JP2000217887A - 凍結細胞から有用細胞を回収する方法およびそのための器具 - Google Patents
凍結細胞から有用細胞を回収する方法およびそのための器具Info
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- JP2000217887A JP2000217887A JP11023676A JP2367699A JP2000217887A JP 2000217887 A JP2000217887 A JP 2000217887A JP 11023676 A JP11023676 A JP 11023676A JP 2367699 A JP2367699 A JP 2367699A JP 2000217887 A JP2000217887 A JP 2000217887A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】解凍後の凍結細胞の活性を維持したまま、凍害
保護剤などを解凍有用細胞から効果的に除去し、かつ、
輸液、細胞修飾、培養などの次工程に適した浸透圧へ有
用細胞内の浸透圧を調整する方法および器具を提供す
る。 【解決手段】容器に収容した凍結細胞を解凍し、該容器
から解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルター
に注入し、該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液
を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透
圧を調整し、さらに、該フィルターに有用細胞回収液を
注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞を回収す
ることを特徴とする凍結細胞から有用細胞を回収する方
法および該方法に使用する器具。
保護剤などを解凍有用細胞から効果的に除去し、かつ、
輸液、細胞修飾、培養などの次工程に適した浸透圧へ有
用細胞内の浸透圧を調整する方法および器具を提供す
る。 【解決手段】容器に収容した凍結細胞を解凍し、該容器
から解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回収フィルター
に注入し、該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液
を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透
圧を調整し、さらに、該フィルターに有用細胞回収液を
注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞を回収す
ることを特徴とする凍結細胞から有用細胞を回収する方
法および該方法に使用する器具。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、凍結した細胞から
有用細胞（赤血球、白血球、造血幹細胞または造血前駆
細胞、卵母細胞、精子またはランゲルハンス細胞など）
を回収する方法およびそのための器具に関する。さらに
詳細には、解凍後の細胞をその活性を減少させることな
く、該細胞から凍害保護剤等の有害物質を除去し、か
つ、該細胞を含む溶液を輸液注入、細胞修飾（遺伝子導
入など）、または培養などに適した浸透圧を有する溶液
に調整する方法およびそのための器具に関する。
有用細胞（赤血球、白血球、造血幹細胞または造血前駆
細胞、卵母細胞、精子またはランゲルハンス細胞など）
を回収する方法およびそのための器具に関する。さらに
詳細には、解凍後の細胞をその活性を減少させることな
く、該細胞から凍害保護剤等の有害物質を除去し、か
つ、該細胞を含む溶液を輸液注入、細胞修飾（遺伝子導
入など）、または培養などに適した浸透圧を有する溶液
に調整する方法およびそのための器具に関する。
【０００２】
【従来の技術】赤血球、白血球、造血幹細胞または造血
前駆細胞、卵母細胞、精子またはランゲルハンス細胞な
どの有用細胞は、ヒトから採取された血液、子宮、精
液、膵臓などから回収され、輸液注入、遺伝子導入、移
植または培養などに利用される。このような有用細胞
は、通常、血液、精液、膵臓などから回収された細胞を
凍結した後、解凍し、再度、精製・回収される。凍結し
た細胞は、一般的に37〜40℃の温浴槽で急速に解凍され
る。しかし、該細胞の解凍後から移植などに至る操作に
は様々な方法が行われており、（１）凍結細胞の洗浄を
行わずに解凍後、直接、該解凍細胞を使用する方法と、
（２）解凍細胞から凍害保護剤を除去し、更に浸透圧に
よる細胞障害（dilutionshock）を緩和するために、該
解凍細胞の洗浄を行ってから、該解凍細胞を使用する方
法とに分けることができる。
前駆細胞、卵母細胞、精子またはランゲルハンス細胞な
どの有用細胞は、ヒトから採取された血液、子宮、精
液、膵臓などから回収され、輸液注入、遺伝子導入、移
植または培養などに利用される。このような有用細胞
は、通常、血液、精液、膵臓などから回収された細胞を
凍結した後、解凍し、再度、精製・回収される。凍結し
た細胞は、一般的に37〜40℃の温浴槽で急速に解凍され
る。しかし、該細胞の解凍後から移植などに至る操作に
は様々な方法が行われており、（１）凍結細胞の洗浄を
行わずに解凍後、直接、該解凍細胞を使用する方法と、
（２）解凍細胞から凍害保護剤を除去し、更に浸透圧に
よる細胞障害（dilutionshock）を緩和するために、該
解凍細胞の洗浄を行ってから、該解凍細胞を使用する方
法とに分けることができる。
【０００３】上記（２）において、解凍細胞を洗浄後、
再懸濁する方法には様々な方式が開発されており、その
目的は凍害保護剤であるジメチルスルフォキサイド（Ｄ
ＭＳＯ）、赤血球の溶血によるヘモグロビン、破壊され
た白血球などを解凍細胞の浮遊液から除き、解凍後の有
用細胞の有害物質に対する感受性を低下させることにあ
る。一般に、浸透圧による細胞障害とは、細胞膜を介し
た細胞内と細胞外に浸透圧差を生じたとき発生するもの
である。その原理とは、発生した浸透圧差により、その
浸透圧差を減少させるために、細胞内外の水を含めた物
質が移動する。ところが、細胞膜は物質によって透過速
度が異なり、凍害保護剤は水と比較すると低速度で移動
するため、急激な浸透圧差により、水のみ細胞膜移動が
起こり、細胞内体積が膨張する。この膨張により細胞膜
が破壊され、細胞は障害を受けるのである。
再懸濁する方法には様々な方式が開発されており、その
目的は凍害保護剤であるジメチルスルフォキサイド（Ｄ
ＭＳＯ）、赤血球の溶血によるヘモグロビン、破壊され
た白血球などを解凍細胞の浮遊液から除き、解凍後の有
用細胞の有害物質に対する感受性を低下させることにあ
る。一般に、浸透圧による細胞障害とは、細胞膜を介し
た細胞内と細胞外に浸透圧差を生じたとき発生するもの
である。その原理とは、発生した浸透圧差により、その
浸透圧差を減少させるために、細胞内外の水を含めた物
質が移動する。ところが、細胞膜は物質によって透過速
度が異なり、凍害保護剤は水と比較すると低速度で移動
するため、急激な浸透圧差により、水のみ細胞膜移動が
起こり、細胞内体積が膨張する。この膨張により細胞膜
が破壊され、細胞は障害を受けるのである。
【０００４】該細胞障害は、細胞膜の透過性がＤＭＳＯ
より遅いグリセロールを凍害保護剤として用いた場合に
顕著になる。また、ＤＭＳＯにおいても、有用細胞、造
血幹細胞の回収率をよくするには、緩徐な希釈でもっ
て、ＤＭＳＯを除くことがよいとされている。このた
め、ＨＢＳＳ（Hanks'balanced salt solution）液を、
徐々に解凍細胞に添加し、最終１０倍まで希釈を行う方
法（Rev.Europ. Etudes. Clin. Et Biol. 17 : 483-48
8, 1972）、または緩徐に、５倍希釈を行う方法（Cryob
iology16 : 201-210, 1979）、段階的に１０倍希釈を行
う方法（Cancer 45:3075-3085, 1980）などが行われて
いる。
より遅いグリセロールを凍害保護剤として用いた場合に
顕著になる。また、ＤＭＳＯにおいても、有用細胞、造
血幹細胞の回収率をよくするには、緩徐な希釈でもっ
て、ＤＭＳＯを除くことがよいとされている。このた
め、ＨＢＳＳ（Hanks'balanced salt solution）液を、
徐々に解凍細胞に添加し、最終１０倍まで希釈を行う方
法（Rev.Europ. Etudes. Clin. Et Biol. 17 : 483-48
8, 1972）、または緩徐に、５倍希釈を行う方法（Cryob
iology16 : 201-210, 1979）、段階的に１０倍希釈を行
う方法（Cancer 45:3075-3085, 1980）などが行われて
いる。
【０００５】このように凍結細胞の解凍後の調製法は、
まず、最初に影響のない濃度まで、緩徐に凍害保護剤を
希釈することから行われてきた。しかし、この方法では
副作用物質である凍害保護剤の全体量は変わらず、また
仮に濃度を薄くすることで、有用細胞への影響が全く無
くなるとしても、全体容量が増加するため、非常に取り
扱いに不便であった。そこで、凍害保護剤の全体量を減
少させる方法として、希釈が行われた後に、有用細胞を
ペレット化するために遠心分離を行い、上澄み液を除去
し、そして有用細胞の再懸濁からなる１回以上のサイク
ルが行われる。
まず、最初に影響のない濃度まで、緩徐に凍害保護剤を
希釈することから行われてきた。しかし、この方法では
副作用物質である凍害保護剤の全体量は変わらず、また
仮に濃度を薄くすることで、有用細胞への影響が全く無
くなるとしても、全体容量が増加するため、非常に取り
扱いに不便であった。そこで、凍害保護剤の全体量を減
少させる方法として、希釈が行われた後に、有用細胞を
ペレット化するために遠心分離を行い、上澄み液を除去
し、そして有用細胞の再懸濁からなる１回以上のサイク
ルが行われる。
【０００６】このような希釈遠心調製法として、例え
ば、室温で培地TC-199を等量、解凍細胞に添加、混合
し、遠心分離した後、上清を除去し（臨床外科39(4) :
503-515,1984）、更に、これらの希釈液に有用細胞の膜
保護の目的で、ヒト血清を加え、具体的には解凍した骨
髄細胞に５％ＡＢ型血清を含むヘパリンを加えたTC-199
の培養液を等量、できるだけ、ゆっくり、よく攪拌しな
がら添加して、凍害保護剤を希釈し、遠心分離して洗浄
した後、適当量のTC-199培養液に、有用細胞を再浮遊す
る方法が実施されている（低温医学9(1) : 30-38, 198
3）。このような方法は高価な遠心分離機を要すること
から、操作が複雑である。
ば、室温で培地TC-199を等量、解凍細胞に添加、混合
し、遠心分離した後、上清を除去し（臨床外科39(4) :
503-515,1984）、更に、これらの希釈液に有用細胞の膜
保護の目的で、ヒト血清を加え、具体的には解凍した骨
髄細胞に５％ＡＢ型血清を含むヘパリンを加えたTC-199
の培養液を等量、できるだけ、ゆっくり、よく攪拌しな
がら添加して、凍害保護剤を希釈し、遠心分離して洗浄
した後、適当量のTC-199培養液に、有用細胞を再浮遊す
る方法が実施されている（低温医学9(1) : 30-38, 198
3）。このような方法は高価な遠心分離機を要すること
から、操作が複雑である。
【０００７】また、20%ＦＣＳ（牛胎児血清）／ＲＰＭ
Ｉを解凍細胞に緩徐に添加し、２回遠心分離して洗浄す
る法が実施されている（J.Hematother. 4(1) : 29-36,
1995）。そして、等量のデキストラン４０／アルブミン
液を10分間以上、解凍細胞に緩徐に添加し、さらに遠心
分離（250G、10分間、10℃）した後、上清を除去し、デ
キストラン４０／アルブミン液で再懸濁する方法が実施
されている（Blood88(3) : 795-802, 1996）。このよう
な方法も高価な遠心分離機を要することから、操作が複
雑である。
Ｉを解凍細胞に緩徐に添加し、２回遠心分離して洗浄す
る法が実施されている（J.Hematother. 4(1) : 29-36,
1995）。そして、等量のデキストラン４０／アルブミン
液を10分間以上、解凍細胞に緩徐に添加し、さらに遠心
分離（250G、10分間、10℃）した後、上清を除去し、デ
キストラン４０／アルブミン液で再懸濁する方法が実施
されている（Blood88(3) : 795-802, 1996）。このよう
な方法も高価な遠心分離機を要することから、操作が複
雑である。
【０００８】更には、凍結保存された臍帯血の造血幹／
前駆細胞の融解法として、下記方法が公知である（米国
特許第5,005,681号明細書、特公平8-69号公報）。液体
窒素中から凍結細胞を収容した容器を取り出し、37℃温
浴中で少量の氷片が残るまで、該容器中の凍結細胞を融
解して、細胞懸濁液を得る。無菌状態で、細胞懸濁溶液
の容量が約２倍になるまで、冷却混合物、例えば50%自
己由来血清／ＲＰＭＩ−１６４０あるいは50%ＦＣＳ／
ＲＰＭＩ−１６４０培地を、滴下毎に少し攪拌しなが
ら、滴下する。この細胞懸濁物を遠心分離用チューブに
移し、冷却混合物、例えば50%血清／ＲＰＭＩ−１６４
０を滴下毎に攪拌しながら加え、その容量を約６倍にす
る。さらに、50%血清／ＲＰＭＩ希釈液を増加分ごとに
混合しながら滴下し、その容量を約１．５倍にする。次
いで遠心処理によって、該細胞をペレット化し、上澄み
液を吸引する。このペレットに対して、冷却混合物、例
えば20%自己由来血清／ＲＰＭＩ−１６４０をゆっくり
と滴下し、再懸濁する。さらに、冷却混合物、例えば20
%自己由来血清／ＲＰＭＩを滴下毎に攪拌しながら加え
る。それから、遠心処理によって細胞をペレット化し、
上澄み液を吸引する。冷却混合物、例えば２0%血清／RP
MIを用いて、再懸濁させる。このような方法は開封系で
あり、やはり高価な遠心分離機を必要とする。
前駆細胞の融解法として、下記方法が公知である（米国
特許第5,005,681号明細書、特公平8-69号公報）。液体
窒素中から凍結細胞を収容した容器を取り出し、37℃温
浴中で少量の氷片が残るまで、該容器中の凍結細胞を融
解して、細胞懸濁液を得る。無菌状態で、細胞懸濁溶液
の容量が約２倍になるまで、冷却混合物、例えば50%自
己由来血清／ＲＰＭＩ−１６４０あるいは50%ＦＣＳ／
ＲＰＭＩ−１６４０培地を、滴下毎に少し攪拌しなが
ら、滴下する。この細胞懸濁物を遠心分離用チューブに
移し、冷却混合物、例えば50%血清／ＲＰＭＩ−１６４
０を滴下毎に攪拌しながら加え、その容量を約６倍にす
る。さらに、50%血清／ＲＰＭＩ希釈液を増加分ごとに
混合しながら滴下し、その容量を約１．５倍にする。次
いで遠心処理によって、該細胞をペレット化し、上澄み
液を吸引する。このペレットに対して、冷却混合物、例
えば20%自己由来血清／ＲＰＭＩ−１６４０をゆっくり
と滴下し、再懸濁する。さらに、冷却混合物、例えば20
%自己由来血清／ＲＰＭＩを滴下毎に攪拌しながら加え
る。それから、遠心処理によって細胞をペレット化し、
上澄み液を吸引する。冷却混合物、例えば２0%血清／RP
MIを用いて、再懸濁させる。このような方法は開封系で
あり、やはり高価な遠心分離機を必要とする。
【０００９】また、臍帯血移植において良好な成績を挙
げているDuke大学のKurtzbergら（N. Engl.J. Med. 33
5(3) : 157-166, 1996）は、ニューヨーク血液センター
のRubinsteinらが示した、5%デキストラン40/2.5% ヒト
アルブミン液で、凍結臍帯血を洗浄する法を実施してい
る（Proc.Natl. Acad. Sci. USA 92 : 10119-10122,199
5）。しかし、このような方法も高価な遠心分離機を必
要とする。
げているDuke大学のKurtzbergら（N. Engl.J. Med. 33
5(3) : 157-166, 1996）は、ニューヨーク血液センター
のRubinsteinらが示した、5%デキストラン40/2.5% ヒト
アルブミン液で、凍結臍帯血を洗浄する法を実施してい
る（Proc.Natl. Acad. Sci. USA 92 : 10119-10122,199
5）。しかし、このような方法も高価な遠心分離機を必
要とする。
【００１０】更に、凍結白血球系幹細胞の調製に使用す
る器具として、無菌バッグ、凍結バッグから無菌バッグ
へ凍結白血球幹細胞を移送する手段、および調製した幹
細胞を患者へ輸液する手段から構成される器具が公知で
ある（WO98/38940）。この器具は、解凍後の白血球系幹
細胞の活性を高く維持したまま、次工程である輸液の際
に、副作用物質と考えられる凍害保護剤が減少され、輸
液に適した浸透圧に調製される。ところが、該器具の操
作が非常に複雑であり、誤操作の可能性がある。また、
操作に約３０分以上の時間を要することから、輸液後
に、白血球の凝集塊が発生し、輸液された患者には悪
寒、発熱、高血圧、徐脈、呼吸困難、胸骨圧迫感などの
副作用を引き起こすとされている。また、遠心分離機な
どの高価な装置を常備している限られた施設でのみしか
使用できないなどの問題点が挙げられる。更に、凍結用
容器（凍結バッグ）内に容器形状および表面張力のため
残留する細胞懸濁液を、それとは大きく異なる浸透圧で
ある生理食塩水を添加して回収することから、細胞障害
（dilutionshock）によるダメージを受けるものであっ
た。また、遠心分離機を用いずにフィルターを使用する
場合においても、フィルターに捕捉された白血球系幹細
胞を回収するために、分離された凍害保護剤が混合した
溶液を使用しなければならなく、副作用物質の除去能が
低下したものとなった。
る器具として、無菌バッグ、凍結バッグから無菌バッグ
へ凍結白血球幹細胞を移送する手段、および調製した幹
細胞を患者へ輸液する手段から構成される器具が公知で
ある（WO98/38940）。この器具は、解凍後の白血球系幹
細胞の活性を高く維持したまま、次工程である輸液の際
に、副作用物質と考えられる凍害保護剤が減少され、輸
液に適した浸透圧に調製される。ところが、該器具の操
作が非常に複雑であり、誤操作の可能性がある。また、
操作に約３０分以上の時間を要することから、輸液後
に、白血球の凝集塊が発生し、輸液された患者には悪
寒、発熱、高血圧、徐脈、呼吸困難、胸骨圧迫感などの
副作用を引き起こすとされている。また、遠心分離機な
どの高価な装置を常備している限られた施設でのみしか
使用できないなどの問題点が挙げられる。更に、凍結用
容器（凍結バッグ）内に容器形状および表面張力のため
残留する細胞懸濁液を、それとは大きく異なる浸透圧で
ある生理食塩水を添加して回収することから、細胞障害
（dilutionshock）によるダメージを受けるものであっ
た。また、遠心分離機を用いずにフィルターを使用する
場合においても、フィルターに捕捉された白血球系幹細
胞を回収するために、分離された凍害保護剤が混合した
溶液を使用しなければならなく、副作用物質の除去能が
低下したものとなった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、解凍後の凍
結細胞の活性を高く維持したまま、次工程（輸注、細胞
修飾、培養など）で影響のある副作用物質（凍害保護剤
など）を有用細胞から効果的に除去し、かつ、次工程に
適した浸透圧へ有用細胞内の浸透圧を調整することを、
高価な装置（遠心分離機等）を必要とせず、かつ無菌的
に短時間で容易に実施できることを課題とする。
結細胞の活性を高く維持したまま、次工程（輸注、細胞
修飾、培養など）で影響のある副作用物質（凍害保護剤
など）を有用細胞から効果的に除去し、かつ、次工程に
適した浸透圧へ有用細胞内の浸透圧を調整することを、
高価な装置（遠心分離機等）を必要とせず、かつ無菌的
に短時間で容易に実施できることを課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは種々鋭意検
討の結果、解凍後の細胞を含む溶液を有用細胞回収フィ
ルターに注入した後、該フィルターに捕捉された有用細
胞に浸透圧調整液を注入して、該有用細胞の浸透圧を調
整して、課題を解決することを見出し、本発明に到達し
た。
討の結果、解凍後の細胞を含む溶液を有用細胞回収フィ
ルターに注入した後、該フィルターに捕捉された有用細
胞に浸透圧調整液を注入して、該有用細胞の浸透圧を調
整して、課題を解決することを見出し、本発明に到達し
た。
【００１３】すなわち、本発明は（１）容器に収容した
凍結細胞を解凍し、（２）該容器から解凍した細胞を含
む溶液を有用細胞回収フィルターに注入し、（３）該有
用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注入して、該
フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整し、さ
らに、（４）該フィルターに有用細胞回収液を注入し
て、該フィルターに捕捉された有用細胞を回収すること
を特徴とする凍結細胞から有用細胞を回収する方法であ
る。
凍結細胞を解凍し、（２）該容器から解凍した細胞を含
む溶液を有用細胞回収フィルターに注入し、（３）該有
用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注入して、該
フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整し、さ
らに、（４）該フィルターに有用細胞回収液を注入し
て、該フィルターに捕捉された有用細胞を回収すること
を特徴とする凍結細胞から有用細胞を回収する方法であ
る。
【００１４】また、本発明は（１）容器に収容した凍結
細胞を解凍し、（２）該容器から解凍した細胞を含む溶
液を有用細胞回収フィルターに注入し、（３）解凍細胞
を含む溶液を排出した容器にリンス用溶液を注入して、
該容器の残留細胞を洗い流し、有用細胞回収フィルター
へ移送し、次いで、（４）該有用細胞回収フィルター
に、浸透圧調整液を注入して、該フィルターに捕捉され
た有用細胞の浸透圧を調整し、さらに、（５）該フィル
ターに有用細胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉
された有用細胞を回収することを特徴とする凍結細胞か
ら有用細胞を回収する方法である。
細胞を解凍し、（２）該容器から解凍した細胞を含む溶
液を有用細胞回収フィルターに注入し、（３）解凍細胞
を含む溶液を排出した容器にリンス用溶液を注入して、
該容器の残留細胞を洗い流し、有用細胞回収フィルター
へ移送し、次いで、（４）該有用細胞回収フィルター
に、浸透圧調整液を注入して、該フィルターに捕捉され
た有用細胞の浸透圧を調整し、さらに、（５）該フィル
ターに有用細胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉
された有用細胞を回収することを特徴とする凍結細胞か
ら有用細胞を回収する方法である。
【００１５】さらに、本発明は下記構成を有する凍結細
胞から有用細胞を回収する器具。（Ａ）少なくとも２つ
の端片を有する有用細胞回収フィルター、（Ｂ）浸透圧
調整液を収容した容器、（Ｃ）有用細胞回収液を収容し
た容器、（Ｄ）フィルターを通過した液を回収する容器
お解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸透
圧調整液を収容する容器および（Ｅ）フィルターを通過
した回収液を収容する容器である。
胞から有用細胞を回収する器具。（Ａ）少なくとも２つ
の端片を有する有用細胞回収フィルター、（Ｂ）浸透圧
調整液を収容した容器、（Ｃ）有用細胞回収液を収容し
た容器、（Ｄ）フィルターを通過した液を回収する容器
お解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸透
圧調整液を収容する容器および（Ｅ）フィルターを通過
した回収液を収容する容器である。
【００１６】
【発明の実施の態様】本発明において、凍結細胞を収容
した容器としては、凍結バッグ、血液バッグなどが例示
される。また、凍結細胞としては、ヒトから採取された
血液、体液、組織などから直接的または間接的に採取さ
れた細胞を凍結したものである。凍結条件は特に問わな
い。該凍結細胞は、凍害保護剤を含む細胞である。凍害
保護剤としては、ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳ
Ｏ）、ヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）、グリセロー
ル、プロピレングリコール、エチレングリコール、デキ
ストラン、ポリビニルピロリドンまたはアルブミンであ
り、その使用濃度は、凍結細胞に対して、適宜選択され
る。凍結細胞から回収される有用細胞としては、赤血
球、白血球、造血幹細胞または造血前駆細胞、卵母細
胞、精子またはランゲルハンス細胞などがある。これら
の有用細胞は、次の工程において、ヒトへの輸液注入、
遺伝子導入、移植または栄養培地にての培養に使用され
る。
した容器としては、凍結バッグ、血液バッグなどが例示
される。また、凍結細胞としては、ヒトから採取された
血液、体液、組織などから直接的または間接的に採取さ
れた細胞を凍結したものである。凍結条件は特に問わな
い。該凍結細胞は、凍害保護剤を含む細胞である。凍害
保護剤としては、ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳ
Ｏ）、ヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）、グリセロー
ル、プロピレングリコール、エチレングリコール、デキ
ストラン、ポリビニルピロリドンまたはアルブミンであ
り、その使用濃度は、凍結細胞に対して、適宜選択され
る。凍結細胞から回収される有用細胞としては、赤血
球、白血球、造血幹細胞または造血前駆細胞、卵母細
胞、精子またはランゲルハンス細胞などがある。これら
の有用細胞は、次の工程において、ヒトへの輸液注入、
遺伝子導入、移植または栄養培地にての培養に使用され
る。
【００１７】有用細胞回収フィルターとしては、繊維性
集合体または多孔性物質などが例示される。繊維性集合
体としては、天然繊維または合成繊維から作製された不
織布、織布、粉状体またはこれらの積層体などがあり、
繊維直径は例えば、１．０〜２５．０μｍ、嵩密度は
０．０５〜０．５０g/cm3である。多孔性物質として
は、天然物質または合成物質から製造された微粒子、膜
状体、フィルム、シートまたはこれらの積層体などが例
示される。多孔性物質の空孔率は、３０〜９５％であ
る。これらのフィルターは種々の嵩密度または空孔率は
その変更が可能である。
集合体または多孔性物質などが例示される。繊維性集合
体としては、天然繊維または合成繊維から作製された不
織布、織布、粉状体またはこれらの積層体などがあり、
繊維直径は例えば、１．０〜２５．０μｍ、嵩密度は
０．０５〜０．５０g/cm3である。多孔性物質として
は、天然物質または合成物質から製造された微粒子、膜
状体、フィルム、シートまたはこれらの積層体などが例
示される。多孔性物質の空孔率は、３０〜９５％であ
る。これらのフィルターは種々の嵩密度または空孔率は
その変更が可能である。
【００１８】浸透圧調整液とは、捕捉された解凍細胞の
浸透圧を目標の浸透圧に調整する溶液であり、具体的に
は、５％デキストラン４０、２．５％アルブミンおよび
生理食塩水を含む。該調整液は、解凍細胞に含まれる凍
害保護剤より低濃度の凍害保護剤を含む溶液であること
が好ましい。浸透圧調整液は、凍結容器内の残液を回収
するためのリンス用溶液およびエアを含み、フィルター
に捕捉された細胞の浸透圧を調整するための溶液であっ
てもよい。リンス用溶液は、毒性のない無菌のエアを含
む溶液であることが好ましい。リンス用溶液は、解凍し
た細胞を含む溶液に含まれる凍害保護剤と実質的に同一
濃度である凍害保護剤を含む溶液であることが好まし
い。エアは、具体的には凍結バッグ容積と同一容積のも
のであり、大気中の空気組成のものである。
浸透圧を目標の浸透圧に調整する溶液であり、具体的に
は、５％デキストラン４０、２．５％アルブミンおよび
生理食塩水を含む。該調整液は、解凍細胞に含まれる凍
害保護剤より低濃度の凍害保護剤を含む溶液であること
が好ましい。浸透圧調整液は、凍結容器内の残液を回収
するためのリンス用溶液およびエアを含み、フィルター
に捕捉された細胞の浸透圧を調整するための溶液であっ
てもよい。リンス用溶液は、毒性のない無菌のエアを含
む溶液であることが好ましい。リンス用溶液は、解凍し
た細胞を含む溶液に含まれる凍害保護剤と実質的に同一
濃度である凍害保護剤を含む溶液であることが好まし
い。エアは、具体的には凍結バッグ容積と同一容積のも
のであり、大気中の空気組成のものである。
【００１９】有用細胞回収液としては、デキストラン、
ヒドロキシエチルまたはアルブミンなどを含む溶液があ
る。
ヒドロキシエチルまたはアルブミンなどを含む溶液があ
る。
【００２０】本発明は、下記工程を有する。 （１）容器に収容した凍結細胞を解凍する。例えば、凍
結バッグに収容された10%ＤＭＳＯで凍害保護された凍
結臍帯血を３７℃で急速解凍する。 （２）該容器から解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回
収フィルターに注入する。具体的には、凍結バッグに当
該器具の接続手段を用いて接続し、重力差で有用細胞回
収フィルターに注入する。 （３）該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注
入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を
調整する。具体的にはフィルターに例えば、5%デキスト
ラン40／25%アルブミン／生理食塩水を添加する。 （４）該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フ
ィルターに捕捉された有用細胞を回収する。例えば、５
％デキストラン溶液にて、逆洗浄、もしくはフィルター
嵩密度を変更することにより回収する。
結バッグに収容された10%ＤＭＳＯで凍害保護された凍
結臍帯血を３７℃で急速解凍する。 （２）該容器から解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回
収フィルターに注入する。具体的には、凍結バッグに当
該器具の接続手段を用いて接続し、重力差で有用細胞回
収フィルターに注入する。 （３）該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注
入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を
調整する。具体的にはフィルターに例えば、5%デキスト
ラン40／25%アルブミン／生理食塩水を添加する。 （４）該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フ
ィルターに捕捉された有用細胞を回収する。例えば、５
％デキストラン溶液にて、逆洗浄、もしくはフィルター
嵩密度を変更することにより回収する。
【００２１】本発明は、また下記工程を有する。 （１）容器に収容した凍結細胞を解凍する。 （２）該容器から解凍した細胞を含む溶液を有用細胞回
収フィルターに注入する。 （３）解凍細胞を含む溶液を排出した容器にリンス用溶
液を注入して、該容器の残留細胞を洗い流し、有用細胞
回収フィルターへ移送する。例えば、10%ＤＭＳＯ／生
理食塩水を注入し、残留細胞を洗い出す。 （４）該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注
入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を
調整する。 （５）該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フ
ィルターに捕捉された有用細胞を回収することを特徴と
する凍結細胞から有用細胞を回収する。
収フィルターに注入する。 （３）解凍細胞を含む溶液を排出した容器にリンス用溶
液を注入して、該容器の残留細胞を洗い流し、有用細胞
回収フィルターへ移送する。例えば、10%ＤＭＳＯ／生
理食塩水を注入し、残留細胞を洗い出す。 （４）該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液を注
入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を
調整する。 （５）該フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フ
ィルターに捕捉された有用細胞を回収することを特徴と
する凍結細胞から有用細胞を回収する。
【００２２】有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整液
を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透
圧を調整する工程において、浸透圧調整液が、凍害保護
されていた有用細胞の浸透圧を最終目標とする有用細胞
の浸透圧へ段階的に変化させることが好ましい。このよ
うな浸透圧を段階的に変化させるには、例えば、10%Ｄ
ＭＳＯで凍害保護されている場合、まず、第一に５％Ｄ
ＭＳＯをフィルターに注入し、次いで、ＤＭＳＯを含ま
ない溶液（０％ＤＭＳＯ溶液）を注入すると可能であ
る。あるいはフィルターに対して、上流位置に０％ＤＭ
ＳＯ溶液を入れた容器、下流位置に10%ＤＭＳＯ溶液を
含む硬質容器を直列に配置する。そして、０％ＤＭＳＯ
溶液を下流位置の10%ＤＭＳＯ溶液容器から注入する
と、０％ＤＭＳＯが注入された等量が、10%ＤＭＳＯ溶
液容器からフィルターに流入する。10%ＤＭＳＯ溶液容
器内は、次第にＤＭＳＯ濃度が低下していき、徐々に低
濃度のＤＭＳＯ溶液がフィルターへ流入することによ
り、段階的に浸透圧を変化させることが可能である。ま
たは０％ＤＭＳＯ溶液を含む溶液と10%ＤＭＳＯ溶液を
含む容器を並列に配置することも可能である。10%ＤＭ
ＳＯ溶液容器を上部に０％ＤＭＳＯ溶液容器を下部に配
置し、ともに開栓することで自重差により、徐々にＤＭ
ＳＯ濃度が低濃度のものがフィルターへ供給され、段階
的に浸透圧を変化させることが可能である。
を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透
圧を調整する工程において、浸透圧調整液が、凍害保護
されていた有用細胞の浸透圧を最終目標とする有用細胞
の浸透圧へ段階的に変化させることが好ましい。このよ
うな浸透圧を段階的に変化させるには、例えば、10%Ｄ
ＭＳＯで凍害保護されている場合、まず、第一に５％Ｄ
ＭＳＯをフィルターに注入し、次いで、ＤＭＳＯを含ま
ない溶液（０％ＤＭＳＯ溶液）を注入すると可能であ
る。あるいはフィルターに対して、上流位置に０％ＤＭ
ＳＯ溶液を入れた容器、下流位置に10%ＤＭＳＯ溶液を
含む硬質容器を直列に配置する。そして、０％ＤＭＳＯ
溶液を下流位置の10%ＤＭＳＯ溶液容器から注入する
と、０％ＤＭＳＯが注入された等量が、10%ＤＭＳＯ溶
液容器からフィルターに流入する。10%ＤＭＳＯ溶液容
器内は、次第にＤＭＳＯ濃度が低下していき、徐々に低
濃度のＤＭＳＯ溶液がフィルターへ流入することによ
り、段階的に浸透圧を変化させることが可能である。ま
たは０％ＤＭＳＯ溶液を含む溶液と10%ＤＭＳＯ溶液を
含む容器を並列に配置することも可能である。10%ＤＭ
ＳＯ溶液容器を上部に０％ＤＭＳＯ溶液容器を下部に配
置し、ともに開栓することで自重差により、徐々にＤＭ
ＳＯ濃度が低濃度のものがフィルターへ供給され、段階
的に浸透圧を変化させることが可能である。
【００２３】本発明の凍結細胞から有用細胞を回収する
器具は、下記構成を有する。 （Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィ
ルター、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器、（Ｃ）有
用細胞回収液を収容した容器、（Ｄ）フィルターを通過
した解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸
透圧調整液を収容する容器および（Ｅ）フィルターを通
過した回収液を収容する容器。
器具は、下記構成を有する。 （Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィ
ルター、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器、（Ｃ）有
用細胞回収液を収容した容器、（Ｄ）フィルターを通過
した解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸
透圧調整液を収容する容器および（Ｅ）フィルターを通
過した回収液を収容する容器。
【００２４】（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用
細胞回収フィルターは、凍結細胞を収容した容器に接続
する。また、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用
細胞回収フィルターは、フィルター密度が変更可能であ
ることが好ましい。フィルター密度を変更可能な状態と
するには、フィルターの嵩密度を変化させるか、フィル
ターの空孔率を変化させる方法などがある。
細胞回収フィルターは、凍結細胞を収容した容器に接続
する。また、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用
細胞回収フィルターは、フィルター密度が変更可能であ
ることが好ましい。フィルター密度を変更可能な状態と
するには、フィルターの嵩密度を変化させるか、フィル
ターの空孔率を変化させる方法などがある。
【００２５】本発明の器具の一例は、（Ａ）少なくとも
２つの端片を有する有用細胞回収フィルターの一方の端
片に、凍結細胞を収容した容器、（Ｂ）浸透圧調整液を
収容した容器および（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容
器が連結し、他方の端片に、（Ｄ）フィルターを通過し
た解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸透
圧調整液を収容する容器および（Ｅ）フィルターを通過
した回収液を収容する容器が連結する。また、本発明の
別な例は、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細
胞回収フィルターの一方の端片に、凍結細胞を収容した
容器、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器および（Ｅ）
フィルターを通過した回収液を収容する容器が連結し、
他方の端片に、（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を
含む溶液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収
容する容器および（Ｃ）有用成分回収液を収容した容器
が連結する。
２つの端片を有する有用細胞回収フィルターの一方の端
片に、凍結細胞を収容した容器、（Ｂ）浸透圧調整液を
収容した容器および（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容
器が連結し、他方の端片に、（Ｄ）フィルターを通過し
た解凍細胞を含む溶液およびフィルターを通過した浸透
圧調整液を収容する容器および（Ｅ）フィルターを通過
した回収液を収容する容器が連結する。また、本発明の
別な例は、（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細
胞回収フィルターの一方の端片に、凍結細胞を収容した
容器、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器および（Ｅ）
フィルターを通過した回収液を収容する容器が連結し、
他方の端片に、（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を
含む溶液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収
容する容器および（Ｃ）有用成分回収液を収容した容器
が連結する。
【００２６】本発明の器具は、さらに、（Ａ）少なくと
も２つの端片を有する有用細胞回収フィルターと（Ｂ）
浸透圧調整液を収容した容器を結合する手段、（Ａ）少
なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターと
（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容器を連結する手段、
（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィ
ルターと（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を含む溶
液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収容する
容器を連結する手段および（Ａ）少なくとも２つの端片
を有する有用細胞回収フィルターと（Ｅ）フィルターを
通過した回収液を収容する容器を連結する手段を含む。
も２つの端片を有する有用細胞回収フィルターと（Ｂ）
浸透圧調整液を収容した容器を結合する手段、（Ａ）少
なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターと
（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容器を連結する手段、
（Ａ）少なくとも２つの端片を有する有用細胞回収フィ
ルターと（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を含む溶
液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収容する
容器を連結する手段および（Ａ）少なくとも２つの端片
を有する有用細胞回収フィルターと（Ｅ）フィルターを
通過した回収液を収容する容器を連結する手段を含む。
【００２７】本発明では、（Ｂ）浸透圧調整液を収容し
た容器と（Ｅ）フィルターを通過した回収液を収容する
容器が、同一容器であることが好ましい。
た容器と（Ｅ）フィルターを通過した回収液を収容する
容器が、同一容器であることが好ましい。
【００２８】本発明では、（Ｂ）浸透圧調整液を収容し
た容器が、異なる浸透圧を保持する調整液を含む複数の
容器であってもよい。浸透圧調整液は凍結容器内の残液
を回収するためのリンス用溶液およびエアを含み、フィ
ルターに捕捉された細胞の浸透圧を調整するための溶液
であってもよい。
た容器が、異なる浸透圧を保持する調整液を含む複数の
容器であってもよい。浸透圧調整液は凍結容器内の残液
を回収するためのリンス用溶液およびエアを含み、フィ
ルターに捕捉された細胞の浸透圧を調整するための溶液
であってもよい。
【００２９】本発明の器具は、解凍された凍結細胞から
凍害保護剤などの副作用物質を除去し、かつ細胞内の浸
透圧調製を行う器具であって、その一例は、 凍結用容器（凍結バッグ）から、無菌的に凍結細胞を
取り出すために、凍結用容器（凍結バッグ）に接続する
ためのコネクター（連結手段） 凍害保護剤等の副作用物質を通過させ、かつ目的の
細胞を補足するフィルター（有用細胞回収フィルター、
Ａ） 上記フィルターで補足されない溶液を収納するため
の容器（フィルターを通過した回収液を収容する容器、
Ｄ） 凍結容器（凍結バッグ）内の残液を回収するための
リンス溶液およびエアを含む容器 フィルターに補足された細胞の浸透圧を調整するた
めの調整液を含む容器（浸透圧調整液を収容した容器、
Ｂ） フィルターに補足された細胞をフィルターから脱離
させるための溶液を含む容器（有用細胞回収液を収容し
た容器、Ｃ） フィルターから脱離した細胞を含む溶液を収納し、
外部（輸液セット、輸血セット、培養バッグなど）に接
続するための接続部を有する容器（Ｅ）、該容器はフィ
ルターを通過した浸透圧調整液を回収する容器（Ｂ）を
兼用してもよい。 各容器、フィルターを無菌的に接続するチューブ
（連結手段） 選択的に溶液を各容器、フィルター間へ移送するた
めの手段（移送手段）からなる。
凍害保護剤などの副作用物質を除去し、かつ細胞内の浸
透圧調製を行う器具であって、その一例は、 凍結用容器（凍結バッグ）から、無菌的に凍結細胞を
取り出すために、凍結用容器（凍結バッグ）に接続する
ためのコネクター（連結手段） 凍害保護剤等の副作用物質を通過させ、かつ目的の
細胞を補足するフィルター（有用細胞回収フィルター、
Ａ） 上記フィルターで補足されない溶液を収納するため
の容器（フィルターを通過した回収液を収容する容器、
Ｄ） 凍結容器（凍結バッグ）内の残液を回収するための
リンス溶液およびエアを含む容器 フィルターに補足された細胞の浸透圧を調整するた
めの調整液を含む容器（浸透圧調整液を収容した容器、
Ｂ） フィルターに補足された細胞をフィルターから脱離
させるための溶液を含む容器（有用細胞回収液を収容し
た容器、Ｃ） フィルターから脱離した細胞を含む溶液を収納し、
外部（輸液セット、輸血セット、培養バッグなど）に接
続するための接続部を有する容器（Ｅ）、該容器はフィ
ルターを通過した浸透圧調整液を回収する容器（Ｂ）を
兼用してもよい。 各容器、フィルターを無菌的に接続するチューブ
（連結手段） 選択的に溶液を各容器、フィルター間へ移送するた
めの手段（移送手段）からなる。
【００３０】本発明の器具の一例を、図１により詳細に
説明する。図１中、１は接続コネクター、２はフィルタ
ー、３は廃液回収容器、４はリンス溶液およびエア収容
容器、５は浸透圧調整液用容器、６は回収溶液収容容
器、７はフィルターから解離した細胞を回収する溶液を
回収する回収容器、８は凍結容器（凍結バッグ）を示
す。
説明する。図１中、１は接続コネクター、２はフィルタ
ー、３は廃液回収容器、４はリンス溶液およびエア収容
容器、５は浸透圧調整液用容器、６は回収溶液収容容
器、７はフィルターから解離した細胞を回収する溶液を
回収する回収容器、８は凍結容器（凍結バッグ）を示
す。
【００３１】解凍された凍結細胞を収容した凍結バッグ
８に、接続コネクター１を接続して、該解凍細胞を含む
懸濁液をフィルター２へ通過させる。解凍細胞はフィル
ター２に捕捉され、凍害保護剤を含む溶液は廃液回収容
器３に流れ込む。次に、凍結容器（凍結バッグ）内に残
存している細胞懸濁液をフィルター２へ通過させるため
に、リンス溶液およびエア収容容器４からエアを凍結容
器（凍結バッグ）内に注入することにより、凍結容器
（凍結バッグ）内の細胞懸濁液の大部分は、フィルター
２へ流出する。凍結容器の形状や表面張力により残存し
ている解凍細胞を回収するために、必要により、凍害保
護時と同等の組成を有するリンス溶液を、リンス溶液お
よびエア収容容器４から凍結容器（凍結バッグ）に添加
し、凍結容器（凍結バッグ）内の細胞懸濁液をフィルタ
ー２へ流入させる。フィルター２に捕捉されないリンス
溶液は廃液回収容器３に流れ込む。フィルター２に捕捉
された細胞は、細胞内の浸透圧が依然、凍害保護時と同
等であるため、細胞障害を起因させないように、浸透圧
調整液を含む浸透圧調整液用容器５よりフィルター２へ
段階的に、浸透圧を目標値に近くする調整液を流入させ
る。フィルター２内での該調整液と細胞との接触の間
に、細胞は目標とする浸透圧へ細胞障害を起こすことな
く調整される。そして、浸透圧が調整された細胞をフィ
ルター２から有用細胞を解離して、回収するために、回
収用溶液を含む回収溶液収容容器６からフィルター２に
対して回収用溶液を流入する。フィルターから解離した
細胞を回収する溶液を回収する回収容器７へ該回収液を
回収する。該回収液から常法に従い、有用細胞を単離す
る。単離、回収された細胞は、輸液注入、遺伝子導入、
移植ななどに使用される。
８に、接続コネクター１を接続して、該解凍細胞を含む
懸濁液をフィルター２へ通過させる。解凍細胞はフィル
ター２に捕捉され、凍害保護剤を含む溶液は廃液回収容
器３に流れ込む。次に、凍結容器（凍結バッグ）内に残
存している細胞懸濁液をフィルター２へ通過させるため
に、リンス溶液およびエア収容容器４からエアを凍結容
器（凍結バッグ）内に注入することにより、凍結容器
（凍結バッグ）内の細胞懸濁液の大部分は、フィルター
２へ流出する。凍結容器の形状や表面張力により残存し
ている解凍細胞を回収するために、必要により、凍害保
護時と同等の組成を有するリンス溶液を、リンス溶液お
よびエア収容容器４から凍結容器（凍結バッグ）に添加
し、凍結容器（凍結バッグ）内の細胞懸濁液をフィルタ
ー２へ流入させる。フィルター２に捕捉されないリンス
溶液は廃液回収容器３に流れ込む。フィルター２に捕捉
された細胞は、細胞内の浸透圧が依然、凍害保護時と同
等であるため、細胞障害を起因させないように、浸透圧
調整液を含む浸透圧調整液用容器５よりフィルター２へ
段階的に、浸透圧を目標値に近くする調整液を流入させ
る。フィルター２内での該調整液と細胞との接触の間
に、細胞は目標とする浸透圧へ細胞障害を起こすことな
く調整される。そして、浸透圧が調整された細胞をフィ
ルター２から有用細胞を解離して、回収するために、回
収用溶液を含む回収溶液収容容器６からフィルター２に
対して回収用溶液を流入する。フィルターから解離した
細胞を回収する溶液を回収する回収容器７へ該回収液を
回収する。該回収液から常法に従い、有用細胞を単離す
る。単離、回収された細胞は、輸液注入、遺伝子導入、
移植ななどに使用される。
【００３２】
【実施例】実施例を用いて、本発明を詳細に説明する。実施例１ ヒト臍帯から採取した臍帯血２０ｍｌに凍害保護剤、５
０％ＤＭＳＯ５ｍｌを添加して、凍結バッグ中に注入
し、暖速凍結し、液体窒素中で、１ケ月間凍結した。該
凍結バッグを３７℃温水浴中に、２分間保持して解凍し
た。次いで、図１に示される器具の有用成分回収フィル
ターの一方の端片に該凍結バッグを連結した。該端片に
は、浸透圧調整液を収容した容器および有用細胞回収液
を収容した容器が連結され、他方の端片に、フィルター
を通過した解凍細胞を含む溶液を収容する廃液容器、フ
ィルターを通過した浸透圧調整液を回収する容器および
フィルターを通過した回収液を収容する容器が連結され
ている。
０％ＤＭＳＯ５ｍｌを添加して、凍結バッグ中に注入
し、暖速凍結し、液体窒素中で、１ケ月間凍結した。該
凍結バッグを３７℃温水浴中に、２分間保持して解凍し
た。次いで、図１に示される器具の有用成分回収フィル
ターの一方の端片に該凍結バッグを連結した。該端片に
は、浸透圧調整液を収容した容器および有用細胞回収液
を収容した容器が連結され、他方の端片に、フィルター
を通過した解凍細胞を含む溶液を収容する廃液容器、フ
ィルターを通過した浸透圧調整液を回収する容器および
フィルターを通過した回収液を収容する容器が連結され
ている。
【００３３】該凍結バッグから解凍した細胞を含む溶液
を有用細胞回収フィルターに注入した。該フィルターは
繊維直径３．５μｍのポリエステル繊維からなる嵩密度
０．１１g/cm3である不織布６枚および繊維直径１．５
μｍのポリエステル繊維からなる嵩密度０．１５g/cm3
である不織布１４枚からなる積層体である。解凍した細
胞を含む溶液は、嵩密度０．１５g/cm3の不織布側から
注入され、嵩密度０．１１g/cm3の不織布側から流出し
た。次いで、該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整
液２００ｍｌを注入して、該フィルターに捕捉された有
用細胞の浸透圧を調整した。浸透圧調整液は５％デキス
トラン４０、２．５％アルブミンおよび生理食塩水を含
む。凍結時の10%ＤＭＳＯの浸透圧は約２８００mOsM/kg
・H2Oであり、該調整液にて浸透圧を約３００mOsM/kg・
H2Oに調整した。
を有用細胞回収フィルターに注入した。該フィルターは
繊維直径３．５μｍのポリエステル繊維からなる嵩密度
０．１１g/cm3である不織布６枚および繊維直径１．５
μｍのポリエステル繊維からなる嵩密度０．１５g/cm3
である不織布１４枚からなる積層体である。解凍した細
胞を含む溶液は、嵩密度０．１５g/cm3の不織布側から
注入され、嵩密度０．１１g/cm3の不織布側から流出し
た。次いで、該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整
液２００ｍｌを注入して、該フィルターに捕捉された有
用細胞の浸透圧を調整した。浸透圧調整液は５％デキス
トラン４０、２．５％アルブミンおよび生理食塩水を含
む。凍結時の10%ＤＭＳＯの浸透圧は約２８００mOsM/kg
・H2Oであり、該調整液にて浸透圧を約３００mOsM/kg・
H2Oに調整した。
【００３４】次いで、該フィルターに有用細胞回収液を
注入して、該フィルターに捕捉された白血球を回収し
た。有用細胞回収液は５％デキストラン４０を含む。回
収液から造血前駆細胞を単離するには、嵩密度を半分に
した。得られた造血前駆細胞の回収率は、メチルセルロ
ースによるコロニー形成細胞の計測により、８０％であ
った。操作時間は１２分間であった。
注入して、該フィルターに捕捉された白血球を回収し
た。有用細胞回収液は５％デキストラン４０を含む。回
収液から造血前駆細胞を単離するには、嵩密度を半分に
した。得られた造血前駆細胞の回収率は、メチルセルロ
ースによるコロニー形成細胞の計測により、８０％であ
った。操作時間は１２分間であった。
【００３５】実施例２ ヒト臍帯から採取した臍帯血２０ｍｌに凍害保護剤、50
%ＤＭＳＯ５ｍｌを添加して、凍結バッグ中に注入し、
暖速凍結し、液体窒素中で、１ケ月間凍結した。該凍結
バッグを３７℃浴中に、２分間保持して解凍した。次い
で、図１に示される器具の有用細胞回収フィルターの一
方の端片に該凍結バッグを連結した。該端片には、浸透
圧調整液を収容した容器および有用細胞回収液を収容し
た容器が連結され、他方の端片に、フィルターを通過し
た解凍細胞を含む溶液を収容する廃液容器、フィルター
を通過した浸透圧調整液を回収する容器およびフィルタ
ーを通過した回収液を収容する容器が連結されている。
%ＤＭＳＯ５ｍｌを添加して、凍結バッグ中に注入し、
暖速凍結し、液体窒素中で、１ケ月間凍結した。該凍結
バッグを３７℃浴中に、２分間保持して解凍した。次い
で、図１に示される器具の有用細胞回収フィルターの一
方の端片に該凍結バッグを連結した。該端片には、浸透
圧調整液を収容した容器および有用細胞回収液を収容し
た容器が連結され、他方の端片に、フィルターを通過し
た解凍細胞を含む溶液を収容する廃液容器、フィルター
を通過した浸透圧調整液を回収する容器およびフィルタ
ーを通過した回収液を収容する容器が連結されている。
【００３６】該凍結バッグから解凍した細胞を含む溶液
を有用細胞回収フィルターに注入した。該フィルターは
繊維直径３．５μｍのポリエステル繊維からなる嵩密度
０．１１g/cm3である不織布６枚および繊維直径１．５
μｍのポリエステル繊維からなる嵩密度０．１５g/cm3
である不織布１４枚からなる積層体である。解凍した細
胞を含む溶液は、嵩密度０．１５g/cm3の不織布側から
注入され、嵩密度０．１１g/cm3の不織布側から流出し
た。次いで、解凍細胞を含む溶液を排出した凍結バッグ
にリンス用溶液を注入して、該バッグの残留細胞を洗い
流し、有用細胞回収フィルターへ移送した。該有用細胞
回収フィルターに、浸透圧調整液２００ｍｌを注入し
て、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整
した。凍結時の浸透圧は約２８００mOsM/kg・H2Oであ
り、該調整液にて調製ｓたい浸透圧は約３００mOsM/kg
・H2O であった。さらに、該フィルターに有用細胞回
収液を注入して、該フィルターに捕捉された造血前駆細
胞を回収した。リンス用溶液は10%ＤＭＳＯ／2.5%デキ
ストラン40／生理食塩水を含む。有用細胞回収液は５％
デキストラン40を含む。得られた有用細胞回収液から造
血前駆細胞を常法に従い、単離した。得られた造血前駆
細胞の回収率は８５％であった。操作時間は１５分間で
あった。
を有用細胞回収フィルターに注入した。該フィルターは
繊維直径３．５μｍのポリエステル繊維からなる嵩密度
０．１１g/cm3である不織布６枚および繊維直径１．５
μｍのポリエステル繊維からなる嵩密度０．１５g/cm3
である不織布１４枚からなる積層体である。解凍した細
胞を含む溶液は、嵩密度０．１５g/cm3の不織布側から
注入され、嵩密度０．１１g/cm3の不織布側から流出し
た。次いで、解凍細胞を含む溶液を排出した凍結バッグ
にリンス用溶液を注入して、該バッグの残留細胞を洗い
流し、有用細胞回収フィルターへ移送した。該有用細胞
回収フィルターに、浸透圧調整液２００ｍｌを注入し
て、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸透圧を調整
した。凍結時の浸透圧は約２８００mOsM/kg・H2Oであ
り、該調整液にて調製ｓたい浸透圧は約３００mOsM/kg
・H2O であった。さらに、該フィルターに有用細胞回
収液を注入して、該フィルターに捕捉された造血前駆細
胞を回収した。リンス用溶液は10%ＤＭＳＯ／2.5%デキ
ストラン40／生理食塩水を含む。有用細胞回収液は５％
デキストラン40を含む。得られた有用細胞回収液から造
血前駆細胞を常法に従い、単離した。得られた造血前駆
細胞の回収率は８５％であった。操作時間は１５分間で
あった。
【００３７】比較例１ 実施例１において、有用細胞回収フィルターに浸透圧調
整液２００ｍｌを注入して、該フィルターに捕捉された
有用細胞の浸透圧を調整する操作を実施することなく、
実施例１と同様にして、臍帯血から造血前駆細胞を単離
した。単離された造血前駆細胞の回収率は４０％であっ
た。
整液２００ｍｌを注入して、該フィルターに捕捉された
有用細胞の浸透圧を調整する操作を実施することなく、
実施例１と同様にして、臍帯血から造血前駆細胞を単離
した。単離された造血前駆細胞の回収率は４０％であっ
た。
【００３８】
【発明の効果】本発明によれば、解凍後の凍結細胞の活
性を高く維持したまま、次工程（輸注、細胞修飾、培養
など）で影響のある副作用物質（凍害保護剤など）を効
果的に除去し、かつ、次工程に適した浸透圧へ調製する
ことを、高価な装置（遠心分離機等）を必要とせず、か
つ無菌的に短時間で容易に実施できる。
性を高く維持したまま、次工程（輸注、細胞修飾、培養
など）で影響のある副作用物質（凍害保護剤など）を効
果的に除去し、かつ、次工程に適した浸透圧へ調製する
ことを、高価な装置（遠心分離機等）を必要とせず、か
つ無菌的に短時間で容易に実施できる。
【図１】本発明の器具の一例を示す図である。
１ 接続コネクター ２ フィルター ３ 廃液回収容器 ４ リンス溶液およびエア収容容器 ５ 浸透圧調整液用容器 ６ 回収溶液収容容器 ７ 回収容器 ８ 凍結バッグ
Claims (16)
- 【請求項１】 （１）容器に収容した凍結細胞を解凍
し、（２）該容器から解凍した細胞を含む溶液を有用細
胞回収フィルターに注入し、（３）該有用細胞回収フィ
ルターに、浸透圧調整液を注入して、該フィルターに捕
捉された有用細胞の浸透圧を調整し、さらに、（４）該
フィルターに有用細胞回収液を注入して、該フィルター
に捕捉された有用細胞を回収することを特徴とする凍結
細胞から有用細胞を回収する方法。 - 【請求項２】 （１）容器に収容した凍結細胞を解凍
し、（２）該容器から解凍した細胞を含む溶液を有用細
胞回収フィルターに注入し、（３）解凍細胞を含む溶液
を排出した容器にリンス用溶液を注入して、該容器の残
留細胞を洗い流し、有用細胞回収フィルターへ移送し、
次いで、（４）該有用細胞回収フィルターに、浸透圧調
整液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の
浸透圧を調整し、さらに、（５）該フィルターに有用細
胞回収液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細
胞を回収することを特徴とする凍結細胞から有用細胞を
回収する方法。 - 【請求項３】 凍結細胞が、凍害保護剤を含む細胞であ
る請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 有用細胞が、赤血球、白血球、造血幹細
胞または造血前駆細胞、卵母細胞、精子またはランゲル
ハンス細胞である請求項１または２記載の方法。 - 【請求項５】 浸透圧調整液が、凍結細胞に含まれる凍
害保護剤より低濃度の凍害保護剤を含む溶液である請求
項１または２記載の方法。 - 【請求項６】 浸透圧調整液が、凍結容器内の残液を回
収するためのリンス用溶液およびエアを含み、フィルタ
ーに捕捉された細胞の浸透圧を調整するための溶液であ
る請求項１または２記載の方法。 - 【請求項７】 有用細胞回収フィルターに、浸透圧調整
液を注入して、該フィルターに捕捉された有用細胞の浸
透圧を調整する工程において、浸透圧調整液が、凍害保
護されていた有用細胞の浸透圧を、最終目標とする有用
細胞の浸透圧へ段階的に変化させる請求項１または２記
載の方法。 - 【請求項８】 リンス用溶液が、解凍した細胞を含む溶
液に含まれる凍害保護剤と実質的に同一濃度である凍害
保護剤を含む溶液である請求項２記載の方法。 - 【請求項９】 下記構成を有する凍結細胞から有用細胞
を回収する器具。（Ａ）少なくとも２つの端片を有する
有用細胞回収フィルター、（Ｂ）浸透圧調整液を収容し
た容器、（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容器、（Ｄ）
フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液およびフィル
ターを通過した浸透圧調整液を収容する容器および
（Ｅ）フィルターを通過した回収液および有用細胞を収
容する容器。 - 【請求項１０】 （Ａ）少なくとも２つの端片を有する
有用細胞回収フィルターは、凍結細胞を収容した容器に
接続する請求項９記載の器具。 - 【請求項１１】 （Ａ）少なくとも２つの端片を有する
有用細胞回収フィルターは、フィルター密度が変更可能
である請求項９記載の器具。 - 【請求項１２】 （Ａ）少なくとも２つの端片を有する
有用細胞回収フィルターの一方の端片に、凍結細胞を収
容した容器、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器および
（Ｃ）有用細胞回収液を収容した容器が連結し、他方の
端片に、（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を含む溶
液およびフィルターを通過した浸透圧調整液を収容する
容器および（Ｅ）フィルターを通過した回収液および有
用細胞を収容する容器が連結された請求項９記載の器
具。 - 【請求項１３】 （Ａ）少なくとも２つの端片を有する
有用細胞回収フィルターの一方の端片に、凍結細胞を収
容した容器、（Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器および
（Ｅ）フィルターを通過した回収液および有用細胞を収
容する容器が連結し、他方の端片に、（Ｄ）フィルター
を通過した解凍細胞およびフィルターを通過した浸透圧
調整液を収容する容器および（Ｃ）有用成分回収液を収
容した容器が連結された請求項９記載の器具。 - 【請求項１４】 さらに、（Ａ）少なくとも２つの端片
を有する有用細胞回収フィルターと（Ｂ）浸透圧調整液
を収容した容器を結合する手段、（Ａ）少なくとも２つ
の端片を有する有用細胞回収フィルターと（Ｃ）有用細
胞回収液を収容した容器を連結する手段、（Ａ）少なく
とも２つの端片を有する有用細胞回収フィルターと
（Ｄ）フィルターを通過した解凍細胞を含む溶液および
フィルターを通過した回収液を収容する容器を連結する
手段を含む請求項９記載の器具。 - 【請求項１５】 （Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器と
（Ｅ）フィルターを通過した回収液を収容する容器が、
同一容器である請求項９記載の器具。 - 【請求項１６】 （Ｂ）浸透圧調整液を収容した容器
が、異なる浸透圧を保持する調整液を含む複数の容器で
ある請求項９記載の器具。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02367699A JP3614016B2 (ja) | 1999-02-01 | 1999-02-01 | 凍結細胞から有用細胞を回収する方法およびそのための器具 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02367699A JP3614016B2 (ja) | 1999-02-01 | 1999-02-01 | 凍結細胞から有用細胞を回収する方法およびそのための器具 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000217887A true JP2000217887A (ja) | 2000-08-08 |
| JP3614016B2 JP3614016B2 (ja) | 2005-01-26 |
Family
ID=12117091
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02367699A Expired - Fee Related JP3614016B2 (ja) | 1999-02-01 | 1999-02-01 | 凍結細胞から有用細胞を回収する方法およびそのための器具 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3614016B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011111386A1 (ja) * | 2010-03-11 | 2011-09-15 | 株式会社カネカ | 細胞濃縮・回収方法及び細胞回収液 |
| JP2013034436A (ja) * | 2011-08-09 | 2013-02-21 | Kaneka Corp | 細胞懸濁液の濃縮方法 |
| JP2015512629A (ja) * | 2012-03-16 | 2015-04-30 | ファーティリティ・イノベーションズ・リミテッドＦｅｒｔｉｌｉｔｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ | 精子細胞の処理 |
| CN105258989A (zh) * | 2008-07-25 | 2016-01-20 | 萨莫芬尼根有限责任公司 | 体液中细胞成分的解离 |
-
1999
- 1999-02-01 JP JP02367699A patent/JP3614016B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105258989A (zh) * | 2008-07-25 | 2016-01-20 | 萨莫芬尼根有限责任公司 | 体液中细胞成分的解离 |
| WO2011111386A1 (ja) * | 2010-03-11 | 2011-09-15 | 株式会社カネカ | 細胞濃縮・回収方法及び細胞回収液 |
| JP5800797B2 (ja) * | 2010-03-11 | 2015-10-28 | 株式会社カネカ | 細胞濃縮・回収方法及び細胞回収液 |
| JP2013034436A (ja) * | 2011-08-09 | 2013-02-21 | Kaneka Corp | 細胞懸濁液の濃縮方法 |
| JP2015512629A (ja) * | 2012-03-16 | 2015-04-30 | ファーティリティ・イノベーションズ・リミテッドＦｅｒｔｉｌｉｔｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ | 精子細胞の処理 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3614016B2 (ja) | 2005-01-26 |
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