WO2011111386A1 - 細胞濃縮・回収方法及び細胞回収液 - Google Patents

細胞濃縮・回収方法及び細胞回収液 Download PDF

Info

Publication number
WO2011111386A1
WO2011111386A1 PCT/JP2011/001385 JP2011001385W WO2011111386A1 WO 2011111386 A1 WO2011111386 A1 WO 2011111386A1 JP 2011001385 W JP2011001385 W JP 2011001385W WO 2011111386 A1 WO2011111386 A1 WO 2011111386A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
filter
concentrating
recovery
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/001385
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
真司 林
武雄 熊谷
勝 中谷
昌紀 市村
Original Assignee
株式会社カネカ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社カネカ filed Critical 株式会社カネカ
Priority to JP2012504334A priority Critical patent/JP5800797B2/ja
Publication of WO2011111386A1 publication Critical patent/WO2011111386A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/02—Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass

Definitions

  • the present invention relates to a method for concentrating and recovering cells with high efficiency.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • regenerative medicine / cell medicine in order to obtain effective cells for treatment from collected body fluids and tissues, a method using centrifugation and a method of culturing and amplifying the collected cells are carried out. In some cases, the culture is repeated until the amount of cells necessary for transplantation is obtained. For the purpose of this purpose, it is necessary to separate non-autologous serum, culture-derived substances such as growth factors, cell-derived debris, and waste products from cells transplanted or repeatedly cultured in patients. Cultured cells are washed and collected by centrifugation.
  • adherent cells typified by mesenchymal stem cells
  • adherent cells typified by mesenchymal stem cells
  • an enzyme, a chelating agent or the like when collecting the cultured cells from the cell culture medium.
  • transplanting adherent cells or repeatedly culturing cells it is naturally necessary to separate and remove these enzymes, chelating agents and the like from cultured cells.
  • Patent Document 1 mesenchymal stem cells contained in umbilical cord blood are captured by a filter, and 18 mL of high-viscosity solution (dextran 40 injection) and 10 mL of air are passed in a direction opposite to the direction in which umbilical cord blood is passed.
  • the cell recovery rate of mesenchymal stem cells is as low as about 60%, and further improvement has been demanded.
  • Patent Document 2 after culturing mesenchymal cells on a filter and washing, the cultured cells are washed and recovered by passing ⁇ MEM medium (without serum) in the direction opposite to the direction in which the cell culture solution is passed. Although a method has been proposed, there is room for improvement with a mesenchymal cell recovery rate of about 70% from the cell culture medium.
  • An object of the present invention is to provide a method for washing and recovering cells with high yield, a recovery solution used in the method, and a cell composition recovered by the method.
  • the present inventors can recover the cells trapped on the filter with a recovery rate of nearly 100% when recovery is performed with a physiological solution containing high-concentration serum.
  • the present inventors have completed the present invention by discovering the surprising properties inherent to serum. That is, the present invention has found a method for washing and recovering cells in a high yield from a cell culture solution containing cells, a recovery solution used in the method, and a cell composition recovered by the method. It is in.
  • a cell concentration / recovery method including a step of capturing cells on a filter, and a step of introducing and recovering a physiological solution containing serum of 30 (v / v)% or more of the cells captured on the filter.
  • a method for concentrating and collecting cells wherein the filter of [1] is made of a synthetic polymer selected from at least one of polyester, rayon, polypropylene, polyolefin and the like.
  • a method for concentrating and collecting cells wherein the filter of [1] is a combination of polyester and polypropylene, or rayon and polyolefin, or a synthetic polymer such as polyester and rayon.
  • [4] A method for concentrating and collecting cells, wherein the filter according to any one of [1] to [3] is a nonwoven fabric.
  • [5] A cell concentration and recovery method, wherein the cell according to any one of [1] to [4] is a cultured cell.
  • [6] A cell concentration and recovery method, wherein the cultured cells according to [5] are colony forming cells.
  • [7] A method for concentrating and collecting cells, wherein the colony forming cells of [6] are adherent cells.
  • [8] A method for concentrating and collecting cells, wherein the adherent cells of [7] are mesenchymal stem cells.
  • a cell concentration / recovery method wherein the cell according to any one of [5] to [8] is prepared by enzyme treatment.
  • Cells can be recovered with a high yield by using high concentration of serum as the recovery solution.
  • the cells in the present invention refer to cells collected from animal body fluids and tissues, artificially established cell lines, and those cultured in vitro, preferably human body fluids and Cells collected from tissue or cultured cells thereof, more preferably human bone marrow fluid, blood (including peripheral blood, G-CSF mobilized peripheral blood, etc.), umbilical cord blood, menstrual blood, adipose tissue, etc. Or that which cultured the cell.
  • human body fluids and Cells collected from tissue or cultured cells thereof more preferably human bone marrow fluid, blood (including peripheral blood, G-CSF mobilized peripheral blood, etc.), umbilical cord blood, menstrual blood, adipose tissue, etc. Or that which cultured the cell.
  • colony-forming cells collected from human bone marrow fluid, blood, umbilical cord blood, menstrual blood, adipose tissue, etc. and cultured are preferred, and adhesive colony-forming cells are more preferred.
  • Colony-forming cells refer to cells that form colonies when cultured in vitro under arbitrary conditions, such as hematopoietic stem cells, vascular endothelial precursor cells, mesenchymal stem cells, adipose-derived stem cells, ES cells, iPS cells, etc. Can be mentioned.
  • Adhesive colony-forming cells refer to cells that grow by adhering to an arbitrary scaffold when the cells proliferate, such as vascular endothelial progenitor cells, mesenchymal stem cells, adipose-derived stem cells, Examples include ES cells and iPS cells.
  • the cells to be concentrated and / or recovered in the present invention are preferably mesenchymal stem cells, adipose-derived stem cells, and iPS cells, and more preferably mesenchymal stem cells.
  • the enzyme treatment refers to a treatment for detaching cells by treatment with a proteolytic enzyme such as trypsin, collagenase, dispase or the like.
  • composition in the present invention means an aqueous liquid containing serum having an arbitrary concentration in which cells are suspended in the liquid.
  • the cell culture solution during culture may be used as it is, or a cell culture solution after pipetting.
  • the cultured cells When the cultured cells are adhesive, it may be a culture solution after physically detaching the cells, such as pipetting or cell scraper, and the cells are detached by treatment with a chelating agent such as EDTA or citric acid. It may be a culture broth after.
  • the filter in the present invention refers to a filter that captures cultured cells and allows unnecessary impurities to pass through.
  • the contaminants referred to herein are fine particles other than the target cells contained in the cell culture solution, for example, cell degradation products, cell-derived secretions, medium components, fine contaminants mixed during the culture operation, enzymes, chelating agents
  • cells other than the target cells for example, red blood cells, platelets, lymphocytes and the like can be mentioned.
  • the material of the filter is a synthetic polymer selected from at least one of polyester, rayon, polyolefin, polystyrene, acrylic resin, nylon, polycarbonate, polyacrylamide, polyurethane, vinyl chloride, hydroxyapatite, glass, alumina, titania, etc.
  • synthetic polymer selected from at least one of polyester, rayon, polyolefin, polystyrene, acrylic resin, nylon, polycarbonate, polyacrylamide, polyurethane, vinyl chloride, hydroxyapatite, glass, alumina, titania, etc.
  • examples thereof include inorganic materials, metals such as stainless steel, titanium, and aluminum.
  • the combination is not particularly limited, but synthetic polymers such as polyolefin, polystyrene, acrylic resin, nylon, polyester, polycarbonate, polyacrylamide, polyurethane, vinyl chloride, hydroxyapatite,
  • synthetic polymers such as polyolefin, polystyrene, acrylic resin, nylon, polyester, polycarbonate, polyacrylamide, polyurethane, vinyl chloride, hydroxyapatite
  • inorganic materials such as glass, an alumina, a titania, stainless steel, titanium, aluminum, etc. is mentioned.
  • the form of the fiber may be a fiber in which one fiber is made of a synthetic polymer of different components, or a split fiber in which different components are separated from each other. Moreover, the form which each compounded the fiber which consists of synthetic polymers with different components individually may be sufficient.
  • composite as used herein is not particularly limited, and examples thereof include a form constituted by a state in which two or more kinds of fibers are mixed, or a form obtained by laminating a form composed of a synthetic polymer alone.
  • polyesters such as polyethylene terephthalate and polybutylene terephthalate are preferable.
  • examples of the shape of the filter include non-woven fabrics, fiber aggregates, and woven fabrics. Among these, non-woven fabrics are preferable.
  • the fiber diameter of the filter is preferably 1 to 40 ⁇ m from the recovery rate of target cells. If it is thinner than 1 ⁇ m, the interaction between the cells and the filter becomes strong, and the recovery rate becomes low. On the other hand, if the thickness is larger than 40 ⁇ m, the effective contact area is likely to be reduced and a short pass is likely to occur, leading to a reduction in the recovery rate of the cultured cells. In order to increase the interaction between the cultured cells and the filter and increase the yield, 3 to 30 ⁇ m is more preferable. More preferably, it is 5 to 25 ⁇ m, and most preferably 10 to 20 ⁇ m.
  • the filter packing density is preferably 0.1 to 0.8 g / cm 3 based on the recovery rate of the target cells. If it is less than 0.1 g / cm 3 , the effective contact area and short path are likely to occur, leading to a decrease in the recovery rate of cultured cells. On the other hand, when the concentration is higher than 0.8 g / cm 3 , the cells are firmly captured and may be difficult to collect.
  • the filter packing density is the value obtained by dividing the weight of the filter packed in the housing by the volume of the filter installation part in the housing.
  • the use form of the filter may take any form such as a sphere, container, cassette, bag, tube, column, etc., but preferred specific examples include, for example, a volume of about 0.1 to 1000 mL and a diameter of about 0.1 to Examples thereof include a transparent or translucent cylindrical container of about 15 cm, or a square or rectangular shape having a length of about 0.1 to 20 cm and a thickness of about 0.1 to 5 cm.
  • the filter may process the body fluid in a flat plate shape cut to an appropriate size, or may process the body fluid in a rolled shape.
  • the necessary cells may be captured by treating the body fluid from the inside to the outside of the roll, or conversely, the body fluid is allowed to flow from the outside to the inside of the roll. Cell capture may be performed.
  • the cell culture solution can be passed through the filter by natural dropping from a bag in which the cell culture solution is pooled, or the syringe containing the cell culture solution is directly connected to the container in which the filter is stored.
  • the body fluid may be injected by manually pushing the plunger of the syringe. Moreover, you may send liquid using a pump etc.
  • the liquid passing speed at this time is not particularly limited, but is preferably in the range of 0.1 to 1000 mm / min when expressed in terms of the passage speed (linear speed) of the cell culture solution with respect to the filter thickness.
  • linear speed the passage speed
  • a more preferable linear velocity is 0.3 to 500 mm / min, and even more preferably 0.5 to 250 mm / min.
  • the filter can be washed, for example, by passing a washing solution from the same direction as the cell culture solution, so that unnecessary contaminants accumulated in the filter can pass through the filter.
  • the washing solution used here is not particularly limited as long as it does not negatively affect the cells. Specific examples include those that have been used as injections such as physiological saline, and phosphate buffer solutions. And buffer medium such as ⁇ MEM medium and DMEM medium. It is preferable to use physiological saline because it has been used for medical purposes.
  • the speed at which the cleaning liquid is passed at this time is not particularly limited, but is preferably in the range of 0.1 to 1000 mm / min when expressed in terms of the passing speed (linear speed) of the cleaning liquid with respect to the filter thickness. If the linear velocity is lower than 0.1 mm / min, the treatment time will be prolonged, and if it is higher than 1000 mm / min, necessary colony forming cells will be easily detached from the filter due to the flowing water pressure of the washing solution, which may lead to a decrease in the recovery rate. .
  • a more preferable linear velocity is 0.3 to 500 mm / min, and even more preferably 0.5 to 250 mm / min.
  • the amount of the washing liquid varies depending on the filter volume, it is desirable to wash with a volume of about 1 to 100 times the volume of the filter. When it is assumed to be administered to the human body for treatment, 10 to remove impurities as much as possible. It is desirable to clean with a volume of about 100 times.
  • the cells captured by the filter can be efficiently collected by flowing the collected solution in the direction opposite to the direction in which the cell culture solution is flowed.
  • the recovered liquid may be left in the filter for about 0 to 10 minutes and then injected at about 0.01 to 20 mL / sec.
  • a liquid containing serum at a certain concentration or higher is used as the recovery liquid.
  • serum at a high concentration a higher cell recovery rate can be achieved as compared with the case where dextran sugar injection having the same viscosity is used as the recovery solution.
  • the concentration of serum contained in the recovered solution is usually 30% or more, preferably 40% or more, more preferably 50% or more, and even more preferably 75% or more when expressed in volume concentration (v / v) (%). It is.
  • the upper limit is not particularly limited, and 100%, that is, undiluted serum can be preferably used. When the serum concentration is less than 30%, the recovery rate is decreased.
  • Serum is not limited to humans as long as it is used for culturing, and bovine, equine, dog-derived sera, etc. are used.
  • the liquid for diluting serum is not particularly limited as long as it does not negatively affect cells. Specific examples include those that have been used as injections such as physiological saline and phosphorous. Examples include a buffer solution such as an acid buffer solution, a medium for cell culture, such as an ⁇ MEM medium and a DMEM medium. It is preferable to use physiological saline because it has been used for medical purposes.
  • the amount of recovered liquid to be used is usually 1 to 10 times, preferably 3 to 7 times the filter volume, although it depends on the filter capacity.
  • the speed at which the recovered liquid is passed is usually 0.01 to 20 mL / sec, preferably 17 to 25 mL / sec.
  • the collection liquid can be passed by, for example, a method in which the collection liquid is put into a syringe and the plunger of the syringe is pushed by hand.
  • about 1 to 3 times the volume of the filter volume is collected (injected), then the housing containing the filter is filled with the collected liquid and allowed to stand for a certain period of time.
  • the standing time is not particularly limited, but is usually 30 sec to 60 min in consideration of workability (time required for cell concentration / recovery).
  • the recovered cells may be seeded on a culture substrate as a subculture, but can be used directly as an injected cell fraction for treatment, particularly when serum from the same species is used.
  • the filter in the present invention may be used alone, may be treated with a cell culture solution prepared in an automatic culture apparatus, or may be processed in combination with an automatic culture apparatus.
  • the automatic culture apparatus refers to an apparatus that can be automatically or semiautomatically performed by replacing all or part of the cell culture operation, which is usually performed manually, with a machine or an instrument.
  • the cell culture operation mentioned here includes, for example, medium exchange and cell recovery operation.
  • Preferable specific examples include Aastrom Replicell System (manufactured by Aastrom Bioscience), and culture apparatuses disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 2004-344128, 2004-89095, and 2001-275659. It is not limited.
  • the solution mixing ratio at the time of preparation of the collection liquid in the following examples indicates a volume ratio.
  • Example 1 Recovery with 100% serum A polyester nonwoven fabric (fiber diameter 10 to 20 ⁇ m, basis weight 60 g / m 2 , thickness 0.3 mm, average pore diameter 30 to 40 ⁇ m), inner diameter 18 mm, height 6 mm, internal volume 1.53 cm 2 was packed in a housing of 33 (packing density: 0.33 g / cm 3 ).
  • the ⁇ MEM medium was removed from the tissue culture petri dish (150 mm petri dish manufactured by IWAKI) in which the porcine bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured until they became confluent, and the inside of the petri dish was rinsed with physiological saline.
  • 3 mL of TrypLE Select (manufactured by GIBCO) was added to the petri dish from which the rinse solution had been removed, and the cells were detached by allowing to stand at 37 ° C. for 10 minutes. Further, 6 mL of the medium was added, and after centrifugation, the number of cells was measured with a hemocytometer, and 2 ⁇ 10 6 cells were suspended in 50 mL of ⁇ MEM medium containing 10% serum.
  • This cell suspension was passed through the column at a rate of 5 mL / min (linear speed: 8 mm / min) to capture the cells. Here, no cells were present in the liquid that passed through the column.
  • Cell recovery rate (%) (cell concentration in recovered liquid ⁇ recovered liquid amount) ⁇ 100/2 ⁇ 10 6
  • Cell concentration rate (times) 50 mL ⁇ 100 / (recovered liquid volume) At this time, the cell recovery rate was 100%, and the cell concentration rate was 4.5 times.
  • Example 2 Recovery with 75% serum The same operation as in Example 1 was performed except that 10 mL of 75% bovine serum was used as the recovery liquid.
  • the recovered liquid was prepared by mixing 100% serum and physiological saline at a ratio of 1: 3.
  • the cell recovery rate at that time was 90%, and the cell concentration rate was 4.6 times.
  • Example 3 Recovery with 50% serum The same operation as in Example 1 was performed except that 10 mL of 50% bovine serum was used as the recovery liquid.
  • the recovered solution was prepared by mixing 100% serum and physiological saline (Otsuka Pharmaceutical) at a ratio of 1: 1.
  • the cell recovery rate at that time was 86%, and the cell concentration rate was 4.8 times.
  • Example 4 Recovery with 30% serum The same operation as in Example 1 was performed, except that 10 mL of 30% bovine serum was used as the recovery liquid.
  • the recovered solution was prepared by mixing 100% serum and physiological saline (Otsuka Pharmaceutical) at a ratio of 3: 7.
  • the cell recovery rate at that time was 83%, and the cell concentration rate was 5.0 times.
  • Example 1 Recovery with 25% serum The same operation as in Example 1 was performed except that 10 mL of 25% bovine serum was used as the recovery liquid. The recovered solution was prepared by mixing 100% serum and physiological saline at a ratio of 3: 1. At that time, the cell recovery rate was 61%, and the cell concentration rate was 4.4 times.
  • Example 2 Recovery with 20% dextran sugar injection The same operation as in Example 1 except that 10 mL of a recovery liquid in which low molecular weight dextran sugar injection (Otsuka Pharmaceutical) and physiological saline were mixed 1: 4 was used as the recovery liquid. Went. At that time, the cell recovery rate was 63%, and the cell concentration rate was 4.4 times.
  • Example 4 Recovery with physiological saline
  • physiological saline Otsuka Pharmaceutical
  • Example 5 Recovery with albumin solution The same operation as in Example 1 was performed except that 10 mL of albumin solution was used as the recovery liquid.
  • the recovered liquid was prepared by mixing a 20 g / dL albumin preparation and physiological saline (Otsuka Pharmaceutical) at a ratio of 1: 4.
  • the cell recovery rate at that time was 88%, and the cell concentration rate was 5.0 times.
  • Example 5 Serum was allowed to stand in a filter and then recovered with 100% serum. The same operation as in Example 1 was performed except that cells were recovered as described below.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

　本発明は、細胞を含有する液体をフィルターに通液して目的とする細胞を捕捉し、次いで、回収液を用いて捕捉された細胞を回収する方法において、回収液として高濃度の血清を含有する溶液を用いることを特徴とする、細胞の濃縮・分離方法に関する。本発明の方法によれば、培養液等から高い収率で目的細胞を濃縮、回収することができる。また、本発明は、当該方法によって回収された細胞含有組成物でもある。本発明の組成物は、目的細胞を高濃度に含み、また夾雑物が少ないため、再生医療・細胞医療に好適に利用することができる。

Description

細胞濃縮・回収方法及び細胞回収液
　本発明は、細胞を高い効率で濃縮・回収する方法に関する。
　近年、患者本人または提供者の体液や組織から細胞を採取し、それらを培養することにより増幅・加工して患部へ移植する治療、いわゆる再生医療・細胞医療が注目を集めている。既に、皮膚、骨、軟骨、角膜等の臓器では一部の疾患においてその安全性と有効性が示されており、患者に有益な治療方法として、普及が待望されている（非特許文献１）。
　再生医療・細胞医療においては、採取した体液や組織から治療に有効な細胞を得るために、遠心分離を利用した方法や採取した細胞を培養・増幅する方法が実施されている。培養は移植に必要な細胞量が得られるまで、繰り返し行われる場合もある。患者へ移植、又は繰り返し培養する細胞からは、自己由来以外の血清や、成長因子等の培養液由来の物質、細胞由来のデブリス、および老廃物等を分離する必要があり、本目的のために遠心分離による培養細胞の洗浄及び回収が実施されている。
　間葉系幹細胞に代表される接着性細胞においては、細胞培養液からの培養細胞の回収の際に、酵素、キレート剤等で処理することにより培養細胞を細胞培養器から剥離する必要がある。接着性細胞の移植又は繰り返し細胞培養をするにあたっては、当然のことながら、これら酵素、キレート剤等を培養細胞より分離、除去する必要がある。
　前述した遠心分離による培養細胞からの酵素等の分離において、閉鎖系での分離操作が容易でないことにより、一部の操作が開放系で行われ、細胞洗浄工程におけるコンタミネーションのリスクが指摘されていた。しかしながら、再生医療・細胞医療が一般的な医療として普及・発展するためには、細胞の分離洗浄操作の非開放系での処理が必須と考えられるが、これまでの検討では以下のように細胞回収率が低いものでしかなかった。
　特許文献１では臍帯血中に含まれる間葉系幹細胞をフィルターに捕捉し、臍帯血を通液した方向と逆方向に高粘度の溶液（デキストラン４０注）１８ｍLと空気１０ｍLを通液することにより間葉系幹細胞を回収しようとしているが、間葉系幹細胞の細胞回収率は６０％程度と低く、さらなる改善が求められた。特許文献２では培養間葉系細胞をフィルターに捕捉・洗浄後、細胞培養液を通液した方向と逆方向にαＭＥＭ培地（血清を含まない）を通液することにより培養細胞を洗浄、回収する方法が提案されているが、細胞培養液からの間葉系細胞回収率が７０％程度と改善の余地があった。
特開２００１－１６３５２ 特開２００８－８６２３５
Robert P. Lanza：　再生医学　ティッシュエンジニアリングの基礎から最先端技術まで（２００２年）
　本発明は、高い収率で細胞を洗浄、回収する方法、及び該方法に使用する回収液、該方法によって回収された細胞組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、従来技術の有する問題点を解決すべく鋭意検討した結果、高濃度の血清を含む生理的溶液で回収を行うと、１００％近い回収率でフィルターに捕捉した細胞を回収できるという血清固有の驚くべき性質を見出し、本発明を完成させたものである。即ち、本発明は、細胞を含む細胞培養液の中から、高い収率で細胞を洗浄、回収する方法、及び該方法に使用する回収液、該方法によって回収された細胞組成物を見出した点にある。よって、本発明が提供するのは以下の通りである：
〔１〕細胞をフィルターに捕捉する工程、フィルターに捕捉した細胞を３０（ｖ／ｖ）％以上の血清を含む生理的溶液を導入して回収する工程を含む細胞濃縮・回収方法。
〔２〕〔１〕のフィルターが、ポリエステル、レーヨン、ポリプロピレン、ポリオレフィン等の少なくとも１種より選択される合成高分子よりなる細胞濃縮・回収方法。
〔３〕〔１〕のフィルターが、ポリエステルおよびポリプロピレン、またはレーヨンおよびポリオレフィン、またはポリエステルおよびレーヨン等の合成高分子の組み合わせからなる細胞濃縮・回収方法。
〔４〕〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のフィルターが、不織布である細胞濃縮・回収方法。
〔５〕〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の細胞が培養細胞である細胞濃縮・回収方法。
〔６〕〔５〕に記載の培養細胞が、コロニー形成細胞である細胞濃縮・回収方法。
〔７〕〔６〕のコロニー形成細胞が接着性細胞である細胞濃縮・回収方法。
〔８〕〔７〕の接着性細胞が間葉系幹細胞である細胞濃縮・回収方法。
〔９〕〔５〕～〔８〕のいずれかに記載の細胞が、酵素処理で調製したものである細胞濃縮・回収方法。
〔１０〕〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の方法によって回収された組成物。
　回収液として高濃度の血清を用いることで高い収率で細胞を回収できる。
血清濃度と細胞回収率の関係
　本発明における細胞とは、動物の体液や組織から採取した細胞、人工的に癌化させた株化細胞、さらにはこれら細胞を生体外で培養したもの等を指すが、好ましくはヒトの体液や組織から採取した細胞またはその細胞を培養したもの、より好ましくはヒトの骨髄液、血液（末梢血、Ｇ－ＣＳＦ動員末梢血等を含む）、臍帯血液、月経血液、脂肪組織等から採取した細胞またはその細胞を培養したものを指す。
　中でもヒトの骨髄液、血液、臍帯血液、月経血液、脂肪組織等から採取し、培養したコロニー形成細胞が好ましく、接着性のコロニー形成細胞がより好ましい。
　コロニー形成細胞とは、生体外で任意条件の下培養すると、コロニーを形成する細胞を指し、例えば、造血幹細胞、血管内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、ＥＳ細胞、iPS細胞等が挙げられる。接着性のコロニー形成細胞とは、該細胞が増殖していく際に、任意の足場に接着して増殖していく細胞を指し、例えば、血管内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、ＥＳ細胞、iPS細胞等が挙げられる。
　なかでも、本発明で濃縮及び／又は回収する細胞としては、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、iPS細胞が好ましく、間葉系幹細胞がより好ましい。
　本発明における酵素処理とはトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ等のタンパク質分解酵素の処理によって細胞を剥離させる処理をいう。
　本発明における組成物とは、細胞が液体中に懸濁されている任意の濃度の血清を含む水性液体を意味する。
　培養細胞が非接着性である場合、培養中の細胞培養液そのままであっても良く、ピペッティングを行った後の細胞培養液であっても良い。
　培養細胞が接着性である場合、ピペッティングやセルスクレイパー等、細胞を物理的に剥離させた後の培養液であっても良く、ＥＤＴＡ、クエン酸等のキレート剤等の処理によって細胞を剥離させた後の培養液であっても良い。
　本発明におけるフィルターとは、培養細胞を捕捉し、不必要な夾雑物を通過させるものを指す。
　ここでいう夾雑物とは、細胞培養液に含まれる目的細胞以外の微粒子、例えば、細胞の分解物、細胞由来の分泌物、培地成分、培養操作中に混入する微細混入物、酵素、キレート剤、さらには目的細胞以外の細胞、例えば、赤血球、血小板、リンパ球等が挙げられる。
　フィルターの材質は、ポリエステル、レーヨン、ポリオレフィン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、塩化ビニル等の少なくとも１種より選択される合成高分子やヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属が挙げられる。
　２種以上の合成高分子を組み合わせる場合は、その組み合わせに特に限定はないが、ポリオレフィン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、塩化ビニル等の合成高分子、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等からなる組み合わせが挙げられる。
　２種類以上の合成高分子を組み合わせる場合の繊維の形態としては、１本の繊維が異成分同士の合成高分子よりなる繊維、あるいは異成分同士が剥離分割した分割繊維でもよい。また、成分の異なる合成高分子単独よりなる繊維をそれぞれ複合化した形態でもよい。ここでいう複合化とは、特に限定はないが２種類以上の繊維が混在した状態より構成される形態、あるいは合成高分子単独よりなる形態をそれぞれ貼り合わせたもの等が挙げられる。
　中でも、ポリエチレンテレフタレートやポリブチレンテレフタレート等のポリエステルが好ましい。
　またフィルターの形状は、不織布、繊維の集合体、織物等が挙げられ、中でも不織布が好ましい。
　フィルターの繊維径は、目的細胞の回収率から、１～４０μｍが好ましい。１μｍより細いと細胞とフィルターの相互作用が強くなり回収率が低くなる。また４０μｍより太いと有効接触面積の低下やショートパスが起こりやすくなり、培養細胞の回収率の低下につながる。培養細胞とフィルターとの相互作用を上げ、収率を上げるためには、３～３０μｍがより好ましい。さらに好ましくは５～２５μｍ、最も好ましくは１０～２０μｍである。
　フィルターの充填密度は、目的細胞の回収率から０．１～０．８ｇ／ｃｍ３が好ましい。０．１ｇ／ｃｍ３よりも小さいと有効接触面積の低下やショートパスが起こりやすくなり、培養細胞の回収率の低下につながる。また０．８ｇ／ｃｍ３よりも大きいと細胞が強固に捕捉されてしまい、回収困難になる可能性がある。
　ここでいうフィルターの充填密度とはハウジング内に詰め込んだフィルター重量をハウジング内のフィルター設置部分の体積で除した値を表す。
　フィルターの使用形態は、球、コンテナ、カセット、バッグ、チューブ、カラム等、任意の形態をとりうるが、好ましい具体例としては、例えば、容量約０．１～１０００ｍＬ程度、直径約０．１～１５ｃｍ程度の透明または半透明の円柱状容器、あるいは一片の長さ０．１～２０ｃｍ程度の正方形あるいは長方形で、厚みが０．１～５ｃｍ程度の四角柱状の形態等が挙げられる。
　また、フィルターは適切な大きさに切断した平板状で体液を処理してもよいし、またロール状に巻いた形状で体液の処理を行ってもよい。ロール状で使用する場合、該ロールの内側から外側に向け体液を処理することにより、必要細胞の捕捉を行ってもよいし、あるいはこの逆に、ロールの外側から内側に体液を流入させ、目的細胞の捕捉を行ってもよい。
　細胞培養液のフィルターへの通液は、細胞培養液をプールしたバッグ等から自然落下で通液してもよいし、細胞培養液を入れたシリンジを直接該フィルターが収納された容器に接続し、手でシリンジのプランジャーを押して体液を注入してもよい。またポンプ等を使用して送液してもよい。
　またこの際の通液速度は、特に限定されないが、フィルターの厚さに対する細胞培養液の通過速度（線速）で表した時、０．１～１０００ｍｍ／ｍｉｎの範囲にあることが好ましい。線速が０．１ｍｍ／ｍｉｎより低いと処理時間が長期化し、１０００ｍｍ／ｍｉｎより高いと細胞培養液の流水圧により必要なコロニー形成細胞がフィルターに捕捉されにくくなる。より好ましい線速は、０．３～５００ｍｍ／ｍｉｎであり、さらにより好ましくは０．５～２５０ｍｍ／ｍｉｎである。
　フィルターの洗浄は、例えば、細胞培養液を流した方向と同方向から洗浄液を流すことによって、フィルター中に溜まっている不要夾雑物をフィルターから通過させることが出来る。
　ここで用いられる洗浄液は、細胞に対して負の影響を与えない液体であれば特に限定されないが、具体例としては、生理食塩液等注射用剤として使用実績のあるものや、リン酸緩衝液等の緩衝液、αＭＥＭ培地やＤＭＥＭ培地等、細胞培養用の培地等が挙げられる。医療用途に用いられている実績があることから、生理食塩水を用いることが好ましい。
　この際の洗浄液を通液する速度は、特に限定されないが、フィルターの厚さに対する洗浄液の通過速度（線速）で表した時、０．１～１０００ｍｍ／ｍｉｎの範囲にあることが好ましい。線速が０．１ｍｍ／ｍｉｎより低いと処理時間が長期化し、１０００ｍｍ／ｍｉｎより高いと洗浄液の流水圧により必要なコロニー形成細胞がフィルターから剥離しやすくなり、回収率の低下につながる恐れがある。より好ましい線速は、０．３～５００ｍｍ／ｍｉｎであり、さらにより好ましくは０．５～２５０ｍｍ／ｍｉｎである。
　洗浄液量はフィルター容積により異なるが、該フィルター容積の約１～１００倍程度の体積で洗浄することが望ましく、治療用として人体に投与することを前提とした場合、夾雑物を極力除くために１０～１００倍程度の体積で洗浄することが望ましい。
　フィルターに捕捉された細胞の回収は、細胞培養液を流した方向とは逆方向から回収液を流すことにより、効率よく回収することができる。
また、回収液はフィルター内に０～１０分程度静置し、その後０．０１～２０ｍＬ／ｓｅｃ程度で注入しても良い。
　本発明では、回収液として、一定濃度以上の血清を含有する液体を使用する。血清を高濃度で含有させることにより、粘度として同程度であるデキストラン糖注を回収液として用いた場合に比して、高い細胞回収率を達成することができる。
　回収液に含まれる血清の濃度としては、体積濃度（ｖ／ｖ）（％）で表した時、通常３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７５％以上である。上限は特に制限されず、１００％、即ち、希釈なしの血清も好適に使用できる。
血清濃度が３０％未満の場合、回収率の低下が見られる。
　血清は培養に使用される血清ならヒトに限定されるものではなくウシ、ウマ、イヌ由来の血清等が使用される。
　また、血清を希釈する液体としては、細胞に対して負の影響を与えない液体であれば特に限定されないが、具体例としては、生理食塩液等注射用剤として使用実績のあるものや、リン酸緩衝液等の緩衝液、αＭＥＭ培地やＤＭＥＭ培地等、細胞培養用の培地等が挙げられる。医療用途に用いられている実績があることから、生理食塩水を用いることが好ましい。
　使用する回収液量は、フィルター容量にもよるが、フィルター容積の通常１～１０倍量、好ましくは３～７倍量である。回収液を通液する速度としては、通常０．０１～２０ｍＬ／ｓｅｃ、好ましくは、１７～２５ｍＬ／ｓｅｃである。回収液の通液は、例えば、回収液をシリンジに入れ、手でシリンジのプランジャーを勢いよく押す等の方法により行うことができる。また、まずフィルター容積の１～３倍量程度の回収液を通液（注入）した後、フィルターを含むハウジング内が回収液で満たされた状態で一定時間静置し、その後、さらにフィルター容積の２～１０倍量、好ましくは３～７倍量の回収液を通液することにより、回収率をより高めることもできる。静置時間は特に限定されないが、作業性（細胞の濃縮・回収に要する所要時間）も考慮して、通常３０ｓｅｃ～６０ｍｉｎである。
　回収後の細胞は、継代培養として培養基材に播種しても良いが、特に同種生物の血清を用いた場合等は、治療用の注入細胞画分としてそのまま使用することもできる。
　本発明におけるフィルターは、単独で使用しても良く、自動培養装置において調製された細胞培養液を処理しても良く、自動培養装置と組み合わせて処理しても良い。
　ここでいう自動培養装置とは、通常は手作業によっておこなう細胞培養操作の全部または一部を、機械または器具で代替することにより自動または半自動的に行うことを可能とした装置のことを指す。
　ここでいう細胞培養操作とは、例えば培地の交換や細胞回収の操作等が挙げられる。好ましい具体例としては、Aastrom Replicell System（Aastrom Bioscience社製）、また、特開２００４－３４４１２８、特開２００４－８９０９５、特開２００１－２７５６５９により開示されている培養装置等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　また、自動培養装置とフィルターとを組み合わせる場合、外気と閉鎖された系で組み合わせることが好ましく、コンタミネーションのリスクを軽減させるために完全閉鎖系で一連の工程を行えることが好ましい。
　以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例における回収液調製時の溶液混合比は、特に記載がない限り体積比を示す。
　（実施例１）１００％血清で回収
　ポリエステル製不織布（繊維径１０～２０μｍ、目付け６０ｇ／ｍ２、厚さ０．３ｍｍ平均孔径３０～４０μｍ）を内径１８ｍｍ、高さ６ｍｍ、内容積１．５３ｃｍ２のハウジング内に３３枚充填（充填密度０．３３ｇ／ｃｍ３）したカラムを作製した。
　次に、コンフルエントになるまで培養したブタ骨髄液由来間葉系幹細胞を培養中の組織培養シャーレ（IWAKI製１５０ｍｍシャーレ）からαＭＥＭ培地を除去し、生理食塩水でシャーレ内をリンスした。リンス液を除去したシャーレにTrypLE Select（GIBCO社製）を３ｍＬ加え、３７℃、１０分間静置することで、細胞を剥離した。さらに培地を６ｍL加え、遠心分離後、血球計算盤にて細胞数を測定し、２×１０６個の細胞を５０ｍＬの１０％血清入りαＭＥＭ培地に懸濁した。
　この細胞懸濁液を、先ほどのカラムに５ｍＬ／ｍｉｎ（線速８ｍｍ／ｍｉｎ）の速度で通液し、細胞を捕捉した。ここでカラムを通過した液体中に細胞は存在しなかった。
　次に、細胞培養液を通液した方向と同一方向に、生理食塩水を２．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で（線速０．８ｍｍ／ｍｉｎ）で２０ｍＬ通液し、カラムを洗浄した。ここでカラムを通過した液体中に細胞は存在しなかった。
　次に、細胞培養液を通液した方向と逆方向に１０ｍＬの１００％ウシ由来血清を３～５ｍＬ／ｓｅｃでカラム内に流すことにより、カラムに捕捉された細胞を回収した。回収された液体中の細胞濃度を血球計算盤にて測定し、以下の計算式によって細胞回収率、細胞濃縮率を算出した。
　細胞回収率、細胞濃縮率は以下の式により計算した。
細胞回収率（％）＝（回収液中の細胞濃度×回収液量）×１００／２×１０６
細胞濃縮率（倍）＝５０ｍＬ×１００／（回収液量）
この際の細胞回収率は１００％、細胞濃縮率は４．５倍であった。
　（実施例２）７５％血清で回収
　回収液として７５％ウシ由来血清１０ｍＬを使用した以外は実施例１と同様の操作を行った。回収液の調製は１００％血清と生理食塩水を１：３の比で混合して調製した。その際の細胞回収率は９０％、細胞濃縮率は４．６倍であった。
　（実施例３）５０％血清で回収
　回収液として５０％ウシ由来血清１０ｍＬを使用した以外は実施例１と同様の操作を行った。回収液の調製は１００％血清と生理食塩水（大塚製薬）を１：１の比で混合して調製した。その際の細胞回収率は８６％、細胞濃縮率は４．８倍であった。
　（実施例４）３０％血清で回収
　回収液として３０％ウシ由来血清１０ｍＬを使用した以外は実施例１と同様の操作を行った。回収液の調製は１００％血清と生理食塩水（大塚製薬）を３：７の比で混合して調製した。その際の細胞回収率は８３％、細胞濃縮率は５．０倍であった。
　（比較例１）２５％血清で回収
　回収液として２５％ウシ由来血清１０ｍＬを用いた以外は実施例１と同様の操作を行った。回収液の調製は１００％血清と生理食塩水を３：１の比で混合して調製した。の際の細胞回収率は６１％、細胞濃縮率は４．４倍であった。
　（比較例２）２０%デキストラン糖注で回収
　回収液として低分子デキストラン糖注（大塚製薬）と生理食塩水を１：４で混合した回収液１０ｍＬを用いた以外は実施例１と同様の操作を行った。その際の細胞回収率は６３％、細胞濃縮率は４．４倍であった。
　（比較例３）４%デキストラン糖注で回収
　回収液として低分子デキストラン糖注（大塚製薬）と生理食塩水を１：２４で混合した回収液１０ｍＬを用いた以外は実施例１と同様の操作を行った。その際の細胞回収率は４４％、細胞濃縮率は４．２倍であった。
　（比較例４）生理食塩水で回収
　回収液として生理食塩水（大塚製薬）を用いた以外は実施例１と同様の操作を行った。その際の細胞回収率は５１％、細胞濃縮率は４．４倍であった。
　（比較例５）アルブミン溶液で回収
　回収液としてアルブミン溶液１０ｍＬを使用した以外は実施例１と同様の操作を行った。回収液の調製は２０ｇ／ｄＬのアルブミン製剤と生理食塩水（大塚製薬）を１：４の比で混合して調製した。その際の細胞回収率は８８％、細胞濃縮率は５．０倍であった。
　（実施例５）血清をフィルター内に静置後、１００％血清で回収
　細胞の回収を下記ように行った以外は実施例１と同様の操作を行った。
　カラム内に細胞培養液を通液下方向と逆方向から３ｍＬの１００％ウシ由来血清を１．２ｍＬ／ｍｉｎの速度で通液後、１０分間静置した。最後に細胞培養液を通液した方向と逆方向に１０ｍＬの１００％ウシ由来血清を３～５ｍＬ／ｓｅｃでカラム内に流すことにより、カラムに捕捉された細胞を回収した。この際の細胞回収率は９５％、細胞濃縮率は４．０倍であった。
　以上の結果を、表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

Claims (10)

  1. 細胞をフィルターに捕捉する工程、フィルターに捕捉した細胞を３０％以上の血清を含む生理的溶液を導入して回収する工程を含む細胞濃縮・回収方法。
  2. フィルターが、ポリエステル、レーヨン、ポリプロピレン、ポリオレフィン等の少なくとも１種より選択される合成高分子よりなる請求項１記載の細胞濃縮・回収方法。
  3. フィルターが、ポリエステルおよびポリプロピレン、またはレーヨンおよびポリオレフィン、またはポリエステルおよびレーヨン等の合成高分子の組み合わせからなる請求項１記載の細胞濃縮・回収方法。
  4. フィルターが、不織布である請求項１～３のいずれかに記載の細胞濃縮・回収方法。
  5. 細胞が培養細胞である請求項１～４のいずれかに記載の細胞濃縮・回収方法。
  6. 培養細胞が、コロニー形成細胞である請求項５記載の細胞濃縮・回収方法。
  7. コロニー形成細胞が接着性細胞である請求項６記載の細胞濃縮・回収方法。
  8. 接着性細胞が間葉系幹細胞である請求項７記載の細胞濃縮・回収方法。
  9. 細胞が、酵素処理で調製したものである請求項５～８のいずれかに記載の細胞濃縮・回収方法。
  10. 請求項１～９のいずれかに記載の方法によって回収された組成物。
PCT/JP2011/001385 2010-03-11 2011-03-09 細胞濃縮・回収方法及び細胞回収液 WO2011111386A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012504334A JP5800797B2 (ja) 2010-03-11 2011-03-09 細胞濃縮・回収方法及び細胞回収液

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-054673 2010-03-11
JP2010054673 2010-03-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011111386A1 true WO2011111386A1 (ja) 2011-09-15

Family

ID=44563217

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/001385 WO2011111386A1 (ja) 2010-03-11 2011-03-09 細胞濃縮・回収方法及び細胞回収液

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP5800797B2 (ja)
WO (1) WO2011111386A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014166144A (ja) * 2013-02-28 2014-09-11 Hitachi Ltd 細胞培養装置
JP2016534363A (ja) * 2013-09-13 2016-11-04 キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッドＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ 生体流体濾過組立体
JP2018513208A (ja) * 2015-04-23 2018-05-24 ボーン セラピューティクス エス．エー． 治療用細胞のインビトロでの保存
WO2019059278A1 (ja) * 2017-09-20 2019-03-28 株式会社カネカ 生体組織からの細胞の分離回収方法
JPWO2018097198A1 (ja) * 2016-11-28 2019-10-17 株式会社バイオ未来工房 間葉系幹細胞の分離方法及びリン酸カルシウム類を含有する不織布の使用
US10533932B2 (en) 2013-09-13 2020-01-14 Cancer Research Technology Limited Apparatus and methods for liquid separation and capture of biologics

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000217887A (ja) * 1999-02-01 2000-08-08 Nissho Corp 凍結細胞から有用細胞を回収する方法およびそのための器具
JP2003304865A (ja) * 2002-04-11 2003-10-28 Asahi Kasei Corp 細胞分離方法
WO2005035737A1 (ja) * 2003-10-10 2005-04-21 Asahi Kasei Medical Co., Ltd. 細胞濃縮物の調製方法および細胞組成物
JP2007289076A (ja) * 2006-04-25 2007-11-08 Kaneka Corp 脂肪組織から幹細胞を採取するのに適した細胞分離装置、およびその方法
JP2008086235A (ja) * 2006-09-29 2008-04-17 Kaneka Corp 細胞回収方法及び細胞回収フィルター
JP2009284860A (ja) * 2008-05-30 2009-12-10 Asahi Kasei Kuraray Medical Co Ltd 単核細胞と血小板の濃縮方法
JP2011010583A (ja) * 2009-06-30 2011-01-20 Kaneka Corp 液性油成分除去方法、細胞分離方法及び細胞分離キット

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000217887A (ja) * 1999-02-01 2000-08-08 Nissho Corp 凍結細胞から有用細胞を回収する方法およびそのための器具
JP2003304865A (ja) * 2002-04-11 2003-10-28 Asahi Kasei Corp 細胞分離方法
WO2005035737A1 (ja) * 2003-10-10 2005-04-21 Asahi Kasei Medical Co., Ltd. 細胞濃縮物の調製方法および細胞組成物
JP2007289076A (ja) * 2006-04-25 2007-11-08 Kaneka Corp 脂肪組織から幹細胞を採取するのに適した細胞分離装置、およびその方法
JP2008086235A (ja) * 2006-09-29 2008-04-17 Kaneka Corp 細胞回収方法及び細胞回収フィルター
JP2009284860A (ja) * 2008-05-30 2009-12-10 Asahi Kasei Kuraray Medical Co Ltd 単核細胞と血小板の濃縮方法
JP2011010583A (ja) * 2009-06-30 2011-01-20 Kaneka Corp 液性油成分除去方法、細胞分離方法及び細胞分離キット

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014166144A (ja) * 2013-02-28 2014-09-11 Hitachi Ltd 細胞培養装置
JP2016534363A (ja) * 2013-09-13 2016-11-04 キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッドＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ 生体流体濾過組立体
US10533932B2 (en) 2013-09-13 2020-01-14 Cancer Research Technology Limited Apparatus and methods for liquid separation and capture of biologics
JP2018513208A (ja) * 2015-04-23 2018-05-24 ボーン セラピューティクス エス．エー． 治療用細胞のインビトロでの保存
JPWO2018097198A1 (ja) * 2016-11-28 2019-10-17 株式会社バイオ未来工房 間葉系幹細胞の分離方法及びリン酸カルシウム類を含有する不織布の使用
WO2019059278A1 (ja) * 2017-09-20 2019-03-28 株式会社カネカ 生体組織からの細胞の分離回収方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2011111386A1 (ja) 2013-06-27
JP5800797B2 (ja) 2015-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5821847B2 (ja) 細胞培養用ディスポセット、細胞培養装置及び細胞調製方法
JP5555278B2 (ja) 幹細胞の分離材および分離方法
EP2550357B1 (en) Cell-culture-bag
JP5259929B2 (ja) 脂肪組織から幹細胞を採取するのに適した細胞分離装置、およびその方法
JP5800797B2 (ja) 細胞濃縮・回収方法及び細胞回収液
JP5515133B2 (ja) 骨再生組成物製造器具
WO2004018615A1 (ja) フィブリン含有組成物
CN111542350B (zh) 用于制备脂肪来源干细胞的系统和方法
JP2008086235A (ja) 細胞回収方法及び細胞回収フィルター
JP5155530B2 (ja) 成体幹細胞分離・培養システム
JPWO2014034456A1 (ja) 細胞濃縮液の製造方法
WO2002101029A1 (fr) Methode de separation et de concentration cellulaires pour la regeneration renale
JP2011010581A (ja) 幹細胞分離材、幹細胞分離フィルター、及び該分離材または該分離フィルターを用いた幹細胞分離方法、幹細胞回収方法
US20020031757A1 (en) Method of regenerating a tissue
EP3271454B1 (en) System and method for providing isolated concentrated multipotent stromal cells for administration
JP6169972B2 (ja) 幹細胞分離方法
JP2009102049A (ja) 細胞含有組成物調製容器、および該細胞含有組成物調製容器を備えた細胞含有組成物製造器具
JP2006094718A (ja) 細胞懸濁液の精製方法および細胞精製デバイス
JP5923292B2 (ja) 骨髄液処理方法
JP6615577B2 (ja) 細胞分離フィルターを用いた細胞濃縮液の製造方法
JP2011010582A (ja) 成体幹細胞分離フィルター及びその分離方法
JP2003250820A (ja) 血管の再生方法、そのための細胞の分離回収方法及び装置
JP2002080377A (ja) 生体組織の再生方法
JP2002080377A5 (ja)

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11753049

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012504334

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11753049

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1