入口用管１７（図２）を、当技術分野で良く知られた無菌結合装置を用いて、ＴＣＣＳＣ産物を入れた供給用袋２５のつなぎ管に結合させる。入口用管１７は流体の流れの関係では入口孔１３を経て上方室３０とつながっている。受け用袋に結合された出口用管１８は出口部分２の中心に位置する出口用管用ソケットに結合させられる。出口用管１８は流体の流れとの関係では出口孔１４を経て低部室２９とつながっている。濾過装置２３は一線上にぶら下がる。ＴＣＣＳＣ産物はその入口孔１３から濾過装置２３に入りそしてＦＳＣ産物がその出口孔１４から濾過装置２３を出ていく。濾過装置２３をＴＣＣＳＣ産物で満たす過程で、濾過プロセスが始まる前にその中にあった空気すべてがＦＳＣ産物が濾過装置２３から流出し始める前に濾過装置２３かは出口用管１８を通って受け用袋２６の中へと排気される。このプロセスはＴＣＲＦパッド３、４、５および６の中に捕捉されている空気が殆どまたは全くないことを保証する。従って、ＴＣＲＦパッドの露出した表面積の全体が濾過のために使用される。ＴＣＣＳＣ産物を濾過するとき、使用者はまず供給用袋２５に結合させる方の端の近くで入口用管１７を管挟み（示していない）で閉管し、次いで入口用管１７の入口側の端と供給用袋２５の間を、当技術分野で良く知られている無菌結合装置を用いて無菌結合させる。実際の無菌結合は入口用管１７と供給用袋２５の一部である短い管との間で行われる。その結果得られるシステムを図４に例示する。供給用袋２５はフック２７を有するポール２８などの適当な機構から吊り下げられる。回収用袋２６は上記の機構により吊り下げることもベンチの上などの表面の上に置くこともできる。図１、図２および図４を参照すると、管挟み（示していない）を開くと、ＴＣＣＳＣ産物は供給用袋２５から入口用管１７を通り、入口孔１３を通り、上方室３０の中へと流れ始める。入口用管１７の内部にあった空気はＴＣＣＳＣ産物の先頭にたって強制的に上方室３０の中へ追いやられる。ＴＣＣＳＣ産物は上方室３０に中心から入り、その結果、上方室３０は中心からＴＣＣＳＣ産物で満たされ、次いで放射状に外側へ拡がる。この放射状の流れは図１および図２に矢で例示してある。上方室３０は中心から放射状に外側に満ちていくから、ＴＣＲＦパッド３、４、５および６も中心から放射状に外側に向かって濡れていく。上方室３０が満ちていくにつれ、上方室３０に残っている空気はすべてＴＣＲＦパッド３、４、５および６の濡れていない部分を通って強制的に下方室２９の中へ、さらに出口孔１４を通り、出口用管１８を通り、そして受け用袋２６の中へと追いやられる。上方室３０は、はじめに上方室３０内にあった空気のすべてがＴＣＲＦパッド３、４、５および６を通って追い出されることを保証するように、ＴＣＣＳＣ産物の初期流速との関係でそのサイズが定められるべきである。上方室３０の容積がＴＣＣＳＣ産物の初期流速との関係で大き過ぎるときは、空気の一部が上方室３０の中に捕捉されることになる。上記のように、ＴＣＲＦパッド３、４、５および６は放射状に外側に向かって濡れ、その中にあった空気は下方室２９の中へ、さらに出口孔１４を通り、出口用管１８を通り、受け用袋２６の中へと追い出される。ＴＣＲＦパッド３、４、５および６が放射状に外側へ濡れることにより、ＦＳＣ産物はまずＴＣＲＦパッド６の中心から流れ出し、ついで放射状に外側へというパターンでＴＣＲＦパッド６から流れ続けることになる。こうして、下方室２９の第１の部分もその中心から放射状に外側へ満ちていく。下方室２９の第１の部分が満ちるにつれ、ＴＣＲＦパッド３、４、５および６を通って追い出された空気もすべて下方室２９の第１の部分を通って放射状に外側へ追いやられる。下方室２９の第１の部分がＦＳＣ産物で満たされると、ＦＳＣ産物は下方室２９の第２の部分の中へ放射状に内側へ流れ、空気を出口孔内へ追い出し、これにより空気を下流に排気する。下方室２９の第２の部分がＦＳＣ産物で満たされると、出口孔１４および出口用管１８が次に満たされ、そして最後に回収用袋２６が満たされる。偏流装置の周りの流れは図２に矢で例示してある。ＴＣＲＦパッド３、４、５および６のクモの巣状マトリックス構成により、腫瘍細胞は濾過装置２３の内部に保持され、より小さな幹細胞および拘束を受けた前駆細胞は通過して回収用袋２６の中で回収される。幹細胞および拘束を受けた前駆細胞の直径は約５μｍと約１５μｍの間である。一方、腫瘍細胞の直径は約２０μｍと約５０μｍの間である。ＴＣＲＦ手段は少なくとも１０倍の腫瘍細胞の低減をもたらし、一方少なくとも３０％、好ましくは５０％を超える幹細胞の回収をもたらすものであることが好ましい。ＴＣＲＦ手段を通る幹細胞産物の流れは少なくとも毎時５０ｍｌであるべきである。本発明者らは、少なくとも毎分約２６．８ft³（ＣＦＭ）（７５０リットル／分）の空気透過性、そしてより好ましくは約１１８．５ＣＦＭ（３．３×１０³リットル／分）の空気透過性を持つＴＣＲＦ手段が本発明の装置において良く機能することを見出した。腫瘍細胞低減フィルターパッドなどの、高い空気透過性を持つＴＣＲＦ手段は、高い平均表面積を有するセルロースまたはセルロースアセテートを使用することにより得られる。集められたＳＣＰは冷凍保存され後の使用のため貯蔵されることがしばしばあるから、ＴＣＲＦ手段が汚染された幹細胞産物中に存在しうる顆粒球をもすべて保持することに注目することが重要である。顆粒球は濾過されたＳＣＰの凍結速度に生き残れず、溶解してその細胞内容物を上清溶液中に放出し、その結果、おそらく溶解の際幹細胞産物の生存率の減少をもたらすであろうから、このことは長所である。従って、顆粒球は冷凍保存処理の前に除去することが好ましい。実施例本発明の好ましい態様は例示の目的でそして限定的目的ではなく提供される下記の実施例を用いてより詳細に以下に説明する。実施例１腺癌細胞かまたは腺管癌腫瘍細胞（集合的に腫瘍細胞、ＴＣ）と５：１の比率で混合した血液単核細胞（ＢＭＮＣ）を用いてモデルのＴＣＣＳＣ産物を調製した。この組成物を本発明の原理に従って、１．５ｍｍ厚さと、５〜１５０μｍの変動幅の１０μｍの有効ポアサイズを持つセルロースまたはセルロースアセテート−ポリエステル複合体ＴＣＲＦパッドを用いて、ＴＣＲＦパッドのクモの巣マトリックス構成により、濾過した。このＦＳＣ産物をＢＭＮＣおよびＴＣ含量について分析した。ライト−ジームサ（Wright-Giemsa）染色をしたサイトスピン（cytospins）により、ＢＭＮＣの回収率はＴＣの回収率よりも２５〜６０倍高いことが明らかになった。実施例２ＢＭＮＣのＴＣに対する比が５０：１のＡＣＣＳＣ産物モデルを調製した。結果の正確な読みを容易にするため、ＴＣには予め蛍光性の膜色素で標識した。このＴＣＣＳＣ産物を実施例１の場合と同様に同一のセルロース−アセテートＴＣＲＦパッドを用いて濾過し、そしてＰＳＣ産物の分析をすると、ＴＣの濃度は検出不可能であった。このことはＴＣの少なくとも３０倍の優先的保持を示すものである。さらに、幹細胞はＢＭＮＣよりも小さいから、顆粒球／マクロファージおよび赤血球前駆細胞の濾過後の回収率はＢＭＮＣのそれよりも必然的により大きいはずである。実際、ＴＣを含まないＢＭＮＣの濾過は、回収された産物の中の造血性幹細胞の濃度が濾過前の産物におけるよりもほとんど１０倍高いことを明らかにした。このことは完全に生きている造血性前駆体の約８０％がＴＣの濃度を３０倍減少させる条件の下で回収することができることを示すものである。この値は現在用いられている積極的選択に基づくＴＣ低減プロセスで得られる値と同等である。表１は実施例１および実施例２の結果を示す。表１実施例３ＴＣに対するＢＭＮＣの比が１０：１のＴＣＣＳＣモデルを調製した。この組成物の濾過テストを種々のＴＣＲＦパッドメディアを用いて数回行った。濾過の後、ＦＳＣ産物について、回収された総細胞数のパーセンテージ、ＢＭＮＣ：ＴＣの比、回収された細胞のタイプおよび特定の造血コロニー形成細胞、ＣＦＵ− ＧＭ（顆粒球／マクロファージ前駆体）の濃度の増加倍率を分析した。これらの濾過テスト（「Ａ」−「Ｖ」）の結果は表２および表２Ａに示してある。見ることができるように、最適な結果は、ＴＣＲＦパッドメディア幹細胞− ３（ＳＣ−３）と名付けられた２枚のＴＣＲＦパッドが用いられたテスト「Ｕ」で得られた。この場合、総ＢＭＮＣの１４．９％が回収され、ＣＦＵ−ＧＭの濃度は８．７倍増加した。ＮＡ＝生育があまりに遅過ぎて試験をするのに十分な細胞を提供できないＴＣＭＲＢＣ＝成熟した赤血球細胞ＬＭＰＨＣＴ＝リンパ球ＭＣＲＰＨＧ＝マクロファージメディア＝ＴＣＲＦパッドは種々の製造業者により作られた。Leukonet^TM（ロイコネット^TM）パッドおよびLydall（リドール）パッドは同一のフィルター材料から調製されたもので、リドール・インク（マンチェスター、ＣＴ）から入手できる。この材料はポリエステル繊維、セルロース微少繊維およびＮＷ−１８４５、アクリル性バインダー（ローム・アンド・ハース）からなる。このポリエステル繊維は各フィルターパッド中で、ＳＣ−３を除き、０．５ｍｍの平均デニールを有していた。ＳＣ−３では、ポリエステル繊維は平均デニールが１．５ｍｍであった。セルロース微少繊維は約２０ｍ²／ｇの表面積を持っていた。この材料中のポリエステル繊維のパーセンテージを変えることにより種々のリドールパッドが得られた。これは表２に空気透過性の関数として示してある。空気透過性は１２．７ｋｇ／ｍ²の先頭圧を用いフラジール(Frasier)法により測定した。 MilliporeＴＣＲＦパッドは架橋したヒドロキシアルキルアクリレートから米国特許第４，６１８，５３３号の方法に従って形成された親水性ポリマーで被覆されたLeukonet^TMＴＣＲＦであった。この特許は１９８６年１０月２１日にストイクに対し登録されミリポア・コーポ（ベッドフォード、ＭＡ）に譲渡されたものである。Biocmptbl ＴＣＲＦパッドはホスフォリルコリンの種々の濃度で被覆されたLeukonet^TMＴＣＲＦであった（Biocompatibles，Ltd.，ミドルセックス、英国）。本発明はＴＣＲＦ手段としてＴＣＲＦパッドの使用に限定する意図はなく、また一回の濾過の間に使用されるＴＣＲＦパッドの数を特定する意図もないが、最適な腫瘍細胞保持および幹細胞回収は２枚のＴＣＲＦパッドの同時使用で得られた。本発明は特定の態様の言葉で記述され、詳細に説明された。しかしながら、これらの態様は例示の目的でのみ提示されており、本発明はこれらに限定されるものではない。後記の請求の範囲に記載の精神および範囲内での修正や変更は、当技術分野における熟練者は理解するように、この開示から極めて明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物から腫瘍細胞を除去する方法であって、（ａ）下記のものを含む直列の濾過装置を提供する工程、その中に一つの入口孔と一つの出口孔を有する容器、および入口孔を経て濾過装置内に流入する腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物を濾過するため上記容器内の入口孔と出口孔の間に配置された腫瘍細胞低減フィルター手段であって、上記容器を第１室と第２室とに分割する腫瘍細胞低減フィルター手段、（ｂ）腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物を提供する工程、（ｃ）腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物を濾過装置に通す工程であって、腫瘍細胞が濾過装置内の腫瘍細胞低減フィルター手段により保持され、そして幹細胞産物が腫瘍細胞低減フィルター手段を通り濾過装置から出ていくものである工程、および（ｄ）腫瘍細胞を激減させた幹細胞産物を回収する工程、を含んで成る方法。２．濾過装置が出口孔を通して濾過装置から気体を排出させるための濾過装置内に配置された手段をさらに含むものである請求項１記載の方法。３．フィルター手段が腫瘍細胞を激減させた幹細胞産物において少なくとも１０倍の腫瘍細胞の減少と少なくとも３０％の幹細胞の回収を与えるものである請求項１記載の方法。４．フィルター手段が少なくとも毎時５０ｍｌの幹細胞産物の流速を与えるものである請求項３記載の方法。５．フィルター手段が一つ以上の腫瘍細胞低減フィルターパッドを含むものである請求項３記載の方法。６．フィルター手段が少なくとも約７５０リットル／分の空気透過性を有するものである請求項３記載の方法。７．フィルター手段が少なくとも約３．３×１０³リットル／分の空気透過性を有するものである請求項６記載の方法。８．腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物が、卵巣癌細胞、精巣癌細胞、乳癌細胞、多発性骨髄癌細胞、非ホジキンスリンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病細胞、慢性リンパ性白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、および急性リンパ性白血病細胞からなる群より選択される腫瘍細胞で汚染された幹細胞産物を含むものである請求項１記載の方法。９．腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物が腺管癌細胞および腺癌細胞からなる群より選択される腫瘍細胞で汚染された幹細胞産物を含むものである請求項１記載の方法。１０．直列の濾過装置に使用するのに適する腫瘍細胞低減フィルター手段であって、濾過された幹細胞産物において少なくとも１０倍の腫瘍細胞の低減および少なくとも３０％の幹細胞の回収を与える機械的に安定な基層を含む腫瘍細胞低減フィルター手段。１１．フィルター手段が少なくとも毎時５０ｍｌの幹細胞産物の流速を与えることをさらに特徴とする請求項１０記載のフィルター手段。１２．フィルター手段が多数の繊維および微少繊維からなるクモの巣状マトリックス構造を持つ一つ以上の腫瘍細胞低減フィルターパッドを含むことをさらに特徴とする請求項１０記載のフィルター手段。１３．繊維が約１．５ｍｍのデニールを持つポリエステルから形成されそして微少繊維がセルロースから形成されるものである請求項１２記載のフィルター手段。１４．フィルター手段が少なくとも約７５０リットル／分の空気透過性を有することをさらに特徴とする請求項１０記載のフィルター手段。１５．フィルター手段が少なくとも約３．３×１０³リットル／分の空気透過性を持つことをさらに特徴とする請求項１４記載のフィルター手段。１６．腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物から腫瘍細胞を除去するための濾過装置として使用するのに適する装置であって、その中に一つの入口孔と一つの出口孔を有する容器、および入口孔を経て容器内に流入する腫瘍細胞に汚染された幹細胞産物を濾過するため上記容器内の入口孔と出口孔の間に配置された腫瘍細胞低減フィルター手段であって、上記容器を第１室と第２室とに分割するフィルター手段、を含む濾過装置。１７．出口孔を通って容器から気体を排出させるための容器内に配置された手段をさらに含む請求項１６記載の濾過装置。１８．フィルター手段が濾過された幹細胞産物において少なくとも１０倍の腫瘍細胞の低減と少なくとも３０％の幹細胞の回収を与えるものである請求項１６記載の装置。１９．フィルター手段が少なくとも毎時５０ｍｌの幹細胞産物の流速を与えるものである請求項１８記載の濾過装置。２０．フィルター手段が一つ以上の腫瘍細胞低減フィルターパッドを含むものである請求項１８記載の濾過装置。２１．フィルター手段が少なくとも約７５０リットル／分の空気透過性を有するものである請求項１８記載の濾過装置。２２．フィルター手段が少なくとも約３．３×１０³リットル／分の空気透過性を持つものである請求項２１記載の濾過装置。