JP2003304865A

JP2003304865A - 細胞分離方法

Info

Publication number: JP2003304865A
Application number: JP2002109045A
Authority: JP
Inventors: Akira Kiguchi; 昌木口
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 2002-04-11
Filing date: 2002-04-11
Publication date: 2003-10-28

Abstract

(57)【要約】【課題】回収必要細胞と除去対象細胞を含有する細胞
集団浮遊液から、閉鎖系で、系外から一切液を加えるこ
となく、回収必要細胞を、簡便な操作で、且つ短時間に
回収する方法を提供すること。【解決手段】回収必要細胞および除去対象細胞を含む
細胞集団浮遊液から、該回収必要細胞を実質的に捕捉
し、該除去対象細胞は実質的に通過する手段を用いて、
該回収必要細胞を捕捉した後、次に該手段を通過した除
去対象細胞浮遊液から該除去対象細胞を除去し、その後
にこの除去対象細胞が除去された液を用いて該手段に捕
捉されている回収必要細胞を回収する、これら全工程を
閉鎖系で行う細胞分離方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する利用分野】本発明は、細胞集団から特定
の細胞を分離するための分離方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】白血病などの造血器腫瘍及び固形癌の化
学療法における副作用である造血障害に対して、骨髄移
植療法が広く施行されている。骨髄移植療法とは、移植
骨髄による致死的造血障害の回復法であるため、患者に
とって致死的な大量放射線及び／又は大量化学療法（以
下、大量化学療法と略す。）の施行が可能となり、白血
病や固形癌の治癒につながる。

【０００３】また、近年、骨髄と同様に末梢血中にも、
これらの治療に必要な造血幹細胞が含まれていることが
明らかになった。通常、これらの細胞の末梢血中での含
有率はかなり低値であり、採取して骨髄移植の代わりに
用いることは困難であるが、抗癌剤及び／又はＧ−ＣＳ
Ｆ（顆粒球コロニー刺激因子）等のサイトカインを投与
することにより、その含有率が増大することが明らかに
され、骨髄採取と比べると、全身麻酔が不要で安全なこ
とから、盛んに臨床応用が行われている。更に近年、臍
帯血中には末梢血よりもはるかに高濃度で造血幹細胞が
含有されていることが明らかになり、臨床応用が始まっ
た。

【０００４】移植法は細胞の提供者（ドナー）が誰であ
るかにより同種移植と自家移植に分けられる。前者は健
康な他人（血縁者又は非血縁者）が提供者になり、後者
は患者自身が提供者となるものである。自家移植におい
ては全てが、また同種移植においては臍帯血を用いる場
合はほとんどが移植まで凍結保存が行われる。凍結保存
の前には、通常赤血球の除去が行われる。これは全血で
保存した場合、保存スペースや解凍時の破壊赤血球によ
る副作用が問題となるためである。従来、赤血球除去は
遠心分離器により行われており、より分離効率を上げた
い場合には比重液（例えばファルマシア社製Ｆｉｃｏｌ
ｌ）を用いる比重遠心法が採用されている。本法は比重
液に原料細胞を重層させる際に液面を乱してはならない
等、非常に熟練を要する煩雑な操作である。また、比重
液を用いることからコスト高である。更に、細胞浮遊液
重層操作はクリーンベンチ内で行われるが、開放系であ
るため、細菌による汚染が危惧されている。

【０００５】特開昭６１−８４５５７号公報、特開平２
−１３４５６４号公報等で操作の煩雑さを解決すべく、
多くの試みがなされているが、これらも、比重液と遠心
分離器を用いる点では何ら従来法と変わらず、簡便、低
コスト、処理時間が短く、閉鎖系の造血幹細胞濃縮シス
テムが待望されていた。また、造血幹細胞を濃縮して凍
結保存する際にはジメチルスルホキシド、ゼラチン等の
凍結保存剤を造血幹細胞浮遊液に添加するが、この際更
に血漿蛋白質を添加すると造血幹細胞の保存状態が向上
する。しかしながら従来の遠心分離器を用いる造血幹細
胞の濃縮方法では血漿蛋白成分が除去されてしまい、別
途アルブミン製剤を添加するか、あるいは、遠心上清か
ら血小板を除去した上で得られた血漿を添加する様な方
法をとらざるを得ず、多大なコストと手間および時間を
要した。

【０００６】ところで、遠心分離を用いない赤血球除去
法の提案も散見されるようになった。特開平８−１０４
６４３号公報では赤血球と造血幹細胞及び／又は造血
前駆細胞を含む細胞集団を、実質的に赤血球は通過し、
白血球は捕捉するフィルターに通液した後、ＨＢＳＳ
（ハンクス液）などの緩衝液や生理食塩水にヒト血清ア
ルブミンなどのタンパクを添加した洗浄液を前記通液方
法とは逆方向に流して捕捉された白血球を回収する赤血
球の除去方法が提案されている。また、ＷＯ９８／３２
８４０には特定の粘度を有する回収液、例えばデキスト
ランを含む生理溶液で捕捉された細胞を回収する方法が
開示されている。いずれの方法も洗浄液を系外から導入
する必要があり閉鎖系ではない。

【０００７】ＥＰ０３４９１８８Ｂ１公報および特開平
９−３２２７５８公報では閉鎖系で細胞分離が可能なシ
ステムが開示されている。しかし、捕捉した回収必要細
胞を回収するための洗浄液を充填した容器が系の付属品
となり、系自体が大きくなって輸送コストがかさむ問題
がある。また回収必要細胞を除去対象細胞浮遊液から除
去対象細胞を除去した液の浮遊液として得る方法とし
て、特開平１０−８４９５０号公報では回収必要細胞を
自己血漿の浮遊液として回収しているが、この回収工程
ではやはり別途調製した回収液を使用している。また、
この方法はフィルターろ過の工程で造血幹細胞のフラク
ションをとる方法であり、最初に血漿のフラクションを
取る工程と、赤血球及び血小板のフラクションを取る工
程では慎重な操作が必要であり、時間もかかる。更に、
特開２０００−３２５０７１号公報には、血液伝播感染
の危険性を伴う市販製剤の血清蛋白質を用いずに自己血
漿で細胞を回収する方法が開示されている。しかし、こ
の方法では、除去対象細胞浮遊液を一旦外部に取り出し
て遠心分離処理等で血漿を分取し、この血漿で回収必要
細胞を回収しており、自己血漿は利用しているが、閉鎖
系ではない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、回収
必要細胞と除去対象細胞を含有する細胞集団浮遊液か
ら、閉鎖系で、系外から一切液を加えることなく、回収
必要細胞を、簡便な操作で、且つ短時間に回収する方法
を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は従来技術の有
する問題点を解決すべく鋭意検討した結果、本発明を完
成させたものである。即ち、本発明は、［１］回収必
要細胞および除去対象細胞を含む細胞集団浮遊液から、
該回収必要細胞を実質的に捕捉し、該除去対象細胞は実
質的に通過する手段を用いて、該回収必要細胞を捕捉し
た後、次に該手段を通過した除去対象細胞浮遊液から該
除去対象細胞を除去し、その後にこの除去対象細胞が除
去された液を用いて該手段に捕捉されている回収必要細
胞を回収する、これら全工程を閉鎖系で行うをことを特
徴とする細胞分離方法、［２］回収必要細胞が白血球
であり、除去対象細胞が赤血球および血小板である
［１］記載の細胞分離方法、［３］回収必要細胞がリ
ンパ球であり、除去対象細胞が赤血球、血小板、顆粒球
および単球である［１］記載の細胞分離方法、である。

【００１０】本発明による、除去対象細胞を除去した液
（これは自己血漿に相当する。）により、回収必要細胞
を実質的に捕捉し、該除去対象細胞は実質的に通過する
手段に捕捉されている回収必要細胞が、系外から一切液
が加えられることなく短時間に簡便に回収できる。ま
た、外気に開放される部分が全くない閉鎖系なので、雑
菌や異物の混入のない回収が可能である。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明を更に詳細に説明す
る。本発明で言う閉鎖系とは、細胞集団浮遊液を採取し
た後、細胞分離システムに繋ぎ込んでから細胞を分離回
収する一連の操作が終了するまでの全工程にわたって該
細胞分離システム内部の物質が系外の大気をはじめとす
るあらゆる物質に直接触れないことである。また系外か
ら一切液を加えないというのは細胞集団浮遊液を採取し
た後、細胞分離システムに繋ぎ込んでから後の工程に関
することであり、細胞集団浮遊液を採取して細胞分離シ
ステムに繋ぎ込むまでの間の工程についてはこの限りで
はない。

【００１２】本発明で言う回収必要細胞と除去対象細胞
を含む細胞集団浮遊液の例としては、骨髄、末梢血、臍
帯血あるいはこれらを遠心分離器等により粗分離したも
のが挙げられる。本発明で言う回収必要細胞は実質的に
捕捉し、除去対象細胞は実質的に通過する手段（以下、
回収必要細胞捕捉手段と称す。）としては、捕捉材を容
器に充填したもの、あるいは成型容器で容器内面に細胞
捕捉面が存在するものが挙げられる。

【００１３】前記捕捉材としては水不溶性であればいか
なる材質でも使用可能であるが、成型性、滅菌性や細胞
毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹
脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ
アクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロ
ース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサ
ン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタ
イト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステ
ンレス、チタン等の金属が挙げられる。また、これらの
捕捉材はこのままでも用いることができるが、必要に応
じ、アミノ酸、ペプチド、糖タンパク（抗体、接着分子
等のバイオリガンドを含む）といった、特定の細胞に親
和性のあるリガンドを固定してもよい。また、捕捉材の
形状としては粒状、繊維塊、織布、不織布、スポンジ状
多孔質体、平板等があげられるが、体積あたりの表面積
が大きいという点で粒状、繊維塊、織布、不織布、スポ
ンジ状多孔質体が好ましい。不織布の場合、繊維径は
１．０μｍ以上３０μｍ以下であり、好ましくは１．０
μｍ以上２０μｍ以下であり、更により好ましくは１．
５μｍ以上１０μｍ以下である。繊維径によって細胞捕
捉力が変化する傾向があり、１．０μｍ未満では回収必
要細胞が強固に捕捉されてしまい回収困難となる可能性
があり好ましくない。３０μｍを超えると、回収必要細
胞は繊維に捕捉されず素通りする可能性が高くなる。い
ずれの場合でも回収率の低下につながるおそれがあるの
で好ましくない。また、スポンジ状構造体の場合、孔径
は通常２．０μｍ以上３０μｍ以下であり、好ましくは
２．５μｍ以上２５μｍ以下であり、さらにより好まし
くは３．０μｍ以上２０μｍ以下である。２．０μｍ未
満では流れ性が著しく劣り、通液自体が困難になるおそ
れがあり、また３０μｍを超えると回収必要細胞の捕捉
率の低下を招くので好ましくない。

【００１４】本発明で言う「回収必要細胞を実質的に捕
捉し」とは回収必要細胞を６０ｗｔ％以上捕捉すること
であるが、好ましくは８０ｗｔ％以上、さらに好ましく
は９０ｗｔ％以上捕捉することである。また「除去対象
細胞は実質的に通過する」とは細胞含有液中の除去対象
細胞が６０ｗｔ％以上通過することであるが、好ましく
は８０ｗｔ％以上、さらに好ましくは９０ｗｔ％以上通
過することである。

【００１５】本発明において、捕捉材により回収必要細
胞が捕捉された残りの除去対象細胞を含む排出液から除
去対象細胞を除去するには例えばフィルターが好適に用
いられる。一般的な血漿分離フィルターの素材で血球
（細胞）成分と血漿成分から血漿成分のみを取り出すこ
とが可能である。このようなフィルター（以下、除去対
象細胞フィルターと称す。）としては膜形や不織布のも
のがあり、膜形のフィルターの材質はポリビニルアルコ
ール、セルロース、セルロースアセテート、ポリエチレ
ン、ポリスルホン、ポリプロピレン、ポリメチルメタク
リレート、ポリ塩化ビニルなどがある。不織布のフィル
ターとしてはガラス繊維を用いたものがある。いずれの
場合でもフィルターは適当な容器に封入され、本発明の
閉鎖系細胞分離のシステムの中に組み込まれる。フィル
ターの容器としては、水不溶性で容器としての十分な強
度を有する材料であればよいが、成型性、滅菌性や細胞
毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹
脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ
塩化ビニル、ポリウレタン等の合成高分子が好ましい。

【００１６】本発明における、原料の細胞集団浮遊液を
捕捉材に通液する方法及び捕捉材により回収必要細胞を
捕捉された残りの除去対象細胞を含む排出液を、フィル
ターに通して除去対象細胞を除去して回収必要細胞捕捉
手段に通液する方法としては、ポンプの利用、液体を貯
留したバッグを押しつぶして液流を惹起する方法、落差
による方法があるが、簡便さの点では落差による方法が
最も好ましい。流速が遅い場合は該バッグを押しても良
い。捕捉材から回収必要細胞を回収する際の回収液の通
液の方向は、原料液である細胞集団浮遊液の通液方法と
同一の方向で回収液を通液するか、逆方向で通液するか
に分かれるが、一般的に逆方向の方が回収率が高い傾向
がある。更に単純に通液するだけでなく、回収必要細胞
捕捉手段に振動を加えたり、ストップドフローにしても
良い。

【００１７】本発明において好ましく用いられる細胞分
離システムの例を図１に示す。図１は回収必要細胞捕捉
手段に細胞集団浮遊液を流した時と逆の方向に回収液を
流して回収必要細胞を回収する例である。図１に基いて
該システムを説明すれば、細胞集団浮遊液を入れた貯留
バッグ１を、途中に回収必要細胞浮遊液貯留バッグ２へ
分岐した三方活栓６を有するチューブで回収必要細胞捕
捉手段４の入口側に接続した。回収必要細胞捕捉手段４
の出口側はチューブで除去対象細胞浮遊液排出バッグ３
に接続されるが、その途中で除去対象細胞フィルター５
を挟んだバイパスチューブが接続される。さらにバイパ
スの下側接続部には三方活栓７が組み込まれている。

【００１８】次に該システムの操作手順を説明する。三
方活栓６を貯留バッグ１から回収必要細胞捕捉手段４側
に、三方活栓７を回収必要細胞捕捉手段４から除去対象
細胞浮遊液排出バッグ３側にセットする。次に貯留バッ
グ１中の細胞集団浮遊液を落差で通液し、除去対象細胞
浮遊液を除去対象細胞浮遊液排出バッグ３に貯留した。
その後、三方活栓７をバイパス側に、三方活栓６を回収
必要細胞浮遊液貯留バッグ２側に回した後に細胞分離シ
ステム全体を倒立させ、除去対象細胞浮遊液排出バッグ
３の液を落差で除去対象細胞フィルター５に通し回収必
要細胞捕捉手段４を通して回収必要細胞浮遊液貯留バッ
グ２に送り、回収必要細胞浮遊液を回収必要細胞浮遊液
貯留バッグ２に回収する。この際、除去対象細胞フィル
ター５を出る最初の液で回収必要細胞補足手段４に残存
する除去対象細胞を三方活栓６を貯留バッグ１側に回し
て洗い流してやれば除去対象細胞除去率を高くすること
ができる。

【００１９】細胞分離システムのもう一つの例を図２に
示す。図２は回収必要細胞捕捉手段に細胞集団浮遊液を
流した時と同じ方向に回収液を流して回収必要細胞を回
収する例である。細胞集団浮遊液を入れた貯留バッグ１
を、途中に除去対象細胞フィルター５を挟んで除去対象
細胞浮遊液排出バッグ３に接続するバイパスチューブに
分岐する三方活栓を有するチューブで回収必要細胞捕捉
手段４の入り口に接続した。回収必要細胞捕捉手段４の
出口側は、回収必要細胞浮遊液貯留バッグ２へ分岐した
三方活栓７を有するチューブで除去対象細胞排出バッグ
３に接続される。

【００２０】次に該システムの操作手順を説明する。三
方活栓６を貯留バッグ１から回収必要細胞捕捉手段４側
に、三方活栓７を回収必要細胞捕捉手段４から除去対象
細胞浮遊液排出バッグ３側にセットする。次に貯留バッ
グ１中の細胞集団浮遊液を落差で通液し、除去対象細胞
浮遊液を除去対象細胞浮遊液排出バッグ３に貯留した。
その後、三方活栓６をバイパス側に、三方活栓７を回収
必要細胞浮遊液貯留バッグ２側に回した後に除去対象細
胞浮遊液排出バッグ３を手で加圧して除去対象細胞浮遊
液排出バッグ３の液を除去対象細胞フィルター５に通し
回収必要細胞捕捉手段４を通して回収必要細胞浮遊液貯
留バッグ２に送り、回収必要細胞浮遊液を該バッグ２に
回収する。

【００２１】本発明における回収必要細胞と除去対象細
胞の組合せの例を示す。回収必要細胞が白血球であり、
除去対象細胞が赤血球、血小板の場合、白血球は捕捉手
段に捕捉され、赤血球、血小板は通過し、本発明によ
る、除去対象細胞をフィルターで除去した液（自己血漿
に相当する）により、捕捉手段に捕捉されている白血球
が回収される。また、回収必要細胞がリンパ球であり、
除去対象細胞が赤血球、血小板、顆粒球、単球の場合、
白血球（顆粒球＋単球＋リンパ球）は捕捉手段に捕捉さ
れ、赤血球、血小板は通過し、本発明による、除去対象
細胞をフィルターで除去した液（自己血漿に相当する）
により、捕捉手段に捕捉されている白血球を回収する
が、この際例えば不織布の繊維径を細くするなどして捕
捉手段の細胞捕捉力を強くしておくと、吸着力が比較的
弱いリンパ球のみを回収することができる。

【００２２】

【実施例】以下、本発明の実施例を図に示す細胞分離シ
ステム例を使って説明するが、本発明はこれにより限定
されるものではない。

【００２３】

【実施例１】本実施例による細胞分離は白血球を回収、
赤血球と血小板を除去することを目的としたものであ
る。（１）回収必要細胞捕捉手段の作製容器寸法４１×４１×１８ｍｍで液体流出口と液体流入
口を対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側に
平均繊維径１２μｍのポリエステル不織布１２枚を、出
口側に平均繊維径２．３μｍのポリエステル不織布２５
枚を充填した。なお、本フィルターの充填密度は０．２
ｇ／ｃｍ³であった。また、このフィルターに血小板通
過性を付与する目的で、親水性ポリマーのコーティング
を行った。即ち、ヒドロキシエチルメタクリレート・ジ
メチルアミノエチルメタクリレート共重合体の１ｗｔ％
エタノール溶液を該フィルターの液体流入口から通液し
た後、窒素ガスを通して乾燥させた。

【００２４】（２）細胞分離操作図１に示す細胞分離システムにおいて、（１）で作製し
た回収必要細胞捕捉手段を用い、除去対象細胞フィルタ
ーとして、ポリエチレン製血漿分離フィルターを用いて
以下の操作を行った。ヒト新鮮臍帯血（抗凝固剤として
ＣＰＤ（ｃｉｔｒａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｘ
ｔｒｏｓｅ）を添加）８０ｍｌを入れた貯留バッグ１を
三方活栓６を有するチューブで回収必要細胞捕捉手段４
の入口側に接続した後、三方活栓６を貯留バッグ１から
回収必要細胞捕捉手段４側に、三方活栓７を回収必要細
胞捕捉手段４から除去対象細胞浮遊液排出バッグ３側に
セットする。次に新鮮臍帯血８０ｍｌを落差で通液し、
白血球を吸着させ除去すべき赤血球及び血小板を含む液
を該排出バッグ３に通液した。その後、三方活栓７をバ
イパス側に回し、細胞分離システム全体を倒立させ、該
排出バッグ３の液を落差で除去対象細胞フィルター５を
通し回収必要細胞捕捉手段４に通して該補足手段４に残
存する赤血球及び血小板を貯留バッグ１に洗い流した
後、三方活栓６を回収必要細胞浮遊液貯留バッグ２側に
回して液を送った。このとき該排出バッグ３の液中の赤
血球及び血小板は除去対象細胞フィルター５で除去さ
れ、赤血球及び血小板が除かれた液（自己血漿）で回収
必要細胞捕捉手段４に捕捉された白血球は洗い流され、
回収必要細胞浮遊液貯留バッグ２に回収される。

【００２５】（３）分析白血球数、赤血球数、血小板数は自動血球計算機にて測
定した。回収率、除去率の算出方法は以下のとおりであ
る。回収率（％）＝１００×（分離後細胞数／分離前細胞
数）除去率（％）＝１００−１００×（分離後細胞数／分離
前細胞数）（４）結果回収すべき白血球が自己血漿を用いた閉鎖系で短時間で
簡単な操作で回収できた。また、除去すべき赤血球、血
小板は表１に示すように、高率で除去されている。

【００２６】

【表１】

【００２７】

【発明の効果】上述の様に、本発明によれば回収必要細
胞と除去対象細胞を含む細胞集団浮遊液から除去対象細
胞を実質的に除去し、回収必要細胞を外部から一切液が
加えられることなく外気にも一切触れることの無い閉鎖
系で短時間で簡便に回収することができ、臨床現場での
有用性が大である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の細胞分離方法を実施するためのシステ
ムの概略図の１例である。

【図２】本発明の細胞分離方法を実施するためのシステ
ムの概略図の他の１例である。

【符号の説明】

１細胞集団浮遊液貯留バッグ２回収必要細胞浮遊液貯留バッグ３除去対象細胞浮遊液排出バッグ４回収必要細胞捕捉手段５除去対象細胞フィルター６三方活栓７三方活栓

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/49 Ａ 33/49 Ｃ１２Ｍ 1/12 // Ｃ１２Ｍ 1/12 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】回収必要細胞および除去対象細胞を含む
細胞集団浮遊液から、該回収必要細胞を実質的に捕捉
し、該除去対象細胞は実質的に通過する手段を用いて、
該回収必要細胞を捕捉した後、次に該手段を通過した除
去対象細胞浮遊液から該除去対象細胞を除去し、その後
にこの除去対象細胞が除去された液を用いて該手段に捕
捉されている回収必要細胞を回収する、これら全工程を
閉鎖系で行うをことを特徴とする細胞分離方法。
【請求項２】回収必要細胞が白血球であり、除去対象
細胞が赤血球および血小板である請求項１記載の細胞分
離方法。
【請求項３】回収必要細胞がリンパ球であり、除去対
象細胞が赤血球、血小板、顆粒球および単球である請求
項１記載の細胞分離方法。